The effect of plant growth regulators and biostimulants on callus formation of Catharanthus roseus

Document Type : Original Article

Authors

Department of Production Engineering and Plant Genetics, Faculty of Agriculture and Natural Resources, University of Mohaghegh Ardabili

Abstract

Catharanthus roseus is a medicinal plant that is of great importance due to its abundant production of the alkaloids vincristine and vinblastine and their use in the production of anticancer drugs. Given the high price of these compounds and their small amounts in this plant, efforts to increase the production of these compounds have led to extensive research on this plant. The aim of the present study is to investigate and test various factors affecting callus formation in Catharanthus roseus, such as plant hormones (2.4-D (0.5, 1, 1.5 mg/L), NAA (0.5, 1, 3 mg/L), and BAP (0.5, 1, 3 mg/L)), ascorbic acid (50, 100, and 150 mg/L), melatonin, and yeast extract (50, 100, and 150 mg/L), as well as to investigate the best method for disinfecting Catharanthus roseus seeds. The results of the study showed that for disinfection of Parvansh seeds, the best method with the highest percentage of survival and the lowest percentage of fungal and bacterial contamination is related to the anti-infection of sodium hypochlorite at 2.5%. Also, the appropriate culture medium for callus growth is MS culture medium containing 1 mg/L NAA and 1 mg/L BAP. Also, in the ascorbic acid treatment, the highest fresh weight of callus was observed in the 150 mg/L ascorbic acid treatment (0.0872), which had the least color change (browning). Also, the results of examining the morphological characteristics of calluses treated with melatonin and yeast extract showed that the highest percentage of callus formation and the highest fresh weight of callus were related to yeast extract at a concentration of 150 mg/L.
  
Introduction
Medicinal plants have played a vital role in human life since ancient times, and today, about 80% of the medicines we consume have plant roots. Catharanthus roseus, native to Madagascar and tropical regions, is one of these natural treasures that has attracted attention due to its valuable medicinal compounds, especially anticancer alkaloids such as vinblastine and vincristine. For the sustainable production of these compounds, modern cultivation methods such as in vitro culture (tissue culture) are used. In this method, different parts of the plant, such as callus, hairy roots, stem, and leaves, can be used to produce seedlings and control the amount of alkaloids. Plant hormones, especially auxin and cytokinin, play a key role in growth and development, as well as the process of callus formation. Research has shown that the appropriate composition and concentration of these hormones can significantly affect the dry weight of callus and the production of alkaloids; For example, the combination of BAP and NAA has yielded positive results. In addition to hormones, substances such as ascorbic acid (vitamin C), yeast extract, and melatonin also help improve callus formation and plant resistance. Ascorbic acid, as a potent antioxidant, plays a role in cell division and growth, and yeast extract increases metabolic activity by providing nutrients and natural hormones. Melatonin, with its antioxidant properties, also reduces oxidative stress and stimulates cell division. The primary objective of this research is to identify the most effective method of seed disinfection and to examine the impact of varying concentrations of plant hormones, ascorbic acid, melatonin, and yeast extract on the callus formation process in the Parvanesh plant, aiming to optimize the production of valuable medicinal compounds.
 
Materials and Methods
In this study, Parvansh seeds were obtained from Pakan Seed Company, Isfahan. Seed disinfection and initial cultivation: For seed disinfection, 70% alcohol and three different concentrations of sodium hypochlorite (1.5%, 2.5%, and 5%) were used. After washing and drying, the seeds were cultivated in MS culture medium (without hormones) and first in the dark (temperature 24 ± 2 °C) and then in controlled light conditions (16 hours of light, 8 hours of darkness) for germination. Investigation of hormones for callus formation: When the seedlings reached the 8-leaf stage, the leaves were cut into small pieces (0.5 to 1 cm) and placed as explants on MS culture medium containing different combinations of plant hormones 2.4-D, NAA, and BAP. After 4 weeks, the percentage and fresh weight of calluses were measured. Effect of ascorbic acid: After determining the best hormone combination (NAA 1 mg/L + BAP 1 mg/L), different concentrations of ascorbic acid (50, 100, and 150 mg/L) were added to this culture medium (using a syringe filter for sterilization). Then, leaf explants were cultured on these media, and the percentage and fresh weight of calluses were evaluated. Effect of melatonin and yeast extract: In the next step, melatonin and yeast extract were also added in three similar concentrations (50, 100, and 150 mg/L) to the culture medium containing NAA and BAP hormones (this time before autoclaving). Callus growth was examined after 20 days. Statistical analysis: All experiments were performed in a completely randomized design with three replications, and data were analyzed using SPSS software and Duncan's test. Graphs were also drawn using Excel.
 
Results and Discussion
The results showed that the seed disinfection method plays a vital role in the success of cultivation. 2.5% sodium hypochlorite gave the highest percentage of seed viability, indicating its high efficiency in eliminating bacterial and fungal contamination while maintaining seed health. In contrast, 5% sodium hypochlorite had the lowest viability, and the use of 70% alcohol and 1.5% sodium hypochlorite resulted in the highest contamination. Different combinations of plant hormones were tested to stimulate callus formation from leaf explants. The results showed that MS medium containing 1 mg/L NAA and 1 mg/L BAP, as well as MS medium containing 1 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BAP, produced the highest callus fresh weight. The highest callus formation percentage (95.23%) was also observed in the same hormonal combination (1 mg/L NAA and 1 mg/L BAP), indicating the importance of hormonal balance in the callus formation process. Adding ascorbic acid to the culture medium significantly improved callus formation and callus quality. A concentration of 150 mg/L ascorbic acid not only resulted in the highest callus formation percentage (86.19%) and callus fresh weight, but also significantly prevented callus browning. This indicates that ascorbic acid plays an essential role in reducing oxidative stress and maintaining callus health. In investigating the effect of yeast extract and melatonin, the results showed that yeast extract at different concentrations, especially 150 mg/L, was able to produce 100% callus formation and the highest callus fresh weight (0.633 g). In contrast, melatonin at a concentration of 150 mg/L resulted in the lowest callus percentage and weight. This finding confirms the importance of yeast extract as a rich source of nutrients and growth regulators in improving callus formation.
 
