The impact of nitrogen concentration on the physiological responses of rice seedlings after inoculation with Azospirillum brasilence

Document Type : Original Article

Authors

1 1Department of Biology-Plant Physiology, Faculty of Science, Golestan University, Gorgan, Iran

2 Department of Soil and Water Research, Golestan's Agricultural and Natural Resources Research Center, Gorgan, Iran

Abstract

Azospirillum is one of the most important plant growth-promoting bacteria,  with the ability to fix nitrogen. The current study aimed to investigate the physiological responses of rice plants with different nitrogen concentrations when inoculated with Azospirillum brasilense. In this experiment, the growth and physiological responses of 21-day-old rice seedlings (Oryza sativa L., cv. Hashemi) were investigated after 4 weeks of treatment with different nitrogen levels, including complete nitrogen (N), half (N/2), fourth (N/4), and zero nitrogen (control) concentrations under two inoculated (AB) and non-inoculated (NI) conditions. The experiment was conducted in a completely randomized design with 4 replications. The current data showed that nitrogen concentration significantly affects all measured parameters in both AB and NI plants. The highest values of growth traits, biomass accumulation, photosynthetic pigments, soluble sugars, and antioxidant enzyme activities (catalase and peroxidase) were observed in plants treated with full nitrogen and inoculated with A. brasilense. These findings highlight the potential of A. brasilense to enhance nitrogen efficiency in agricultural crops. Meanwhile, our data showed that inoculation with A. brasilense can improve rice plant productivity, especially under optimal nitrogen conditions.
Introduction
Rice (Oryza sativa) is a monocotyledonous plant that belongs to the Poaceae family. Rice is a strategic crop and the primary food source for more than half of the world’s population. The increase in rice cultivation areas in our country and the widespread use of chemical fertilizers have led to the emergence of various diseases. Today, the use of Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) is considered an alternative to chemical fertilizers. These bacteria are present in the rhizosphere of plants and enhance plant growth in various ways, including increasing nutrient absorption, producing plant hormones, and protecting plants against pathogens. These bacteria enhance mineral nutrient uptake by stimulating root system development. A group of PGPRs is called endophytes. Endophytes are non-pathogenic bacteria that spend part of their life cycle within plant tissues. So far, various types of nitrogen-fixing endophytes have been identified and reported in the stems, roots, and seeds of rice.
Azospirillum is one of the most important plant growth-promoting bacteria, capable of fixing nitrogen. Recently, this bacterium has been used as a biofertilizer, especially in areas facing nitrogen deficiency. By fixing atmospheric nitrogen and converting it into a usable form, Azospirillum brasilense improves nitrogen efficiency and reduces demand for chemical fertilizers.  The current study aimed to investigate the physiological responses of rice seedlings to different nitrogen concentrations when inoculated with Azospirillum brasilense.
 
