Studying the expression of some candidate MicroRNAs in Petunia under drought stress

Document Type : Original Article

Authors

1 Department of Biotechnology and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran

2 Department of Horticultural Plants Biotechnology, Iranian Academic for Education, Culture and Research (ACECR), Khorasan Razavi Province, Mashhad, Iran

Abstract

Small non-coding RNAs known as microRNAs are essential for responding to biotic and abiotic stresses. A few microRNAs that exhibited varied expressions in the face of drought stress are miR393, miR159, miR169, and miR319. This study examined how these four microRNAs helped petunia deal with drought stress. A 50% drought stress was applied to the petunia plants in the 4 to 6-leave stage, and RNA was isolated from both stressed and control plants. The expression level of microRNAs was examined using the qRT-PCR method under two conditions: control and stress. The data obtained indicated that the expression level of miR319 remained unchanged, while miR393 showed a decrease in expression, and miR169 and miR159 showed increases of 4 and 6.5-fold, respectively.
 Introduction
The world is getting warmer, there is less rainfall, and other factors have changed the weather, making it riskier for plants to grow and thrive. It is anticipated that drought will become a more pressing issue in the ensuing decades. Drought is a significant issue that impacts the physiological, biochemical, and molecular processes of plants. In addition to negatively affecting stomatal motions, nutrient absorption, and the synthesis of photosynthetic chemicals, this stress negatively impacts the plant's metabolism and ultimately results in a drop in yield. Like other plant activities, a plant's reaction to stress depends on the proper control of gene expression, which is accomplished by a variety of processes. The alteration of gene expression by post-transcriptional regulation at various developmental stages is one of the most significant of them. Sometimes the activity of short RNAs or microRNAs changes the expression of a gene. These small RNAs play a crucial role in the body's reaction to biotic and abiotic stresses. Certain miRNAs are overexpressed or reduced in response to environmental stresses to help plants deal with the stress. Among the microRNAs that exhibited varied expressions under drought stress are miR393, miR159, miR169, and miR319. Petunia hybrida, the scientific name for this plant, belongs to the Solanaceae family, which is commonly utilized to create greenery in urban areas. Because drought stress is one of the most significant abiotic stresses and green space is essential to human existence, this study intends to explore the function of microRNAs 159, 319, 169, and 393 in response to drought stress in petunia.
Materials and methods
An Iranian cultivar of petunia hybrida was employed in this experiment. Three generations of the same seeds were self-pollinated. After being sanitized in a 1.5% sodium hypochlorite solution, the petunia plant's seeds were cleaned with sterile distilled water. The seeds were cultured on a culture tray with cleaned peat moss following disinfection. It was moved to the culture chamber, which had a temperature of 25 °C, 16 h of light, and 8 h of darkness. The plant grew to the stage of 4-6 leaves about 4-6 weeks after planting. Based on the Field Capacity (FC), a 50% stress treatment was applied during this stage for 48 h.  To extract total RNA, leaf tissue samples from the stressed plant and the control plant were collected independently. For both the control and stressed samples, total RNA extraction was carried out using the RiboEx RNA extraction solution according to the manufacturer's instructions. The methods of Varkoni et al. (2007) and Chen et al. (2005) were used to develop primers. Following primer design, cDNA was produced using Addbio's reverse transcription enzyme and stem-loop PCR. Then, using BioRad equipment, the real-time SYBER Green PCR method was used to examine the expression level of microRNAs under 50% drought stress and in two standard circumstances. Using the CYP gene as an internal control gene and the specific primers for each microRNA, the PCR reaction was carried out using the prepared cDNAs as templates. Using the 2-ΔΔCT method, the quantitative expression values of genes were determined. Catalase enzyme activity was also tested. Analysis of variance was performed using JMP statistical software version 8 and the mean of treatments was compared using LSD test at the level of 5%.
Results and discussion
After extracting the RNA from two samples under both stress and control, an agarose gel and spectrophotometry tests revealed that the isolated RNA was of good quality. Consequently, it was evident that the two bands, which corresponded to the 28s and 18s ribosomal RNA, were sharp. Additionally, the extracted samples' absorption numbers at the 280/260 wavelength ranged from 1.85-2, demonstrating the high quality of the extracted RNAs. The isolated RNAs were converted into cDNA. PCR was used to confirm the synthesized cDNAs. Next, they underwent qRT-PCR analysis using primers that were specifically created for them. According to the study's findings, the expression level of microRNA 319 is 50% lower during drought stress than it is under normal condition, essentially remaining the same. Reduced expression of microRNA 393 was observed during drought stress. On the other hand, when the petunia plant is stressed by drought, the expression levels of microRNAs 169 and 159 have increased. Following a 48 h 50% drought stress treatment, the petunia plant had a nearly 4-fold rise in microRNA 169 expression and a 6.5-fold increase in microRNA 159 expression. The obtained data indicated that, of the four microRNAs discussed, miR159 has the highest level of expression, compared to the control state. These findings support the critical and significant role of miR159 in the petunia plant during drought stress.
Conclusion
This study's findings demonstrated that elevating microRNA159 expression in petunia  plants improves the plant's resistance to drought stress. The impact that this miR has on the MYB101 and MYB33 proteins is what causes this elevated tolerance. MYBs involved in cell division, morphological regulation, disease resistance, stress response, and the secondary biosynthesis pathway. They most likely fulfill their function in response to stresses including cold, salinity, and drought by altering the hormones auxin and abscisic acid.