Conclusion
The best method of seed disinfection is the use of 2.5% sodium hypochlorite, which provides high viability and low contamination. The optimal composition for callus production includes MS medium with 1 mg/L NAA and 1 mg/L BAP. An ascorbic acid concentration of 150 mg/L has the highest percentage of callus formation. Yeast extract at a concentration of 150 mg/L increases callus formation, but melatonin at higher concentrations inhibits callus growth.

Keywords

Main Subjects

Full Text

مقدمه

استفاده از گیاهان دارویی همزمان با آغاز بشریت و زندگی انسان بر روی کره زمین است. انسان‌های نخستین بدون هیچ شناخت و اطلاعاتی از ترکیبات موجود در این گیاهان از آن‌ها استفاده می­کردند، امّا امروزه اهمیت این گیاهان و ترکیبات موجود در آن‌ها در زندگی بشر اهمیت چشمگیری پیدا کرده ‌است. امروزه حدود 80 درصد از مواد دارویی مورد استفاده بشر به طور مستقیم و یا غیر مستقیم از گیاهان دارویی تأمین می‌شود، به طوری که از بین 252 داروی تائید شده توسط سازمان بهداشت جهانی 11 درصد آن را داروهایی با منشاء گیاهی تشکیل می‌دهند (Kumar et al., 2022). گیاه پروانش با نام علمی Catharanthus roseous از خانواده آپوسیناسه است و در نقاط مختلف ایران با نام­های متفاوتی شناخته شده است که از جمله آن­ها می­توان به قصاب­مصری، گل تلفنی و ونکه­ی صغیره اشاره کرد. گیاه پروانش بومی مناطق جنوب شرقی و شرق ماداگاسکار است و در مناطق گرمسیری نیز یافت می‌شود. پروانش دارای سطح پلوئیدی 16=n2 است. راه‌های مختلفی جهت پرورش این گیاه وجود دارد. امروزه استفاده از کشت درون شیشه‌ای در داخل اتاقک‌های رشد گیاهی و محیط‌های کشت جامد و مایع یکی از این روش‌ها است. کشت سلول در شرایط آزمایشگاهی سبب می­شود که بتوانیم دارای متابولیت­های ارزشمند در تمام فصول و با مقدار و کیفیت مورد نظر باشیم (Sharafi et al., 2014). در کشت بافت از قسمت‌های مختلف گیاه می­توان استفاده کرد. در روش کشت درون شیشه‌ای این گیاه از بافت‌ها و اندام‌هایی از جمله کالوس، ریشه های موئین، ساقه، برگ و ... می­توان جهت تولید گیاهچه و تغییر در میزان آلکالوئید‌ها استفاده نمود (Ahmadi et al., 2012). نقش اصلی هورمون‌های گیاهی تنظیم تمام فرآیندهای فیزیولوژیکی و رشد گیاه است. ساختارهای هورمون‌ها مانند اکسین، سیتوکینین، جیبرلین، اسیدآبسزیک، اتیلن، پلی‌آمین‌ها، جاسمونات، اسید سالیسیلیک و بر اسیتوستروئیدها متنوع هستند. در میان هورمون‌ها، اکسین وسیتوکینین برای تنظیم بسیاری از فرآیندهای رشد، نمو و کشت بافت ضروری است. اکسین سبب رشد ریشه و سیتوکینین هورمون مهارکننده رشد ریشه است (Schaller et al., 2015; Hagen & Guilfoyle, 2002; Bajguz & Piotrowska, 2009; Schaller et al., 2015). وزن مولکولی هورمون‌های گیاهی بسیار پائین است و در غلظت میکرومولار و کمتر عمل می‌کنند. نقش اصلی هورمون‌های گیاهی تنظیم تمام فرآیندهای فیزیولوژیکی و رشد گیاه است. در زمینه تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی بر ریز ازدیادی و تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاه پروانش، پژوهش‌های متعددی انجام شده است. (2019) Rahman et al. و (2017)Kumari & Ra  نشان داده‌اند که ترکیب‌های مختلف اکسین و سیتوکینین، به طور قابل توجهی بر وزن خشک کالوس و میزان تولید آلکالوئیدهای وین‌بلاستین و وین‌کریستین تأثیر می‌گذارند. به طور خاص، غلظت 3 میلی‌گرم در لیتر BAP و 3 میلی‌گرم در لیتر NAA بیشترین وزن خشک را ایجاد کرده، و ترکیب2.4-D /NAA حداکثر میزان وین‌بلاستین و وین‌کریستین را به همراه داشته است. در مقابل، IAA/NAA سبب کاهش بیوسنتز آلکالوئیدها شده است. همچنین، (2011) Singh et al. گزارش کردند ریزنمونه‌های هیپوکوتیل در محیط کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر BAP و 1 میلی‌گرم در لیتر NAA، در شرایط تاریکی، بیشترین پاسخ القای کالوس (99%) را در مدت 10 روز نشان داده‌اند. این یافته‌ها نشان می‌دهند که انتخاب مناسب تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی و شرایط محیطی، نقش مهمی در بهینه‌سازی ریزازدیادی و تولید ترکیبات دارویی در گیاه پروانش