Document Type : Original Article
Authors
1 Department of Biology, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
2 Department of Biology, Payame Noor University, Tehran, Iran
3 Department of Biotechnology, Shahid Bahonar University of Kerman, Iran
4 Department of Ecology, Institute of Environmental Science, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran
Abstract
Keywords
Main Subjects
استبرق با نام علمی Calotropis procera Aiton. درختچهای چندساله و همیشهسبز از خانوادهی خرزهرهایان (Apocynaceae) است که عمدتاً در مناطق خشک و نیمهخشک رشد میکند. استبرق، یک گیاه چندمنظوره است که به علّت داشتن سطوح بالایی از متابولیتهای ثانویه خاص در پزشکی، تولید سوختهای زیستی، تهیه الیاف، علوفه و الوار و همچنین در گیاهپالایی و برای سنتز انواع نانوذرات مورد توجه بسیار قرار گرفته است (Kaur et al., 2021). این گیاه در طب سنتی نیز بهعنوان داروی ضداسهال، ضدالتهاب، ضدمیکروب، ضدآسم و ضددرد استفاده میشود (Choedon et al., 2006). بنابراین با توجه به اهمیّت دارویی و صنعتی استبرق، حفاظت از گیاه و ایجاد دستورالعملهای قابل تکرار و دائمی برای تولید هرچه بیشتر متابولیتهای ثانویه آن ضروری به نظر میرسد.
امروزه، استفاده از محرکهای زیستی و غیرزیستی در محیطهای کشت بهعنوان یکی از مهمترین راهکارهای افزایش تولید و تجمع متابولیتهای ثانویه اتخاذ شدهاست. آهن، بهعنوان یکی از ریزمغذیهای ضروری برای سلامت گیاهان و عنصری غیرقابل جایگزین تقریباً در همهی موجودات زنده میباشد که در بررسیهای اخیر مشخص شده است اعمال آن بهصورت برونزا در محیطهای کشت میتواند از طریق تولید بیش از حد گونههای فعال اکسیژن و با ایجاد تنش اکسیداتیو، بهعنوان یک محرک قوی در افزایش تولید متابولیتهای ثانویه عمل کند (Sharma et al., 2012). با اینحال، پژوهشهای پیشین بهخوبی نشان داده است که نانوذرات اکسید آهن نسبت به فرم اولیه فلز، به علّت اندازه کوچک، سطح ویژه بزرگ، واکنشپذیری بالا، حمل و نقل درون سلولی زیاد و قابلیت جذب میتوانند بهسرعت و بهطور کامل توسط گیاهان جذب شوند و ویژگیهای فیزیکوشیمیایی متفاوتی را نشان دهند که در شکل معمول آنها وجود ندارد (Sun et al., 2015). پژوهشهای قبلی نشان میدهد نانوذرات اکسید آهن در فعال کردن متابولیسم ثانویه و فعالیتهای آنتی اکسیدانی و افزایش مقاومت در برابر تنشها تاثیر دارد (Khan et al., 2021؛Moharrami et al., 2017). همچنین، نانوذرات سبب افزایش رشد و محتوای کلروفیل در گیاهان میشود (Tawfik et al., 2021). با پتانسیل امیدوارکننده نانوذرات اکسید آهن، به نظر میرسد میتواند جایگزین آهن معمولی در محیطهای کشت گیاهی شوند. با وجود این، در استفاده از این نانوذرات چندین چالش مهم وجود دارد. خاصیت مغناطیسی بالا، غلظت و اندازه نانوذرات، چگونگی افزودن نانوذرات، زمان افزودن آن به محیط کشت و مدت زمان مواجهه نمونه با آن از جمله این چالشها و از مهمترین عوامل تعیین کنندهی اثرات الیسیتور بر میزان تولید متابولیتهای ثانویه است که باید مورد توجه قرار گیرند (Ma et al., 2010؛Kornarzyński et al., 2020 ). سالیسیلیک اسید نیز یک ترکیب فنول طبیعی و از تنظیم کنندههای رشد درونزا است که بسیاری از پژوهشها نشان دادهاند اعمال برونزای آن، آنتیاکسیدانهای آنزیمی و غیرآنزیمی را افزایش میدهد و با حفظ گونههای فعال اکسیژن در سطح بهینه میتواند تولید متابولیتهای ثانویه را افزایش دهد (Koo et al., 2020). از اینرو، تصور میشود که غلظت مناسب سالیسیلیک اسید میتواند بهعنوان نمونهای از محرکهای طبیعی بیخطر در جهت تقویت بیوسنتز متابولیتهای ثانویه خاص و همچنین به حداقل رساندن اثرات نامطلوب احتمالی نانوذرات اکسید آهن عمل کند.
بنابراین، با توجه به اهمیّت گیاه دارویی استبرق از نظر دارویی و صنعتی، در پژوهش حاضر، اثرات نانوذرات اکسید آهن بههمراه سالیسیلیک اسید برای بهبود رشد و فیزیولوژی گیاهچههای استبرق در شرایط هیدروپونیک مورد بررسی قرار گرفت. در این پژوهش، برای جلوگیری از هرگونه سمیّت احتمالی نانوذرات مصنوعی، از نانوذرات اکسید آهن سنتز شده با عصاره برگ استبرق استفاده شد.
موادها و روشها
برای بررسی واکنش گیاه استبرق به نانوذره اکسید آهن و سالیسیلیک اسید، آزمایشی بهصورت فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی با سه تکرار انجام شد. بذرهای گیاه استبرق در مهرماه از گیاه وحشی در منطقه شهداد، یکی از رویشگاههای طبیعی استبرق در استان کرمان جمعآوری شد. منطقه شهداد در ۸۷ کیلومتری شمالشرق شهر کرمان (طول و عرض جغرافیایی: ۵۷٫۷۰۶۱۳۴۶۷° و ۳۰٫۴۱۷۰۹۳۶۷°) با ارتفاع 400 متر از سطح دریا واقع میباشد. تعدادی بذر پس شستوشو و استریل کردن با الکل 70% بهمدت یک دقیقه و آب ژاول 20% (v/v) بهمدت 12 دقیقه، برای جوانهزنی در ظروف پتریدیش قرار داده و در اتاق کشت با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، شدت نور μmol m−2 s−190، دمای C˚25±2 و رطوبت 98-95% نگهداری شد. 10 روز پس از جوانهزنی و رشد گیاهچهها، گیاهچههای یکشکل به فالکونهای حاوی 50 میلیلیتر محلول غذایی½ هوگلند منتقل و در اتاق کشت با شرایط گفته شده نگهداری شدند. گیاهچههای 21 روزه که به مرحله شش برگی رسیدند به فالکونهای حاوی محلول غذایی½ هوگلند همراه با غلظتهای مختلف سالیسیلیک اسید (0، 05/0 و 1/0 میلیمولار) منتقل شدند. همزمان غلظتهای مختلف نانوذرات اکسید آهن (0، 50، 100، 150 و 200 میلیگرم بر لیتر) بر روی برگها اسپری شد؛ برای جلوگیری از آسیب برگها، اسپری در طول دو هفته بهصورت یک روز در میان انجام شد (Bastani et al., 2018). در پژوهش حاضر، از نانوذرات مغناطیسی اکسید آهن سنتز شده به روش همرسوبی با عصاره برگ گیاه استبرق، کلرید آهن (III) و آهن (II) بهعنوان پیشساز در اندازه ذرات 11 نانومتر استفاده شد (Adabavazeh et al., 2022). پس از دو هفته تیماردهی، پارامترهای ریخت شناسی و فیزیولوژیکی مورد بررسی قرار گرفت.