Keywords

Main Subjects

Full Text

با توجه به تغییرات شرایط آب و هوایی، گرم شدن زمین و کاهش بارندگی­ها، شرایط برای رشد و توسعه گیاهان دشوار شده است. تنش خشکی می تواند بر بقا، رشد و توسعه گیاه تأثیر بسزایی داشته باشد که نتیجه آن کاهش درکیفیت، عملکرد و تولید زیست توده گیاهی است(Mittler, 2006; Wang et al., 2003). خشکی مسئله ای مهم است که بر روند فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی گیاهان تأثیر می‌گذارد و پیش بینی می­شود در دهه های آینده به مشکل بزرگتری تبدیل شود. این تنش تأثیر زیان باری بر روند متابولیسم گیاه دارد و بر حرکات روزنه، جذب مواد مغذی و تولید ترکیبات فتوسنتزی اثر منفی گذاشته و در نهایت سبب کاهش محصول می شود (Neumann, 2008; Shinozaki et al., 2003 Jaleel et al.,2009;). پاسخ گیاهان در مواجه با تنش همانند سایر فعالیت های گیاه، نیازمند تنظیم صحیح بیان ژن ها است و این فرآیند با سازوکار های مختلفی تنظیم می­شود. یکی از مهمترین آنها، تغییر بیان ژن ها با تنظیم پس از رونویسی در مراحل مختلف نموی است (Fernandez, 2014; Mathur et al., 2014; Suzuki et al., 2014; Zhu, 2002). همچنین تغییر بیان ژن­ها با فعالیت RNA های کوچک یا همان microRNA ها انجام می­شود. miRNAها،RNA  های کوچک غیرکدکننده هستند که به­عنوان مهمترین تنظیم کننده بیان ژن های کد کننده پروتئین مطرح هستند. miRNA ها برای اولین بار در سال 1993در نماتد Caenorhabditis elegans کشف شدند (Lee, 1993). این RNA های کوچک، اجزای مهمی در پاسخ به تنش های زیستی و غیر زیستی هستند (Khraiwesh, 2012). تنش های محیطی منجر به کاهش بیان یا بیش بیان برخی از miRNA ها برای مقابله با تنش در گیاهان می شوند. از جمله microRNA هایی که تحت تأثیر تنش خشکی بیان متغیری را نشان داده اند می توان به miR393، miR159، miR169 و miR319 اشاره کرد (Abe et al., 2003 Liu et al., 2008; Reyes et al., 2007; Liu et al., 2007; Sunkar et al., 2004;). miR393 نقش کلیدی درتنظیم ژن های F-box تحت تأثیر شرایط تنش خشکی در بسیاری از گونه‌های گیاهی از جمله در آرابیدوپسیس (Arabidopsis thaliana)، برنج(Oryza sativa)، یونجه (Medicago sativa) و نیشکر(Saccharum officinarum) دارد (Ferreira et al., 2012). miR393  تحت تأثیر تنش خشکی در اکثر گونه‌های گیاهی بیش بیان می شود و به سایر تنش‌ها مانند شوری، درجه حرارت پائین و سمیّت آلومینیوم نیز واکنش نشان می دهد (Sunkar & Zhu, 2004 Trindade et al., 2010; Arenas-Huertero et al., 2009; Liu et al., 2008; Zhao et al., 2007;). miR319 و miR159 توالی های بسیار مشابهی دارند، امّا ژن های متفاوتی را در موجودات زنده تنظیم می‌کنند. اغلب آن­ها را در یک گروه دسته بندی می‌کنند و یا برخی آنان را به­صورت جداگانه قرار می‌دهند. در حال حاضر هر دو مورد پذیرفته شده است (Meyers et al., 2008). ژن های هدفmiRNA ها اصولاً فاکتورهای رونویسی هستند. ژن هدف miR319 خانواده TCP و ژن هدف miR159، MYB101 و MYB33 و ژن هدفmiR393  خانواده TIR1 و ژن هدف miR169 خانواده NFYA هستند (Liu et al., 2008; Reyes et al., 2007; Sunkar & Zh., 2004).

پروتئین های MYB در واقع کلاس متنوعی از پروتئین­های متصل شونده به DNA هستند که در تنظیم رونویسی ژن­های گیاهی مسئول پاسخ به تنش‌های محیطی شامل سرما، شوری و خشکی نقش‌دارند. از ویژگی های این خانواده داشتن دومین حفاظت شده اتصال به DNA یعنی دومین MYB است(Du et al., 2009; Gantet, 2002). این دومین دارای ساختارHelix-Turn-Helix  بوده و در شیار بزرگ DNA قرار می گیرد. ژن هدف miR393 خانواده TIR1 است که بعنوان گیرنده­ی اکسین عمل می کنند و نقش تنظیمی مثبتی در مسیر پیام­رسانی اکسین دارند (Ferreira et al., 2012) و در پاسخ به تنش هایی مانند خشکی بیان می شود. خانواده NFYA رمز کننده زیر واحد فاکتور رونویسیY(NF-Y) در هسته است. پروتئین (NF-Y) فاکتور رونویسی ویژه ای است و نقش کلیدی در پاسخ به تنش های محیطی و نمو گیاه دارد (Liu et al., 2008).