دارد. اسیدآسکوربیک یک ویتامین محلول در آب است و جزء متابولیت‌های مهم در گیاهان محسوب می‌شود که در اکثر فرآورده‌های گیاهی به ویژه مرکبات، گوجه فرنگی، گیاهان سبز و سیب‌زمینی به مقدار زیادی وجود دارد. از سوی دیگر، اسید آسکوربیک در شرایط طبیعی به شکل احیا شده ‌است که در نتیجه فعالیت دو آنزیم دی‌هیدروآسکوربات‌ ردوکتاز و مونو هیدرو آسکوربات ‌ردوکتاز است. اسید آسکوربیک به عنوان یک آنتی‌اکسیدان در گیاهان مطرح می­شود که در ارتباط با دیگر ترکیبات آنتی‌اکسیدانی بوده و با پاکسازی اشکال اکسیژن واکنشی، گیاه را در برابر تنش‌های اکسیداتیو حفاظت می­کند (Smirnoff, 1996). اسید آسکوربیک می‌تواند چرخه سلولی، تقسیم سلولی و رشد سلولی را در گیاهان تعدیل کند و بدین ترتیب، در رشد و نمو گیاهی درگیر شود. پژوهش‌های مختلف نشان می‌دهند هر جا فعالیت میتوزی زیاد باشد، مقدار اسید آسکوربیک هم در S به G زیاد است و حضور آن برای عبور از مرحله چرخه سلولی، ضروری است. این ماده، توسط کوتاه کردن زمان G و تحریک ورود به مرحله S، سبب کوتاه شدن زمان چرخه سلولی شده و با دخالت در این چرخه، منجر به افزایش رشد سلول گیاهی می‌شود ‌(Smirnoff, 1996). عصاره مخمر به عنوان یک منبع طبیعی برای بسیاری از تیامین‌ها، موادمعدنی، ریبوفلاوین‌ها، نیاسین، پیریدوکسین و ویتامین B1، B2، B3، B12، سیتوکینین و مواد مغذی همچنین ترکیبات آلی کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها، اسید نوکلئیک‌ها و لیپیدها است. محتوای اکسین و سیتوکینین در عصاره مخمر بسیار بالا است (Keramati et al., 2011). عصاره مخمر با تأثیرگذاری بر هورمون‌های گیاهی، بهبود شرایط محیطی و افزایش فعالیت‌های متابولیکی می‌تواند به تقویت فرآیند کالوس‌زایی کمک کند. این تأثیرات می‌تواند به افزایش کیفیت و تعداد کالوس‌های تولید شده در آزمایش‌های کشت بافت گیاهی منجر شود. علاوه بر عصاره مخمر، ملاتونین نیز به عنوان یک تنظیم‌کننده رشد گیاهی نقش مهمی در کالوس‌زایی دارد؛ این هورمون با خواص آنتی‌اکسیدانی خود، به کاهش استرس اکسیداتیو در بافت‌های گیاهی کمک کرده و می‌تواند فرآیند تقسیم سلولی و تمایز سلولی را تحریک نماید، در نتیجه سبب بهبود تشکیل و رشد کالوس می‌شود. ملاتونین (ان-استیل 5- متوکسی تریپتامین) در سال 1958 اولین بار از غده پینه‌آل گاوی شناسایی و جدا شد و در گیاهان تک لپه و دولپه نیز در سال 1995 شناسایی و جداسازی شد. ملاتونین در گیاهان نقش‌های متنوعی دارد که عبارتند از: 1) تنظیم ریتم شبانه‌روزی 2) تنظیم رشد و نمو گیاه 3) آنتی‌اکسیدان قوی 4) حفظ تمامیت غشاء و جلوگیری از پراکسیداسیون لیپید 5) تأثیر بر دستگاه فتوسنتز 6) مقاومت گیاه در برابر تنش‌های محیطی (Olumi & Ahmadi Mousavi, 2012). هدف از این پژوهش، بررسی بهترین روش ضدعفونی بذر با بیشترین درصد زنده­مانی و ارزیابی سطوح مختلف هورمون­های گیاهی، اسید آسکوربیک ، ملاتونین و عصاره مخمر بر کالوس‌زایی گیاه پروانش است.

 

مواد و روش‌ها

مواد گیاهی

در این پژوهش، بذرهای گیاه پروانش از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد.

 

ضدعفونی و کشت بذر

برای تعیین روش ضدعفونی مناسب بذرهای گیاه پروانش، از درصدهای مختلف هیپوکلریت سدیم استفاده شد: ابتدا بذرها با آب دیونیزه اتوکلاو شده شستشو داده شدند، سپس بذرها به سه قسمت تقسیم شد: قسمت اول بذرها ابتدا در الکل 70% به مدت 3 دقیقه غوطه‌ور شده سپس با آب دیونیزه شستشو داده شد و بعد با هیپوکلریت سدیم 5/1 درصد به مدت 20 دقیقه ضدعفونی شدند. در نهایت بذرها 3 مرتبه با آب دیونیزه اتوکلاو شده و هر بار به مدت 5 دقیقه شستشو داده شدند. تمامی روش‌های ذکر شده برای دو قسمت دیگر نیز تکرار شد ولی برای یک قسمت از هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد و برای قسمت دیگر از هیپوکلریت سدیم 5 درصد استفاده شد. سپس بذرهای ضدعفونی شده توسط کاغذ صافی اتوکلاو شده خشک شدند. در نهایت توسط پنس استریل در محیط کشت MS بدون هورمون کشت شده و تا زمان جوانه‌زنی در اتاقک رشد در تاریکی و دمای 2±24 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. پس از ظاهر شدن جوانه‌ها، در قفسه‌های اتاقک رشد با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند.