Methods and Materials
 In this experiment, Azospirillum brasilense was prepared from the Soil Biology Laboratory of the Agricultural Research and Education Center of Golestan province. Then, the bacteria were cultured and identified on a specific RC medium. After selecting a single colony of the desired bacteria, the bacteria were cultured on NFB liquid medium at 30 °C for 48 hours. Rice seeds of the Hashemi cultivar were obtained from the National Rice Research Institute (AML). After surface sterilization, the seeds were placed on moist filter paper at 29 °C for germination. Then, the 7-day-old seedlings were transferred to Yoshida culture medium under a photoperiod of 18 h day (33 °C) and 6 h night (22 °C), with a relative humidity of 71%. In the next step, 21-day-old rice seedlings were treated with Yoshida medium containing nitrogen levels: complete nitrogen (N), half nitrogen (N/2), quarter nitrogen (N/4), and zero nitrogen (control) under two inoculation conditions: inoculated (AB) and non-inoculated (NI). After 4 weeks of treatment, the roots of rice seedlings were collected, and various growth parameters and several biochemical factors were examined. The experiment was conducted in a completely randomized design with four replications.
 Results and Discussion Microscopic observations revealed that the bacteria first settled on the root epidermis and then entered the root cells. After passing through the epidermis, the bacteria penetrated the parenchyma layer and formed colonies. The results showed that small and large colonies, with single or scattered bacteria, were observed in the root cells. On the other hand, the current data showed that nitrogen concentration significantly affects all measured parameters in both AB and NI plants. The highest amount ​​of root and shoot length, root fresh and dry weight, shoot dry weight, total dry and fresh weight, relative growth, soluble and total shoot sugar, chlorophyll b, and total chlorophyll were observed in the treatment with both full nitrogen concentration and inoculation with A. brasilense. Also, the present data revealed that seedlings inoculated with Azospirillum performed better than the non-inoculated samples.Meanwhile, current data showed that catalase enzyme activity increased with increased nitrogen concentration (in both inoculated and non-inoculated conditions). However, catalase enzyme activity was higher in inoculated seedlings at all nitrogen levels, compared to non-inoculated seedlings. These data indicate that inoculation with A. brasilense increases oxidative stress tolerance in rice seedlings. This evidence suggests that this bacterium improves plant resilience to treatment with different nitrogen concentrations and enhances their ability to scavenge reactive oxygen species (ROS) produced during nitrogen metabolism. The present data showed that peroxidase enzyme activity increased with higher nitrogen concentrations, in both inoculated and non-inoculated conditions.
 
Conclusion
The present results showed that inoculating rice seedlings with A. brasilense can significantly enhance their physiological responses. At all nitrogen concentrations, treatment improved the growth of inoculated plants, which showed higher protein content and enzyme activity compared to non-inoculated seedlings. These findings highlight the potential of A. brasilense to enhance nitrogen efficiency in crops. Meanwhile, our data showed that inoculation with A. brasilense can improve rice seedling productivity, especially under optimal nitrogen conditions.

Keywords

Main Subjects

Full Text

مقدمه

امروزه میکروارگانیسم‌ها نقش مهمی را در کشاورزی پایدار ایفا می­کنند. میکروارگانیسم­ها با افزایش جذب مواد مغذی، مقاومت در برابر تنش­های زیستی و غیرزیستی، بهبود سلامت خاک و حمایت از تنوع زیستی به عملکرد اکوسیستم کمک می­کنند (Elsheikh et al., 2021).

اندوفیت­ها میکروارگانیسم­هایی هستند که بدون ایجاد بیماری در بافت­های گیاهی زندگی می­کنند. این موجودات با افزایش جذب مواد مغذی، تولید هورمون­های گیاهی و محافظت از گیاهان در برابر عوامل بیماری­زا، رشد گیاه را افزایش می‌دهند (Prasad, 2023). باکتری­های اندوفیت به کمک سازوکارهای مختلف رشد گیاه را افزایش می­دهند. این باکتری‌ها فیتوهورمون­هایی مانند اکسین، جیبرلین و سیتوکینین تولید می­کنند که رشد ریشه را تحریک کرده و جذب مواد مغذی را بهبود می­بخشند. این هورمون­ها با توسعه سیستم ریشه، گیاهان را قادر می­سازند تا به آب و مواد مغذی بیشتری از خاک دسترسی پیدا کنند. علاوه بر این، اندوفیت­ها می­توانند فسفر را حل کرده و این ماده مغذی حیاتی را در دسترس گیاهان قرار دهند. آنها همچنین نیتروژن اتمسفر را که برای رشد گیاه ضروری است، تثبیت می­کنند (Adeleke et al., 2021). باکتری­های اندوفیت همچنین سبب ایجاد مقاومت سیستمیک در گیاهان شده و در دفع پاتوژن­ها و آفات نقش دارند که این امر نیاز به آفت­کش­های شیمیایی را کاهش داده و به کشاورزی پایدار کمک می‌کنند (Elsheikh et al., 2021; Prasad, 2023).