گیاه اطلسی با نام علمی Petunia hybrida از خانواده سولاناسه است که در فضای سبز شهری کاربرد زیادی دارد (Ghahraman, 1994). این گیاه نسبتاً دارای رشد سریع با ساقه های منشعب به بلندی و گستردگی ۳۰ سانتی متر است و به صورت گیاه یکساله نگهداری می شود. اطلسی از گیاهان بومی آمریکای جنوبی است و نوع بومی آن در ایران هر چند با گلبرگ کمتر، اما با عطر بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد. گل اطلسی، شیپوری شکل و مخملی است که به صورت کم پَر یا پُر پَر و بیشتر به رنگ های سفید، قرمز، بنفش، و یا دو رنگ دیده می شود (Ghasemi, 2010).

با توجه به اهمیت تنش خشکی به عنوان یکی از مهمترین تنش های غیر زیستی و همچنین با توجه به نقش فضای سبز و اهمیت آن در زندگی بشر، این پژوهش برای بررسی نقش میکروRNA های 159، 319، 169و 393 در پاسخ به تنش خشکی در گیاه اطلسی است.

 مواد و روش ها

مواد گیاهی

در این آزمایش از بذر اطلسی (Petunia hybrida) رقم ایرانی استفاده شد. در پژوهش حاضر، لازم است از بذور خالص استفاده شود، برای همین بذرها تا 3 نسل خودگشن شدند و سپس از بذور 3 نسل خودگشن شده جهت ادامه پژوهش استفاده شد. بذر گیاه اطلسی به مدّت 10 دقیقه در محلول 5/1 درصد هیپوکلریت سدیم، ضدعفونی و سپس سه مرتبه با آب مقطر استریل شستشو داده شد. بذور پس از ضدعفونی در سینی کشت حاوی پیت ماس شسته شده کشت داده شد. سپس سینی کشت به اتاق کشت با شرایط دمایی 25درجه سانتی­گراد و 16 ساعت نور، 8 ساعت تاریکی و شدت نور 40 کیلو لوکس منتقل شد. پس از جوانه زدن بذرها، به صورت روز در میان از کود 20:20 جهت رشد بهتر استفاده شد. حدود 6-4  هفته پس از کشت، رشد گیاه به مرحله 4 تا 6 برگی رسید. در این مرحله تیمار تنش50 درصد بر اساس ظرفیت زراعی مزرعه (FC) به مدّت 48 ساعت استفاده شد. از بافت برگ گیاه تحت تنش و گیاه شاهد به صورت مجزا برای استخراج RNAی کل، نمونه‌برداری انجام شد.

استخراج RNA کل و تعیین کیفیت و کمیت RNA

استخراج RNA کل با محلول استخراج RNA، RiboEx از شرکت GeneAll برای هر دو نمونه شاهد و تحت تنش بر اساس دستورالعمل شرکت انجام شد. سپس بررسی کمیّت و کیفیت RNAی استخراجی با الکتروفورز (ژل 5/1درصد) و دستگاه نانو دراپ شرکت BIORAD انجام شد. پس از تأیید کیفیت و کمیّت RNAی استخراج شده و مشاهده باندهای RNA ریبوزومی 28S و18S و همچنین باندهای مربوط به RNA با وزن مولکولی کم، ویال ها به فریزر ˚c80- منتقل شدند.

 طراحی آغازگرها

miRNA ها توالی های کوتاه 24 –20 نوکلئوتیدی هستند که شناسایی آن ها با آغازگرهای معمولی امکان پذیر نیست. برای شناسایی آن ها از ساختاری بنام  ساقه- حلقه (stem-loop)  استفاده شد. بر همین اساس آغازگرها با روش Chen و همکاران (2005) و  Varkonyi-Gasicو همکاران (2007) طراحی شدند (جدول1). ویژگی این آغازگرها مربوط به شش نوکلئوتید آخر واقع در انتهای َ3 توالی است. این شش نوکلئوتید مکمل وارون توالی انتهایی سر '3 miRNA ها هستند. به غیر از این شش نوکلئوتید اختصاصی بقیه توالی، توالی عمومی هستند که برای همه miRNA ها یکسان است. جهت بررسی و صحت بیان RNA ها از ژن کنترل داخلی CYP استفاده شد. آغازگرها، توسط شرکت سیناژن سنتز شدند (جدول1).

جدول1- توالی آغازگرهای مورد استفاده در این پژوهش

Table 1- Sequence of primers used in this research

توالی

 

UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA

miR 159

GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG AC TAGAGC

miR159-RT stem-loop

CGGCCGTTTGGATTGAAGGGA

miR159 Forward primer

CAGCCAAGGAUGACUUGCCGA

miR 169

GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG AC TCGGCA

miR169-RT stem-loop

CCGGGCCAGCCAAGGATGACT

miR169 Forward primer

UUGGACUGAAGGGAGCUCCCU

miR 319

GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG AC AGGGAG

miR319-RT stem-loop

CCGGCG TTGGACTGAAGGGAG

miR319 Forward primer

UCCAAAGGGAUCGCAUUGAUCC

miR 393

GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG AC GGATCA

miR393-RT stem-loop

GCGCGC TCCAAAGGGATCGCAT

miR393 Forward primer

GTGCAGGGTCCGAGGT

Reverse primer

AGGCTCATCATTCCACCGTGT

CYP Forward

TCATCTGCGAACTTAGCACCG

CYP Reverse

پس از طراحی آغازگرها، از روش PCR ساقه–حلقه و آنزیم رونوشت برداری معکوس ساخت شرکت Addbio، جهت سنتز cDNA استفاده شد. در این روش در میکروتیوب شماره 1، MixI را که شامل (1 میکرولیتر از dNTP به همراه 1 میکرولیتر آغازگر RT ، 0.2 میکرولیتر آغازگر CYP R و H2O) است تهیه شد. میکروتیوب در دمای 65 درجه سانتی­گراد به مدّت 5 دقیقه قرار داده شده و سپس بلافاصله به مدّت 2 دقیقه بر روی یخ قرار گرفت. در این فاصله MixII  که شامل (10 میکرولیتر بافر، 1 میکرولیتر آنزیم، 1 میکرولیتر RNA با غلظت 500 نانوگرم ) است آماده و به MixI اضافه شد. حجم نهایی واکنش20 میکرولیتر در نظر گرفته شد. جهت ساخت cDNA برنامه حرارتی 16 درجه سانتی­گراد به مدّت 30 دقیقه در یک سیکل، 30 درجه سانتی­گراد به مدّت 30 ثانیه، 42 درجه سانتی­گراد به مدّت 30 ثانیه، 50 درجه سانتی­گراد به مدّت 10 ثانیه در 60 چرخه و 85 درجه سانتی­گراد به مدّت 5 دقیقه انجام شد. cDNA های سنتز شده جهت بررسی میزان بیان microRNA ها با روش qRT-PCR استفاده شدند.

 بررسی میزان بیان microRNA ها با روش qRT-PCR

در این روش جهت بررسی میزان بیان microRNA ها در دو حالت استاندارد و تحت تنش خشکی 50% از روش Real time SYBER Green PCR با دستگاه BioRad استفاده شد. cDNA های ساخته شده به­عنوان الگو استفاده شدند و واکنش PCR با آغازگرهای اختصاصی هر microRNA و ژن SYB به­عنوان ژن کنترل داخلی انجام شد. برای هر واکنش 3 تکرار تکنیکی و 2 تکرار زیستی در نظر گرفته شد. واکنش qRT-PCR برای هر واکنش شامل: 2 میکرولیتر cDNA، 1 میکرولیتر آغازگر رفت، 1 میکرولیتر آغازگر برگشت، 6 میکرولیتر آب مقطر استریل فاقد RNase و 10 میکرولیتر مستر ریل تایم شرکت Amplicon است که در حجم 20 میکرولیتر در چاهک های پلیت مخصوص دستگاه لود شدند. واکنش زنجیره ای پلی مراز با شرایط یک تکرار به مدّت30 دقیقه با دمای 16 درجه سانتی­گراد، 35 تکرار با چرخه های30 ثانیه با دمای 30 درجه سانتی­گراد، 30 ثانیه با دمای 42 درجه سانتی‌گراد،10 ثانیه با دمای 50 درجه سانتی­گراد انجام شد. مقادیر بیان کمّی ژن ها با روش CTΔΔ- 2 محاسبه شدند. مقایسه بین دو نمونه شاهد و تحت تنش با نرم افزار jmp بررسی شد و بدین صورت مقایسه بین میزان بیان کمّی هر microRNA با سایر microRNA ها، تحت تنش خشکی و استاندارد و ژن کنترل با معنی داری در سطح 1% انجام شد.

 استخراج آنزیم‌ آنتی‌اکسیدانی- کاتالاز

در شرایط تنش در داخل گیاه، رادیکال های آزاد اکسیژن تولید می شوند. این رادیکال ها برای سلول های گیاهی خطرناک هستند، در نتیجه گیاه به دنبال فعال کردن سیستم های دفاعی برای حذف این رادیکال ها هستند. از جمله این سیستم های دفاعی، تولید آنتی اکسیدان هایی مانند کاتالاز است. این آنتی اکسیدان در شرایط تنش خشکی، در پاسخ بیوشیمیایی گیاه فعال می شود(Yang et al., 2014).

جهت استخراج آنزیم کاتالاز، 50 میلی گرم از نمونه برگ تازه و 50 میلی گرم از نمونه ریشه تازه به طور مجزا در ازت مایع پودر شدند. سپس یک میلی‌لیتر از بافر فسفات پتاسیم 1/0 مولار با 7=pH حاوی EDTA یک میلی‌مولار به نمونه ها اضافه شد. سپس نمونه ها به مدّت 20 دقیقه توسط سانتریفیوژ یخچال دار با سرعت g 12000 و دمای 4 درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ شدند و فرآیند جداسازی انجام شد. مایع شفاف داخل میکروتیوپ‌ها که حاوی عصاره آنزیمی بود برای سنجش میزان فعالیت آنزیم کاتالاز استفاده شد (Sairam et al., 2002).

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز

برای تعیین مقدار فعالیت آنزیم کاتالاز موجود در عصاره آنزیمی از روش Velikova و همکاران (2000) استفاده شد. بدین ترتیب 1/0 میلی لیتر عصاره آنزیمی به 20 میکرولیتر H2O2 افزوده و سپس حجم محلول با محلول 10 میلی‌مولار فسفات پتاسیم با  7=pH به 2 میلی لیتر رسانده شد. واکنش آنزیم کاتالاز با افزودن عصاره آنزیمی به مخلوط بالا آغاز شد. سپس جذب ترکیب حاصل در طول موج 240 نانومتر در مدّت 3 دقیقه هر30 ثانیه یک‌بار، با دستگاه نانودراپ اندازه‌گیری شد. هر یک واحد فعالیت آنزیم کاتالاز برابر با تغییر 01/0 در جذب نمونه ها در یک دقیقه است. سپس میزان فعالیت آنزیم کاتالاز برحسب میزان آنزیم موردنیاز برای تجزیه یک میکرومول سوبسترای پراکسید هیدروژن در یک دقیقه محاسبه شد.

