Bioremediation of acid blue 113 dye by Spirulina platensis blue-green microalga under sucrose treatment and absence of C and N mineral sources

Document Type : Original Article

Authors

Department of Biology, Faculty of Science, Lorestan University, Khoramabad, Iran

Abstract

The ability of microalga Spirulina platensis in bioremediation diazo acid blue 113 dye (50 mg L-1) was investigated under photoautotrophic and heterotrophic conditions (with or without sucrose, 1 g L-1). Remove of mineral carbon and nitrogen sources was designed in order to encourage the microalgal cells for biodegradation of dye and using it as a nutrient source. The highest amount of decolorization during 10 days was observed by 92.3% at heterotrophic condition, in the presence of sucrose but the absence of carbon and nitrogen sources. Removal of carbon and nitrogen in photoautotrophic condition stimulated decolorization, but in heterotrophic condition, decolorization was stimulated only at the presence of sucrose. In photoautotrophic condition, dry weight decreased with removal of carbon and nitrogen or by dye addition, but in heterotrophy, biomass production increased in the presence of dye and was further stimulated by sucrose. Treatment by dye in the condition of carbon and nitrogen removal (in one or both photoautotrophic and heterotrophic states) increased chlorophyll a, carotenoid, phycobilins, astaxanthin, carbohydrate, protein and total antioxidant potential of cells compared to the absence of dye condition. At this situation, reactive oxygen species and phenol contents were decreased in photoautotrophic and increased in heterotrophic states. In heterotrophic conditions, sucrose induced the antioxidant potential and reduced reactive oxygen species. In general, it seems that, in addition to the ability of S. platensis to remove acid blue 113 dye, this microalga can use the dye to increase biomass in heterotrophic condition, and in the absence of inorganic carbon and nitrogen in the medium, dye can be used to stimulate the production of other valuable cellular metabolites.
 Introduction
According to the global water assessment program of the United Nations, two million tons of factory effluents and industrial wastewaters every day are discharged into different waters. The physical and chemical purification processes that are carried out in order to remove pollutants on industrial effluents increase the risk of environmental pollution and production of new toxic intermediate compounds. But the phycoremediation technology which uses algae to remove pollutants, is superior to other technologies for the reasons, low cost, being based on natural processes and reducing the risk of accumulating toxic substances. In addition to photoautotrophic growth, S. platensis microalga is able to live and grow in heterotrophic and mixotrophic conditions.
According to the literature, in autotrophic growth of S. platensis, sodium bicarbonate can be used as a carbon source along with atmospheric CO2. However, in heterotrophic condition where light is prevented, sugar is available to microalgae as a source of energy and organic carbon. There are reports of treating Spirulina at heterotrophic conditions by glucose, sucrose, maltose, fructose, glycerol or other carbon sources, and based on the results, an increase in biomass and growth was observed.
The aims of this research firstly was to evaluate the potential of S. platensis in removing the acid blue 113 dye in two photoautotrophic and heterotrophic (in presence or absence of sucrose) nutritional modes. Secondly, in order to encourage the microalgae for possible use of dye, removing the inorganic carbon (sodium bicarbonate) and nitrogen (sodium nitrate) sources from the medium were also done as a treatment. At the same time, investigating the possibility of increasing algal biomass and identifying the conditions in which the valuable intracellular compounds of S. platensis increase were also of the other goals of the research.
 
Materials and Methods
 Zarrouk nutrient medium was prepared aseptically in the Erlenmeyer flasks for the cultivation of microalgae. 50 mg L-1 of Acid blue 113 (C32H21N5Na2O6S2) was used as dye. Treatments were designed in two trophic modes; autotrophic (Auto) at the presence of light (16/8 hours light/darkness, 80 μmol photons m-2 s-1) or heterotrophic (Het) which was completely at dark at the presence or absence of sucrose (Suc, as organic carbon/energy source, 1 g L-1). In order to investigate the possibility of dye degradation by alga and to encourage the cells for using it as carbon/nitrogen/energy source, simultaneous removal of sodium bicarbonate (inorganic carbon source) and sodium nitrate (inorganic nitrogen source) as –CN treatment was also designed. Different controls were also designed in order to compare the effects of treatments. Then, all were placed at the controlled temperature of 30±1◦C. The indices, dry weight and removal percentage of dye were measured on days 0, 1, 3, 6, 8 and 10 of experiment. The rest of the physiological and biochemical indices, chlorophyll a, total carotenoids, astaxanthin, phycobilins pigments, total soluble carbohydrate, total soluble protein, reactive oxygen species (ROS), phenol and total antioxidant activity (DPPH radical scavenging) were measured on the day 10.
 
Results and Discussion
The highest amount of dye removal during 10 days was observed at heterotrophic condition by 92.3%, in the presence of sucrose but absence of carbon and nitrogen sources. Removal of carbon and nitrogen in photoautotrophic condition stimulated decolorization, but in heterotrophic condition dye removal was stimulated only in the presence of sucrose (Fig. 1A). This shows that the removal of acid blue 113 dye by microalgae S. platensis is possible not only in photoautotrophic condition, but also at dark and heterotrophic condition, and even it is possible without the existence of an organic source (but in a slower rate). The results showed that the metabolism of S. platensis to remove and break down of dye in heterotrophic condition is stimulated and intensified by sucrose. At Auto-CN+dye condition, the dye treatment although could not increase the cell biomass (Fig. 1B), but was able to arise chlorophyll a, carotenoid, total phycobilins (phycocyanin, allophycocyanin and phycoerythrin) and astaxanthin by respectively, 1.8, 1.6, 1.4, and 1.7 times, compared to Auto-CN condition (Figs. 2-4).
Carbohydrate and protein contents also were significantly (P<0.05) increased compared to the conditions without dye (Fig. 5). Evaluation of oxidant/antioxidant potential of cells also indicates a clear drop in ROS level and a significant increase of antioxidant potential, confirming improvement of physiological condition (Fig. 6). These results are in accordance with some studies that show bioremediation in autotrophic condition along with increase of intracellular substances. At heterotrophic conditions, simultaneous treatments by sucrose and dye (Het+Suc+dye and Het-CN+Suc+dye) caused to increase dry weight and improvement of decolorization and antioxidant activities, but decrease of ROS level, compared to the conditions Het+Suc, Het+dye, Het-CN+Suc and Het-CN+dye.
Photosynthetic pigments can be considered as indicators for evaluating the capacity of cell acclimation to the environmental conditions. The inhibition of chlorophyll biosynthesis or its gradual degradation has been observed in microalgae which are exposed to nitrogen deficiency. Degradation of phycobiliproteins, chlorophyll and carotenoid pigments have also been observed at nitrogen deficiency. The increase of cell protein content under stress can indicates the stimulation of the cell physiological responses to deal with stress or the new conditions. There are some reports regarding the increase in cellular protein under dye removal or remediation of pollutants, which is attributed to the induction of nitrogen metabolism enzymes. Phenolic compounds are of most important and valuable bioactive compounds of S. platensis microalga, and the increase of phenolic compounds under stress conditions may be an escape for the accumulation of carbon skeletons that have accumulated due to stress and blockage of common metabolic pathways.
 
Conclusion
In general, it seems that microalga can use acid blue 113 dye to increase dry weight and cellular metabolites, and the removal of mineral carbon and nitrogen sources are effective to intensify this action. This suggests the possibility of using dye by microalga as a carbon/nitrogen source, however, the need for an organic source of nutrition in heterotrophic conditions is observed to activate and induce metabolic processes. All these results suggest the good metabolic compatibility of S. platensis for removal of pollutants and colored effluents in the environment and its biotechnological applications.

Keywords

Main Subjects

Full Text

امروزه کمتر از 3% ذخایر آبی برای آشامیدن مناسب است که این میزان نیز با توجه به شرایط کنونی محیط­زیست، در حال آلوده شدن است. بر اساس برنامه ارزیابی جهانی آب در سازمان ملل متحد که منابع آبی سراسر جهان را رصد می­کند، روزانه دو میلیون تن پساب کارخانه­ها و فاضلاب­های صنعتی در آب­های مختلف تخلیه می­شوند. با آن­که در گذشته، آلایندگی زباله­های خانگی و کشاورزی در کانون توجه پژوهشگران بوده، امّا اکنون تاکیدها بر آلاینده­های آلی پایدار از جمله مواد رنگ­زا گذارده شده که به علت ارتباط اکوسیستم­های مختلف محیط­زیست با یکدیگر، می­توانند اثرات غیرقابل پیش­بینی بر سلامت موجودات زنده بگذارند (Cepoi & Zinicovscaia, 2020).

رنگ­های مصنوعی به علّت استفاده کاربردی و سهولت تولید، علاوه بر صنایع نساجی در صنایع چاپ کاغذ، فراورده­های مواد غذایی، دارویی، آرایشی و به عنوان مواد افزودنی در فرآورده­های نفتی، بسیار مورد استفاده هستند و پایداری آنها نیز به مراتب بیشتر از رنگ­های طبیعی است. بنابراین می­توانند سبب عدم تعادل محتوای شیمیایی و آلی اکوسیستم­های آبی شده و مشکلات زیست­محیطی فراوانی ایجاد نمایند (Sarkar et al., 2017; Khan et al., 2013). مواد رنگ­زا، بر اساس کاربرد به انواع اسیدی، بازی، دایرکت، اینگرین، دیسپرس و غیره و بر اساس ساختار شیمیایی به انواع آزو، آنتراکینون، دی و تری آریل متان، تری فنیل متان، فتالوسیانین، هتروسیکل و غیره قابل تقسیم­بندی هستند (Bafana et al., 2011).

در میان رنگ­های مصنوعی، ترکیبات آزو (دارای پیوند -N=N-) بزرگترین و متنوع­ترین گروه را تشکیل داده و تقریباً 70 % از کل مواد رنگ­زای آلی تولید شده در جهان را شامل می­شوند (Khan et al., 2013; El-Sheekh et al., 2009). رنگ­های آزو به علّت ماهیت خود بطورکلی نسبت به روش­های تجزیه آزمایشگاهی مقاومت بسیار زیادی نشان می­دهند (El-Sheekh et al., 2009). منابع آبی آلوده به این گونه پساب­های سمی به مرور زمان می­توانند مناطق و اکوسیستم­های خاکی اطراف خود را نیز آلوده نموده و مشکلات زیست محیطی فراوانی برای رشد موجودات زنده گیاهی و جانوری ایجاد کنند، در این مورد، گزارش­ها نشان می­دهند برخی مواد رنگ­زای آزو می­توانند رشد گیاهان را از روش مهار جوانه­زنی بذر، کاهش زنده­مانی گیاهچه، کاهش فتوسنتز و جلوگیری از طویل شدن شاخه و ریشه تحت تأثیر قرار دهند (Baena-Baldiris et al., 2020; Pokharia & Ahluwalia 2015; Ravi et al., 2014). رنگ اسیدبلو 113، یک رنگ مصنوعی دارای دو پیوند آزو است که در مورد حذف آن از روش­های شیمیایی و فتوکاتالیستی نیز بررسی­هایی انجام شده است (Mohagheghian et al., 2022).

فرایندهای پالایش فیزیکی و شیمیایی از جمله اسمز معکوس، تبادل یونی، فتوکاتالیزوری، اکسیداسیون الکتروشیمیایی، فرایند فنتون و فیلتراسیون که برای حذف آلاینده بر روی پساب­های صنعتی انجام می­شوند، خطر افزایش آلودگی محیط زیست و تولید ترکیبات حدواسط جدید سمی را افزایش می­دهند. تکنولوژی جلبک پالایی[1] از جلبک­ها برای حذف آلاینده ها استفاده می­کنند (Moradi et al., 2021; Sarkar et al., 2017) و به علّت هزینه پائین و مبتنی بودن بر فرآیندهای طبیعی و کاهش خطر تجمع مواد سمّی، به سایر تکنولوژی­ها برتری دارد (Cepoi & Zinicovscaia, 2020; Wang et al., 2019). فرآیند پالایش زیستی آلاینده­ها می­تواند به­صورت جذب یا تخریب زیستی انجام شود. جذب زیستی به معنی حذف آلاینده­ها از فاز مایع (پساب یا محیط کشت) و انتقال به فاز جامد (سطح جاذب زیستی) است (Rasolzadeh et al., 2019) و برخی اوقات نیز جلبک دخیل در پالایش زیستی، پس از تخریب زیستی ترکیبات آلاینده، از آنها به عنوان منبع کربن، نیتروژن یا انرژی استفاده می­کند (Moradi et al., 2021; Zohoorian et al., 2020; Cepoi & Zinicovscaia, 2020). در واقع، جلبک­ها به علّت تنوع گروه­های عملکردی از جمله هیدروکسیل، کربوکسیل، آمینو، فسفات و غیره موجود در سطح سلول، جاذب­های زیستی بالقوه­ای هستند و علاوه بر ویژگی­های دیواره سلولی، جذب زیستی آلاینده­ها به داخل سلول­های جلبک نیز حائز اهمیت است (Moradi et al., 2021; Dmytryk et al., 2014). روند تخریب و تجزیه زیستی آلاینده­ها در داخل سلول زنده، از طریق واکنش­های مختلف آنزیمی اکسیداسیون و احیاء انجام می­شود (Zohoorian et al., 2020; Cepoi & Zinicovscaia, 2020).

برخی پژوهش­ها، در زمینه توانایی ریز جلبک­ها در پالایش زیستی رنگ­های مصنوعی انجام شده­اند. برای مثال، حذف 83 درصدی رنگ متیلن­بلو توسط جلبک سبز تک سلولی Chlorella vulgaris (Chin et al., 2020)، حذف 6/97 درصدی رنگ کریستال ویوله توسط یک جلبک دیاتومه، Phaeodactylum tricornutum (Santaeufemia et al., 2021) و حذف 1/69 درصدی رنگ آلیزارین رد توسط جلبک سبز-آبی Spirulina platensis (Nasoudaria et al., 2023) گزارش شده است.