باکتری Azospirillum brasilense یک باکتری تثبیت­کننده نیتروژن شاخص است که به طور گسترده به علّت نقش آن در تقویت رشد گیاهان، به ویژه در غلاتی مانند برنج، ذرت و گندم شناخته شده است. این باکتری به عنوان یک ریزوباکتری محرک رشد گیاه یا (PGPR) Plant Growth promoting hizobacteria طبقه­بندی می­شود که بر همکنش­های مفیدی را با ریشه گیاهان جهت رشد و افزایش جذب مواد مغذی و مقاومت در برابر تنش ایجاد می­کند. به تازگی از این باکتری به عنوان کود زیستی، به ویژه در مناطقی که با کمبود نیتروژن مواجه هستند، استفاده می­شود. توسط تثبیت نیتروژن اتمسفر و تبدیل آن به شکل قابل استفاده توسط A. brasilense، کارایی مصرف نیتروژن در گیاهان بهبود یافته و نیاز به کودهای شیمیایی کاهش می‌یابد (Zeffa et al., 2019).

نیتروژن (N) یکی از حیاتی­ترین مواد مغذی برای برنج است که فرآیندهای کلیدی مانند سنتز پروتئین، تجمع زیست­توده و رشد کلی گیاه را تحت تأثیر قرار می­دهد. از نظر فیزیولوژیکی، نیتروژن مستقیماً بر روی رشد ریشه و اندام هوایی و همچنین توانایی گیاه در جذب سایر مواد مغذی تأثیر می گذارد (Xin et al., 2019). تثبیت زیستی نیتروژن یا (BNF) Biological Nitrogen Fixation فرآیندی است که در آن باکتری­هایی مانند A. brasilense نیتروژن اتمسفر (N2) را به آمونیاک (NH3) تبدیل می­کنند. این فرآیند برای گیاهان مختلف از جمله برنج از اهمیت خاصی برخوردار است. پژوهش‌ها نشان داده است که A. brasilense می‌تواند جذب نیتروژن را به طور قابل توجهی در برنج افزایش دهد و در نتیجه منجر به عملکرد بالاتر و بهبود کارایی مصرف نیتروژن ­شود (Thomas et al., 2019).

پژوهشگران نشان داده­اند تلقیح گیاه برنج با A. brasilense سبب افزایش زیست توده بخش هوایی در مراحل حیاتی رشد مانند تولید برگ­ و پرکردن دانه شود (García et al., 2010). همچنین نتایج برخی دیگر از پژوهشگران نشان داده که تلقیح همزمان گیاهانی مانند برنج، گوجه فرنگی و فلفل قرمز با باکتری‌هایی مانند Methylobacterium oryzae و A. brasilense سبب افزایش غلظت نیتروژن و فسفر در این گیاهان شده و همچنین فعالیت آنزیم­های نیتروژناز و فسفاتاز را افزایش می­دهد (Madhaiyan et al., 2010). پژوهش‌های انجام شده بر روی گیاه ذرت نشان داده که تیمار توام کود نیتروژن به همراه تلقیح با A. brasilense سبب افزایش رشد، محتوای کلروفیل و فعالیت آنزیم­های کلیدی می­شود. این پژوهش نشان داد تلقیح گیاهان با A. brasilense، زمانی که با تیمار کود نیتروژن همراه شود، رشد گیاه و سلامت خاک را افزایش می‌دهد (Morais et al., 2021). نتایج پژوهش‌های انجام شده بر روی گیاه گندم تلقیح شده با A. brasilense که به طور همزمان با سه سطح مختلف کود نیتروژن نیز تیمار شده بودند نشان داد که تلقیح سبب افزایش جذب نیتروژن، فعالیت آنزیم نیترات ردوکتاز و گلوتامین­سنتتاز و محتوای کلروفیل شده است. همچنین این پژوهشگران نشان دادند که حتی در گیاهانی که با سطوح پائین نیتروژن تیمار شده بودند، تلقیح باکتری سبب افزایش رشد در این گیاهان می­شود (Silveria et al., 2016). سایر پژوهش‌ها نیز نشان دادند تیمار توام غلظت­های مختلف نیتروژن و تلقیح با A. brasilense بر رشد گیاه و تبادل گاز در گیاه ذرت تأثیر دارد. نتایج این پژوهش نشان داد غلظت­های بالاتر نیتروژن در ترکیب با تلقیح باکتریایی، فتوسنتز، هدایت روزنه­ای و شاخص­های رشد گیاه مانند قطر ساقه و سطح برگ را به طور قابل توجهی بهبود می­بخشد (Palheta, 2021). از سوی دیگر، نتایج پژوهش‌های دیگر پژوهشگران نیز نشان داد که تلقیح توام گیاهچه­های برنج با باکتری A. brasilense به همراه تیمار هورمونی سبب افزایش شاخص­های رشدی در گیاه برنج می­شود (Sharifalsadat et al., 2023).