نتایج و بحث

استخراج RNA های دو نمونه تحت تأثیر تنش و شاهد انجام شد و کیفیت RNA ی استخراج شده پس از بررسی بر روی ژل آگارز و اسپکتروفتومتری مطلوب بود. به­طوری که 2 باند مربوط به rRNA ریبوزومی 28s و 18s به خوبی قابل رویت بود و نشان از سالم بودن RNA داشت. همچنین اعداد جذب نمونه های استخراج شده در طول موج 280//260 برابر با 94/1 بود که عددی بین 2 - 85/1 است و بالا بودن کیفیت مناسب و مطلوب RNA های استخراجی را نشان داد (شکل شماره 1). از RNA های استخراجی طبق روش گفته شده، سنتز cDNA صورت گرفت. cDNA های سنتز شده با PCR معمولی تأئید شد. سپس با آغازگرهای اختصاصی طراحی شده، مورد آنالیز qRT-PCR قرار شدند. شکل شماره 2 نتایج بدست آمده از این واکنش را نشان می دهد.

                                                                                        

شکل 1- نتایج استخراج RNA. چاهک 1،ladder ، چاهک 2 تا 9 نمونه های استخراج RNA

Figure 1- RNA extraction results. 1, ladder 2 to 9 RNA extraction samples

 

شکل 2- نتایج سنتز cDNA، چاهک 1 Ladder، چاهک 3 تا 7 نتایج سنتز cDNA

Figure 2- cDNA synthesis results, ladder 1, 3 to 7 cDNA synthesis results

نتایج با تغییرات نورفلورسنت و به صورت منحنی در هر سیکل تکثیری قابل مشاهده است. به طوری که هرچه میزان تکثیر بیشتر باشد، به همان اندازه میزان نور فلورسنت ساطع شده نیز بیشتر خواهد شد. نتایج پژوهش نشان داد میزان بیان 319 microRNA تحت تأثیر شرایط تنش خشکی 50% نسبت به شرایط نرمال تقریباً بدون تغییر است. 393microRNA تحت تنش خشکی کاهش بیان را نشان داد، امّا میزان بیان microRNA های 169 و 159در برگ­های گیاه اطلسی تحت تنش خشکی روند افزایشی داشتند. گیاه اطلسی پس از 48 ساعت تیمار تنش خشکی 50% افزایش تقریباً 4 برابری در میزان بیان microRNA169 و افزایش5/6 برابری در میزان بیان microRNA159 از خود نشان داد. بر اساس نتایج به دست آمده در بین 4 microRNA مطرح شده، miR159 بیشترین میزان بیان را نسبت به حالت کنترل نشان داد که این نتایج نشانگر عملکرد حیاتی و بالایmiR159  در گیاه اطلسی در شرایط تنش خشکی است (شکل شماره 3).

 

شکل 3- مقایسه میزان بیان MicroRNA ها

Figure 3- Comparison of MicroRNA expression levels

تأثیر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز

بررسی تغییرات آنزیم کاتالاز در طول اعمال تنش خشکی نشان داد با افزایش میزان تنش، فعالیت آنزیم کاتالاز افزایش یافت. به طوری که بیشترین میزان بیان را در روز پنجم بعد از اعمال تنش خشکی از خود نشان داد (شکل شماره 4). پژوهش‌های انجام شده نشان دادند فعالیت آنزیم کاتالاز در زمان تنش خشکی در گیاهان مختلف افزایش می یابد(Khodabin et al., 2020; Kazerani et al., 2019). افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز سبب افزایش مقاومت گیاه در برابر آسیب های اکسیداتیو و به عبارتی به افزایش سیستم دفاعی گیاه منجر می شود (Hafez et al., 2012).

شکل 4- میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در برگ گیاه تحت تنش خشکی 50% ظرفیت زراعی. اعداد با حروف مشترک دارای اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با آزمون LSD نیست.

Figure 4- The amount of catalase enzyme activity in plant leaves under drought stress of 50%  of field capacity. Numbers with same letters do not have a significant difference at the 5% level using the LSD test.

بیش از این در پژوهش­های زیادی ارتباط مستقیم بین میکروRNA ها و پاسخ به تنش های محیطی شناخته شده است. همان طور که گفته شد، یکی از راه­های پاسخ گیاه به تنش، تنظیم بیان ژن هاست که این تنظیم بیان به کمک microRNA ها انجام می­شود. در طی این فرآیند در زمان تنش، microRNA ها با تغییر در میزان بیان خود، میزان تولید پروتئین های هدف خود را نیز تنظیم می کنند و بدین گونه می توانند در گیاه مقاومت و یا حساسیت به تنش را ایجاد کنند.