جلبک­های سبز-آبی یا سیانوباکترها، تولیدکنندگان تودۀ زیستی و اکسیژن از زمان شروع حیات درکره زمین بوده و دارای ویژگی­های فیزیولوژیک بسیار ارزشمندی از جهات مختلف هستند (Troschl et al., 2017). ریز جلبک سبز- آبیSpirulina  platensis  از شاخه Cyanophyta، رده Cyanophyceae، راسته Spirulinales و خانواده Spirulinaceae است. این سیانوباکتر ریسه­ای در اغلب زیستگاه­های طبیعی جهان یافت شده و به­واسطه پاسخ­های فیزیولوژیک سازگارکننده، تحمّل زیادی به انواع تنش­های زیست­محیطی نشان می­دهد (Malliga et al., 2020; Klasener da Silva et al., 2018; Fazal et al., 2018). ریز جلبک Spirulina علاوه بر رشد فتواتروفی[2]، قادر به زندگی و رشد در شرایط هتروتروفی و میکسوتروفی[3] نیز است (Sánchez et al., 2003). این ویژگی نه تنها زیست سلول در شرایط کمبود نور و در حضور مواد آلی و آلاینده‌ها را میسر می­سازد، بلکه در برخی از این شرایط، ریز جلبک ممکن است بتواند مقدار زیادی تودۀ زیستی حاوی ترکیبات ارزشمند را نیز ذخیره کنند.

از همین­رو S. platensis به­عنوان یک نمونه بسیار خوب برای پژوهش­های فیزیولوژیک با هدف شناسایی سازوکارهای درگیر در فرایند پالایش زیستی و شناسایی عوامل موثر بر حذف آلاینده­ها از محیط و بررسی هر چه بهتر نحوه پاسخگویی به شرایط تنش آلایندگی شناخته می­شود (Diaconu et al., 2023; Robledo-Padilla et al., 2020). تودۀ زیستی این جلبک نیز به علّت غنی بودن از پروتئین­ها، اسیدآمینه­های ضروری، ویتامین­ها، رنگدانه­های فتوسنتزی، کربوهیدرات و سایر ترکیبات زیست فعال، جهت مصرف انسان، دام و طیور در مراکز و صنایع مختلف دنیا مورد توجه است (Cardoso et al., 2021; Cepoi & Zinicovscaia, 2020; Klasener da Silva et al., 2018; Ghannad et al., 2017).

بر اساس منابع، در رشد اتوتروفی S. platensis ، ترکیب بیکربنات سدیم می­تواند به­عنوان یک منبع کربنی در کنار CO2 هوا بکار گرفته شود(Magwell et al., 2023) . اما، در شرایط هتروتروفی که از تابش نور ممانعت می­شود، قند به­عنوان یک منبع کربن آلی در اختیار ریز جلبک قرار گرفته و کاتابولیسم آن عمدتاً از مسیر اکسیدی پنتوز فسفات انجام می­شود (Perez-Garcia et al., 2011). ترکیبات حد واسط مسیر اکسیدی پنتوز فسفات نظیر زایلولوز 5-فسفات، ریبوز 5-فسفات، سدوهپتولوز 7-فسفات و غیره می توانند وارد مسیر مرسوم گلیکولیز یعنی [4]EMP شده و بقیه مسیر را برای تولید پیرووات ادامه دهند(Perez-Garcia et al., 2011). این نکته حائز اهمیت است که توانایی زیست در شرایط هتروتروف، درواقع وابسته به نوع ریز جلبک و پتانسیل ژنتیکی آن بوده و برای کلیه ریز جلبک­ها امکان پذیر نیست (Li et al., 2020). گزارش­هایی از قرار دادن S. platensis  در شرایط هتروتروف و تیمار آن با گلوکز، ساکارز، مالتوز، فروکتوز، گلیسرول و یا سایر منابع کربنی وجود دارد که بر اساس نتایج بدست آمده، افزایش تودۀ زیستی و رشد مشاهده شده است (Verma et al., 2020; Mühling et al., 2005).

بنابراین، هدف این پژوهش، ارزیابی پتانسیل S. platensis در حذف ماده رنگ­زای اسید بلو 113 در دو حال  فتواتوتروف و هتروتروف (در حضور یاحضور ماده آلی ساکارز) است. همچنین، برای تحریک ریز جلبک جهت استفاده احتمالی از رنگ، حذف منابع کربن معدنی (بیکربنات سدیم) و نیتروژن معدنی (نیترات سدیم) از محیط کشت در قالب یک تیمار طراحی شد. در عین حال، بررسی امکان افزایش تودۀ زیستی جلبکی و شناسایی شرایطی که ترکیبات ارزشمند درون سلولی S. platensis در آن افزایش می­یابد، نیز انجام شد.

مواد و روش­ها

آماده‌سازی محیط کشت جلبک S. platensis و طراحی تیمارها

همه مواد شیمیائی لازم برای تهیه محیط کشت  S. platensisاز شرکت­های Sigma و Merck تهیه شدند. محیط کشت مغذی زاروک (Zarrouk, 1966) با K2HPO4­(2 میلی­مولار)، K2SO4 (5 میلی­مولار)، MgSO4.7H2O (8 میلی­مولار)، FeSO4.7H2O (03/0 میلی­مولار)، ZnSO4.4H2O (1 میلی­مولار)، CuSO4.5H2O (5/0 میلی­مولار)، NaNO3 (29 میلی­مولار)، CaCl2.2H2O (2/0 میلی­مولار)، MnCl2.4H2O (9 میلی­مولار)،NaCl (17 میلی­مولار)، EDTA (4/0 میلی­مولار)، H3BO3 (46 میلی­مولار)، Na2MoO4 (07/0 میلی­مولار)، NaHCO3 (7/160 میلی­مولار) در شرایط استریل تهیه و برای کشت ریز جلبک بکار برده شد. محیط کشت پس از آماده سازی، به ارلن­های­ استریل 250 میلی­لیتری اتوکلاو شده اضافه شد، سپس تلقیح توده زیستی ریز جلبک در ارلن­ها به مقدار مساوی انجام شد.

ماده­ی رنگ­زای اسید بلو 113 (AB113) با فرمول شیمیایی C32H21N5Na2O6S2 و متعلق به گروه رنگ­زای آزو با غلظت 50 میلی­گرم بر لیتر، خریداری (ساخت شرکت مرک) و در پژوهش استفاده شد. غلظت ماده رنگ­زا بر اساس یکسری آزمون­های مقدماتی به گونه­ای انتخاب شد که از تأثیرات شدید و کشنده بر سوسپانسیون جلبکی اجتناب شده و در عین حال تأثیر تحریک کنندگی آن بر میزان رشد و مقدار ترکیبات درون سلولی ریز جلبک نیز قابل تحمّل باشد.

تیمارها در دو حالت نوع تغذیه اتوتروفی (Auto) در حضور نور و نیز حالت عدم حضور نور یا هتروتروفی (Het) طراحی شدند. تیمارهای Auto در شرایط کنترل شده نوری 80 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه (16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی) و تیمارهای Het ،کاملاً در تاریکی در دو حالت حضور ساکارز (Suc، به­عنوان منبع کربن آلی) به میزان یک گرم بر لیتر (Tosuner & Ürek, 2020) و یا عدم حضور Suc قرار داده شدند. برای بررسی امکان تخریب رنگ و استفاده جلبک از آن در غیاب منابع کربن و نیتروژن محیط کشت، تیمار حذف همزمان منبع کربن معدنی (بیکربنات سدیم) و منبع نیتروژنی (نیترات سدیم) به­صورت تیمار -CN نیز طراحی شد. نمونه­های شاهد مورد نیاز در کلیه آزمون­ها نیز برای امکان مقایسه تأثیر تیمارها طراحی شدند (جدول شماره 1). سپس همه تیمارها در دمای 1±30 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند و 10 روز پس از شروع تیماردهی، سنجش شاخص­های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی انجام شد. در همه برداشت­ها، جهت استخراج کامل ترکیبات درون سلولی ریز جلبک، چندین مرحله فریز-ذوب و سونیکیشن (سه مرتبه و هر مرتبه 3 دقیقه در 80 هرتز در مجاورت یخ) توسط دستگاه سونیکاتور (مدلSONIC 4D ، شرکت جیمز انگلستان) و سپس عمل ورتکس در مجاورت گلوله­های شیشه­ای انجام شد (Moraes et al., 2011).

درصد حذف و میزان باقیمانده ماده رنگ­زا در محیط کشت: درصد رنگ زدائی ماده رنگ­زا از رابطه (1) محاسبه و سپس محاسبه مقدار رنگ باقیمانده در محیط کشت بر حسب میلی­گرم بر لیتر انجام شد. برای تعیین مقادیر جذب در طول موج ماکزیمم رنگ (560 نانومتر) از دستگاه اسپکتروفوتومتر 96 چاهکی (مدل Epoch، شرکت بیوتک انگلستان) استفاده شد.

رابطه (1):

 Dye removal (%) = [C0-Cn/C0] ×100

C0 و Cn به ترتیب، غلظت­های ابتدایی و انتهایی ماده رنگ­زا (AB113) بر حسب میلی­گرم بر لیتر در محیط کشت ریز جلبک پس از زمان­های مورد ارزیابی است (Movafeghi et al., 2016).

جدول 1- شرح تیمارهای طراحی شده و علائم اختصاری بکاربرده شده.

Table 1 – Description of designed treatments and used abbreviations.

Number of

treatments

Type of

tropic

Abbreviation of

treatments

Dye

(50 mg L-1)

Sucrose,

(Suc,

 1 g L-1)

Source of carbon/nitrogen

 in medium, (CN)

1

Autotroph

Auto

-

-

-

2

Auto + dye

+

-

-

3

Auto - CN

-

-

+

4

Auto - CN + dye

+

-

+

5

Heterotroph

Het

-

-

-

6

Het + Suc

-

+

-

7

Het + dye

+

-

-

8

Het + Suc + dye

+

+

-

9

Het - CN

-

-

+

10

Het - CN + Suc

-

+

+

11

Het - CN + dye

+

-

+

12

Het - CN + Suc + dye

+

+

+

سنجش وزن خشک: برای اندازه­گیری وزن خشک S. platensis ، مقادیر همگن از سوسپانسیون سلولی به مدت 15 دقیقه درg  13500 سانتریفیوژ شد. برای حذف محیط کشت، سطح بیوماس تر، 2 تا 3 بار با آب دو بار تقطیر شستشو داده شد و پس از تخلیه کامل محلول رویی، تودۀ زیستی تر به دست آمده به مدت 24 ساعت در دمای 55 درجة سانتی­گراد داخل آون خشک و سپس توزین شد. وزن خشک براساس میلی­گرم در میلی­لیتر سوسپانسیون سلولی گزارش شد (Khademi & Ardebili, 2017).

سنجش رنگدانه­های فتوسنتزی: برای استخراج رنگدانه کلروفیل a (Chl a) و کاروتنوئید کل (Car) از حلال متانول خالص استفاده شد (Zavřel & Červený, 2015). جذب نوری عصاره متانولی نمونه­ها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر 96 چاهکی (مدل Epoch، شرکت بیوتک انگلستان) در طول موج­های 470، 665 و 720 نانومتر خوانده شد، سپس نتایج با روابط (2) و (3) محاسبه و بر حسب میکروگرم رنگدانه بر گرم وزن تر ارائه شدند.

رابطه (2):

Chl a = 12.9447 (A665-A720)         

رابطه (3):

Car = [1000 (A470-A720)-2.86 (Chl a)]/221      

سنجش رنگدانه­های فیکوبیلین: استخراج رنگدانه­های فیکوبیلین بر اساس روش Moraes et al., (2011) توسط تودۀ زیستی خشک انجام شد. جذب عصاره در طول موج­های 562، 615 و 652 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر 96 چاهکی (با مشخصات بالا) خوانده شد، محاسبه مقدار فیکوبیلین­ها طبق روابط 4 تا 7 انجام شد (Bennett & Bogorad, 1973) و مقادیر بر حسب میلی­گرم رنگدانه بر گرم وزن خشک ارائه شدند.

رابطه (4):

Phycocyanin (C-PC) = {A615 – (0.474 ×A652)}/5.34

رابطه (5):

Allophycocyanin (APC) = {A652 – (0.208   × A615)}/5.09

رابطه (6):

Phycoerythrin (PE) = {A562 - (2.41× PC) - (0.849 × APC)}/ 9.62

رابطه (7):

PE Phycobiliprotein= PC + APC +PE

سنجش آستاگزانتین: برای اندازه­گیری آستاگزانتین ، محلول دی­متیل­سولفوکساید (DMSO) به تودۀ زیستی خشک اضافه شد. سپس نمونه­ها به مدت 120 ثانیه در دستگاه سونیکاتور (مدل Elma، P60H، آلمان) قرار گرفتند و 8 ساعت با مگنت هم زده و مجدداً سونیک شدند. پس از انجام سانتریفیوژ، جذب عصاره در طول موج 489 نانومتر با اسپکتروفتومتر 96 چاهکی خوانده شد. سپس با ضریب خاموشی 105×25/1 لیتر بر مول بر سانتی­متر، مقدار آستاگزانتین بر حسب میلی­گرم رنگدانه بر گرم وزن خشک ریز جلبک محاسبه و نتایج گزارش شدند (Régnier et al., 2015).