برنج یکی از مهمترین محصولات کشاورزی در سراسر جهان است که بیش از نیمی از جمعیت جهان از آن تغذیه می­کنند.  قاره آسیا بیش از 90 درصد از تولید جهانی برنج را به خود اختصاص داده است (Fukagawa & Ziska, 2019). برنج مانند همه محصولات زراعی برای رشد، نمو و عملکرد مناسب نیاز به تأمین متعادلی از عناصر درشت مغذی و ریز مغذی دارد. نیتروژن یک ماده مغذی حیاتی برای رشد و عملکرد برنج است. این عنصر برای رشد برگ و تشکیل کلروفیل ضروری بوده و در فتوسنتز نقش دارد (White & Brown, 2010). هدف از پژوهش حاضر بررسی اثر غلظت­های مختلف نیتروژن بر پاسخ­های فیزیولوژیکی گیاهان برنج تلقیح شده با باکتری اندوفیت A. brasilense است. این پژوهش به بررسی چگونگی تأثیر سطوح مختلف نیتروژن بر رشد، فعالیت­های آنزیمی و فاکتورهای بیوشیمیایی در گیاهان برنج، با تمرکز بر نقش بالقوه A. brasilense در تخفیف اثرات ناشی از کمبود نیتروژن می­پردازد.

 

مواد و روش­ها

خالص­سازی و آماده­سازی کشت باکتری: به این منظور، باکتری­ها به شکل یک کلنی منفرد از روی محیط کشت اختصاصی RC جامد شناسایی شده و برای خالص­سازی در محیط کشت مایع Nfb غنی­شده با مقدار یک گرم در لیتر کلرور آمونیوم، در انکوباتور (30 درجه سانتی­گراد) رشد داده شدند. پس از 48 ساعت، باکتری­ها بر اساس تولید هاله سفید- رنگ (که نشان دهنده رشد آنها است) شناسایی و به مدت 20 دقیقه در 5000 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. سپس محلول رویی حذف شده و سپس توده باکتری توسط محلول بافر فسفات نمکی (شامل 2/0 گرم KH2PO4، 15/1 گرم K2HPO4 و 5/7 گرم NaCl در 1000سی‌سی آب با 2/7pH=) دو بار شستشو شدند. سپس با افزودن بافر فسفات نمکی به توده باکتری جذب نوری محلول در طول موج 540 نانومتر برابر 05/1 تنظیم شد. در این وضعیت غلظت باکتری CFU/ml 109 است، که با رقیق­کردن مداوم این محیط و مطابقت با معیار مک فارلند، غلظت CFU/ml 106 بدست آمد. برای اطمینان، رقت­هایی از غلظت­های فوق تهیه شده و بر روی محیط کشت RC کشت شدند. شمارش کلنی و ضرب تعداد آن در ضریب رقت، غلظت CFU/ml 106 را تأئید کرد.