 

بررسی ترکیب هورمونی مناسب کالوس­زایی

پس از رسیدن گیاهچه­ها به سن مناسب (8 برگی)، برگ­ها به قطعات 5/0 تا 1 سانتی­متری برش داده شده و به عنوان ریز نمونه بر روی محیط کشت MS حاوی ترکیبات مختلف هورمون­های گیاهی 2.4-D (5/0، 1 و 5/1 میلی­گرم در لیتر)، NAA (5/0، 1 و 3 میلی­گرم در لیتر) و BAP (5/0، 1 و 3 میلی­گرم در لیتر) کشت شدند (جدول 3) و تحت دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و دمای 25 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند و پس از گذشت 4 هفته درصد کالوس­زایی و وزن تر کالوس اندازه­گیری شد.

 

بررسی تأثیر اسیدآسکوربیک بر کالوس­زایی

پس از تعیین بهترین ترکیب هورمون‌های گیاهی (1 NAA+ 1 BAP)، تأثیر غلظت‌های مختلف اسیدآسکوربیک بر کالوس­زایی در این محیط کشت مورد ارزیابی قرار گرفت. به علت حساس بودن اسید آسکوربیک به دمای بالا از فیلتر سر سرنگی برای استریل آسکوربیک اسید استفاده شد و پس از اتوکلاو کردن محیط کشت و سرد شدن آن تا دمای حدود 45-40 درجه سانتی‌گراد، غلظت‌های مورد نیاز برای مقادیر 50، 100 و 150 میلی‌گرم در لیتر به محیط‌های کشت افزوده شد. ریزنمونه‌های برگی به قطعات کوچک تقسیم شدند و بر روی این محیط کشت­ها قرار داده‌ شدند. پس از رشد کالوس، درصد کالوس­زایی و وزن تر کالوس‌ها اندازه‌گیری و با یکدیگر مقایسه شدند.

 

بررسی تأثیر ملاتونین و عصاره مخمر بر کالوس‌زایی

محیط کشت مورد استفاده، محیط MS دارای هورمون‌های NAA و BAP به میزان 1 میلی‌گرم در لیتر بودکه قبل از اتوکلاو غلظت‌های مورد نیاز ملاتونین برای مقادیر 50، 100 و 150 میلی‌گرم در لیتر به محیط‌های کشت افزوده شد. همچنین عصاره مخمر نیز قبل از اتوکلاو در غلظت­های 50، 100 و 150 میلی­گرم در لیتر به محیط کشت افزوده شد. ریزنمونه­های کالوس بر روی محیط کشت­ها قرار داده شدند و پس از گذشت 20 روز میزان رشد کالوس­ها مورد ارزیابی قرار گرفت.

 

تجزیه و تحلیل آماری

آزمایش­ها بر پایه طرح کامل تصادفی در سه تکرار انجام شد. تجزیه و تحلیل آماری داده‌های آزمایش‌ توسط نرم افزار SPSS و مقایسه میانگین نیز توسط آزمون دانکن در سطح احتمال 5% انجام شد. نمودارها با نرم‌افزار Microsoft office Excel 2016 رسم شد.

 

نتایج

تعیین مناسب ترین روش ضدعفونی

نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول 1) نشان دادند بین تیمارهای ضدعفونی از نظر آلودگی باکتریایی، آلودگی قارچی و زنده‌مانی بذور اختلاف معنی‌داری وجود داشت. علاوه بر این با توجه به نتایج به دست آمده (شکل 1) مشاهده شد که بیشترین درصد زنده‌مانی در تیمار ضدعفونی با هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد (شکل 2) و کمترین درصد زنده‌مانی در تیمار ضدعفونی با هیپوکلریت سدیم 5 درصد مشاهده شد (شکل 3). بیشترین درصد آلودگی مربوط به ضدعفونی با الکل 70% و هیپوکلریت سدیم 5/1% و کمترین درصد آلودگی مربوط به ضدعفونی با الکل 70% و هیپوکلریت سدیم 5% است.

 

 

جدول1 - تجزیه واریانس تأثیر تیمارهای مختلف ضدعفونی بر میزان آلودگی و زنده­مانی ریزنمونه برگی

Table 1 - Analysis of variance of the effect of different disinfection treatments on the percentage of contamination and live leaf explants

Sources of change

Degree of freedom

Meansquares

Live explant

Bacterial contamination

Fungal contamination

disinfection treatments

2

1644.44**

300**

1011**

Error

6

188.8

66.66

122.22

Coefficient of variation (percentage)

-

53.77

49.01

67.46

** معنی‌داری در سطح احتمال 1٪                                                                          

**Significant at 1% probability level

 

شکل 1- تأثیر روش ضدعفونی بر درصد ریزنمونه­های زنده و غیر آلوده، دارای آلودگی قارچی و دارای آلودگی باکتریایی در پروانش. ضدعفونی اول: ضدعفونی با اتانول 70% و هیپوکلریت سدیم 5/1%، ضدعفونی دوم: ضدعفونی با اتانول 70% و هیپوکلریت سدیم 5/2%، و ضدعفونی سوم: ضدعفونی با اتانول 70% و هیپوکلریت سدیم 5%. حروف مختلف نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد است. میانگین ارائه شده دارای حداقل 3 تکرار است.