سنجش کربوهیدرات محلول کل: سوسپانسیون سلولی برداشت شده به مدّت 15 دقیقه در g 13500 سانتریفیوژ شد. پس از تخلیه محلول رویی، برای حذف تداخل رنگدانه­ها از استون خالص استفاده و مجددا نمونه­ها سانتریفیوژ شدند (Marshall, 1986). رسوب برداشت شده در اتانول 80 درصد توسط چندین بار فریز-ذوب-سونیک و ورتکس هموژن شد و مجدداً سانتریفیوژ شد، این مرحله بار دیگر تکرار شده و پس از سانتریفیوژ، مایع رویی جدا و با محلول جاصل از مرحله قبل مخلوط شد. مقدار کربوهیدرات محلول کل بر اساس روش آنترون بر اثر واکنش با اسیدسولفوریک (72 درصد) سنجیده شد (Irigoyen et al., 1992). جذب نمونه­ها در طول موج 625 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر 96 چاهکی خوانده و برای رسم منحنی استاندارد از گلوکز خالص استفاده شد.

سنجش پروتئین محلول کل: پس از استخراج عصاره بر اساس روش Smirnoff & Colombe (1998)، مقدار پروتئین محلول کل بر اساس روش Bradford (1976) در طول موج 595 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر 96 چاهکی سنجش شد. نتایج بر حسب میکروگرم بر میلی­گرم وزن تر گزارش و از پروتئین آلبومن گاوی به عنوان استاندارد استفاده شد.

سنجش گونه­های فعال اکسیژن (ROS): بافر فسفات­سدیم 50 میلی­مولار (8/6=pH) برای استخراج ROS، به تودۀ زیستی تر اضافه شد. میزان ROS طبق روش Bindschedler et al., (2001) توسط ترکیب زایلنول اورنج سنجش شد. جذب نمونه­ها در طول موج 560 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر 96 چاهکی خوانده شد. برای رسم منحنی استاندارد از H2O2 استفاده شد و نتایج بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر ارائه شدند.

سنجش فنل: برای تهیه عصاره فنلی از افزودن آب مقطر به تودۀ زیستی خشک و انجام ورتکس، سونیک به مدّت 5 دقیقه و سپس قرار دادن نمونه­ها در بن­ماری (80 درجه سانتی­گراد به مدّت 10 دقیقه) استفاده شد. سپس سلول­ها با معرف فولین مخلوط و به آن­ها محلول کربنات سدیم 20 درصد اضافه شد، نمونه­ها ورتکس شدند و به مدّت 1 ساعت در دمای اتاق و تاریکی انکوبه شدند (Machu et al., 2015). جذب نمونه­ها در طول موج 765 نانومتر با اسپکتروفتومتر 96 چاهکی خوانده شد و نتایج بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن خشک ارائه شد. برای رسم منحنی استاندارد از ماده گالیک اسید استفاده شد.

 سنجش فعالیت آنتی­اکسیدانی سلول (درصد مهار 2 و 2- دی­فنیل- 1- پیکریل هیدرازیل): برای عصاره گیری از افزودن حلال متانول: اتانول به نسبت 1:10 (حجمی- حجمی) به تودۀ زیستی خشک استفاده شد. پس از اضافه نمودن محلول 2 و 2- دی­فنیل- 1- پیکریل هیدرازیل (DPPH)- متانولی، جذب نمونه­ها در طول موج 517 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر 96 چاهکی خوانده و فعالیت آنتی­اکسیدانی کل از رابطه 8 بر درصد محاسبه شد (Shalaby & Shanab, 2013).

رابطه (8):

Activity (%) =Ac-At/Ac × 100

Activity (%)= فعالیت بر حسب درصد مهار 2 و 2- دی­فنیل- 1- پیکریل هیدرازیل، At= جذب نمونه عصاره، Ac= جذب محلول DPPH- متانول بدون عصاره (نمونه بلانک)

تجزیه و تحلیل آماری: همه آزمایش­ها در 3 تکرار انجام شدند و داده­ها تحت آنالیز واریانس  (ANOVA)قرار گرفتند. مقایسه میانگین داده­ها توسط آزمون دانکن در سطح احتمال 05/0P < انجام شد و جهت بررسی آماری نتایج از نرم افزار SPSS نسخه 16 استفاده شد.

 نتایج

جدول 2، تجزیه واریانس شاخص­های رنگ زدائی در مدّت ده روز اعمال تیمارهای مختلف را نشان می­دهد. بر اساس نتایج بدست آمده در بیشتر موارد، همه تأثیرات از جمله تأثیرات دوتایی و سه تایی تیمارها بر شاخص­های رنگ زدائی معنی­دار (P<0.01) بودند.

جدول 2- تجزیه واریانس شاخص­های رنگ زدائی ریز جلبک S. platensis تحت تأثیر تیمارهای نوع تغذیه (Trophic)، وجود یا حذف همزمان منابع کربن و نیتروژن (CN) و مدّت زمان تیمار (0، 1، 3، 6، 8 و 10 روز) (Time). df: درجه آزادی؛ (Dye removal) DRM: میزان رنگ زدائی بر حسب میلی­گرم بر لیتر؛ DRP: میزان رنگ زدائی بر حسب درصد.

Table 2- Variance analysis of the dye removal indices of S. platensis microalgae under treatments of nutrition type (Trophic), simultaneous presence or absence of carbon and nitrogen sources (CN) and duration of treatments (0, 1, 3, 6, 8 and 10 days) (Time). df, degree of freedom; DRM, dye removal (mg L-1); DRP, dye removal percentage.

 

Treatment

df

DRM

DRP

Trophic

2

921.25**

3681.52 **

CN

1

8.48**

34.79 ns

Time

5

5850.51**

23351.24**

Trophic*CN

2

102.07**

408.18 **

Trophic*Time

10

252.08**

1007.14 **

CN*Time

5

37.21**

149.82**

Trophic*CN*Time

10

21.06**

84.39**

Error

72

0.62

10.13

Total

108

 

 

* و ** به ترتیب معنی­دار در سطح احتمال 5 و 1 درصد، ns نشان­دهنده عدم معنی­داری هستند.

* and ** Significant at 0.05 and 0.01 probability level, ns indicate non-significance.

جدول 3، تجزیه واریانس شاخص­های فیزیولوژیک مختلف ارزیابی شده در ریز جلبک S. platensis را، ده روز پس از اعمال تیمارها نشان می­دهد. بر اساس نتایج بدست آمده در بیشتر موارد، (به جز تأثیر اصلی رنگ و تأثیر دوتایی رنگ در تیمار نوع روش تغذیه، بر وزن خشک و نیز تأثیر دوتایی رنگ درحذف کربن و نیتروژن بر مقدار کربوهیدرات و ROS)، سایر تأثیرها بویژه تأثیر­های دوتایی و سه تایی تیمارها معنی­دار (P<0.01, 0.05) بودند.

جدول 3- تجزیه واریانس شاخص­های فیزیولوژیک ریز جلبک S. platensis ده روز پس از اِعمال تیمارهای نوع شرایط تغذیه­ای (Trophic)، وجود یا عدم وجود رنگ اسیدبلو 113 (Dye)، وجود یا حذف همزمان منابع کربن و نیتروژن (CN). Df: درجه آزادی؛ Dw: وزن خشک؛ Chl a: کلروفیل؛ PC: فیکوسیانین؛ APC: آلوفیکوسیانین؛ PE: فیکواریترین؛ Total PBP: فیکوبیلین کل؛ DPPH scavenging: مهار 2 و 2- دی­فنیل- 1- پیکریل هیدرازیل.

Table 3- Variance analysis of the physiological indices of S. platensis microalgae under treatment of the type of nutrition (Trophic), presence or absence of Acid Blue 113 dye (Dye), the simultaneous presence or absence of a carbon and nitrogen sources (CN). df, degree of freedom; DW, dry weight; Chl a, chlorophyll a; PC, phycocyanin; APC, allophycocyanin; PE, phycoerythrin; total PBP, total phycobilin, DPPH scavending: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydraz.

Treatment

df

Dw

Chl a

Caro

tenoids

PC

APC

PE

Total PBP

Asta

xanthin

Carbo

hydrate

Protein

ROS

Phenol

DPPH scavenging

Trophic

2

1.0**

9135.6**

6276.5**

2.0**

7.6**

0.9**

25.9**

0.1**

2656.2**

5147.3**

21.8**

16.1**

807.8**

Dye

1

2.8E-6 ns

17459.0**

14305.6**

2.5**

4.8**

1.0**

22.7**

0.01**

406.4*

87.3**

7.1**

2.3**

184.5**

CN

1

0.8**

276.2*

1342.7**

4.5**

7.6**

1.9**

39.1**

0.02**

25.26.2**

14641.1**

16.8**

12.9**

517.9**

Trophic*Dye

2

0.01 ns

3120.2**

1050.2**

0.3**

0.6**

0.2**

2.7**

0.01**

845.9**

910.9**

3.4**

3.1**

67.3**

Trophic*CN

2

1.1**

2800.5**

2792.8**

0.1**

0.3**

0.1**

1.1**

0.01**

670.8**

231.8**

4.8**

4.1**

204.3**

Dye*CN

1

0.04*

19474.6**

14535.4**

0.8**

1.1**

0.4**

6.6**

0.01**

222.9ns

1621.2**

0.7 ns

4.3**

145.5**

Trophic*Dye

*CN

2

0.1**

3059.7**

2103.7**

0.1**

0.2**

0.1**

1.2**

0.01**

939.6**

452.5**

9.1**

4.3**

236.8**

Error

24

0.01

53.8

8.2

0.001

0.003

0.000

0.01

1.8E-5

85.2

9.8

0.5

0.02

0.3

Total

36

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

* و ** به ترتیب معنی­دار در سطح احتمال 5 و 1 درصد، ns نشان­دهنده عدم معنی­داری هستند.

* and ** Significant at 0.05 and 0.01 probability level, ns indicate non-significance.

شکل 1 قسمت A، میزان باقیمانده رنگ اسیدبلو 113 در محیط کشت (بر حسب میلی­گرم بر لیتر) و نیز درصد رنگ زدائی رنگ توسط S. platensis را تحت شرایط اتوتروفی و هتروتروفی در مدّت 10 روز نشان می­دهد. قسمت B نمودار، نیز تغییرات وزن خشک S. platensis بر اثر تیمارهای مختلف را نمایش می­دهد.

همه تیمارها در طی 24 ساعت اول، دست کم حدود 10 میلی­گرم رنگ در لیتر را حذف نمودند. بیشترین درصد حذف رنگ طی روز اول به تیمار Het+Suc+dye به میزان 3/0± 97/24 درصد رنگ زدائی اختصاص داشت. در روزهای سوم و ششم آزمون، هر دو تیمار هتروتروف فاقد ساکارز Het +dye) و (Het-CN+dye توانایی کمتری در حذف رنگ نسبت به سایر تیمارها نشان دادند. امّا در حضور ساکارز، میزان رنگ زدائی افزایش یافت، به­طوری که در تیمار Het-CN+Suc+dye، در روزهای پایانی آزمون (روزهای 8 و 10)، رنگ باقیمانده در محیط کشت به کمترین میزان (8/3 میلی­گرم بر لیتر) با بیشترین درصد رنگ زدائی (4/92) در میان تیمارهای هتروتروف رسید. تیمار اتوتروف در شرایط فقدان کربن و نیتروژن یعنی تیمارAuto-CN+dye  از روز سوم به بعد، سبب حذف رنگ بیشتری نسبت به همین تیمار در شرایط دارای کربن و نیتروژن (Auto+dye) شد. امّا عدم وجود منبع کربن و نیتروژن معدنی در شرایط هتروتروف (Het-CN+dye)، نسبت به تیمار Het+dye سبب کاهش توانایی حذف رنگ از روز سوم به بعد شد، بنابراین در تیمار Het +dye، درصد رنگ زدائی بیشتری مشاهده شد.

بر اساس شکل B1، مقدار وزن خشک در همه تیمارها با گذشت زمان تا روز دهم افزایش یافت. در شرایط Auto، افزودن رنگ در غالب روزها (بجز روز هشتم نمونه­برداری) سبب کاهش مقدار وزن خشک شد و حذف کربن و نیتروژن در همین شرایط (Auto-CN) سبب کاهش معنی­دار )05/0(P< و قابل توجه مقدار وزن خشک نسبت به تیمار شاهد شد. افزودن رنگ در شرایط اتوتروفی و حذف منابع کربن و نیتروژن (Auto-CN+dye) این کاهش را ترمیم نکرد. مقدار وزن خشک در شرایط Het نسبت به شرایط اتوتروف کاهش نشان داد. در شرایط هتروتروف، وزن خشک بر اثر تغذیه با ساکارز (Het+Suc) یا بر اثر تیمار رنگ (Het+dye) نسبت به شاهد افزایش (Het) پیدا کرد. تیمار همزمان رنگ و ساکارز (Het+Suc+dye) مقدار وزن خشک را بویژه در روز دهم نسبت به تیمارهای قبلی هتروتروف افزایش داد. در کل، تیمارهای ساکارز و یا رنگ بصورت منفرد و یا به­طور همزمان سبب افزایش میزان وزن خشک از روز سوم به بعد، نسبت به تیمار Het شدند. در شرایط Het، حذف کربن و نیتروژن در حضور ساکارز (Het-CN+Suc) و در شرایط تیمار همزمان ساکارز و رنگ (Het-CN+Suc+dye) سبب افزایش معنی­دار )05/0(P< وزن خشک نسبت به سایر تیمارها در شرایط هتروتروف شد، امّا افزودن رنگ در حالت Het-CN+dye، سبب کاهش وزن خشک شد.