کشت بذر و تولید گیاهچه: بذر برنج (Oryza sativa L.) رقم هاشمی از موسسه تحقیقات برنج کشور (آمل) تهیه شد. سپس بذرها با آب ژاول 3% به مدت 5 دقیقه و به دنبال آن با اتانول 96 % به مدت 30 ثانیه به خوبی ضدعفونی شدند. پس از 3 بار شستشو با آب مقطر استریل، بذرها بر روی کاغذ صافی مرطوب در دمای 29 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند تا جوانه زنی صورت گیرد. پس از انتقال گیاهچه­های 7 روزه به محیط کشت یوشیدا (Yoshida & Coronel, 1975)، در اتاق کشت با درجه حرارت حداقل و حداکثر در شب و روز به ترتیب 22 و 33 درجه سانتی­گراد و رطوبت نسبی 70 درصد وumolm-2s-1 720 Photosynthetic photon folx با طول موج بین 700-400 نانومتر نگهداری شدند. به طور روزانه pH محلول غذایی یوشیدا بر روی 2/0 ± 6 تنظیم و در پایان هر هفته محلول­های غذایی تعویض شدند. گیاهچه­ها پس از دو هفته آماده تلقیح با باکتری A. brasilense شدند.

تلقیح باکتری: در ادامه گیاهچه­های (21 روزه) از محیط کشت یوشیدا خارج و در سوسپانسیون حاوی A. brasilense با غلظت 100 باکتری در هر میلی­لیتر قرار داده شدند. پس از 24 ساعت مجددا گیاهچه­ها به محیط کشت یوشیدا حاوی غلظت های مختلف نیتروژن (کامل، یک دوم، یک چهارم و فاقد نیتروژن یا شاهد) منتقل شدند. منبع اصلی نیتروژن در محیط کشت یوشیدا نیترات آمونیوم است که در این آزمایش جهت بررسی اثر غلظت‌های مختلف نیتروژن از غلظت­های مختلف نیترات آمونیوم به صورت کامل، یک دوم، یک چهارم و بدون نیترات آمونیوم (شاهد یا کنترل) در محیط کشت استفاده شد. پس از چهار هفته رشد در شرایط اتاقک کشت، گیاهچه­ها برداشت شده و فاکتورهای مختلف رشد و بیوشیمیایی مورد بررسی قرار گرفتند.

مشاهدات میکروسکوپی: برای اطمینان از ورود باکتری به ریشه، رنگ آمیزی ساده آنیلین بلو انجام شد. جهت انجام آن ریشه گیاهچه­ها به مدت 5 دقیقه در آب مقطر قرار داده شده و سپس با آنیلین بلو 05/0 به مدت 3 الی 5 دقیقه رنگ­آمیزی شدند. پس از سه بار شستشو با آب مقطر، نمونه­ها نمونه­ها با میکروسکوپ نوری مجهز به دوربین دیجیتال (BH2, Olympus, Japan) با بزرگنمایی 100× مورد بررسی و عکس­برداری شدند.

اندازه­گیری وزن خشک و تر نمونه­ها: پس از نمونه­برداری، وزن خشک و تر ریشه و اندام هوایی در کلیه تیمارها به طور جداگانه اندازه­گیری شد. برای تعیین وزن تر نمونه­ها با ترازو توزین شدند و برای تعیین وزن خشک نمونه­ها در دستگاه آون در دمای ۳۷ درجه سانتی­گراد به مدت سه روز خشک شده و مجددا با ترازو توزین شدند.

اندازه­گیری سرعت رشد نسبی: سرعت رشد نسبی گیاه بر اساس وزن خشک کل در روز و با استفاده از معادله زیر محاسبه شد:

 

PGR= (ln W₂- ln W₁) / (T2-T₁)

که در آن PGR سرعت رشد نسبی، W2 وزن خشک نهایی بعد از تیمار، W وزن خشک گیاه یک روز بعد از تیمار و T نشان­دهنده روزهای تیمار در روزهای 1و ۲۸ است.