سنجش مقدار رنگیزههای فتوسنتزی
برای سنجش مقدار کلروفیل و کاروتنوئید از روش Lichtenthaler (1987) استفاده شد. 2/0 گرم بافت برگ با 5 میلیلیتر استون 80% سائیده و با کاغذ صافی، صاف شد. حجم محلول با استون 80% به 15 میلیلیتر رسانده و شدت جذب در طول موجهای 2/663، 8/646 و 470 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Visible (مدل JENWAY 6305، انگلیس) خوانده شد. برای اندازهگیری پیشسازهای کلروفیل، شدت جذب در طول موجهای 590، 628، 667 و 650 که بالاترین جذب پروتوپورفیرین، منیزیم_پروتوپورفیرین، پروتوکلروفیلید میباشد، خوانده شد (Yang et al., 1998). نتایج حاصل از اندازهگیری بر اساس رابطه 1 محاسبه و بر حسب میلیگرم بر گرم وزن تر ارائه شد.
رابطه 1:
Chl a (mg g−1 FW) = (12.25 A663.2) - (2.79 A646.8)
Chl b (mg g−1 FW) = (21.51 A646.8) - (5.1 A663.2)
Chl. T (mg g−1 FW) = Chl. a + Chl. b
Car (mg g−1 FW) = [(1000 A470) – (1.8 Chl. a) - (85.02 Chl. b)] ÷ 198
PPIX (mg g−1 FW) = 196.25 A575 - 46.6 A590 - 58.68 A628
MGPP (mg g−1 FW) = 61.81 A590 - 23.77 A575 - 3.55 A628
Pchlide (mg g−1 FW) = 42.59 A628 - 34.22 A575 - 7.25 A590
Chlide a (mg g−1 FW) = A667 /74.9
Chlide b (mg g−1 FW) = A650 /47.2
در روابط فوق Chl a، Chl b، Chl T، Car، PPIX، MGPP، Pchlide و Chlide بهترتیب کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل، کاروتنوئید، پروتوپورفیرین، منیزیم- پروتوپورفیرین، پروتوکلروفیلید و کلروفیلید هستند.
سنجش عناصر
در پژوهش حاضر، میزان عناصر آهن، پتاسیم، کلسیم و منیزیم در برگ در سطح 0 و 200 میلیگرم بر لیتر تیمار نانوذره آهن و سطح 0 و 1/0 میلیمولار سالیسیلیک اسید مورد بررسی قرار گرفت و برای سنجش آنها از دستگاه طیفسنج نشر اتمی پلاسمایی جفت شده القایی (ICP-OES) با حد تشخیص ppm 02/0 ( مدل Spectro ARCOS System760095555، آلمان) استفاده شد (Sagner et al., 1998).
شاخص پایداری غشاء با اندازهگیری میزان نشت الکترولیتی برگ ارزیابی شد (Ben Hamed et al., 2007). برای این منظور 2/0 گرم از بافت سالم و تازه برگ گیاه را بعد از شستوشو با آب مقطر برای شستوشوی یونهای احتمالی از سطح گیاه درون لولهی آزمایش درپیچدار قرار داده و 10 میلیلیتر آب به آن اضافه شد. لولههای آزمایش بهمدّت 2 ساعت در دمای C˚32 قرار داده و میزان هدایت الکتریکی نمونهها (EC1) با Ecمتر (مدل HI9811، شرکت HANNA، آمریکا) اندازهگیری شد. سپس لولههای آزمایش در دمای C˚121 بهمدّت 20 دقیقه اتوکلاو شده و بعد از خنک شدن لولهها تا C˚25، میزان هدایت الکتریکی نمونهها (EC2) مجدداً اندازهگیری و طبق رابطه 2 درصد نشت یونی (EL) محاسبه شد.
رابطه 2:
(EC1 / EC2) × 100= EL%
سنجش مقدار پراکسیدهیدروژن (H2O2)
مقدار H2O2 در بافتهای برگ بر اساس روش Oktay و همکاران (2003) اندازهگیری شد. ابتدا 2/0 گرم از بافت تر بر روی یخ با 3 میلیلیتر تری کلرواستیک اسید 1/0% هموژنه و سپس بهمدّت 20 دقیقه در xg 10000 در دمای C˚4 سانتریفیوژ شد. پس از سانتریفیوژ، 5/0 میلیلیتر مایع رویی با 5/0 میلیلیتر بافر فسفات 10 میلیمولار (7pH=) و یک میلیلیتر محلول یدیدپتاسیم یک مولار مخلوط شد. پس از انکوباسیون نمونهها در دمای C˚25 بهمدّت 15 دقیقه، شدت جذب آنها در طولموج 390 نانومتر خوانده شد و با منحنی استاندارد، محتوای H2O2 محاسبه شد.
سنجش مقدار مالوندیآلدهید (MDA)
محتوای MDA، بهعنوان شاخصی از میزان آسیب ناشی از گونههای فعال اکسیژن به گیاه، براساس روش Heath & Packer (1968) اندازهگیری شد. ابتدا 2/0 گرم از بافتهای مورد نظر بر روی یخ با 3 میلیلیتر تریکلرواستیک اسید 1/0% هموژنه و سپس بهمدت 20 دقیقه با سرعت xg 10000 در دمای C˚4 سانتریفیوژ شد. سپس به 5/0 میلیلیتر مایع رویی 2 میلیلیتر تریکلرواستیک اسید 20% حاوی 5/0% تیوباربیتوریک اسید اضافه شد. نمونهها ابتدا در دمای C˚95 بهمدّت 30 دقیقه انکوبه و سپس بهسرعت در حمام یخ خنک شدند. جذب نمونهها در طولموجهای 532 و 600 نانومتر خوانده شد. میزان MDA از رابطه 3 محاسبه و بهصورت نانومول بر گرم وزن تر بیان شد؛ در این رابطه ضریب خاموشی M−1cm−1 155000ε= میباشد.
رابطه 3:
MDA (nmol g-1 FW) = [(A532-A600)/ ε] × 106
سنجش قند محلول
محتوای قند محلول در برگ توسط معرف آنترون براساس روش اصلاح شدهFales (1951) مورد سنجش قرار گرفت. بر این اساس، 1/0 گرم نمونه با 5/2 میلیلیتر اتانول 80% سائیده و بهمدّت 60 دقیقه در دمای C˚95 قرار داده شد. عصاره حاصل با سرعت xg 3000 بهمدّت 10 دقیقه سانتریفیوژ و مایع رویی جمعآوری شد. سپس برای حذف حلال استخراجکننده، فالکونهای حاوی عصاره درون آون در دمای C˚50 قرار داده شدند. مقدار 5/2 میلیلیتر آب به رسوب حاصل اضافه شد. سپس 5/0 میلیلیتر از محلول بهدست آمده با 5 میلیلیتر معرف آنترون مخلوط و بهمدت 17 دقیقه در دمای C˚90 گرم شد. شدت جذب در طولموج 625 نانومتر خوانده شد. غلظت قند با منحنی استاندارد بهدست آمد و نتایج براساس میلیگرم بر گرم وزن تر گزارش شد.