شکل 1- میزان رنگ اسیدبلو 113 در محیط کشت (نمودار ستونی) و میزان رنگ زدائی بر حسب درصد (نمودار خطی) (A)، میزان وزن خشک S. platensis (B)، در طی 10 روز قرارگرفتن در شرایط اتوتروف  (Auto)و هتروتروف (Het)، تحت تأثیر تیمارهای رنگ اسید بلو 113(dye) ، حذف منبع نیتروژن و کربن معدنی (–CN)  و وجود یا عدم وجود ساکارز در شرایط هتروتروفی (به­ترتیب Het+Suc و Het). مقادیر میانگین سه تکرار± SD هستند. حروف بزرگ و کوچک متفاوت، به­ترتیب بیان کننده­ی تفاوت معنی­دار (05/0P<) میان تیمارها در شاخص مقدار رنگ باقیمانده در محیط کشت و میان تیمارها در شاخص میزان رنگ زدائی بر حسب درصد، بر اساس آزمون دانکن هستند.

بر اساس شکل A2، در شرایط اتوتروفی (Auto)، افزودن رنگ سبب افزایش مقدار رنگیزه کلروفیل  aنشد و حذف منبع کربن و نیتروژن (–CN)، نیز مقدار کلروفیل aرا نسبت به شاهد کاهش داد. درحالی­که، افزودن رنگ در شرایط حذف کربن و نیتروژن (Auto–CN+dye) سبب افزایش معنی­دار)05/0(P< و قابل توجه مقدار کلروفیل aنسبت به شاهد و سایر تیمارها شد. مقدار کلروفیل بر اثر حذف نور و قرار دادن ریز جلبک در شرایط هتروتروفی (Het) در بیشتر موارد، نسبت به شرایط Auto کاهش نشان داد. در همین شرایط، افزودن ساکارز (Suc) در شرایط-CN یعنیHet-CN+Suc  ، سبب افت بیشتری در مقدار کلروفیل شد، در حالی­که بالعکس تیمار کردن سوسپانسیون سلولی با رنگ اسیدبلو 113 (Het-CN+dye و Het-CN+Suc+dye)، این کاهش را اصلاح کرد و مقدار کلروفیل را حتی به اندازه نمونه شاهد افزایش داد. این نتیجه، تأثیر مثبت و تحریک­کنندگی رنگ بر افزایش مقدار کلروفیلa در شرایط حذف منبع کربن و نیتروژن در هر دو حالت فتواتوتروف و هتروتروف را نشان می­دهد.

تغییرات مقدار کاروتنوئید، الگوی تقریباً مشابه با تغییرات کلروفیل a را نشان دادند (شکل B2). با این تفاوت که افزودن رنگ در شرایط اتوتروفی(Auto+dye) ، سبب کاهش مقدار کاروتنوئید نسبت به شاهد (Auto) شد، امّا تیمار رنگ در شرایط هتروتروف و فاقد نیتروژن و کربن، سبب افزایش مقدار کاروتنوئید نسبت به شاهد (Het) و نیز سایر تیمارها شد که نشان دهنده تأثیر تحریک­کنندگی بیشتر رنگ در شرایط Het-CN+dye بر افزایش مقدار کاروتنوئید، نسبت به سایر شرایط است.

شکل 2- مقدار کلروفیل a (A) و کاروتنوئید کل (B) در S. platensis ، 10 روز پس از قرارگرفتن در شرایط تغذیه­ای اتوتروف  (Auto)و هتروتروف (Het)، تحت تأثیر تیمارهای رنگ اسید بلو 113(dye) ، حذف منبع نیتروژن و کربن معدنی (–CN)  و وجود یا عدم وجود ساکارز در شرایط هتروتروفی (به­ترتیب Het+Suc و Het). مقادیر میانگین سه تکرار± SD هستند. حروف متفاوت، بیان کننده­ی تفاوت معنی­دار در سطح 05/0P< بر اساس آزمون دانکن هستند.

Figure 2- Chl a and total Carotenoid contents of S. platensis after 10 days at photoautotrophic (Auto) and heterotrophic (Het) conditions, treated by Acid blue 113 (dye), removal of mineral carbon and nitrogen sources (-CN) and presence or absence of sucrose at heterotrophic condition (Het+Suc and Het, respectively). Data is the average of three replicates ± SD. Different letters indicate significant differences based on Duncan's test at P<0.05.

تغییرات و نوسانات رنگیزه های فیکوبیلین PE)، APC، (PC و مقدار فیکوبیلین کل (PBP) بر اثر تیمارهای اعمال شده به میزان زیادی تشابه نشان دادند (شکل A, B, C, D 3). به­عنوان یک نمونه، مقدار رنگدانه PC، در شرایط اتوتروف، بر اثر افزودن رنگ نسبت به شاهد Auto افزایش نشان داد، با این­حال تأثیر تحریک­کنندگی بیشتر رنگ، در شرایط حذف منبع کربن و نیتروژن (Auto-CN+dye) مشاهده شد که مقدار رنگدانه را حدودا 8/37 درصد نسبت به Auto-CN افزایش داد. مقدار فیکوبیلین­ها در شرایط هتروتروف، در مقایسه با شرایط اتوتروف کمتر بود، اگرچه تیمار رنگ در این شرایط نیز (Het+dye, Het+Suc+dye) مقدار رنگدانه­ها را نسبت به حالت بدون رنگ (Het, Het+Suc) افزایش داد.

حذف منابع کربن و نیتروژن، در هر دو شرایط اتوتروف و هتروتروف سبب کاهش قابل توجه و معنی­دار )05/0(P< مقدار فیکوبیلین­ها شد.  (Auto-CN, Het-CN) و افزودن ساکارز در حالت هتروتروف، در حضور و یا عدم حضور منابع کربن و نیتروژن (Het+Suc, Het-CN+Suc) نیز نتوانست این کاهش را جبران کند و حتّی منجر به کاهش بیشتری شد. امّا افزودن رنگ در این شرایط (Het-CN+dye)، سبب افزایش مقدار فیکوبیلین­ها شد و این افزایش در تیمار همزمان ساکارز و رنگ (Het-CN+Suc+dye) تشدید شد. تأثیر مثبت  تیمارهای همزمان رنگ و ساکارز، بر روی مقدار رنگدانه PE، بیشتر از PC بود. با این­حال در مجموع، بیشترین مقدار رنگیزه­های فیکوبیلین، در شرایط تیمار رنگ در حالت اتوتروفی (Auto+dye) مشاهده شدند.

شکل 3- مقادیر رنگیزه­های فیکوسیانین (A)، آلوفیکوسیانین (B)، فیکواریترین (C) و فیکوبیلی پروتئین کل (D) در S. platensis ، 10 روز پس از قرارگرفتن در شرایط تغذیه اتوتروف  (Auto)و هتروتروف (Het)، تحت تأثیر تیمارهای رنگ اسید بلو 113(dye) ، حذف منبع نیتروژن و کربن معدنی(–CN)  و وجود یا عدم وجود ساکارز در شرایط هتروتروفی (به­ترتیب Het+Suc و Het). مقادیر میانگین سه تکرار± SD هستند. حروف متفاوت، بیان کننده­ی تفاوت معنی­دار در سطح 05/0P< بر اساس آزمون دانکن هستند.

Figure 3- The content of Phycocyanin (A), Allophycocyanin (B), Phycoerythrin (C) and Total Phycobilin (D) of S. platensis after 10 days at photoautotrophic (Auto) and heterotrophic (Het) conditions, treated by Acid blue 113 (dye), removal of mineral carbon and nitrogen sources (-CN) and presence or absence of sucrose at heterotrophic condition (Het+Suc and Het, respectively). Data is the average of three replicates ± SD. Different letters indicate significant differences based on Duncan's test at p<0.05.

مقدار رنگیزه آستاگزانتین در نمونه شاهد Auto، تقریباً 7/1 برابر آن در نمونه شاهد Het بود (شکل 4). افزودن رنگ در شرایط اتوتروف (Auto+dye) سبب کاهش اندکی در مقدار آستاگزانتین شد و در شرایط هتروتروف نیز افزودن رنگ (Het+dye)  سبب افزایش مقدار رنگدانه نشد. در مقابل، تیمار ساکارز در این شرایط (Het+Suc)، آستاگزانتین را نسبت به Het افزایش داد. حذف منبع کربن و نیتروژن در هر دو حالت Auto و Het سبب افت قابل ملاحظه رنگدانه شد، امّا صرفاً در شرایط Auto-CN+dye، رنگ توانست افت مقدار رنگدانه نسبت به Auto-CN را تا حدود زیادی جبران کند. در شرایط Het، صرفاً تیمار تلفیقی رنگ و ساکارز (Het-CN+Suc+dye) توانست سبب افزایش زیادی رنگدانه نسبت به حالت فقدان یک یا هر دو تیمار(Het-CN, Het-CN+Suc, Het-CN+dye) شود. این نتایج در مجموع نشان دادند تیمار رنگ در غیاب منابع کربن و نیتروژن، صرفاً در شرایط اتوتروف می­تواند تولید رنگدانه آستاگزانتین را تحریک کند و این امر در شرایط هتروتروف فقط بر اثر تیمار تلفیقی رنگ با ساکارز امکان-پذیر است.

شکل4- مقدار رنگیزه­ آستاگزانتین در S. platensis ، 10 روز پس از قرارگرفتن در شرایط اتوتروف  (Auto)و هتروتروف (Het)، تحت تأثیر تیمارهای رنگ اسید بلو 113(dye) ، حذف منبع نیتروژن و کربن معدنی(–CN)  و وجود یا عدم وجود ساکارز در شرایط هتروتروفی (به­ترتیب Het+Suc و Het). مقادیر میانگین سه تکرار± SD هستند. حروف متفاوت، بیان کننده­ی تفاوت معنی­دار در سطح 05/0P< بر اساس آزمون دانکن هستند.

Figure 4- The content of astaxanthin in S. platensis after 10 days at photoautotrophic (Auto) and heterotrophic (Het) conditions, treated by Acid blue 113 (dye), removal of mineral carbon and nitrogen sources (-CN) and presence or absence of sucrose at heterotrophic condition (Het+Suc and Het, respectively). Data is the average of three replicates ± SD. Different letters indicate significant differences based on Duncan's test at P<0.05.

مقدار کربوهیدرات و پروتئین محلول کل، 10 روز پس از اعمال تیمارهای متفاوت رنگ اسیدبلو 113، حذف منابع کربن و نیتروژن و نیز وجود و یا عدم وجود ساکارز در شرایطAuto  و/ یاHet  اندازه­گیری شدند (شکلA, B 5). برخلاف کربوهیدرات، مقدار پروتئین پس از اعمال تیمار رنگ (Auto+dye) به میزان کمی افزایش نشان داد. همچنین رنگ توانست افت واقع شده در مقدار کربوهیدرات بر اثر حذف منابع کربن و نیتروژن ((Auto-CN را تا حد نمونه شاهد دارای منابع کربن و نیتروژن (Auto) افزایش دهد. همچنین در مورد مقدار پروتئین افزایش(Auto-CN+dye)  مشاهده شد، امّا به اندازه میزان اولیه آن در نمونه شاهد Auto نبود. در واقع، رنگ توانست در غیاب منابع کربن و نیتروژن در شرایط فتواتوتروف، مقدار کربوهیدرات و پروتئین را تا حد نمونه شاهد دارای این منابع و یا نزدیک به آن افزایش دهد. حذف نور و اعمال شرایط Het سبب افت مقدار کربوهیدرات و پروتئین نسبت به حالت Auto شدند، امّا تیمار رنگ فقط توانست مقدار پروتئین را در حضور و یا غیاب ساکارز (Het+Suc+dye, Het+dye) افزایش دهد. ساکارز در شرایط هتروتروف سبب افزایش معنی­دار  )05/0(P< مقدار کربوهیدرات (Het+Suc) نسبت به نمونه شاهد Het نشد. حذف منابع کربن و نیتروژن در شرایط Het مشابه با شرایط Auto، سبب کاهش مقادیر کربوهیدرات و پروتئین شدند. افزودن ساکارز(Het-CN+Suc) ، سبب افت بیشتر مقدار پروتئین نسبت به حالت H-CN شد که با شرایط Het+Suc نسبت به Het تشابه دارد. این بدان معنی است که افزودن ساکارز در شرایط حذف نور، حداقل تا روز دهم در حضور یا غیاب منابع کربن و نیتروژن، کمکی به افزایش مقدار پروتئین نمی­کند. بالعکس تیمار تلفیقی ساکارز و رنگ در شرایط هتروتروف (Het-CN+Suc+dye)، سبب افزایش مقادیر کربن و همچنین نیتروژن و جبران عدم حضور CN شد.

شکل 5- مقادیر کربوهیدرات محلول کل (A) و پروتئین محلول (B) در S. platensis ، 10 روز پس از قرارگرفتن در شرایط اتوتروف  (Auto)و هتروتروف (Het)، تحت تأثیر تیمارهای رنگ اسید بلو 113(dye) ، حذف منبع نیتروژن و کربن معدنی (–CN) و وجود یا عدم وجود ساکارز در شرایط هتروتروفی (به­ترتیب Het+Suc و Het). مقادیر میانگین سه تکرار± SD هستند. حروف متفاوت، بیان کننده تفاوت معنی­دار در سطح 05/0P< بر اساس آزمون دانکن هستند.

Figure 5- The content of total soluble Carbohydrate (A) and Protein (B) in S. platensis after 10 days at photoautotrophic (Auto) and heterotrophic (Het) conditions, treated by Acid blue 113 (dye), removal of mineral carbon and nitrogen sources (-CN) and presence or absence of sucrose at heterotrophic condition (Het+Suc and Het, respectively). Data is the average of three replicates ± SD. Different letters indicate significant differences based on Duncan's test at P<0.05.