در آرابیدوپسیس در زمان تنش خشکی و تحت تیمار ABA، میزان بیان miR169 کاهش یافته و در نتیجه سبب افزایش بیان فاکتور رونویسی NFYA5 شده که این فرآیند همراه با تغییر فنوتیپ در گیاه جهت مقاومت به تنش خشکی است (Ding et al., 2009). همچنین در آرابیدوپسیس ترانسژن با افزایش بیان ژن NFYA5 مشاهده شده که میزان آب از دست رفته از برگ ها به نسبت کاهش یافته و تحمّل به تنش خشکی بیشتر شده بود(Zhang et al., 2011). در نتیجه طبق یافته­ها در گیاه آرابیدوپسیس در هر دو حالت، بیش بیانی miR169 و یا سرکوب nfya5، افزایش حساسیت به تنش خشکی و از دست رفتن بیشتر آب مشاهده شد(Liu et al., 2008). در گیاه یونجه تحت تنش خشکی کاهش بیانmiR169  مشاهده شد که حاصل آن ایجاد تحمّل در گیاه یونجه است. افزایش بیان miR169 به انسداد رشد و نمو گره ها در گیاه منجر شده است که این افزایش بیان سبب می شود سطح mRNAی ژن MtHAP، که در تمایز سلول های گره نقش دارد، کاهش یابد (Combier et al., 2006). در گوجه فرنگی ترانسژن با افزایش بیان miR169 و تأثیر بر فعالیت ژن های موثر بر باز و بسته شدن روزنه ها، تحمّل به تنش خشکی افزایش داشت(Zhang et al., 2011). در خیار بوته ای نیز تحت تنش خشکی بیش بیانmiR169  مشاهده شد که بر خلاف آرابیدوپسیس سبب افزایش تحمّل به تنش خشکی شده است. در آرابیدوپسیس در تنش خشکی کاهش بیان miR169 و افزایش بیان NFYA5 و تحمّل به تنش خشکی مشاهده شده است، امّا در خیار بوته ای تحت تنش خشکی، افزایش بیان miR169 و کاهش بیان NFYA در ساقه و ریشه دیده شد که تحمّل به تنش خشکی ایجاد می شود. تحت تنش خشکی کاهش بیان miR169 در آرابیدوپسیس، P. persica و P. virgatum و یونجه مشاهده شد (Liu et al., 2008). از سوی دیگر، miR169در برنج، سویا و گوجه فرنگی تحت تنش خشکی بیشتر بیان می شود(Zhou et al., 2010). همچنین در میزان بیانmiR159  تحت تنش خشکی در گیاه هلو تغییرات ناچیزی دیده شد، امّا در گیاه بادام تحت شرایط تنش شدید خشکی کاهش بیان مشاهده شد. همچنین در هیبرید GN افزایش های 8 و 4 برابری به ترتیب در شرایط تنش ملایم و شدید از خود نشان داده است (Esmaili et al., 2015). در پژوهش­های قبل به افزایش بیان miR159 تحت تنش خشکی در گیاهانی مانند آرابیدوبسیس (Liu et al., 2008) و ذرت (Wei et al., 2009) اشاره شده است. در بعضی پژوهش­ها، کاهش بیان miR159 در گیاهانی از جمله توتون (Xie et al., 2015) و سیب زمینی (Yang et al., 2014) تحت تنش خشکی گزارش شده است. در پژوهشی تحت تنش خشکی افزایش بیان miR159 در برگ­های گیاه جو و یولاف و کاهش بیان miR159 در ریشه گیاه مطرح شده است (Zou et al., 2023; Hackenberg et al., 2015). در پژوهش حاضر، هدف این بود تا بعضی از miRNA هایی که در گیاهان دیگر به­عنوان  miRهای مقاوم به خشکی مطرح هستند بررسی شوند، تا miRی که در گیاه اطلسی تحت تنش نقش بیشتری دارد، شناسایی شود. بیان 6.5 برابری miR159 تحت تنش 50% نسبت به نمونه کنترل، مهر تأئیدی بر نقش مهم این miR در تنش خشکی است. نقش این miR در مواجهه با تنش خشکی به علّت تأثیر آن بر پروتئین های MYB101 و MYB33 است. خانواده ژنی MYB به­عنوان ابر خانواده ژنی شناخته شده­اند که یکی از بزرگترین فاکتورهای رونویسی در گیاهان هستند و دارای تنوع بالایی از نظر عملکرد و ساختمان هستند (Du et al., 2009). MYB ها درمسیر بیوسنتزی ثانویه، کنترل ریخت شناسی، تقسیم سلولی، مقاومت به بیماری ها و پاسخ به تنش ها نقش دارند. در پاسخ به تنش هایی مانند خشکی، شوری و سرما احتمالاً با تغییر هورمون اکسین و اسیدابسیزیک نقش خود را ایفا می کنند(Jianga, 2004; Paz-Ares, 1987). miR159 در سیگنال دهی هورمون­های ABA نقش مهمی دارند (Reyes & Chua, 2007).

نتیجه گیری

گیاهان در مواجه با تنش ها با تأثیر بر میزان بیان microRNA ها و نیز تأثیر بر بیان ژن های هدف می توانند واکنش های مقاومت و یا حساسیت نسبت به تنش را از خود نشان دهند. در این پژوهش تحت شرایط تنش خشکی، در میزان بیان microRNA319 تغییری مشاهده نشد، امّا میزان بیان microRNA159 و microRNA169 روند افزایشی و میزان بیان microRNA393 روند کاهشی نشان دادند که این نتایج نشان دهنده اهمیت بیشتر microRNA159 و microRNA169 در جهت افزایش مقاومت گیاه به شرایط تنش در گیاه است.