سنجش پروتئین محلول و آنزیمهای آنتیاکسیدان
برای تهیه عصارهی پروتئینی و آنزیمی، ابتدا 1/0 گرم بافت برگ روی یخ و توسط 2 میلیلیتر بافر فسفات 25 میلیمولار (8/7pH=) هموژنیز شد. سپس عصارهها بهمدّت 15 دقیقه با سرعت xg 10000 و در دمای C˚4 سانتریفیوژ شدند. پس از انجام این مرحله، محلول رویی بهآرامی به میکروتیوبهای جدید انتقال داده شد و برای بررسی پروتئین کل و آنزیمهای آنتیاکسیدان استفاده شد. اندازهگیری پروتئین طبق روش برادفورد (Bradford, 1976) با اندکی تغییر انجام شد.
فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD) با سنجش مهار احیای نوری نیترو بلو تترازولیوم (NBT) طبق روش Giannotolitis & Ries (1997) انجام شد. در این روش، بعد از افزودن 100 میکرولیتر عصارهی آنزیمی به بافر واکنش شامل بافر فسفات 50 میلیمولار (8/7pH=) حاوی EDTA 1/0 میلیمولار، کربناتسدیم 50 میلیمولار، ال_متیونین 12 میلیمولار، ریبوفلاوین یک میکرومولار و NBT 75 میکرومولار، نمونهها بهمدّت 10 دقیقه در معرض نور فلورسنت (μmol m−2s−1 45) قرار گرفتند. برای اندازهگیری فعالیت آنزیمی، نمونههای شاهد و بلانک تهیه شد که حاوی مخلوط واکنش بهجز عصارهی آنزیمی بودند. سپس نمونهی شاهد مانند سایر نمونهها در معرض نور قرار گرفت. میزان جذب در نمونههای آنزیمی و شاهد بهواسطه تشکیل فورمازان در طول موج 560 نانومتر خوانده شد. اختلاف جذب نمونهها و شاهد، مهار احیای نوری NBT را در حضور آنزیم SOD موجود در نمونهها نشان میدهد. فعالیت آنزیم بر حسب واحد آنزیم به ازای هر میلیگرم پروتئین بیان شد.
فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) با بررسی کاهش جذب H2O2 در طولموج 240 نانومتر در دو دقیقه طبق روش Aebi (1974) اندازهگیری شد. در این روش، مخلوط واکنش شامل 800 میکرولیتر فسفات سدیم بافر 50 میلیمولار (7pH=) و 100 میکرولیتر آب اکسیژنه 37% و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. میزان فعالیت آنزیم توسط ضریب خاموشی معادل mM-1cm-1 36 محاسبه و بر حسب واحد آنزیم به ازای هر میلیگرم پروتئین بیان شد.
فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) با آسکوربیک اسید و میزان کاهش جذب آن طبق روش Asada & Nakano (1981) انجام شد. مخلوط واکنش شامل 675 میکرولیتر محلول EDTA 2/0 مولار، 175 میکرولیتر محلول اسید آسکوربیک 5/0 میلیمولار، 50 میکرولیتر H2O2 250 میلیمولار و 100 میکرولیتر عصاره گیاهی بود. بهدنبال اکسید شدن آسکوربیک اسید با آغاز واکنش آنزیمی، کاهش جذب در 290 نانومتر، 2 دقیقه پس از آغاز واکنش نسبت به زمان آغاز واکنش محاسبه شد. میزان فـعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی معادل mM-1cm-1 8/2 محاسبه و بر حسب واحد آنزیم به ازای هر میلیگرم پروتئین بیان شد.
فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (GPX) توسط گایاکول و اندازهگیری میزان جذب تتراگایاکول براساس روش Kao & Lin (1999) اندازهگیری شد. مخلوط واکنش شامل 800 میکرولیتر بافر فسفات 50 میلیمولار (7=pH)، 10 میکرولیتر H2O2 19 میلیمولار، 150 میکرولیتر گایاکول 9 میلیمولار و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. میزان جذب تتراگایاکول در 470 نانومتر در لحظه آغاز واکنش پس از افزودن عصاره آنزیمی و پس از یک دقیقه خوانده شد. میزان فـعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی معادل mM-1cm-1 6/26 محاسبه و بر حسب واحد آنزیم به ازای هر میلیگرم پروتئین بیان شد.
ارزیابی مواد مؤثره اسانس
در این پژوهش، جهت استخراج اسانس از متانول 80% بهعنوان حلال و دستگاه اسانسگیری سوکسله استفاده شد (Mokhtassi Bidgoli et al., 2013). برای شناسایی مواد مؤثره اسانس از دستگاه گاز کروماتوگراف جرم سنجی (GC/MS) مدل Hewlett-Packard-589 (شرکت Agilent، آمریکا) دارای سیستم تله یونی استفاده شد که در آن انرژی یونیزاسیون 70 الکترونولت و درجه حرارت C˚250، برای تولید منبع یون تنظیم شد (Davies, 1990). شناسائی هر ترکیب براساس زمان بازداری و جرم ثبت شده آنها انجام شد.
محاسبات آماری
تمام آزمایشها به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی با سه تکرار انجام شد. دادهها با نرمافزار SPSS به روش آنالیز واریانس یکطرفه (TWO-Way ANOVA) مورد تجزیه آماری قرار گرفتند. مقایسه میانگین دادهها براساس آزمون چنددامنهای دانکن و سطوح معنیدار بودن تیمارها در سطح P≤0/05 انجام شد.
نتایج
اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر پارامترهای رشد
نتایج محاسبات آماری نشان دادند بین سطوح مختلف تیمارهای اعمال شده از لحاظ صفات، طول و وزن تر و خشک اندامهوایی و ریشه اختلاف معنیداری وجود دارد. همانطور که در شکل A1 نشان داده شده است، تمام غلظتهای نانوذرات مغناطیسی (MNPs) بهاستثنای بالاترین غلظت آن (200 میلیگرم بر لیتر)، بهطور معنیداری سبب کاهش طول اندامهوایی نسبت به شاهد شد (Adabavazeh et al., 2022). کاربرد سالیسیلیک اسید (SA) بهتنهایی در سطح 05/0 میلیمولار بیشترین تأثیر را در افزایش طول اندامهوایی داشت (5/40%)، با وجود اینکه در سطح 1/0 میلیمولار تفاوت معنیداری با شاهد مشاهده نشد. علاوهبر این، MNPs در ترکیب با SA در تمامی سطوح در مقایسه با شاهد طول اندامهوایی را بهطور معنیداری افزایش داد. طول ریشه نیز با قرار گرفتن در معرض تمام غلظتهای MNPs بهطور معنیداری نسبت به شاهد کاهش نشان داد، بهطوریکه در غلظت 100 میلیگرم بر لیتر آن بیشترین کاهش ارتفاع ریشه (حدوداً 47% کاهش)، مشاهده شد (شکل B1) (Adabavazeh et al., 2022). تیمار SA در سطح 05/0 میلیمولار بهتنهایی و در ترکیب با MNPs سبب بهبود رشد ریشه نشد، بهجز در غلظت 50 میلیگرم بر لیتر که منجر به افزایش 33درصدی طول ریشه در مقایسه با سطح بدون تیمار شد. سطح 1/0 میلیمولار SA نیز بهتنهایی و در ترکیب با دو سطح 50 و 100 میلیگرم بر لیتر MNPs بهترتیب 6/28، 5/38 و 4/30% طول ریشه را نسبت به شاهد افزایش داد.
|
|
|
شکل 1- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر طول اندامهوایی(A) و طول ریشه(B) در گیاهچههای استبرق. مقادیر، میانگین سه تکرار ±SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.