Figure 1- Effect of disinfection methods on the percentage of viable and non-infected explants, fungally contaminated and bacterially contaminated in Provansh. First disinfection: disinfection with 70% ethanol and 1.5% sodium hypochlorite, second disinfection: disinfection with 70% ethanol and 2.5% sodium hypochlorite, and third disinfection: disinfection with 70% ethanol and 5% sodium hypochlorite. Different letters indicate significant differences at the 1% probability level. The average presented has at least 3 replicates.

 

شکل 2- گیاهچه‌های حاصل از بذرهای زنده و غیرآلوده مربوط به تیمار ضدعفونی با هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد.

Figure 2- Seedlings from live, uncontaminated seeds treated with 2.5% sodium hypochlorite.

 

شکل 3- ریزنمونه‌ها با آلودگی قارچی و باکتریایی.

Figure 3 - Explants with fungal and bacterial contamination.

 

تعیین محیط کشت مناسب کالوس‌زایی

ریزنمونه‌های برگی پس از انتقال به محیط‌های کالوس‌زایی حاوی غلظت‌های مختلف NAA و BAP و 2,4-D پس از گذشت 8 تا 10 روز شروع به متورم شدن و تولید کالوس کردند (شکل 4). بر اساس نتایج تجزیه واریانس، تیمارهای مختلف از نظر وزن ‌تر کالوس و درصد کالوس‌زایی اختلاف معنی­داری در سطح احتمال یک درصد داشتند ( جدول 2). با توجه به نتایج حاصل از مقایسه میانگین (جدول 3) بیشترین وزن تر کالوس (866/0و 862/0 گرم) در محیط کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP و همچنین محیط کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP مشاهده شد. کمترین وزن کالوس (0378/0) نیز در محیط کشت MS بدون هورمون مشاهده شد و همچنین بیشترین درصد کالوس‌زایی(23/95) در محیط کشت MS  حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP و نیز محیط کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 5/1 میلی‌گرم در لیتر BAP مشاهده شد. کمترین درصد کالوس‌زایی (14/57) نیز در محیط کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP مشاهده شد (شکل 5).  

 

 

شکل 4- الف) ریزنمونه‌های برگی پس از انتقال به محیط‌ کالوس‌زایی، ب) شروع کالوس­زایی ریزنمونه‌ها پس از گذشت حدود 2 هفته.

Figure 4- A) Leaf explants after transfer to callus medium, B) Start of callus formation of explants after about 2 weeks.

 

جدول 2- تجزیه واریانس درصد کالوس‌زایی و وزن ‌تر کالوس پروانش تحت تاثیر ترکیبات هورمونی مختلف

Table 2- Analysis of variance of callus formation percentage and fresh weight of callus seedlings under the influence of different hormonal compounds

Sources of change

Degree of freedom

Mean squares

Callus formation percentage

Callus fresh weigh

hormonal compounds

11

1650.652**

0.351**

Error

24

102.046

0.0001

Coefficient of variation (percentage)

-

14.22

4.2

** معنی‌دار در سطح احتمال 1%           

**Significant at the 1% probability level

                                                                                                                                                           

جدول 3- میانگین درصد کالوس‌زایی و وزن‌ تر کالوس در ترکیبات هورمونی مختلف. میانگین ارائه شده دارای حداقل 3 تکرار است.

Table 3- Average callus formation percentage and callus fresh weight in different hormone combinations. The average presented has at least 3 replicates.

Plant hormones (mg/L)

Callus formation percentage

Callus fresh weight

Callus tissue

Callus color

2,4-D

BAP

NAA

-

0.5

0.5

76.190abcd

0.07823cd

Soft

Milky

-

1

0.5

80.950abc

0.09510c

Soft

Milky

-

0.5

1

85.173ab

0.04863ef

Soft

Milky

-

1

1

95.236a

0.86600a

Soft

Milky

-

3

3

90.473a

0.66530a

Soft

Milky

-

-

-

61.903cd

0.03777f

Soft

Milky

1

1.5

-

9.523c

0.03810f

Compact

Brown

0.5

1

-

71.42bcd

0.06520de

Soft

Milky

1

0.5

-

95.23a

0.86230a

Soft

Milky

1

1

-

57.14d

0.0442ef

Soft

Milky

1.5

1.5

-

61.90cd

0.470ef

Soft

Milky
               

 حروف مختلف نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد است.

Different letters indicate significant differences at the 1% probability level.