بررسی تغییرات مقدار ROS، فنل و فعالیت خاموش­سازی DPPH تحت تأثیر تیمارهای مختلف (شکل A, B, C 6) نشان داد مقدار ROS تحت تأثیر حذف منابع کربن و نیتروژن از محیط کشت، در هر دو حالت Auto-CN و Het-CN، به­صورت معنی­دار )05/0(P< افزایش یافت (شکل  A6). افزودن رنگ در شرایط اتوتروف Auto-CN+dye، سبب کاهش قابل ملاحظه و معنی­دار )05/0(P< مقدار ROS نسبت به حالت Auto-CN شد، درحالی­که تیمار رنگ در شرایط فاقد نور و هتروتروف (Het-CN+dye)، بالعکس منجر به تشدید افزایش مقدار ROS شد. از سوی دیگر، تحت شرایط فوق، تیمار ساکارز(Het-CN+Suc) ، توانست مقدار ROS را به میزان قابل توجهی نسبت به Het-CN کاهش دهد. در مجموع، مقدار ROS، تحت شرایط حذف نور (Het) و شرایط حذف منابع کربن و نیتروژن (-CN)، به­طور معنی­دار )05/0(P< افزایش یافت و تأثیر تیمار رنگ بسته به حالت اتوتروفی (Auto-CN+dye) و یا هتروتروفی (Het-CN+dye) به­ترتیب به­صورت تأثیر کاهشی و یا افزایشی در میزان ROS مشاهده شد.

الگوی تغییرات مقدار فنل با طرح تغییرات ROS جز در چند مورد، تا حدود زیادی تشابه نشان داد (شکل  B6). در یکی از موارد، برخلاف تغییرات ROS، مقدار فنل بر اثر تیمار رنگ در شرایط Het+dye، نسبت به شاهد Het کاهش نیافت و نیز تیمارهای تلفیقی رنگ و ساکارز (Het+Suc+dye, Het-CN+Suc+dye) ، سبب پائین نگاهداشتن مقدار فنل و جلوگیری از افزایش آن شدند.

بررسی نتایج بدست آمده از سنجش فعالیت آنتی­اکسیدانی سلول در خاموش­سازی رادیکال آزاد DPPH (شکل  C6) نشان دادند الگوی تغییرات مقدار فعالیت آنتی­اکسیدانی در واقع در بیشتر حالات و تیمارها، عکس تغییرات ROS و مقدار فنل را نشان می­دهد. بدین معنی که در شرایط CN در شرایط اتوتروف و هتروتروف (Auto-CN, Het-CN) و نیز در شرایط Het و Het-CN+dye که مقدار ROS و فنل افزایش نشان می­دهند، درواقع، مقدار فعالیت آنتی­اکسیدانی کل افزایش نیافته است. بالعکس در هر کجا که فعالیت آنتی­اکسیدانی افزایش یافته است، مقدار ROS کاهش نشان داد. بررسی فعالیت آنتی­اکسیدانی کل، همچنین نشان دادند افزودن رنگ در شرایط فقدان کربن و نیتروژن محیط کشت (Auto-CN+dye)، سبب تحریک فعالیت آنتی­اکسیدانی نسبت به شرایط Auto-CN شد، درحالی­که تیمار رنگ در شرایط Het-CN بطور مشابه عمل نکرد. با اینحال، تیمار تلفیقی رنگ و ساکارز، سبب تحریک فعالیت آنتی­اکسیدانی سلول در شرایط وجود و یا فقدان منابع کربن و نیتروژن شد.

شکل 6- تغییرات میزان ROS (A)، فنل (B) و فعالیت خاموش سازی رادیکال آزاد DPPH (C) در S. platensis ، 10 روز پس از قرارگرفتن در شرایط تغذیه اتوتروف  (Auto)و هتروتروف (Het)، تحت تأثیر تیمارهای رنگ اسید بلو 113(dye) ، حذف منبع نیتروژن و کربن(–CN)  و وجود یا عدم وجود ساکارز در شرایط هتروتروفی (به­ترتیب Het+Suc و Het). مقادیر میانگین سه تکرار± SD هستند. حروف متفاوت، بیان کننده تفاوت معنی­دار در سطح 05/0P < بر اساس آزمون دانکن هستند.

Figure 6- The level of ROS (A) Phenol content (B) and DPPH scavenging activity (C) in S. platensis after 10 days at photoautotrophic (Auto) and heterotrophic (Het) conditions, treated by Acid blue 113 (dye), removal of carbon and nitrogen sources (-CN), presence or absence of sucrose at heterotrophic condition (Het+Suc and Het, respectively). Data is the average of three replicates ± SD. Different letters indicate significant differences based on Duncan's test at P<0.05.

 بحث

پژوهش­هائی که بر روی پالایش پساب­های صنعت نساجی توسط ریز جلبک­ها انجام شده، نشان دادند در اغلب این پژوهش­ها، بیشتر تمرکز بر روی کاربرد تودۀ زیستی مرده جلبکی و جذب سطحی آلاینده­ها قرار گرفته (Sodhani et al., 2022; Boukarma et al., 2021; Dotto et al., 2012) و کمتر از نظر فیزیولوژیک، فعالیت­های متابولیسمی و تولیدات ریز جلبکی تحت تنش مواد رنگزا، به موضوع پرداخته شده است (Moradi et al., 2021; Moradi et al., 2019; Taslimi et al., 2013; Qayyum et al., 2009). به­همین علّت در این پژوهش، جنبه­های متابولیسمی پاسخ های فیزیولوژیک سلول به رنگ بیشتر مورد توجه قرار گرفته­اند.

بر اساس نتایج بدست آمده، رنگ زدائی رنگ دی آزو اسید بلو 113، در طی10 روز آزمون، در سوسپانسیون­های سلولی S. platensis در همگی تیمارهای اعمال شده، با سرعت­های مختلف انجام شد. سرعت رنگ زدائی در تیمار Het در روز اول بیشتر از تیمار Auto بود (به­ترتیب، 7/18 درصد نسبت به 1/16 درصد)، امّا از روز سوم به بعد با سرعت کمتری نسبت به Auto دنبال شد. با این حال، هر دو در نهایت به ماکزیمم مقدار 3/83 درصد رنگ زدائی (6/41 میلی گرم بر لیتر) رسیدند. این مساله نشان داد رنگ زدائی اسیدبلو 113 توسط ریز جلبک S. platensis نه تنها در شرایط فتواتوتروف، بلکه با حذف نور و اعمال شرایط هتروتروفی و حتی در فقدان منبع تغذیه آلی ساکارز (حتی با سرعت کمتری) نیز امکان­پذیر است. گزارش­هایی درباره پتانسیل S. platensis  در حذف رنگ­های متیلن بلو، مالاشیت گرین و قرمز کنگو در شرایط فتواتوتروفی نیز وجود دارد (Sharmila et al., 2020). برای مقایسه، در یک پژوهش، رنگ زدائی رنگ اسیدبلو 113، توسط مجموعه ای شامل 5 نوع سویه باکتریایی بررسی شد که طی آن 90 درصد رنگ در طی 22 ساعت در پساب نساجی رقیق شده در حضور گلوکز و نیترات آمونیوم توسط مخلوطی از باکتری­ها تجزیه شدند(Valli Nachiyar et al., 2012) .

افزودن ساکارز به­عنوان منبع غذایی آلی در شرایط هتروتروف به محیط کشت حاوی رنگ (Het+Suc) سرعت و میزان رنگ زدائی را افزایش داد و در روز اول به بیشترین مقدار (25 درصد رنگ زدائی) در میان تیمارها رسانید. همچنین تیمار ساکارز مقدار رنگ زدائی را در شرایط فقدان کربن و نیتروژن معدنی (-CN)در محیط کشت، به­شدت تحریک کرد و مقدار ماکزیمم رنگ زدائی را به 93 درصد رسانید. بالعکس، حذف CN و عدم افزودن ساکارز(Het-CN) ، سرعت رنگ زدائی را به کندترین حالت در میان تیمارها رسانید. این مساله نشان داد احتمالاً فعالیت­های متابولیسمی S. platensis  برای حذف و تجزیه آلاینده مورد بررسی در محیط کشت هتروتروف، توسط یک منبع کربن آلی در محیط کشت، تحریک و تشدید می­شود. استفاده از رنگ­های آزو به­عنوان منبع کربنی توسط بعضی موجودات از جمله باکتری­های سودوموناس و کنسرسیوم آرتروباکتر به­همراه ریزوبیوم نیز گزارش شده است (Ruiz-Arias et al., 2010)، همچنین علّت استفاده از منابع کربن یا نیتروژن اضافی برای تحریک رنگ زدائی، کمبود میزان غلظت کربن و نیتروژن در ساختار ماده رنگ­زا، عنوان شده است (Dav et al., 2015; Kumar et al., 2009).

در یافته­های پژوهش حاضر، حذف منابع کربن و نیتروژن معدنی از محیط کشت در شرایط Auto (Auto -CN+ dye) و در شرایط Het صرفاً در حضور ساکارز(Het-CN+Suc+dye) ، سبب تحریک و تشدید رنگ زدائی در روزهای آخر آزمون شد. بنابراین احتمال دارد ریز جلبک S. platensis  بتواند جهت تأمین حداقل بخشی از نیازهای متابولیسمی خود از رنگ به­عنوان منبع کربن، نیتروژن یا انرژی استفاده کند. در تأئید این مطلب، افت قابل توجه میزان رنگ زدائی در حضور مقدار زیاد کربن (Solis et al., 2012) و نیتروژن محیط کشت (Rawat et al., 2011) در برخی پژوهش­ها گزارش شده است. در مورد تولید تودۀ زیستی جلبکی باید ذکر شود، درصورتی که فرآیندهای جلبک پالایی و حذف زیستی آلاینده­ها بتوانند با افزایش تودۀ زیستی جلبکی همراه شوند، نتایج مفیدتری حاصل خواهد شد. در واقع، تعیین شرایط رشد بهینه ریز جلبک­ها که در مقیاس تجاری از اهمیت برخوردار است، تحت تأثیر غلظت مواد مغذی و شرایط محیط کشت است (Akgül, 2020; Akbari & Madadkar Haghjou 2018). برخی گزارش­ها حاکی از پالایش برخی فاضلاب­ها و پساب­های کارخانه­ای (نظیر رنگ نساجی، پنیر، روغن و...) توسط ریز جلبک­ها و تبدیل همزمان مواد پالایش شده به تودۀ زیستی و محصولات زیستی هستند (Afrin et al., 2024; Moradi et al., 2021; Zohoorian et al., 2020; Cepoi & Zinicovscaia, 2020).

در نتایج حاصل از پژوهش حاضر، تیمار رنگ در شرایط اتوتروفی (Auto+dye) سبب کاهش مقدار کمی در میزان وزن خشک S. platensis شد که احتمالاً به علّت کاهش فتوسنتز بر اثر کاهش رنگ در رسیدن نور به سلول­ها است (Chin et al., 2020)، با وجود این در چنین شرایطی، میزان رنگدانه­های فیکوبیلین، ترکیبات فنلی و نیز مقدار پروتئین سلول­ها بر اثر تیمار رنگ افزایش یافتند. بررسی پتانسیل آنتی­اکسیدانی S. platensis نیزکاهش اندک سطح فعالیت آنتی­اکسیدانی سلول­ها (در خاموش­سازی رادیکال DPPH) و نیز کاهش مقدار کاروتنوئید کل در شرایط Auto+dye را نشان دادند. فیکوبیلین­ها از رنگدانه­های کمکی فتوسنتزی در  S. platensis محسوب شده و دارای ارزش بسیار زیاد از نظر اقتصادی و صنعتی هستند (Perez-Garcia et al., 2011). به نظر می­رسد افزایش مقدار رنگدانه فیکوبیلین توسط سلول­های ریز جلبک در شرایط اتوتروف، منجر به افزایش میزان جذب نور که بر اثر تیمار رنگ و کدورت محیط کشت، کاهش یافته شود (Moradi et al., 2021). پروتئین­ها نیز از ترکیبات سلولی و بسیار با ارزش ریز جلبک­ها هستندکه همواره امکان افزایش آنها در پژوهش­ها، تحت تیمارهای مختلف بررسی می­شود (Akgül, 2020; Borah et al., 2020). افزایش مقدار پروتئین در سلول تحت تنش، می­تواند نشان دهنده برانگیخته شدن پاسخ­های فیزیولوژیک سلول و کسب آمادگی مقابله با تنش و یا شرایط جدید باشد (Hamida et al., 2020). بعضی گزارش­ها در زمینه افزایش مقدار پروتئین سلولی در شرایط رنگ زدائی و یا پالایش آلاینده­ها وجود دارد که به افزایش مقدار آنزیم­های متابولیسم نیتروژن نسبت داده شده است (Ahmed et al., 2022). همچنین در برخی پژوهش­ها، افزایش محتوای پروتئین کل به تحریک بیوسنتز آنزیم روبیسکو تحت شرایط تنش نسبت داده شده است (Li et al., 2020). تیمار حذف منبع کربن و نیتروژن محیط کشت در شرایط اتوتروفی(Auto-CN)، به کاهش شدید مقدار وزن خشک و همچنین کاهش معنی­دار (05/0P<) تمام رنگدانه­های کلروفیل a، کاروتنوئید کل، آستاگزانتین و فیکوبیلین­ها و نیز مقدار کربوهیدرات و پروتئین محلول منجر شدند که این اثرها نشان دهنده شدت تنش وارده بر سلول­ها هستند.