Figure 1- Effect of magnetic nanoparticles and salicylic acid on shoot length (A) and root length in C. procera seedlings. Values represent the mean of three replicates ± standard errors, and similar letters are significantly different according to Duncan's test (P ≤ 0.05).
نتایج نشان دادند نسبت به شاهد، تمامی سطوح تیمار موجب افزایش معنیداری در وزن تر و خشک اندامهوایی و ریشه شد. بیشترین میزان وزن تر اندام هوایی تحت تیمار 200 میلیگرم بر لیتر MNPs تا حدود 62% و ریشه تحت تیمار 05/0 میلیمولار SA تا 116% مشاهده شد (شکل A-B2). تأثیر تیمارهای اعمال شده بر وزن خشک اندامهوایی و ریشه از لحاظ آماری تقریباً یکسان بود. کمترین میزان وزن خشک ریشه در سطح 05/0 میلیمولار SA همراه با 50 میلیگرم بر لیتر MNPs (22% کاهش) و بیشترین میزان تحت تیمار 05/0 میلیمولار SA بهتنهایی (5/55% در ریشه و 8/99% در اندامهوایی) نسبت به شاهد مشاهده شد (شکل C-D2).
|
|
|
|
|
|
شکل 2- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر وزن تر اندامهوایی(A) ، وزن تر ریشه(B) ، وزن خشک اندامهوایی(C) و وزن خشک ریشه(D) در گیاهچههای استبرق. مقادیر، میانگین سه تکرار ±SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.
Figure 2- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on shoot fresh weight (A), root fresh weight (B), shoot dry weight (C), and root dry weight (D) in C. procera seedlings. Values represent the mean of three replicates ± standard errors, and similar letters are significantly different according to Duncan's test (P ≤ 0.05).
اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر میزان رنگیزههای فتوسنتزی
براساس نتایج بهدست آمده، میزان کلروفیل و کاروتنوئید در گیاهچههای استبرق بهطور قابل توجهی تحت تأثیر تیمارهای MNPs و SA قرار گرفت. همانطور که در شکل A3 مشخص است تمامی سطوح تیمار سبب افزایش معنیداری در میزان کلروفیل a شد. بیشترین میزان کلروفیل a (%151 نسبت به شاهد) تحت تیمار 1/0 میلیمولار SA حاصل شد. میزان کلروفیل b تحت تأثیر MNPs بهطور معنیداری کاهش یافت، بهاستثنای غلظت 200 میلیگرم بر لیتر، که در آن میزان کلروفیل b 2/1 برابر شاهد بود (شکل B3) (Adabavazeh et al., 2022). در بررسی اثر تیمار SA نیز مشخص شد که هیچکدام از غلظتهای SA تأثیر معنیداری بر میزان کلروفیل b نداشتند. همچنین، میزان کلروفیل b در ترکیب 200 میلیگرم بر لیتر MNPs همراه با 1/0 میلیمولار SA نسبت به شاهد کاهش یافت. غلظت 1/0 میلیمولار SA بهتنهایی و همچنین در ترکیب با MNPs بیشترین تأثیر را در افزایش کلروفیل کل و کاروتنوئید داشت (شکل C-D3).
|
|
|
|
|
|
شکل 3- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر میزان کلروفیلa (A)، کلروفیل(B) b ، کلروفیل کل(C) و کاروتنوئید(D) در گیاهچههای استبرق. مقادیر، میانگین سه تکرار ±SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.
Figure 3- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on the amount of chlorophyll a (A), chlorophyll b (B), total chlorophyll (C), and carotenoids (D) in C. procera seedlings. Values represent the mean of three replicates ± standard errors, and similar letters are significantly different according to Duncan's test (P ≤ 0.05).
اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر پیشسازهای کلروفیل
یافتهها نشان دادند تیمار 100 میلیگرم بر لیتر MNPs همراه با 05/0 میلیمولار SA منجر به افزایش قابلتوجهی در میزان پیشسازهای مسیر بیوسنتزی کلروفیل از جمله پروتوپورفیرین (83%)، منیزیم پروتوپورفیرین (9%) و کلروفیلید b (23%) در مقایسه با شاهد شد (شکل A-B-E4). علاوهبر این، پروتوکلروفیلید نیز تحت تیمار 150 میلیگرم بر لیتر MNPs همراه با 05/0 میلیمولار SA تا 80% نسبت به شاهد افزایش نشان داد (شکل C4). همچنین در تمامی سطوح تیمار افزایش معنیداری در مقدار کلروفیلید a نسبت به شاهد مشاهده شد و بیشترین میزان آن در سطح 1/0 میلیمولار SA حاصل شد، که مقدار آن تقریباً 4 برابر شاهد بود (شکل D4). در مقدار کلروفیلید b نسبت به شاهد تفاوت معنیداری مشاهده نشد (شکل E4).
|
|
|
||
|
|
|
||
|
|
|
|
|
شکل 4- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر میزان پروتوپورفیرین (A)، منیزیم پروتوپورفیرین(B) ، پروتوکلروفیلید(C) ، کلروفیلید(D) a و کلروفیلید b (E) در گیاهچههای استبرق. مقادیر، میانگین سه تکرار ±SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.
Figure 4- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on the amount of protoporphyrin IX (A), magnesium protoporphyrin (B), protochlorophyllide (C), chlorophyllide a (D), and chlorophyllide b (E) in C. procera seedlings. Values represent the mean of three replicates ± standard errors, and similar letters are significantly different according to Duncan's test (P ≤ 0.05).
اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر میزان عناصر آهن، پتاسیم، کلسیم و منیزیم
تغییرات میزان آهن، منیزیم، پتاسیم و کلسیم گیاهچهها در پاسخ به بالاترین سطح MNPs و SA در جدول 1 ارائه شده است. در مقایسه با شاهد، محتوای آهن بهطور قابل توجهی در پاسخ به تیمارهای اعمال شده افزایش یافت. همچنین روند مشابهی در محتوای منیزیم و کلسیم مشاهده شد. در حالیکه میزان پتاسیم در 1/0 میلیمولار SA با شاهد اختلاف معنیداری نداشت و در ترکیب با MNPs افزایش یافته و به حداکثر میزان رسید. با توجه به دادههای ارائه شده در جدول 1، تیمار 1/0 میلیمولار SA در ترکیب با 200 میلیگرم بر لیتر MNPs نسبت به SA و MNPs بهصورت مجزا بهترین اثر را بر میزان عناصر داشت.
جدول 1- اثر نانوذرات آهن مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر عناصر غذایی گیاهچههای استبرق
Table 1- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on nutritional elements of C. procera seedlings
|
SA concentartion (mM) |
MNPs concentartion (mg L-1) |
Fe (DW%) |
Mg (DW%) |
Ca (DW%) |
K (DW%) |
|
0 |
0 |
0.25c |
6.9d |
6.47d |
4.43c |
|
0 |
200 |
0.38a |
8.24b |
7.28b |
4.66b |
|
0.1 |
0 |
0.33b |
7.48c |
6.85c |
4.32c |
|
0.1 |
200 |
0.39a |
8.78a |
9.3a |
5.51a |
مقادیر، میانگین سه تکرا ر و حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.