References

Abe, H., Urao, T., Ito, T., Seki, M., Shinozaki, K., & Yamaguchi-Shinozaki, K. (2003). Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling. The Plant Cell, 15, 63–78. https://doi.org/10.1105/tpc.006130
Arenas-Huertero, C., Pérez, B., Rabanal, F., Blanco-Melo, D., De la Rosa, C., Estrada-Navarrete, G., Sanchez, F., Covarrubias, A. & Reyes, J. (2009) Conserved and novel miRNAs in the legume Phaseolus vulgaris in response to stress. Plant Molecular Biology, 70, 385-401. http://dx.doi.org/10.1007/s11103-009-9480-3
 Reyes, J. L. (2009) Conserved and novel miRNAs in the legume Phaseolus vulgaris in response stress. Plant Molecular Biology, 70: 385–401. https://doi.org/10.1007/s11103-009-9480-3
Combier, J-P., Billy, F., Boualem, A., Yahyaoui, F., Moreau, S., Vernie, T., Ott, T., Gamas, P., Crespi, M., & Niebel, M. (2006). MtHAP is a key transcriptional regulator of symbiotic nodule development regulated by microRNA169 in Medicago truncatula. Genes & Development. https://doi: 10.1101/gad.402806
Du, H., Zhang, L., Liu, L., Tang, X. F., Yang, W. J., Wu, Y. M., Huang, Y. B., & Tang, Y. X. (2009) Biochemical and Molecular Characterization of Plant MYB Transcription Factor Family. Biochemistry (Moscow). 74, 1-11. https://doi.org/10.1134/S0006297909010015
Ding, Y. F., & Zhu, C. (2009) The role of microRNAs in copper and cadmium homeostasis. Biochemical   and Biophysical Research Communications. 386, 6–10. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2009.05.137
Fernandez, J-E. (2014) Understanding olive adaptation to abiotic stresses as a tool to increase cropperformance. Environmental and Experimental Botany,103, 158–179. https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2013.12.003
Jaleel, C. A., Manivannan, P., Wahid, A., Farooq, M., Somasundaram, R., & Panneerselvam R. (2009). Drought stress in plants: a review on morphological characteristics and pigments composition. International Journal of Agriculture and Biology,11, 100–105 [in Persian].
Jianga, C., Gua, J., Chopraa, S., Gua, X., & Peterson, T. (2004). Ordered origin of the typical three-Repeat Myb genes. Gene. 326, 13–22. https://doi.org/10.1016/j.gene.2003.09.049
Hackenberg, M., Gustafson, P., Langridge, P., & Shi, B. J. (2015) Differential expression of micro RNAs and other small RNAs in barley between water and drought conditions. Plant Biotechnology Journal, 13(1), 2–13. https://doi.org/10.1111/pbi.12220
Hafez, Y. M., Bacso, R., Kiraly, Z., Kunstler, A., & Kiraly, L. (2012). Up-regulation of antioxidants in tobacco by low concentrations of H2O2 suppresses necrotic disease symptoms. Biochemistry and Cell Biology, 102, 848-856. https://doi.org/10.1094/PHYTO-01-12-0012-R
Gantet, P., & Memelink, J. (2002) Transcription factors: tools to engineer the production of pharmacologically active plant metabolites. Trends in Pharmacological Sciences, 23, 563-569. https://doi.org/10.1016/S0165-6147(02)02098-9
Ghahraman, A. (1994). Plant Systematics. Volume III. Tehran. Press center of academic publishing. 306 [in Persian].
Ghasemi, G. H., & Kafi, M. (2010). Scientific and practical floriculture. Esfahan Moalef Press [in Persian].
Kazerani, B., Navabpour, S., Sabouri, H., Ramezanpour, S. S., Zaynali Nezhad, K., & Eskandari, A. (2019). Evaluation of proline content and enzymatic defense mechanism in response to drought stress in rice. Plant Physiology, 9(2), 2749-2757. https://doi.org/10.30495/ijpp.2019.664580
Khodabin, G., Tahmasebi‐Sarvestani, Z., Rad, A. H. S., & Modarres‐Sanavy, S. A. M. (2020). Effect of drought stress on certain morphological and physiological characteristics of a resistant and a sensitive canola cultivar. Chemistry and Biodiversity, 17(2), e1900399. https://doi.org/10.1002/cbdv.201900399
Khraiwesh, B., Jian-Kang, Z., & Jianhua, Z. (2012) Role of miRNAs and siRNAs in biotic and abiotic stress responses of plants. Biochimica et Biophysica Acta, 1819, 137–148. https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2011.05.001
Lee, R. C., Feinbaum, R. L., & Ambros, V. (1993). The C. elegans heterochronic gene line-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lines. Cell, 75, 843–854. https://www.cell.com/cell/pdf/0092-8674(93)90529-Y.pdf
Liu H. H., Tian, X., Li, Y. J., Wu, C. A., & Zheng, C. C. (2008). Microarray-based analysis of stress- regulated MicroRNAs in Arabidopsis thaliana. RNA, 14, 836–843. https://doi.org/10.1261/rna.895308
Liu, P. P., Montgomery, T. A., Fahlgren, N., Kasschau, K. D., Nonogaki, H., & Carrington, J. C. (2007). Repression of Auxin response factor 10 by MicroRNA160 is critical for seed germination and post germination stages. The Plant Journal, 52, 133–146. https://doi.org/10.1111/j.1365- 313X.2007.03218  Mathur, S., Agrawal, D., & Jajoo, A. (2014). Photosynthesis response to high temperature stress. Journal of Photochemistry and Photobiology Biology, 137, 116–126. https://doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2014.01.010.