 

شکل 5- 1) کالوس‌زایی حاوی تیمار 1 شامل 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر BAP 2) تیمار 2 شامل 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP، 3) تیمار 3 شامل 1 میلی‌گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP، 4) تیمار 4 شامل 1 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP، 5) تیمار 5 شامل 3 میلی‌گرم در لیتر NAA و 3 میلی‌گرم در لیتر BAP، 6) تیمار 6 محیط کشت MS بدون هورمون، 7) تیمار 7 شامل 5/1 میلی­گرم در لیتر BAP و 1 میلی­گرم در لیتر 2.4-D، 8)تیمار 8 شامل 1 میلی­گرم در لیتر BAP و 5/0 میلی­گرم در لیتر 2.4-D، 9)تیمار 9 شامل 5/0میلی­گرم در لیتر BAP و 1 میلی­گرم در لیتر 2.4-D

Figure 5- 1) Callus formation containing treatment 1 including 0.5 mg/L NAA and 0.5 mg/L BAP 2) Treatment 2 including 0.5 mg/L NAA and 1 mg/L BAP, 3) Treatment 3 including 1 mg/L NAA and 0.5 mg/L BAP, 4) Treatment 4 including 1 mg/L NAA and 1 mg/L BAP, 5) Treatment 5 including 3 mg/L NAA and 3 mg/L BAP, 6) Treatment 6 MS culture medium without hormones, 7) Treatment 7 including 1.5 mg/L BAP and 1 mg/L 2.4-D, 8) Treatment 8 including 1 mg/L BAP and 0.5 mg/L 2.4-D, 9) Treatment 9 including 0.5 mg/L BAP and 1 mg/L 2.4-D

 

 

تأثیر اسید آسکوربیک بر کالوس‌زایی

نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول 4) نشان دادند غلظت­های مختلف اسیدآسکوربیک اختلاف معنی­داری با هم دارند. ریزنمونه‌های کشت شده در محیط کشت بدون اسید آسکوربیک و محیط کشت دارای 50 میلی‌گرم در لیتر اسید آسکوربیک تقریبا به­طور همزمان شروع به کالوس‌زایی کردند و حدود دو هفته پس از کشت اولین آثار تشکیل کالوس در آن‌ها مشاهده شد. امّا کالوس‌های حاصل پس از چند روز شروع به قهوه‌ای شدن کردند و همچنین دارای اندازه و حجم کمی بودند. ریز نمونه‌های کشت شده در تیمار 100 و 150 میلی‌گرم در لیتر اسید آسکوربیک نیز تقریباً همزمان شروع به کالوس‌زایی کردند و کالوس‌های حاصل دارای اندازه و حجم بزرگ­تری بودند و قهوه‌ای نشدند (شکل 6). بالاترین درصد کالوس‌زایی (190/86) متعلق به تیمار 150 میلی‌گرم در لیتر اسید آسکوربیک و کمترین درصد تشکیل کالوس (439/50) هم در تیمار شاهد مشاهده شد. بالاترین وزن تر کالوس در تیمار 150 میلی‌گرم در لیتر اسید آسکوربیک (0872/0) مشاهده شد که کمترین تغییر رنگ (قهوه‌ای شدن) را داشت. همچنین در تیمار 50 میلی‌گرم در لیتر و شاهد بیشترین میزان قهوه‌ای شدن کالوس‌ها مشاهده شد (جدول 5).

جدول 4- جدول تجزیه واریانس کالوس­زایی در غلظت‌های مختلف اسید آسکوربیک

Table 4 - Analysis of variance of callus formation at different concentrations of ascorbic acid

Sources of change

Degree of freedom

Mean squares

ascorbic acid

3

0.0309**

Error

8

0.004

Coefficient of variation (percentage)

-

12.22

** معنی‌داری در سطح احتمال 1%                                                             

**Significant at the 1% probability level

 

جدول 5- میانگین درصد کالوس‌زایی و وزن ‌تر کالوس در غلظت‌های مختلف اسید آسکوربیک. میانگین ارائه شده دارای حداقل 3 تکرار است.

Table 5- Average callus formation percentage and callus fresh weight at different concentrations of ascorbic acid. The average presented has at least 3 replicates.

Ascorbic acid concentration

Callus formation percentage

Callus fresh weight

Type of texture

Callus color

0

50.439d

0.0159d

Soft

brown

50

61.783c

0.0287c

Soft

brown

100

75.513b

0.0456b

Soft

Milky

150

86.190a

0.0872a

Soft

Milky

 حروف مختلف نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد است.

Different letters indicate significant differences at the 1% probability level.

 

تأثیر ملاتونین و عصاره مخمر بر کالوس‌زایی

نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول 6) نشان دادند بین غلظت­های مختلف عصاره مخمر و ملاتونین از نظر کالوس‌زایی و وزن ‌تر کالوس اختلاف معنی‌داری وجود دارد. نتایج حاصل از مقایسه میانگین (جدول 8) نشان داد که بیشترین درصد کالوس‌زایی (100 درصد) مربوط به عصاره مخمر در غلظت‌های مختلف و شاهد است. همچنین بیشترین وزن ‌تر کالوس (633/0 گرم) مربوط به عصاره مخمر با غلظت 150میلی‌گرم در لیتر بود همچنین کمترین درصد کالوس‌زایی(16/66) مربوط به ملاتونین در غلظت 150میلی‌گرم در لیتر و کمترین وزن تر کالوس(038/0) مربوط به ملاتونین در غلظت 150 میلی‌گرم در لیتر است (شکل 7).

 

شکل 6- ریزنمونه‌های قهوه‌ای شده کالوس شاهد (چپ)، ریزنمونه سالم کالوس غلظت 150 میلی­گرم در لیتر اسید آسکوربیک (راست).