Values represent the mean of three replicates and similar letters denote significant differences according to Duncan’s test (P ≤ 0.05).
اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر درصد نشت الکترولیتی غشاء
همانطور که در شکل 5 نشان داده شده است، میزان درصد نشت الکترولیتی غشاء در گیاهچههای استبرق بهطور قابل توجهی تحت تأثیر تیمارهای اعمال شده نسبت به شاهد کاهش یافت. در مقایسه با شاهد، در گیاهچههای تیمار شده با 50 میلیگرم بر لیتر MNPs و گیاهچههای رشدیافته در 05/0 میلیمولار SA همراه با 200 میلیگرم بر لیتر MNPs کمترین نشت یونی (حدوداً 30%) مشاهده شد.
شکل 5- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر میزان نشت الکترولیتی در گیاهچههای استبرق. مقادیر، میانگین سه تکرار ±SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.
Figure 5- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on the amount of electrolyte leakage in C. procera seedlings. Values represent the mean of three replicates ± standard errors, and similar letters are significantly different according to Duncan's test (P ≤ 0.05).
اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر مقدار H2O2، MDA، قند محلول و پروتئین محلول
مقایسه نتایج دادهها نشان دادند محتوای H2O2 در برگ تیمار شده با 100 میلیگرم بر لیتر MNPs افزایش یافته و به حداکثر مقدار (18/14 میکرومول در گرم وزن تر) رسیده است. در مقابل، سطح H2O2 زمانیکه گیاه در معرض 150 و 200 میلیگرم بر لیتر MNPs در مقایسه با شاهد قرار داشت، بهطور معنیداری کاهش یافت (شکل A6) (Adabavazeh et al., 2022). علاوهبر این، در میزان H2O2 در تمامی سطوح حاوی 05/0 میلیمولار SA نسبت به شاهد کاهش معنیداری مشاهده شد، در حالیکه SA بهتنهایی در سطح 1/0 میلیمولار سبب %7 افزایش و در ترکیب با تمام غلظتهای MNPs موجب کاهش معنیدار میزان H2O2 شد.
دادههای ارائه شده در شکل B6 نشان میدهند در بین غلظتهای MNPs زمانی که بهتنهایی اعمال شد، فقط غلظت 150 میلیگرم بر لیتر آن بهطور معنیداری مقدار MDA را در برگها نسبت به شاهد افزایش داد (61%) و در سایر سطوح نسبت به شاهد از نظر آماری تفاوت معنیداری مشاهده نشد (Adabavazeh et al., 2022). در بررسی اثر متقابل MNPs و SA نیز تنها سطح 1/0 میلیمولار SA با تمام غلظتهای MNPs بهاستثنای کمترین غلظت آن به کاهش MDA منجر میشود. بهطوریکه در مقایسه با شاهد، میزان MDA در سطح 1/0 میلیمولار SA با دو غلظت 150 و 200 میلیگرم بر لیتر MNPs بهترتیب 64 و 40% کاهش نشان داد.
محتوای قندهای محلول بهتدریج با افزایش غلظت MNPs افزایش یافت، در حالیکه بین دو غلظت SA تفاوت معنیداری مشاهده نشد و هر دو منجر به افزایش مقدار قند محلول شدند (حدوداً 4/1 برابر شاهد) (شکل C6). تأثیر متقابل MNPs و SA بر مقدار قند محلول برگها نیز معنیدار بود و اعمال دو نوع تیمار با هم منجر به افزایش معنیداری در مقدار قند محلول شد. کمترین و بیشترین مقدار قند محلول در برگ بهترتیب در شاهد و نمونه تیمار شده با 200 میلیگرم بر لیتر MNPs مشاهده شد.
محتوای پروتئین بهطور قابلتوجهی با تیمار MNPs در مقایسه با شاهد افزایش نشان داد. بالاترین مقدار در 100 میلیگرم بر لیتر MNPs، در حدود دو برابر بیشتر از شاهد مشاهده شد (شکل D6). با اینحال، کاهش مشاهده شده در محتوای پروتئین در 150 و 200 میلیگرم بر لیتر بهطور محسوسی نسبت به شاهد افزایش یافته است (تقریباً 2/1 برابر). در مقایسه دو غلظت SA بر مقدار پروتئین، 1/0 میلیمولار سبب 6/45% افزایش و 05/0 میلیمولار منجر به 2/15% افزایش نسبت به شاهد شد. در سایر غلظتها نیز در مقایسه با شاهد افزایش مشاهده شد.
|
|
|
|
|
|
شکل 6- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر میزانH2O2 (A)، (B) MDA، قند محلول(C) و پروتئین محلول (D) در گیاهچههای استبرق. مقادیر، میانگین سه تکرار ±SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.
Figure 6- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on H2O2 (A), MDA (B), total protein (C), and soluble sugar (D) contents in C. procera seedlings. Values represent the mean of three replicates ± standard errors, and similar letters are significantly different according to Duncan's test (P ≤ 0.05).
اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان
در بررسی تأثیر MNPs و SA بر میزان فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان (SOD، CAT، APX و GPX)، تفاوتهای معنیداری در فعالیت آنزیمی در گیاهان تیمار شده مشاهده شد. با توجه به نتایج نشان داده شده در شکل A7، فعالیت آنزیم SOD با غلظتهای مختلف MNPs در مقایسه با شاهد بهطور قابل توجهی کاهش داشت، در حالیکه تحت تیمار توأم در سطح 100 و 150 میلیگرم بر لیتر MNPs با 1/0 میلیمولار SA، فعالیت آنزیم بهترتیب 54 و 61% افزایش یافت. بیشترین فعالیت آنزیم CAT در سطح 50 میلیگرم بر لیتر MNPs مشاهده شد که 3 برابر فعالیت آنزیم در نمونه شاهد بود (شکل B7). همچنین در بررسی تأثیر متقابل SA و MNPs بر میزان فعالیت آنزیم CAT مشخص شد غلظت 1/0 میلیمولار SA همراه با غلظتهای مختلف MNPs سبب افزایش فعالیت آنزیم شد، در حالیکه 05/0 میلیمولار SA در ترکیب با غلظتهای مختلف MNPs بهاستثنای 200 میلیگرم بر لیتر، تفاوت معنیداری در فعالیت آنزیم با شاهد ایجاد نکرد. در بررسی اثر تیمار MNPs بهتنهایی بر فعالیت آنزیم APX، همانطور که شکل C7 نشان میدهد، غلظت 200 میلیگرم بر لیتر MNPs منجر به افزایش فعالیت آنزیم (3/1 برابر بیشتر از شاهد) شد و در سایر غلظتهای آن تفاوت معنیداری با شاهد مشاهده نشد (Adabavazeh et al., 2022). در بین نمونههای تیمار شده با غلظتهای مختلف MNPs و SA نیز برگهای تیمار شده با 100 میلیگرم بر لیتر MNPs همراه با 05/0 میلیمولار SA بیشترین فعالیت آنزیم APX را نشان دادند و مقدار آن 203% افزایش نسبت به شاهد بود.