رنگدانه­های فتوسنتزی می­توانند به­عنوان شاخصی برای ارزیابی ظرفیت سازگاری سلول با شرایط محیطی درنظر گرفته شوند (Ajayan et al., 2018). توقف بیوسنتز کلروفیل یا تخریب تدریجی آن در ریز جلبک­هایی که در معرض کمبود نیتروژن قرار دارند، مشاهده شده (Costa et al., 2018; Hong et al., 2017) و تخریب رنگدانه­های فیکوبیلی­پروتئین، کلروفیل (Khosravi-Darani et al., 2013) و کاروتنوئید (Nagappan & Kumar, 2021) نیز در شرایط فقر نیتروژن مشاهده شده است. بر اساس منابع، توانایی سلول­ها برای تجزیه منابع نیتروژن آلی (نظیر رنگدانه­های فیکوبیلی­پروتئین) تحت شرایط کمبود نیتروژن افزایش پیدا می­کند (Depraetere et al., 2015) و سلول­های ریز جلبک می­توانند فیکوبیلی زوم­های حاوی نیتروژن را برای حفظ نیتروژن درون سلولی و عملکرد متابولیکی طبیعی خود، تجزیه کنند (Pancha et al., 2014). نتایج مشابهی هنگام پژوهش کمبود نیتروژن در S. platensis  مشاهده شده است (Li et al., 2018).

در نتایج حاصل از این پژوهش، حذف نور در شرایط هتروتروفی نیز سبب کاهش کلروفیل و کاروتنوئید شدند که تحت تیمار -CN تشدید شد. مقدار کلروفیل در ریز جلبک­های Nannnochloropsis و Chlorella و میزان کاروتنوئید در Asterarcys sp. SCS-1881 در شرایط تغذیه هتروتروفی در مقایسه با شرایط اتوتروفی نیز کاهش یافت که با نتایج ما همخوانی دارد (Li et al., 2020; Cheirsilp & Torpee, 2012). با آن­که رنگدانه ها در زندگی فتواتوتروفی سلول برای انجام فتوسنتز بسیار حائز اهمیت هستند، امّا کاهش مقدار آنها در شرایط هتروتروفی ناشی از تغییر منبع تولید و تأمین انرژی برای سلول و هدفمندی سلول­ها در بیوسنتز ترکیبات مورد نیازشان است (Li et al., 2020).

پژوهش­ها نشان دادند افزودن یک منبع کربن آلی اگزوژن می­تواند سبب افزایش غلظت آستاگزانتین به­عنوان یک رنگدانه کتوکاروتنوئیدی لیپوفیل با خاصیت آنتی­اکسیدانی در گونه­های مختلف جلبکی (Dechatiwongse & Choorit, 2021) شود، که این مورد نیز با یافته­های پژوهش حاضر که میزان آستاگزانتین همواره در حضور ساکارز افزایش می­یابد، همخوانی دارد. فرضیه­های متعددی در مورد چگونگی تأثیر قند بر تولید آستاگزانتین در سلول­های ریزجلبکی مطرح شده که در کل، تجزیه قند و تولید NADPH، بروز تغییرات در pH و فعالیت آنزیم Phytoene desaturase در بیوسنتز رنگدانه نقش مهمی دارند (Desmarchelier & Borel, 2017; Huang et al., 2008). همچنین در یک بررسی، افزایش 3/1 برابری غلظت آستاگزانتین در هنگام رشد با گلوکز اگزوژن در شرایط کمبود نیتروژن در مقایسه با محیط بدون گلوکز مشاهده شده است (Zhang et al., 2019) که با افزایش آستاگزانتین در تیمار Het-CN+Suc مطابقت دارد. در واقع کمبود نیتروژن با کاهش متابولیسم اولیه سلول­ها (مانند تولید تودۀ زیستی، کلروفیل و پروتئین)، سبب تحریک متابولیسم ثانویه در سلول­های جلبکی شده و منجر به افزایش بیوسنتز آستاگزانتین می­شود (Nagappan et al., 2019; Zhang et al., 2018).

کمبود نیتروژن محیط کشت، با کاهش پروتئین­سازی و کاهش نیاز به اسکلت کربنی، سبب کاهش مقدار کل پروتئین سلولی شده (Akgül, 2020; Borah et al., 2020) که جریان انرژی به سمت تولید نسبی کربوهیدرات هدایت می­شود (Nagappan & Kumar 2021; Costa et al., 2018). در یافته­های حاصل از این پژوهش در تیمارهای -CN هر جا که ساکارز یا رنگ و یا هر دو حضور داشته­اند، میزان کربوهیدرات­سازی افزایش یافته که نشان دهنده استفاده احتمالی ریز جلبک از ساکارز و یا رنگ بعنوان منبع کربن است. در شرایط اتوتروفی و تیمار Auto-CN، مقدار ترکیبات فنلی به حدود 2/2 برابر مقدار آنها در کنترل Auto افزایش یافت. از سویی، سطح ROS در این شرایط به­شدت افزایش و مقدار DPPH کاهش نشان داد که می­تواند بیانگر تنش موجود باشد. در پژوهش حاضر، افزایش ترکیبات فنلی در همه تیمارها در مقایسه با مقدار آن در شاهد Auto مشاهده شد که بیشترین افزایش در شرایط حذف CN (Auto-CN) و نیز افزودن رنگ  (Het-CN+dye) بود. ترکیبات فنلی از مهمترین و با ارزش­ترین ترکیبات زیست فعال ریز جلبک S. platensis  هستند و بر اساس منابع، افزایش ترکیبات فنلی در شرایط تنش، می­تواند به­عنوان گریز راهی برای تجمع اسکلت کربنی باشد که بعلّت تنش و مسدود شدن مسیرهای متداول متابولیسمی تجمع یافته­اند (Caretto et al., 2015).

نیتروژن به­عنوان یک ماده مغذی در بیوسنتز ماکرومولکول­های حیاتی و رشد ریزجلبک­ها دخالت دارد (Akgül, 2020) . نیتروژن علاوه بر مشارکت در ساخت پروتئین­ها، می­تواند از تجزیه قندها جلوگیری کند (Sajjadi et al., 2018; Pagnanelli et al., 2014). منبع نیتروژنی می­تواند تقسیمات سلولی را تقویت و رشد را تسریع کند (Pancha et al., 2014). به­طوری­که کاهش 20 درصدی رشد ریز جلبک Chlorella تحت تأثیر کمبود نیتروژن (Costa et al., 2018) و کاهش تودۀ زیستی ریز جلبک Picochlorum sp. در مقایسه با کشت شاهد، 12 روز پس از تنش کمبود نیتروژن (El-Kassas, 2013) گزارش شده است. حذف CN در نتایج این پژوهش، علاوه بر کاهش رشد، سبب کاهش معنی­دار مقدار پروتئین نیز شد که با افزودن رنگ کاهش پیدا کرد و یا حتی برعکس شد که این مساله می­تواند نشان دهنده استفاده احتمالی ریز جلبک از رنگ، بعنوان منبع نیتروژن نیز باشد.

تیمار رنگ در شرایط Auto-CN+dye، اگرچه نتوانست سبب افزایش مقدار تودۀ زیستی سلولی شود، با این­حال منجر به افزایش 8/1، 6/1 و 4/1 و 7/1 برابری به­ترتیب؛ در مقدار کلروفیل a، کاروتنوئید و فیکوبیلین کل (مجموعه فیکوسیانین، آلوفیکوسیانین و فیکواریترین) و آستاگزانتین نسبت به تیمار (Auto-CN) شد. مقدار کربوهیدرات و پروتئین نیز نسبت به شرایط بدون رنگ افزایش معنی­دار (05/0P<) نشان دادند. بنابراین به نظر می­رسد که افزودن رنگ اسید بلو 113 به تیمار اتوتروف در شرایط فقدان کربن و نیتروژن، سبب بهبود وضعیت سلول­ها شده است. در تأئید این مساله، می­توان به میزان رنگ زدائی بیشتر ریز جلبک در این شرایط (4/89 درصد)، نسبت به شرایط Auto+dye (2/83 درصد) اشاره کرد. بررسی وضعیت اکسیدانی/آنتی­اکسیدانی سلول نیز حاکی از افت مشخص سطح ROS و افزایش معنی­دار پتانسیل آنتی­اکسیدانی است که بهبود وضعیت را تأیید می­کند. بعضی از پژوهش­ها نیز رنگ زدائی در شرایط اتوتروفی و افزایش مواد درون سلولی را نشان می­دهند (Moradi et al., 2021; Borah et al., 2020; Moradi et al., 2019; Bhattacharya et al., 2017).

به­طور کلی، از آنجا که در هتروتروفی، سهولت استفاده از منابع مغذی موجود در محیط کشت به آسانی دسترسی به منابع کربن فتوسنتزی نیست، بنابراین، ریز جلبک در معرض تنش قرار گرفته و سطح ROS سلولی ممکن است افزایش یابد (Chavosh & Shariati, 2019). تیمار ساکارز در شرایط هتروتروف(Het+Suc) ، همان­گونه که قبلاً نیز ذکر شد، سبب تحریک رنگ زدائی، افزایش وزن خشک و برخی دیگر از ترکیبات نظیر مقدار کاروتنوئیدها و آستاگزانتین شد و میزان فعالیت آنتی­اکسیدانی بر اثر آن افزایش و مقدار ROS، کاهش یافت که نشان دهنده بهبود شرایط است. همچنین تیمار سلول­ها با رنگ، به جای ساکارز در شرایط هتروتروفی(Het+dye)  منجر به کاهش اندک در میزان تودۀ زیستی نسبت به Het+Suc شد، امّا میزان وزن خشک تولید شده را بسیار بالاتر از حالت Het نگاه داشت. این مسأله استفاده احتمالی سلول­ها از رنگ برای زیست و تولید تودۀ زیستی را در این شرایط به جای منبع آلی ساکارز نشان می­دهد. بعضی از پژوهش­ها نیز امکان افزایش تودۀ زیستی، همزمان با پالایش آلاینده­ها توسط جلبک­ها را نشان می­دهند (Devi et al., 2023; Prabhath et al., 2022; Cardoso et al., 2021).

تیمار هم‌زمان با ساکارز و رنگ در شرایط هتروتروف (Het+Suc+dye)، سبب افزایش وزن خشک نسبت به هر یک از تیمارها به تنهایی شد و سایر شاخص­های سلول از جمله فیکوبیلین­ها، پروتئین و فعالیت آنتی­اکسیدانی سلول را حتی نسبت به شرایط Het+Suc افزایش داد و مقدار ROS را کم کرد. این شرایط نشان دهنده وضعیت بهتر سلول در حضور تیمار دوتایی رنگ و ساکارز، نسبت به هر یک از تیمارها به تنهایی است. در شرایط مشابه در حالت فقدان CN معدنی در محیط کشت هتروتروفی مشاهده شد که با حضور همزمان ساکارز و رنگ (Het-CN+Suc+dye)، مقدار وزن خشک افزایش یافته و میزان رنگ زدائی و نیز وضعیت سایر شاخص­ها نظیر فعالیت آنتی­اکسیدانی بهبود می­یابد و مقدار ROS نسبت به شرایط تیمارهای تکی (Het-CN+Suc/Het-CN+dye) کم می­شود.

 جمع­بندی

پژوهش حاضر نشان می­دهد ریز جلبک سبز- آبیS. platensis ، در مدّت 10 روز، رنگ زدائی و حذف رنگ اسید بلو 113 را در هر دو شرایط فتواتوتروفی و هتروتروفی به میزان بیش از 90 درصد انجام می­دهد، امّا در شرایط هتروتروفی این ریز جلبک به حضور یک منبع انرژی آلی (نظیر ساکارز) برای تحریک رنگ­بری نیاز دارد. همچنین حذف منابع معدنی کربن و نیتروژن از محیط کشت در شرایط اتوتروفی، توانست رنگ زدائی و استفاده از رنگ برای افزایش متابولیت­های درون سلولی را تشدید کند، امّا مجدداً در شرایط هتروتروفی برای این فعالیت­ها به حضور ساکارز نیاز دارد. در مجموع، به نظر می­رسد که ریز جلبک می­تواند از رنگ اسید بلو 113 برای افزایش وزن خشک و متابولیت­های سلولی استفاده کند و حذف منابع معدنی کربن و نیتروژن در تشدید این اثر موثرند. این مسأله احتمال استفاده ریز جلبک از رنگ بعنوان منبع کربن/ نیتروژن را مطرح می­کند، با این­حال نیاز به یک منبع آلی تغذیه در شرایط هتروتروف برای فعال­سازی و القای فرایندهای متابولیسمی مشاهده می­شود. مجموع این نتایج، سازگاری متابولیسمی خوب S. platensis  برای حذف آلاینده­ها و پساب­های رنگی در محیط و کاربردهای بیوتکنولوژیکی آن را پیشنهاد می­کند. تجمع متابولیت­های درون سلولی ارزشمند در طی فرآیند پالایش رنگ نیز بر رویکردهای جامع پالایشگاه­های زیستی تاکید می­کند، فرایندهایی که در آن­ها تصفیه پساب­ها با تولید ترکیبات با ارزش همراه است.