Figure 6- Browned explants of control callus (left), healthy explant of callus with a concentration of 150 mg/L of ascorbic acid (right)

 

شکل 7- کالوس‌زایی در محیط کشت MS حاوی 1 میلی­گرم در لیتر NAA همراه با 1 میلی­گرم در لیتر BAP، با اعمال تیمار ، غلظت 150 ملاتونین(الف) و مخمر(ب) و شاهد (ج)

Figure 7- Callus formation in MS culture medium containing 1 mg/L NAA with 1 mg/L BAP, with treatment, concentration of 150 melatonin (a) and yeast (b) and control (c)

 

جدول 6- تجزیه واریانس درصد کالوس‌زایی و وزن ‌تر کالوس پروانش تحت تأثیر غلظت‌های مختلف عصاره مخمر و ملاتونین

Table 6- Analysis of variance of callus formation percentage and fresh weight of callus of Provence under the influence of different concentrations of yeast extract and melatonin

Sources of change

Degree of freedom

Mean squares

Callus fresh weight

Callus formation percentage

yeast extract and melatonin

6

0.133**

2807.540**

Error

14

0.003

90.702

Coefficient of variation (percentage)

 

59.08

37.73

** معنی‌داری در سطح احتمال 1

**Significant at the 1% probability level

 

شکل 8- میانگین درصد کالوس‌زایی و وزن ‌ترکالوس تحت تأثیر غلظت­های مختلف عصاره مخمر و ملاتونین. میانگین ارائه شده دارای حداقل 3 تکرار است.

Figure 8- Average callus formation percentage and callus weight under the influence of different concentrations of yeast extract and melatonin. The average presented has at least 3 replicates.

   

بحث

بررسی روش­های ضدعفونی بذر گیاه پروانش نشان دادند بهترین تیمار ضدعفونی با توجه به بیشترین درصد ریزنمونه زنده و کمترین درصد آلودگی باکتریایی و قارچی ریزنمونه بذر با تیمار ضدعفونی هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد است. در ریزنمونه‌های بذر ضدعفونی شده با هیپوکلریت سدیم 5 درصد نسبت به غلظت‌های 5/2 و 5/1 درصد میزان آلودگی کمتر ولی زنده‌مانی پائینی را نشان داد. بررسی مناسب‌ترین محیط کشت با ترکیبات هورمونی مختلف نشان داد که با توجه به بیشترین درصد کالوس‌زایی و بیشترین وزن‌‌تر کالوس بهترین محیط برای کالوس‌زایی ریزنمونه‌های برگ، محیط MS حاوی 1 میلی‌گرم بر لیتر NAA و 1 میلی‌گرم بر لیتر BAP است. البته پژوهش‌های زیادی جهت بررسی محیط مناسب کالوس‌زایی گیاه پروانش صورت گرفته است. در یک پژوهش، (2011) Singh et al. نشان دادند استفاده از 1 میلی‌گرم در لیتر BAP و 1 میلی‌گرم در لیتر NAA در محیط کشت MS سبب ایجاد بالاترین پاسخ القای کالوس (99%) پس از 10 روز در ریزنمونه‌های هیپوکوتیل می‌شود. این نتایج به وضوح نشان‌دهنده اهمیت غلظت‌ها و ترکیب‌های تنظیم‌کننده‌های رشد در القای کالوس و افزایش ریزازدیادی هستند. پژوهش‌های بعدی نشان دادند تغییر غلظت و ترکیب اکسین و سیتوکینین می‌تواند تأثیرات قابل توجهی بر روی وزن خشک و بیوسنتز آلکالوئیدها داشته باشد. (2019) Rahman et al. توسط غلظت‌های 3 میلی‌گرم در لیتر BAP و 3 میلی‌گرم در لیتر NAA به بیشترین وزن خشک در کالوس پروانش دست یافتند. این موضوع نشان‌دهنده این است که تنظیم ترکیب‌ها و غلظت‌ها می‌تواند به بهبود ویژگی‌های رشد گیاه و تولید ترکیبات مفید کمک کند. در پژوهش دیگر، (2010) Kalidass et al. به بررسی اثر ترکیبات مختلف اکسین و سیتوکینین در تولید وین‌کریستین از رشد کالوس پرداختند. نتایج آن‌ها نشان داد ترکیب 1 میکرومولار NAA و 5/0 میکرومولار BAP بیشترین تولید وین‌کریستین را به همراه داشت. این نکته نشان می‌دهد که نه تنها غلظت، بلکه نوع ترکیبات اکسین و سیتوکینین نیز در بهینه‌سازی تولید متابولیت‌های ثانویه مهم است. (2012)Udhaya Arivalagan et al.  نیز تأثیر نوع و غلظت تنظیم‌کننده‌های رشد بر کالوس‌زایی گیاه کاتوک را بررسی کردند و نشان دادند که محیط کشت MS با ترکیب خاصی از NAA و kin سبب کالوس‌زایی بالایی می‌شود. این نتایج به اهمیت محیط کشت و ترکیبات موجود در آن در فرآیند کشت بافت تأکید می‌کند. در نهایت،(2023)  AlQaseer & Al-Rekaby با بررسی پاسخ پروانش به محرک‌های رشد خارجی بیان کردند که در محیط MS با 1 میلی‌گرم از NAA و kin، بهترین رشد رویشی مشاهده شد. این پژوهش‌ها به وضوح نشان دهنده اهمیت تنظیم‌کننده‌های گیاهی در بهبود رشد و تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاه پروانش و کشت بافت به‌طور کلی است.