با توجه به شکل D7، با افزایش غلظت MNPsتا 150 میلیگرم بر لیتر فعالیت آنزیم GPX بهتدریج افزایش یافت و سپس در بالاترین غلظت MNPs (200 میلیگرم بر لیتر) فعالیت آنزیم بهطور قابلتوجهی کاهش پیدا کرد. بیشترین فعالیت آنزیم GPX نیز در گیاهان رشدیافته تحت تیمار 05/0 میلیمولار SA مشاهده شد که فعالیت آنزیم را تا 176% نسبت به شاهد افزایش داد.
|
|
|
|
|
|
شکل 7- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر فعالیت آنزیم SOD (A)،(B) CAT ،APX (C) و GPX (D) در گیاهچههای استبرق. مقادیر، میانگین سه تکرار ±SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.
Figure 7- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on SOD (A), CAT (B), APX (C), and GPX (D) activityies in C. procera seedlings. Values represent the mean of three replicates ± standard errors, and similar letters are significantly different according to Duncan's test (P ≤ 0.05).
اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر ترکیبات اصلی اسانس
در بررسی تأثیر MNPs و SA بر ترکیبات اسانس برگ گیاهچههای رشدیافته تحت شرایط هیدروپونیک مشخص شد تیمار توأم MNPs با SA بیشترین اثر را بر روی ترکیبات اصلی اسانس داشت (جدول 2). برای مثال، میزان سیترونلال و کافور که از ترکیبات اصلی اسانس برگ هستند، تحت تیمار 1/0 میلیمولار SA همراه با 50 و 100 میلیگرم بر لیتر MNPs بهترتیب 71/435% و 6/391% افزایش یافت. بههمینترتیب، 8/1- سینئول، ژرانیال، A- فلاندرن و آلفا- پینن ترکیبات مهم دیگری هستند که بهترتیب 8/5، 5/5، 5 و 8/3 برابر بیشتر از شاهد تحت تیمار 200 میلیگرم بر لیتر MNPs و 1/0 میلیمولار SA افزایش نشان دادند.
جدول2- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر ترکیبات اصلی اسانس گیاهچههای استبرق با GC/MS
Table 2- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on the main essential oil constituents of C. procera seedlings using GC/MS
|
Essential oil components |
Retention Time (min) |
Control |
50 mg L-1 MNPs |
100 mg L-1 MNPs |
150 mg L-1 MNPs |
200 mg L-1 MNPs |
0.05mM SA |
50 mg L-1 MNPs + 0.05mM SA |
100 mg L-1 MNPs + 0.05mM SA |
150 mg L-1 MNPs + 0.05mM SA |
200 mg L-1 MNPs + 0.05mM SA |
0.1mM SA |
50 mg L-1 MNPs + 0.1mM SA |
100 mg L-1 MNPs + 0.1mM SA |
150 mg L-1 MNPs + 0.1mM SA |
200 mg L-1 MNPs + 0.1mM SA |
|
Alpha-pinene |
1036 |
1.5o |
1.9m |
2.2k |
2.5j |
3.0h |
2.0i |
2.7f |
3.3d |
4.2b |
5.1n |
1.8i |
3.1g |
3.8e |
4.6c |
5.8a |
|
Α-phellandrene |
1176 |
1.3i |
2.4j |
2.9i |
3.3h |
3.6f |
1.6k |
2.9g |
3.5d |
4.4b |
5.3j |
2.4i |
3.3h |
4.1e |
5.0c |
6.6a |
|
1,8-Cineol |
1214 |
1.2n |
2.7k |
3.4i |
4.2g |
5.1d |
1.7m |
3.0h |
3.6e |
4.7b |
6.0l |
2.6j |
3.4i |
4.4f |
5.5c |
7.0a |
|
β-Ocymene |
1251 |
2.8b |
2.7c |
1.8i |
2.4e |
2.0h |
2.7c |
2.2d |
2.5g |
2.1i |
1.8a |
2.9f |
2.4e |
2.0h |
2.1g |
1.7j |
|
Citronellal |
1487 |
1.4m |
5.1g |
4.0i |
3.2j |
2.1k |
1.3n |
7.0d |
6.2e |
5.6h |
4.6o |
1.2b |
7.5a |
6.6c |
5.3f |
4.6h |
|
Camphor |
1536 |
1.2n |
5.5d |
4.3f |
3.1i |
2.0m |
1.1o |
6.0e |
4.7h |
3.5k |
2.2n |
1.2b |
6.2a |
5.9c |
3.7g |
2.6j |
|
Linalool |
1582 |
2.6d |
2.1h |
2.4f |
2.5e |
3.1c |
3.2b |
2.1f |
2.4g |
2.2e |
2.5a |
3.7h |
2.1h |
2.0i |
2.2g |
2.5e |
|
Geranial |
1741 |
1.4p |
2.3m |
3.0k |
4.1g |
5.2d |
1.6n |
3.2h |
3.8e |
5.1b |
6.6o |
1.5j |
3.5i |
4.6f |
5.9c |
7.7a |
|
α-Terpineol |
1790 |
2.5c |
1.9e |
3.1a |
1.7g |
2.0d |
2.7b |
1.8h |
1.6e |
1.9h |
1.6b |
2.7f |
1.6h |
2.0d |
1.8f |
1.5i |
مقادیر، میانگین سه تکرار و حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.
Values represent the mean of three replicates and similar letters denote significant differences according to Duncan’s test (P ≤ 0.05).
بحث
در بررسی تأثیر MNPs سنتزشده در گیاهچههای استبرق رشدیافته در شرایط هیدروپونیک، نتایج نشان دادند افزودن MNPs در غلظت معین (200 میلیگرم بر لیتر) منجر به افزایش فاکتورهای ریخت شناسی از جمله طول اندام هوایی، وزن تر و خشک اندامهوایی و ریشه شدند (Adabavazeh et al., 2022). این نتایج با پژوهشهای قبلی انجام شده توسط Ngan و همکاران (2020) همخوانی داشت؛ آنها گزارش کردند آهن در بهبود رشد و بازده ریشهزایی در گیاهان نقش دارد. در گیاه سویا، محلولپاشی برگی و خاکی نانوذرات مغناطیسی تأثیر مثبت بر فاکتورهای رشد گیاه داشت و در پژوهش حاضر مشخص شد محلولپاشی برگی مؤثرتر از روش خاکی بود (Alidoust & Isoda, 2013). یکی از دلایل احتمالی افزایش رشد تحت تأثیر تیمار MNPs افزایش غلظت کلروفیل و سرعت فتوسنتز است. پژوهشهای قبلی نشان دادند تیمار نانوذرات آهن بهطور قابل توجهی پتانسیل افزایش کلروفیل و فاکتورهای رشد را دارند و ارتباط مثبت بین محتوای کلروفیل و محتوای آهن را تأیید میکنند (Sheykhbaglou et al., 2018 Iannone et al., 2016;) و با نتایج ما همخوانی دارد.آهن یک واسطهی مهم برای زنجیره انتقال الکترون، سنتز +NADP در طی فتوسنتز، بیوسنتز سیتوکرومها، کمک به سنتز 5-آمینو لوولینیک اسید (پیشساز کلروفیل) است که ممکن است از این روش، تأثیر مثبتی بر رشد و بهرهوری گیاه داشته باشد (Ngan et al., 2020). همچنین در پژوهش حاضر، افزایش مقدار پروتوپورفیرین با افزایش کلروفیلید a نیز نشانهی اثر احتمالی MNPs و SA بر مسیر بیوسنتزی کلروفیل a است و شامل سلسله واکنشهای آنزیمی از تبدیل شدن آمینواسید گلوتامیک به پروتوپورفیرینوژن، پروتوپورفیرین و سپس کلاته شدن با منیزیم و تولید مولکول منیزیم پروتوپورفیرین است که در نهایت پس از تبدیل شدن به پروتوکلروفیلید، کلروفیلید a بوجود میآید که میتواند به کلروفیل a تبدیل شود (Taiz et al., 2015).