References

Afrin, E., Akter, T., Baidya, A., Hossain, M. A., Islam, M. R., Das, M., Fatema, U. K., Alam, M. S. & Iqbal, M. A. (2024) Biofloc wastewater for microalgae (Chlorella ellipsoidea) production: an approach to algal biomass production and nutrient remediation. Journal of Applied Aquaculture, 1-21.‏ https://doi.org/10.1080/10454438.2024.2351375.
Ahmed, S. F., Mofijur, M., Parisa, T. A., Islam, N., Kusumo, F., Inayat, A., Le, V. G., Badreddian, I. A., Khan, T. M. Y. & Ong, H. C. (2022) Progress and challenges of contaminate removal from wastewater using microalgae biomass. Chemosphere, 286(1), 131656.‏ https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2021.131656.
Ajayan, K. V., Harilal, C. C. & Selvaraju, M. (2018) Phycoremediation resultant lipid production and antioxidant changes in green microalgae Chlorella sp. International Journal of Phytoremediation, 20(11), 1144-1151. https://doi.org/10.1080/15226514.2017.1413333.
Akbari, F. & Madadkar Haghjou, M. (2018) Increase in biomass and growth of Dunaliella microalga under vanillin treatment. Journal of Plant Process and Function, 7(24), 211-228 [in Persian]. http://jispp.iut.ac.ir/article-1-691-en.html.
Akgül, F. (2020) Effects of nitrogen concentration on growth, biomass, and biochemical composition of Desmodesmus communis (E. Hegewald) E. Hegewald. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 50(1), 98-105.‏ https://doi.org/10.1080/10826068.2019.1697884.
Baena-Baldiris, D., Montes-Robledo, A. & Baldiris-Avila, R. (2020) Franconibacter sp., 1MS: A new strain in decolorization and degradation of azo dyes ponceau s red and methyl orange. American Chemical Society Omega, 5(43), 28146-28157.‏ https://doi.org/10.1021/acsomega.0c03786.
Bafana, A., Devi, S. S. & Chakrabarti, T. (2011) Azo dyes: past, present and the future. Environmental Reviews, 19, 350-371.‏ https://doi.org/10.1139/a11-018.
Bennett, A. & Bogorad, L. (1973) Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green algae. The Journal of Cell Biology, 58(2), 419-35. https://doi.org/10.1083/jcb.58.2.419.
Bhattacharya, S., Pramanik, S. K., Gehlot, P. S., Patel, H., Gajaria, T., Mishra, S. & Kumar, A. (2017) Process for preparing value-added products from microalgae using textile effluent through a biorefinery approach. American Chemical Society Sustainable Chemistry and Engineering, 5(11), 10019-10028.‏ https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.7b01961.
Bindschedler, L. V., Minibayeva, F., Gardner, S. L., Gerrish, C., Davies, D. R. & Bolwell, G. P. (2001) Early signalling events in the apoplastic oxidative burst in suspension cultured French bean cells involve CAMP and Ca2+. New Phytologist, 151, 185–194. https://doi.org/10.1046/j.1469-8137.2001.00170.x.
Borah, D., Kennedy, B., Gopalakrishnan, S., Chithonirai, A. & Nooruddin, T. (2020) Bioremediation and biomass production with the green microalga Chlorococcum humicola and textile mill effluent (TE). Proceedings of the National Academy of Sciences, India Section B: Biological Sciences, 90, 415-423. https://doi.org/10.1007/s40011-019-01112-x.
Boukarma, L., Aziam, R., Baroud, S., Eddaoudi, E., Sinan, F., Sadki, I., Tahrouch, S. & Chiban, M. (2021). Kinetic and equilibrium isotherm studies for the removal of acid blue 113 dye by dried corallina officinalis algae as a novel eco-friendly adsorbent. E3S Web of Conferences, 240, 02004. https://doi.org/10.1051/e3sconf/202124002004.
Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(1), 248-254. https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3.
Cardoso, L. G., Duarte, J. H., Costa, J. A. V., de Jesus Assis, D., Lemos, P. V. F., Druzian, J. I., de Souza, C. O., Nunes, I. L. & Chinalia, F. A. (2021) Spirulina sp. as a bioremediation agent for aquaculture wastewater: production of high added value compounds and estimation of theoretical biodiesel. BioEnergy Research, 14(1), 254-264.‏ https://doi.org/10.1007/s12155-020-10153-4.
Caretto, S., Linsalata, V., Colella, G., Mita, G. & Lattanzio, V. (2015) Carbon fluxes between primary metabolism and phenolic pathway in plant tissues under stress. International Journal of Molecular Sciences, 16(11), 26378-26394.‏ https://doi.org/10.3390/ijms161125967.
Cepoi, L. & Zinicovscaia, I. (2020) Spirulina platensis as a model object for the environment bioremediation studies. In Handbook of Algal Science, Technology and Medicine (pp. 629-640). Academic Press.‏ https://doi.org/10.1016/B978-0-12-818305-2.00039-5.
Chavoshi, Z. Z. & Shariati, M. (2019) Lipid production in Dunaliella salina under autotrophic, heterotrophic, and mixotrophic conditions. Biologia, 74, 1579-1590.‏ https://doi.org/10.2478/s11756-019-00336-6.
Cheirsilp, B. & Torpee, S. (2012) Enhanced growth and lipid production of microalgae under mixotrophic culture condition: effect of light intensity, glucose concentration and fed-batch cultivation. Bioresource Technology, 110, 510-516.‏ https://doi.org/10.1016/j.biortech.2012.01.125.
Chen, B., Wan, C., Mehmood, M. A., Chang, J. S., Bai, F. & Zhao, X. (2017) Manipulating environmental stresses and stress tolerance of microalgae for enhanced production of lipids and value-added products–A review. Bioresource Technology, 244, 1198-1206.‏ https://doi.org/10.1016/j.biortech.2017.05.170.
Chin, J. Y., Chng, L. M., Leong, S. S., Yeap, S. P., Yasin, N. H. M. & Toh, P. Y. (2020) Removal of synthetic Dye by Chlorella vulgaris microalgae as natural adsorbent. Arabian Journal for Science and Engineering, 45, 7385-7395.‏ https://doi.org/10.1007/s13369-020-04557-9.
Costa, S. S., Miranda, A. L., Andrade, B. B., de Jesus Assis, D., Souza, C. O., de Morais, M. G., Costa, J. A. V. & Druzian, J. I. (2018) Influence of nitrogen on growth, biomass composition, production, and properties of polyhydroxyalkanoates (PHAs) by microalgae. International Journal of Biological Macromolecules, 116, 552-562.‏ https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.05.064.
Dave, S. R., Patel, T. L. & Tipre, D. R. (2015) Bacterial degradation of azo dye containing wastes.  In: Microbial degradation of synthetic dyes in wastewaters, (Ed. Singh, S.N.) 57-83.  Springer International Publishing Switzerland. https://doi.org/10.1007/978-3-319-10942-8_3.
Dechatiwongse, P. & Choorit, W. (2021) Mixotrophic Growth of Astaxanthin-Rich Alga Haematococcus pluvialis using Refined Crude Glycerol as Carbon Substrate: Batch and Fed-Batch Cultivations. Walailak Journal of Science and Technology (WJST), 18(2). https://doi.org/10.48048/wjst.2021.7354.
Depraetere, O., Deschoenmaeker, F., Badri, H., Monsieurs, P., Foubert, I., Leys, N., Wattiez, R. & Muylaert, K. (2015) Trade-off between growth and carbohydrate accumulation in nutrient-limited Arthrospira sp. PCC 8005 studied by integrating transcriptomic and proteomic approaches. Plos One, 10(7), e0132461.‏ https://doi.org/10.1371/journal.pone.0132461.
Desmarchelier, C. & Borel, P. (2017) Overview of carotenoid bioavailability determinants: From dietary factors to host genetic variations. Trends in Food Science and Technology, 69, 270–280. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2017.03.002.
Devi, A., Verma, M., Saratale, G. D., Saratale, R. G., Ferreira, L. F. R., Mulla, S. I. & Bharagava, R. N. (2023) Microalgae: A green eco-friendly agents for bioremediation of tannery wastewater with simultaneous production of value-added products. Chemosphere, 336, 139192.‏ https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2023.139192.
Diaconu, M., Soreanu, G., Balan, C. D., Buciscanu, I. I., Maier, V. & Cretescu, I. (2023) Study of Spirulina platensis (Arthrospira) development under the heavy metals influence, as a potential promoter of wastewater remediation. Water, 15(22), 3962. https://doi.org/10.3390/w15223962.
Dmytryk, A., Saeid, A. & Chojnacka, K. (2014) Biosorption of microelements by Spirulina: towards technology of mineral feed supplements. The Scientific World Journal, 356328.‏ https://doi.org/10.1155/2014/356328.
Dotto, G. L., Cadaval, T. R. S. & Pinto, L. A. A. (2012) Use of Spirulina platensis micro and nanoparticles for the removal synthetic dyes from aqueous solutions by biosorption. Process Biochemistry, 47(9), 1335-1343.‏ https://doi.org/10.1016/j.procbio.2012.04.029.
El-Kassas, H. Y. (2013) Growth and fatty acid profile of the marine microalga Picochlorum sp. grown under nutrient stress conditions. The Egyptian Journal of Aquatic Research, 39(4), 233-239.‏ https://doi.org/10.1016/j.ejar.2013.12.007.
El-Sheekh, M. M., Gharieb, M. M. & Abou-El-Souod, G. W. (2009) Biodegradation of dyes by some green algae and cyanobacteria. International Biodeterioration and Biodegradation, 63(6), 699-704.‏ https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2009.04.010.
Fazal, T., Mushtaq, A., Rehman, F., Khan, A. U., Rashid, N., Farooq, W., Rehman, M. S. U. & Xu, J. (2018) Bioremediation of textile wastewater and successive biodiesel production using microalgae. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 82, 3107-3126.‏ https://doi.org/10.1016/j.rser.2017.10.029Get rights and content.
Ghannad, R., Akbari, F. & Madadkar, H. M. (2017) Effect of blue-green and green algae Spirulina, Chlorella, Dunaliella and minerals on the stimulation of metabolic and biochemical processes of germination in Dracocephalum kotschyi Boiss. Seeds. Nova Biologoca Reperta, 3(4), 295-307 [in Persian]. http://nbr.khu.ac.ir/article-1-2791-fa.html.
Hamida, R. S., Ali, M. A., Redhwan, A. & Bin-Meferij, M. M. (2020) Cyanobacteria–a promising platform in green nanotechnology: a review on nanoparticles fabrication and their prospective applications. International Journal of Nanomedicine, 15, 6033-6066.‏ https://doi.org/10.2147/IJN.S256134.
Hong, S. J., Park, Y. S., Han, M. A., Kim, Z. H., Cho, B. K., Lee, H., Choi, H. K. & Lee, C. G. (2017) Enhanced production of fatty acids in three strains of microalgae using a combination of nitrogen starvation and chemical inhibitors of carbohydrate synthesis. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 22, 60-67.‏ https://doi.org/10.1007/s12257-016-0575-9.
Huang, J., Liu, J., Li, Y. & Chen, F. (2008) Isolation and characterization of the phytoene desaturase gene as a potential selective marker for genetic engineering of the astaxanthin-producing green alga chlorella zofingiensis (Chlorophyta). Journal of Phycology, 44(3), 684–690. http://www.blackwell-synergy.com/loi/jpy.
Irigoyen, J. J., Einerich, D. W. & Sánchez‐Díaz, M. (1992) Water stress induced changes in concentrations of proline and total soluble sugars in nodulated Alfalfa (Medicago sativa) plants. Physiologia Plantarum, 84(1), 55-60. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1992.tb08764.x.
Khademi, S. & Oraghi Ardebili, N. (2017) Changes in antioxidant systems and biomass in response to selenate in blue-green microalgae Spirulina platensis, Cyanophyta. Journal of Plant Process and Function, 6(20), 9-16. http://jispp.iut.ac.ir/article-1-592-en.html.
Khan, R., Bhawana, P. & Fulekar, M. H. (2013) Microbial decolorization and degradation of synthetic dyes: a review. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology, 12(1), 75-97. https://doi.org/10.1007/s11157-012-9287-6.
Khosravi-Darani, K., Mokhtari, Z. B., Amai, T. & Tanaka, K. (2013) Microbial production of poly (hydroxybutyrate) from C1 carbon sources. Applied Microbiology and Biotechnology, 97, 1407-1424.‏ https://doi.org/10.1007/s00253-012-4649-0.
Klasener da Silva, C. K., Costa, J. A. V. & de Morais, M. G. (2018) Polyhydroxybutyrate (PHB) synthesis by Spirulina sp. LEB 18 using biopolymer extraction waste. Applied Biochemistry and Biotechnology, 185(3), 822-833.‏ https://doi.org/10.1007/s12010-017-2687-x.
Kumar K., Dastidara M. G. & Sreekrishnan T. R. (2009) Effect of process parameters on aerobic decolorization of reactive azo dye using mixed culture. World Academy of Science, Engineering and Technology, 58, 962-965.
Li, X., Li, W., Zhai, J. & Wei, H. (2018) Effect of nitrogen limitation on biochemical composition and photosynthetic performance for fed-batch mixotrophic cultivation of microalga Spirulina platensis. Bioresource Technology, 263, 555–561. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2018.05.046.
Li, T., Yang, F., Xu, J., Wu, H., Mo, J., Dai, L. & Xiang, W. (2020) Evaluating differences in growth, photosynthetic efficiency, and transcriptome of Asterarcys sp. SCS-1881 under autotrophic, mixotrophic, and heterotrophic culturing conditions. Algal Research, 45, 101753.‏ https://doi.org/10.1016/j.algal.2019.101753.