نتایج حاصل از کالوس‌زایی در غظت‌های مختلف اسید آسکوریک نیز نشان داد که بالاترین درصد کالوس‌زایی، متعلق به تیمار 150 میلی‌گرم در لیتر اسید آسکوربیک و پس از آن تیمار 100 میلی‌گرم در لیتر بود. همچنین کالوس‌های حاصل دارای اندازه و حجم بزرگتری بودند و قهوه‌ای نشدند. به طورکلی اسید آسکوربیک تأثیر مثبت و معناداری بر رشد کالوس‌ها داشت و مقدار 150میلی‌گرم در لیتر آن سبب شد تا کالوس‌هایی با اندازه بزرگتر و بدون تغییر رنگ داشته باشیم. کالوس‌زایی تحت تیمار ملاتونین و عصاره مخمر نیز مورد بررسی قرار گرفت که بیشترین درصد کالوس‌زایی و بیشترین وزن‌تر کالوس در غلظت 150میلی‌گرم بر لیتر عصاره مخمر مشاهده شد. با توجه به نتایج به دست آمده نشان داده شد عصاره مخمر به علت افزایش فعالیت­های هورمون­های گیاهی سبب افزایش کالوس­زایی شده و ملاتونین سبب کاهش کالوس­زایی گیاه می­شود، زیرا هرچه میزان غلظت ملاتونین افزایش پیدا کند عمل بازدارنده بر رشد کالوس­ها دارد.

References

Ahmadi, J., Mohammadi, R., Grosi, Q., & Hosseini, R.) 2012(. Optimization of callus formation and cell suspension of Catharanthus roseus. Journal of Agricultural Biotechnology, 4(1), 1-18. https://doi.org/10.22103/jab.2012.464 [In Persian]
AlQaseer, Z. F., & Al-Rekaby, L. S. (2023). Response Catharanthus roseus to plant Ggrowth regulators in vitro. In IOP Conference Series: Earth and Environmental Science (Vol. 1215, No. 1, p. 012030). IOP Publishing.          https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1755-1315/1215/1/012030
Bajguz, A., & Piotrowska, A. (2009). Conjugates of auxin and cytokinin. Phytochemistry, 70(8), 957-969.  ‏ https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2009.05.006
Hagen, G., & Guilfoyle, T. (2002). Auxin-responsive gene expression: genes, promoters and regulatory factors. Plant Molecular Biology, 49(3), 373-385.‏ https://doi.org/10.1023/A:1015207114117
Kalidass, C., Mohan, V. R., & Daniel, A. (2010). Effect of auxin and cytokinin on vincristine production by callus cultures of Catharanthus roseus L. (Apocynaceae). Tropical and Subtropical Agroecosystems, 12(2), 283-288.            ‏ https://www.cabidigitallibrary.org/doi/full/10.5555/20103106748
Karamati, S., Gholami, A., Baradaran Firouzabadi, M., & Abbas Dokht, H. (2011). The effect of yeast extract on physiological and biochemical indices of Vigna unguiculata drought stress conditions. Agricultural Crops, 23(2), 247-261 https://doi.org/10.22059/jci.2020.295925.2338 [In Persian]
 
 
 
Kumar, S., Singh, B., & Singh, R. (2022). Catharanthus roseus (L.) G. Don: A review of its ethnobotany, phytochemistry, ethnopharmacology and toxicities. Journal of Ethnopharmacology, 284, 114647.https://doi.org/10.1016/j.jep.2021.114647
Kumari, A., & Ra, S. (2017). Evaluation of total phenolic, flavonoid content, and DPPH free radical scavenging activity of methanolic extract of Ailanthus excelsa roxb. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 10(4), 8-11. ‏ https://doi.org/10.22159/ajpcr.2017.v10i4.16507
Olumi, H., & Ahmadi Mousavi. A. (2012). Melatonin, a growth regulator and potent antioxidant in plants. Plant Process and Function, (1), 37-54.       https://jispp.iut.ac.ir/article-1-1621-fa.html [In Persian]
Rahman, N. N. A., Rosli, R., Kadzimin, S., & Hakiman, M. (2019). Effects of auxin and cytokinin on callus induction in Catharanthus roseus (L.) G. Don. Fundamental and Applied Agriculture, 4(3), 928-932.  ‏ https://doi.org/10.5455/faa.54779  
Schaller, G. E., Bishopp, A., & Kieber, J. J. (2015). The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Journal of the Plant Cell, 27(1), 44-63.    ‏ https://doi.org/10.1105/tpc.114.133595
Sharafi, A., Hassanloo, T., Khayyam-Nekoui, M., Foutokian, M., & Davoudi, D. )2014). Effects of application of zinc and iron oxide nanoparticles and type of explant on shoot formation and callus survival of Calendula officinalis in vitro conditions. Quarterly Journal of Agricultural Engineering and Natural Resources, 11, 43. https://www.magiran.com/p1284220 [In Persian]
Singh, R., Kharb, P., & Rani, K. (2011). Rapid micropropagation and callus induction of Catharanthus roseus in vitro using different explants. World Journal of Agricultural Sciences, 7(6), 699-704.‏ https://B2n.ir/nb4575
Smirnoff, N. (1996). Botanical briefing: the function and metabolism of ascorbic acid in plants. Annals of Botany, 78(6), 661-669.‏ https://doi.org/10.1006/anbo.1996.0175
Udhaya Arivalagan, U. A., Alderson, P. G., & Arun Nagarajan, A. N. (2012). Effect of growth hormones on callus induction of Sauropus androgynous (sweet shoot).‏ Annals of Biological Research, 3(10), 4668-4674. https://www.cabidigitallibrary.org/doi/full/10.5555/20123375081 
Journal of Plant Biological Sciences
Volume 16, Issue 3 - Serial Number 61
September 2024
Pages 79-94

Files

History

  • Receive Date: 14 May 2025
  • Revise Date: 26 August 2025
  • Accept Date: 26 August 2025

Share

How to cite

Statistics