یکی دیگر از دلایل احتمالی افزایش رشد تحت تأثیر تیمار MNPs ممکن است بهدلیل افزایش جذب عناصر معدنی بهویژه آهن باشد. طی بررسی انجام شده تأثیر نانواکسید و اکسید آهن معمولی بر غلظت آهن در گیاه گندم، مشخص شد که نانواکسید آهن نسبت به اکسید آهن معمولی در افزایش غلظت آهن در گیاه مؤثرتر بود (Mazaherinia et al., 2010). پژوهش Abdi و همکاران (2008) نیز پتانسیل نانوذرات آهن در جذب و انتقال مواد مغذی محلول، بهویژه منیزیم، یکی دیگر از مواد معدنی مهم دخیل در سنتز کلروفیل و نیز کلسیم و پتاسیم، بهعنوان مواد معدنی ضروری با بیشترین تقاضا در رشد و نمو گیاه را تأیید نمود. Ngan و همکاران (2020) نشان دادند نانوذرات آهن در غلظت معین سبب بهبود جذب کلسیم، پتاسیم و منیزیم و در نتیجه رشد گیاهچههای میخک (Dianthus caryophyllus) شده که با نتایج ما همخوانی دارد. Wei & Wang (2013) نیز گزارش نمودند نانوذرات مغناطیسی با فعالیت شبهپراکسیدازی ذاتی و کاهش H2O2 و نیز بهواسطه آزادسازی آهن آزاد در اثر تجزیه لیزوزومی نانوذرات آهن در سلول و در نتیجه تشدید پیشرفت چرخههای سلولی میتوانند سبب افزایش رشد سلول شوند.
با وجود این در پژوهش حاضر، تأثیر متقابل MNPs و SA تأثیر بیشتری بر بهبود فاکتورهای رشد در گیاه استبرق نسبت به هر کدام از تیمارها بهصورت جداگانه داشت که با نتایج گزارش شده توسط Mozafari و همکاران (2018) همخوانی داشت. همچنین پژوهشهای متعدد نشان دادند SA با تأثیر بر ساختار کلروپلاست، میزان فتوسنتز، فعالیت آنزیم روبیسکو، مقدار رنگیزههای فتوسنتزی و کاهش نشت یونی گیاه منجر به بهبود فاکتورهای رشد در گیاهان میشود (Popova et al., 2009؛ Korkmaz et al., 2007).
در این پژوهش، برای ارزیابی سمیّت MNPs سنتز شده در غلظتهای بالا در گیاه علاهبر رشد، نشت الکترولیتی غشاء، میزان پراکسیدهیدروژن و پراکسیداسیون لیپیدها نیز بررسی شدند؛ به علّت آنکه، لیپیدهای غشای پلاسمایی یکی از اولین ساختارهای سلول گیاهی هستند که در شرایط تنشی بهدنبال افزایش ترکیبات فعال اکسیژن (ROS) آسیب میبینند. افزایش ROS به بسیاری از ساختارها و اجزای سلول نظیر پروتئینها، کربوهیدراتها و اسیدهای نوکلئیک آسیب زده و با تغییر ساختار غشاء در اثر پراکسیداسیون چربیها و پروتئینها، سبب افزایش تراوایی غشای سلولی شده و منجر به نشت الکترولیتهای داخل سلولی به سمت بیرون میشود و رشد گیاه را تحت تأثیر قرار میدهد. در پژوهش حاضر، با کاربرد MNPs میزان نشت یونی گیاه استبرق نسبت به گروه شاهد کمتر شد و با نتایج Banijamali (2019) در گل داوودی تحت تأثیر نانوذرات سوپرپارامغناطیس اکسید آهن با پوشش اسیدهیومیک همخوانی داشت. Rawat و همکاران (2017) نیز گزارش نمودند محلولپاشی نانوذرات سولفیدآهن در غلظت بهینه 4 میلیگرم بر لیتر موجب کاهش نشت یونی و پراکسیداسیون غشای سلولی در گیاه خردل شد. در این پژوهش، میزان H2O2، علیرغم پژوهشهای قبلی مبنی بر افزایش سطوح H2O2 با کاربرد نانوذرات فلزی (Hashemi et al., 2019؛ Ma et al., 2015)، با بالاترین غلظتهای MNPs (150 و 200 میلیگرم بر لیتر) در مقایسه با شاهد کاهش نشان داد. پژوهشها نشان دادند MNPs در غلظت مناسب فعالیت شبهپراکسیدازی در سلول داشته که میتواند سبب کاهش H2O2 و کاهش تنش اکسیداتیو در سلول شود و از دلایل افزایش مقاومت سلول در برابر تنشهای اکسیداتیو هستند (Pariona et al., 2016). با اینحال، کاربرد SA همراه با MNPs تأثیر مثبت و بهبوددهندهتری در کاهش میزان نشت مواد محلول از غشاء، همچنین میزان H2O2 و MDA در گیاهچههای استبرق داشت و این یافتهها با نتایج Dedejani (2016) همخوانی دارد. تأثیر مثبت SA در افزایش پایداری غشاء میتواند به علّت افزایش میزان پلیآمینهای پوترسین، اسپرمیدین و اسپرمین باشد که از این طریق به یکپارچگی و حفظ غشاء کمک میکند (Nemeth et al., 2002). علاوهبر این، حضور کارتنوئیدها در فاز چربی غشاء نیز به حفظ غشاء در شرایط نامناسب محیطی کمک میکند. از اینرو افزایش کارتنوئید با تیمار MNPs و SA در گیاه استبرق میتواند در کاهش نشت یونی نقش مؤثری داشته باشد. مشابه این نتایج، تیمار همزمان FeNPs و SA، میزان کارتنوئید را در توتفرنگی افزایش و در مقابل میزان نشت یونی، H2O2 و MDA را کاهش داده است (Dedejani, 2016).
از یافتههای دیگر پژوهش حاضر، افزایش محتوای قندهای محلول و پروتئین محلول تحت تأثیرMNPs و SA بود. پژوهشهای قبلی نشان دادند آهن بهعنوان کوفاکتور تنظیمی آنزیمهای مختلف میتواند بر تمام متابولیسمهای گیاه تأثیر بگذارد. اگرچه، نانوذرات آهن در مقایسه با فلز آهن میتواند سریعتر و کاملتر توسط گیاهان جذب شود، که سبب می شود گیاهان بتوانند از مواد مغذی موجود در آن استفاده کنند و رشد پربارتری داشته باشند (Askary et al., 2017). بر این اساس، به نظر میرسد که نانوذرات اکسید آهن میتوانند +Fe2 مورد نیاز را برای واکنشهای آنزیمی درگیر در متابولیسم قندها و نیتروژن در دسترس گیاه قرار دهند و متابولیسم قند و پروتئین را افزایش دهند. بهطور مشابه، افزایش قند و محتوای پروتئین در پاسخ به نانوذرات اکسید آهن نیز توسط پژوهشگران مختلف گزارش شده است (Sheykhbaglou et al., 2018؛ Vadivel et al., 2012). با وجود این، در این پژوهش، نانوذرات زمانی که با SA استفاده شد بهطور قابلتوجهی مؤثرتر بود. تعدادی از پژوهشها نشان دادند تیمار SA با فعالیت افزایش ساکارز فسفات سنتاز، آنزیم اصلی در سنتز ساکارز (Dong et al., 2011) و نیترات ردوکتاز، آنزیم کلیدی برای جذب نیتروژن (Fariduddin et al., 2003) بر متابولیسم کربوهیدرات و پروتئین تأثیر میگذارد.