Meyers, B. C., Axtell, M. J., Bartel, B., Bartel, D. P., Baulcombe, D., Bowman, J. L., Cao, X., Carrington, J. C., Chen, X., Green, P.J, Griffiths-Jones, S., Jacobsen, S. E., Mallory, A. C., Martienssen, R. A., Poethig R.S., Qi, Y., Vaucheret, H., Voinnet, O., Watanabe, Y., Weigel, D., & Zhu, J. K. (2008). Criteria for annotation of plant MicroRNAs. Plant Cell, 20, 3186–3190. https://doi.org/10.1105/tpc.108.064311.
Mittler, R. (2006). Abiotic stress, the field environment and stress combination. Trends in Plant Science,11, 15–19. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2005.11.002
Neumann, P. M. (2008). Coping mechanisms for crop plants in drought prone environments. Annals of Botany, 101, 901–907. https://doi.org/10.1093/aob/mcn018
Paz-Ares, J., Ghosal, D., Wienand, U., Peterson, P., & Saedler, H. (1987). The regulatory c1 locus of Zeamays oncogene products and with structural similarities to transcriptional activators. Embo Journal, 3553–3558. https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1987.tb02684.x
Reyes, J. L., & Chua, N. H. (2007) ABA induction of miR159 controls transcript levels of two MYB factors during Arabidopsis seed germination. Plant Journal, 49, 592–606. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2006.02980.x
Sairam, R. K., Rao, K. V., & Srivastava, G. C. (2002) Differential response of wheat genotypes to longter salinity stress in relation to oxidative stress, antioxidant activity and osmolyte concentration. Plant Science, 163, 1037–1046. https://doi.org/10.1016/S0168-9452(02)00278-9
Shinozaki, K., Yamaguchi-Shinozaki, K., & Seki, M. (2003). Regulatory network of gene expression in the drought and cold stress responses. Current Opinion in Plant Biology, 6, 410–417. https://doi.org/10.1016/S1369-5266(03)00092-X.
Sunkar, R., & Zhu, J. K. (2004). Novel and stress‐regulated MicroRNAs and other small RNAs from Arabidopsis. Plant Cell, 16, 2001–2019. https://doi.org/10.1105/tpc.104.022830
Trindade, I., Capito, C., Dalmay, T., Fevereiro, M., & Santos, D. M. (2010). miR398 and miR408 are up-regulated in response to water deficit in Medicago truncatula. Planta: An International Journal of Plant Biology; Heidelberg, 231(3), 705-16. https://doi: 10.1007/s00425-009-1078-0
regulated in response to water deficit in Medicago truncatula. Planta, 231, 705–716. https://doi.org/10.1007/s00425-009-1078-0
Velikova, V., Yordanov, I., & Edreva, A. (2000). Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants: protective roles of exogenous polyamines. Plant Science, 151, 59-66. https://doi.org/10.1016/S0168-9452(99)00197-1
Wang, W., Vinocur, B., & Altman, A. (2003). Plant responses to drought, salinity and extreme temperatures: towards genetic engineering for stress tolerance. Planta, 218, 1–14. https://doi.org/10.1007/s00425-003-1105-5
Wei, L., Zhang, D., Xiang, F., & Zhang, Z. (2009). Differentially expressed miRNAs potentially involved in the regulation of defense mechanism to drought stress in maize seedlings. International Journal of Plant Science, 170, 979-989.Xie, F., Wang, Q., Sun. R., & Zhang, B. (2015). Deep sequencing reveals important roles of MicroRNAs in response to drought and salinity stress in cotton. Journal of Experimental Botany, 66, 789-804. https://doi.org/10.1093/jxb/eru437.
Yang, J., Zhang, N., Mi, X., Wu, L., Ma, R., Zhu, X., Yao, L., & Jin, X. (2014). Identification of miR159s and their target genes and expression analysis under drought stress in potato. Computational Biology Chemist, 53, 204-213. https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem. 2014.09.009
Zhang, X., Zou, Z., Gong, P., Zhang, J., Ziaf, K., Li, H., Xiao, F., & Ye, Z. (2011) Over-expression of microRNA169 confers enhanced drought tolerance to tomato. Biotechnology Letters, 33, 403–409. https://doi.org/10.1007/s10529-010-0436-0
Zhao, B., Liang, R., Ge, L., Li, W., Xiao, H., Lin, H., Ruan, K., & Jin, Y. (2007). Identification of drought-induced MicroRNAs in rice. Biochemical and Biophysical Research Communications, 354, 585–590. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2007.01.022
Zhou, L., Liu, Y., Liu, Z., Kong, D., Duan, M., & Luo, L. (2010). Genome-wide identification and analysis of drought-responsive microRNAs in Oryza sativa. Journal of Experimental Botany, 61, 4157–4168. https://doi.org/10.1093/jxb/erq237
Zhu, J. K. (2002). Salt and drought stress signal transduction in plants. Annual Review of Plant Biology, 53, 247. https://doi.org/10.1146/annurev.arplant.53.091401.143329
Zou, C., Guo, Zh., Zhao, S. H., & Chen, J. (2023). Identification and prediction of functions for drought-responsive microRNAs in sugar beet (Beta vulgaris). Crop and Pasture Science, 74(12), 1180-1192. zhttps://doi.org/10.1071/CP22359
Journal of Plant Biological Sciences
Volume 15, Issue 2 - Serial Number 56
September 2023
Pages 85-96

Files

History

  • Receive Date: 12 December 2023
  • Revise Date: 02 May 2024
  • Accept Date: 11 May 2024

Share

How to cite

Statistics