Machu, L., Misurcova, L., Vavra, A. J., Orsavova, J., Mlcek, J., Sochor, J. & Jurikova, T. (2015) Phenolic content and antioxidant capacity in algal food products. Molecules, 20(1), 1118-1133. https://doi.org/10.3390/molecules20011118.
Magwell, P. F. R., Djoudjeu, K. T., Minyaka, E., Tavea, M. F., Fotsop, O. W., Tagnikeu, R. F., Fofou, A. M., Darelle, C. K. V., Dzoyem, C. U. D. & Lehman, L. G. (2023) Sodium bicarbonate (NaHCO3) increases growth, protein and photosynthetic pigments production and alters carbohydrate production of Spirulina platensis. Current Microbiology, 80(2), 63.‏ https://doi.org/10.1007/s00284-022-03165-0.
Malliga, P., Bela, R. B. & Shanmugapriya, N. (2020) Conversion of textile effluent wastewater into fertilizer using marine cyanobacteria along with different agricultural waste. In: Biovalorisation of wastes to renewable chemicals and biofuels (Eds. Rathinam, N. K. & Sani, R. K.) 87-111. Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-817951-2.00005-5.
Marshall., J. D. (1986) Drought and shade interact to cause fine-root mortality in Douglas-fir seedlings. Plant and Soil, 91, 51-60. https://doi.org/10.1007/BF02181818.
Mohagheghian, A., Hooshmand Rad, S., Ayagh, K. & Shirzad-Siboni, M. (2022) Photocatalytic Removal of Acid Blue 113 Dye from Aqueous Solutions Using Zinc Oxide-Kaolin Nanocomposite under Visible Light Irradiation. Journal of Mazandaran University of Medical Sciences, 32(209), 146-162 [in Persian]. http://jmums.mazums.ac.ir/article-1-17973-en.html.
Moradi, Z., Madadkar Haghjou, M. & Zarei, M. (2019) Bioremediation of textile dye Direct Blue 129, by green alga Chlorella vulgaris Beijerinck and cyanobacter Spirulina (Arthrospira) platensis Gomont, and influence of dye on their physiological and biochemical indices. Iranian Journal of Plant Biology, 11(4), 83-106‏ [in Persian]. https://doi.org/10.22108/ijpb.2020.118969.1172.
Moradi, Z., Madadkar Haghjou, M., Zarei, M., Colville, L. & Raza, A. (2021) Synergy of production of value-added bioplastic, astaxanthin and phycobilin co-products and direct green 6 textile dye remediation in Spirulina platensis. Chemosphere, 280, 130920.‏ https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2021.130920.
Moraes, C. C., Sala, L., Cerveira, G. P. & Kalil, S. J. (2011) C-phycocyanin extraction from Spirulina platensis wet biomass. Brazilian Journal of Chemical Engineering, 28(1), 45-49.
Movafeghi, A., Khataee, A. R., Moradi, Z. & Vafaei, F. (2016) Biodegradation of direct blue 129 diazo dye by Spirodela polyrrhiza: an artificial neural networks modeling. International Journal of Phytoremediation, 18(4), 337-347. https://doi.org/10.1080/15226514.2015.1109588.
Mühling, M., Belay, A. & Whitton, B. A. (2005) Screening Arthrospira (Spirulina) strains for heterotrophy. Journal of Applied Phycology, 17, 129-135.‏ https://doi.org/10.1007/s10811-005-7214-8.
Nagappan, S., Devendran, S., Tsai, P. C., Dahms, H. U. & Ponnusamy, V. K. (2019) Potential of two-stage cultivation in microalgae biofuel production. Fuel, 252, 339–349. https://doi.org/10.1016/j.fuel.2019.04.138.
Nagappan, S. & Kumar, G. (2021) Investigation of four microalgae in nitrogen deficient synthetic wastewater for biorefinery based biofuel production. Environmental Technology and Innovation, 23, 101572.‏ https://doi.org/10.1016/j.eti.2021.101572.
Nasoudari, E., Ameri, M., Shams, M., Ghavami, V. & Bonyadi, Z. (2023) The biosorption of Alizarin Red S by Spirulina platensis; process modelling, optimisation, kinetic and isotherm studies. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 103(3), 633-647.‏ https://doi.org/10.1080/03067319.2020.1862814.
Pancha, I., Chokshi, K., George, B., Ghosh, T., Paliwal, C., Maurya, R. & Mishra, S. (2014) Nitrogen stress triggered biochemical and morphological changes in the microalgae Scenedesmus sp. CCNM 1077. Bioresource Technology, 156, 146-154.‏ https://doi.org/10.1016/j.biortech.2014.01.025.
Pagnanelli, F., Altimari, P., Trabucco, F. & Toro, L. (2014) Mixotrophic growth of Chlorella vulgaris and Nannochloropsis oculata: interaction between glucose and nitrate. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 89(5), 652-661.‏ https://doi.org/10.1002/jctb.4179.
Perez-Garcia, O., Escalante, F. M. E., de-Bashan, L. E. & Bashan, Y. (2011) Heterotrophic cultures of microalgae: metabolism and potential products. Water Research, 45(1), 11–36. https://doi.org/10.1016/j.watres.2010.08.037.
Pokharia, A. & Ahluwalia, S. S. (2015) Toxicological effect of textile dyes and their metabolites: A review. Current Trends in Biotechnology and Chemical Research, 5(1), 11-17.
Prabhath, G. P. W. A., Shukla, S. P., Srivastava, P. P., Kumar, K., Sawant, P. B., Verma, A. K., Chouksey M. K. & Nuwansi, K. K. T. (2022) Downstream processing of biomass produced in aquaculture wastewater for valuable pigments from the cyanobacterium Spirulina (Arthrospira) platensis: a green and sustainable approach. Aquaculture International, 30(6), 3081-3106. https://doi.org/10.1007/s10499-022-00949-w.
Qayyum, H., Maroof, H. & Yasha, K. (2009). Remediation and treatment of organopollutants mediated by peroxidases: a review. Critical Reviews in Biotechnology, 29(2), 94-119.‏ https://doi.org/10.1080/07388550802685306.
Rasolzadeh, F., Hashemi, P., Madadkar Haghjou, M. & Safdarian, M. (2019) Chlorella vulgaris microalgae as a green packing for the microextraction by packed sorbent of nitrofurantoin in urine. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research, 6(2), 419-429.‏ https://doi.org/10.22036/abcr.2019.164580.1297.
Ravi, D. Parthasarathy, R. Vijayabharathi, V. & Suresh, S. (2014) Effect of textile dye effluent on soybean crop. Journal of Pharmaceutical, Chemical and Biological Sciences, 2(2), 111-117.
Rawat, I, Kumar, R. R, Mutanda, T. & Bux, F. (2011) Dual role of microalgae: phycoremediation of domestic wastewater and biomass production for sustainable biofuels production. Applied Energy, 88(10), 3411–3424. https://doi.org/10.1016/j.apenergy.2010.11.025.
Robledo-Padilla, F., Aquines, O., Silva-Núñez, A., Alemán-Nava, G. S., Castillo-Zacarías, C., Ramirez-Mendoza, R. A., Zavala-Yoe, R., Iqbal, H. M. N. & Parra-Saldívar, R. (2020) Evaluation and predictive modeling of removal condition for bioadsorption of indigo blue dye by Spirulina platensis. Microorganisms, 8(1), 82.‏ https://doi.org/10.3390/microorganisms8010082.
Ruiz-Arias, A., Juárez-Ramírez, C., De Los Cobos-Vasconcelos, D., Ruiz-Ordaz, N., Salmerón-Alcocer, A., Ahuatzi-Chacón, D. & Galíndez-Mayer, J. (2010) Aerobic biodegradation of a sulfonated phenylazonaphthol dye by a bacterial community immobilized in a multistage packed-bed BAC reactor. Applied Biochemistry and Biotechnology, 162, 1689-1707.‏ https://doi.org/10.1007/s12010-010-8950-z.
Sajjadi, B., Chen, W. Y., Raman, A. A. A. & Ibrahim, S. (2018) Microalgae lipid and biomass for biofuel production: A comprehensive review on lipid enhancement strategies and their effects on fatty acid composition. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 97, 200-232.‏ https://doi.org/10.1016/j.rser.2018.07.050.
Sánchez, M., Bernal-Castillo, J., Rozo, C. & Rodríguez, I. (2003) Spirulina (Arthrospira): An edible microorganism: a review. Universitas Scientiarum, 8(1), 7-24.
Santaeufemia, S., Abalde, J. & Torres, E. (2021) Efficient removal of dyes from seawater using as biosorbent the dead and living biomass of the microalga Phaeodactylum tricornutum: Equilibrium and kinetics studies. Journal of Applied Phycology, 33, 3071-3090.‏ https://doi.org/10.1007/s10811-021-02513-0.
Sarkar, S., Banerjee, A., Halder, U., Biswas, R. & Bandopadhyay, R. (2017) Degradation of synthetic azo dyes of textile industry: a sustainable approach using microbial enzymes. Water Conservation Science and Engineering, 2(4), 121-131.‏ https://doi.org/10.1007/s41101-017-0031-5.
Shalaby, E. A. & Shanab, S. M. M. (2013) Comparison of DPPH and ABTS assays for determining antioxidant potential of water and methanol extracts of Spirulina platensis. Indian Journal of Geo-Marine Sciences, 42, 556-564. http://nopr.niscpr.res.in/handle/123456789/24794.
Sharmila, J., Saravanan, P., Sivasankar, S. & Chamundeeswari, M. (2020) A novel and an eco-friendly approach for organic dyes degradation using Spirulina platensis cultivated water. Catalysis Today, 340, 245-252. https://doi.org/10.1016/j.cattod.2018.11.044.
Smirnoff N. & Colombe S. V. (1988) Drought influences the activity of enzymes of the chloroplast hydrogen peroxide scavenging system. Journal of Experimental Botany, 39(8), 1097-1108. https://doi.org/10.1093/jxb/39.8.1097.
Sodhani, H., Hedaoo, S., Murugesan, G., Pai, S., Vinayagam, R., Varadavenkatesan, T., Bharath, G., Haija, M. A., Nadda, A. K., Govarthanan, M. & Selvaraj, R. (2022) Adsorptive removal of Acid Blue 113 using hydroxyapatite nanoadsorbents synthesized using Peltophorum pterocarpum pod extract. Chemosphere, 299, 134752.‏ https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2022.134752.
Solis, M., Solis, A., Perez, H. I., Manjarrez, N. & Flores, M. (2012) Microbial decoloration of azo dyes: a review. Process Biochemistry, 47(12),1723–1748. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2012.08.014.
Taslimi, P., Adiguzel, A., Nadaroglu, H., Bozoglu, C. & Gulluce, M. (2013) Removal of some textile dyes from aqueous solution by using a catalase-peroxidase from Aeribacillus pallidus (P26). Journal of Pure and Applied Microbiology, 7(4), 2629-2640.‏
Tosuner, Z. V. & Ürek, R. Ö. (2020) Evaluation of sucrose as carbon source in mixotrophic culture of Arthrospira platensis Gomont 1892. Aquatic Research, 3(1), 1-12.‏ https://doi.org/10.3153/AR20001.
Troschl, C., Meixner, K. & Drosg, B. (2017) Cyanobacterial PHA production—Review of recent advances and a summary of three years’ working experience running a pilot plant. Bioengineering, 4(2), 26.‏ https://doi.org/10.3390/bioengineering4020026.
Valli Nachiyar, C., Sunkar, S., Narendra Kumar, G., Karunya, A., Ananth, P. B., Prakash, P., & Anuradha Jabasingh, S. (2012) Biodegradation of Acid blue 113 containing textile effluent by constructed aerobic bacterial consortia: Optimization and mechanism. Journal of Bioremediation and Biodegradation, 3(162). http://dx.doi.org/10.4172/2155-6199.1000162.
Verma, R., Kumari, K. K., Srivastava, A. & Kumar, A. (2020) Photoautotrophic, mixotrophic, and heterotrophic culture media optimization for enhanced microalgae production. Journal of Environmental Chemical Engineering, 8(5), 104149. https://doi.org/10.1016/j.jece.2020.104149.
Wang, L., Xiao, H., He, N., Sun, D. & Duan, S. (2019) Biosorption and biodegradation of the environmental hormone nonylphenol by four marine microalgae. Scientific Reports, 9(1), 1-11.‏ https://doi.org/10.1038/s41598-019-41808-8.
Zhang, W. W., Zhou, X. F., Zhang, Y. L., Cheng, P. F., Ma, R., Cheng, W. L. & Chu, H. Q. (2018) Enhancing astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis by coupled light intensity and nitrogen starvation in column photobioreactors. Journal of Microbiology and Biotechnology, 28(12), 2019–2028. https://doi.org/10.4014/jmb.1807.07008.
Zhang, Z., Sun, D., Zhang, Y. & Chen, F. (2019) Glucose triggers cell structure changes and regulates astaxanthin biosynthesis in Chromochloris zofingiensis. Algal Research, 39, 101455. https://doi.org/10.1016/j.algal.2019.101455.
Zarrouk, C. (1966) Contribution a l'etude d'une Cyanophycee. Influence de Divers Facteurs Physiques et Chimiques sur la croissance et la photosynthese de Spirulina mixima. Thesis. University of Paris, France.‏
Zavrel, T., Sinetova, M. & Cervený, J. (2015) Measurement of chlorophyll a and carotenoids concentration in cyanobacteria. Bio-Protocol, 5(9), 1-5. http://www.bio-protocol.org/e1467.
Zohoorian, H., Ahmadzadeh, H., Molazadeh, M., Shourian, M. & Lyon, S. (2020) Microalgal bioremediation of heavy metals and dyes. In: Handbook of Algal Science, Technology and Medicine 659-674.‏ Academic Press. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-818305-2.00041-3.
Journal of Plant Biological Sciences
Volume 15, Issue 3 - Serial Number 57
September 2023
Pages 45-76

Files

History

  • Receive Date: 19 June 2024
  • Revise Date: 02 July 2024
  • Accept Date: 08 July 2024

Share

How to cite

Statistics