یکی دیگر از فاکتورهایی که جهت بررسی آسیب اکسیداتیو احتمالی ناشی از تیمار MNPs در گیاه بررسی شد، سیستم آنتیاکسیدانت آنزیمی بود؛ در این پژوهش، فعالیت SOD در گیاهچههای استبرق کاهش قابل توجهی در تمام تیمارهای MNPs اعمال شده نشان داد، اما CAT در 50 میلیگرم بر لیتر و APX در بالاترین غلظت MNPs (200 میلیگرم بر لیتر) بهطور قابل توجهی افزایش داشت. فعالیت GPX نیز با افزایش غلظت MNPs تا 150 میلیگرم بر لیتر افزایش و در بالاترین غلظت MNPs کاهش یافت. با توجه به این نتایج، احتمالاً منابع دیگری برای تولید H2O2 در گیاه، به غیر از تولید H2O2 ناشی از فعالیت SOD وجود داشته است، از جمله برخی از واکنشهای درگیر در فتوسنتز و تنفس، که ROS از محصولات جانبی اجتنابناپذیر آنها است. نتایج این پژوهش با یافتههای Wang و همکاران (2011) که فعالیتهای مختلف SOD و CAT را در مواجهه با نانوذرات Fe3O4 نشان میداد همخوانی داشت. در مقایسه با پژوهشهای قبلی که اثر نانوذرات آهن را بر آسیب اکسیداتیو، تولید ROS و فعالیتهای آنتیاکسیدانها گزارش کردهاند، تفاوت در فعالیت آنزیمی گیاهان میتواند به علّت تفاوت در شرایط سنجش، نوع و اندازه نانوذرات، غلظت و مدت زمان قرار گرفتن در معرض نانوذرات و مرحله رشد و نمو گیاه، گونه گیاه و نیز بافت مورد سنجش گیاه باشد (Ma et al., 2015). در پژوهش حاضر برای تقویت سیستم آنزیمی و غیرآنزیمی آنتیاکسیدان و جهت کاهش آسیبهای اکسیداتیو احتمالی ناشی از MNPs در گیاه از SA استفاده شد. همانطور که پژوهشهای قبلی نشان دادند، هنگامیکه SA در غلظت و زمان مناسب بهکار برده شود با تغییر فعالیت آنزیمهایی نظیرSOD ، CAT، APX و POD یا NAD(P)H اکسیداز متصل به غشای سیتوپلاسمی (آنزیمهای دخیل در تولید یا تجزیهH2O2 ) موجب افزایش موقت و جزیی در مقدار H2O2 (بهعنوان پیامبر ثانویه) شده که منجر به القای ظرفیت آنتیاکسیدانی سلول میشود (Horváth et al., 2007؛ Hayat et al., 2007). در پژوهش حاضر مشاهده شد تیمار SA در بالاترین غلظت همراه با 200 میلیگرم بر لیترMNPs سبب افزایش فعالیت آنزیمهای CAT و APXشد، در مقابل تأثیر معنیداری بر فعالیت SOD نداشت.
نتایج ما نشان دادند ترپنها با طیف وسیعی از کاربردهای صنعتی و دارویی، ترکیبات اصلی اسانس گیاهچهها استبرق را تشکیل داده و MNPs و SA بهویژه تأثیر متقابل آنها محرکهای قوی برای القا آنها هستند. تغییر در متابولیتهای ثانویه و محتویات اسانس میتواند به علّت تولید ROS، فعال شدن آنزیمهای آنتیاکسیدانی و تنظیم یا تحریک بیان ژنهای خاص در مسیر بیوسنتزی آنها باشد و نشانهنده سازوکار تطبیقی دیگری برای از بین بردن ROS تولید شده تحت تیمار غیرزیستی هستند. گزارشهای قبلی نشان داد که افزایش مشاهدهشده در غلظت ترپنها تحت تیمارهای غیرزیستی با تخصیص اسکلت کربن بین رشد و دفاع همبستگی دارد، در حقیقت در این شرایط، گیاه کربن کمتری را صرف رشد کرده و بخش بیشتر آن را به ساخت ترپنها، هیدروکربنهای موجود در اسانس، اختصاص میدهد (Turtola et al., 2003). پژوهش Dubey و همکاران (2003) نیز نشان داد افزایش قندهای محلول، مهمترین محصول مستقیم فتوسنتز، در بیوسنتز اسانس مورد استفاده قرار میگیرد که منجر به افزایش تولید اسانس میشود و با یافتههای ما همخوانی داشت. براساس پژوهشهای قبلی در مورد پتانسیل Fe-NPs و SA در افزایش رنگدانههای فتوسنتزی (Mozafari et al., 2018)، پیشنهاد میشود هر دو تیمار با افزایش فرآیندهای فتوسنتز و متعاقب آن افزایش محتوای کربوهیدرات ممکن است سبب افزایش تولید متابولیتهای ثانویه شوند. احتمالاً برای ایجاد تعادل کربوهیدرات بین منبع و مخزن، گیاه کربوهیدراتهای اضافی را به سمت تولید این متابولیتها سوق داده است. یافتههای پژوهش ما نیز نشان دادند محتوای قند محلول در برگها بهطور قابل توجهی با شدت MNPs و SA افزایش نشان داد و بیانگر این است که افزایش قند محلول ممکن است مسئول افزایش تولید اسانس باشد. این نتایج با یافتههای Ghasemzadeh و همکاران (2010) وGuo و همکاران (2011) همخوانی دارد.
جمعبندی
بهطور کلی، نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد نانوذره سوپرپارامغناطیس اکسید آهن سنتز شده تا غلظت 200 میلیگرم بر لیتر نهتنها سبب تنش اکسیداتیو در گیاه استبرق نشد، بلکه بهعنوان یک الیسیتور مؤثر ضمن تأمین آهن مورد نیاز گیاه و افزایش محتویات کلروفیل و کارتنوئید، جذب عناصر غذایی و کاهش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی با فعالیت شبهپراکسیدازی خود، موجب افزایش معنیدار صفات کمی و کیفی استبرق از جمله افزایش متابولیتهای دارویی شد. با وجود این، تأثیر متقابل نانوذرات اکسید آهن و سالیسیلیک اسید در افزایش زیست توده، محتویات کلروفیل، قندهای محلول، مواد مغذی، متابولیتهای ثانویه و اجزای اسانس و کاهش محتوای H2O2 و MDA در گیاهچههای تیمار شده چشمگیرتر بود.
سپاسگزاری
نویسندگان مقاله از همکاری و مساعدت دانشکده علوم دانشگاه شهید باهنر کرمان و همه عزیزانی که در این پژوهش یاری نموده اند، سپاسگزاری می نمایند.
)