 

سنجش قند‌های محلول: سنجش قندهای محلول به روش  McCready et al. (1950) صورت گرفت. در ابتدا به 05/0 گرم از پودر خشک نمونه­ها پنج میلی لیتر اتانول 70% اضافه و به مدت یک هفته دریخچال نگهداری شد. سپس عصاره موردنظر به مدت 15 دقیقه در 10000 دور در دقیقه ودر دمای اتاق سانتریفیوژ شد. از سوپرناتانت (محلول بالایی) برای سنجش قندهای محلول استفاده شد. در نهایت طول موج نمونه­ها در 485 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شده و مقدار قند محلول نمونه­ها توسط منحنی استاندارد گلوکز و براساس میلی­گرم بر گرم وزن خشک گیاه محاسبه شد.

پروتئین محلول: ابتدا مقدار 1/0 گرم از بافت تر ریشه در هاون چینی با دو میلی­لیتر بافر فسفات 1/0 مولار با 8/6 = pH هموژن شده و سپس به مدت ۱۵ دقیقه در 13000 دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ شد. از فاز بالایی عصاره به­دست آمده برای اندازه­گیری پروتئین محلول به روش Bradford (1976) و توسط رنگ کوماسی برلیانت بلو انجام شد. در این آزمایش مقدار جذب نمونه­ها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج ۵۹۵ نانومتر اندازه­گیری شد. در ادامه مقدار پروتئین محلول نمونه­ها توسط منحنی استاندارد آلبومین محاسبه شد.

پروتئین کل: استخراج پروتئین کل توسط روش مارک­ول انجام شد (Markwell et al., 1981). در این روش مقدار 05/0 گرم بافت تر ریشه با 1 میلی­لیتر بافر تریس 100 میلی­مولار با 9=pH حاوی EDTA 1 میلی­مولار، PMSF 1 میلی­مولار، Triton 1/0 درصد و PVPP 06/0 درصد در هاون چینی سرد سائیده شد و در g 15000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس مقدار 100 میکرولیتر از عصاره پروتئینی استخراج شده با 3 میلی­لیتر معرف مخلوط و به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق قرار داده شد. در ادامه مقدار 300 میکرولیتر از معرف فولین رقیق­شده به آن اضافه و به شدت ورتکس شد. پس از 45 دقیقه جذب در طول موج 750 نانومتر خوانده شد. در این آزمایش منحنی استاندارد توسط سرم آلبومین رسم شد.

 

اندازه­ گیری فعالیت آنزیم­ های کاتالاز و پراکسیداز

تهیه عصاره آنزیمی: مقدار 05/0 گرم از بافت ریشه در یک هاون چینی سرد (که بر روی ظرف یخ قرار داده شده بود) با دو میلی لیتر بافر فسفات 1/0 مولار (8/6 pH=) سائیده شده و سپس به مدت 15 دقیقه در 16000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ شد. از فاز رویی برای اندازه­گیری فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز استفاده شد (Kar & Mishra, 1976).

اندازه­گیری فعالیت کاتالاز در مد سینتیک و در طول موج 240 نانومتر انجام شد (Maehly & Chance, 1954). جهت این کار، به۱۰۰ میکرولیتر از عصاره آنزیمی، سه میلی­لیتر مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی مولار با 8/6 pH=، آب اکسیژنه ۱۵ میلی مولار اضافه شد.

فعالیت آنزیم پراکسیداز محلول نیز در مد سینتیک و در طول موج 471 نانومتر اندازه­گیری شد. در این آزمایش معرف مورد نیاز گایاکول است. جهت انجام کار، به 51 میکرولیتر عصاره آنزیمی مقدار 3 میلی­لیتر مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 25 میلی مولار (8/6 pH=)، گایاکول 21 میلی مولار،آب اکسیژنه 41 میلی مولار اضافه شد. در نهایت فعالیت آنزیمی(پراکسیداز وکاتالاز) براساس معادله زیر محاسبه شد:

Activity (U/mL) = (ΔA / (Ɛ × d)) × V

که در این معادله ΔA برابر با تغییر جذب نور در دقیقه، Ɛ برابر با ضریب خاموشی مولی گایاکول، d برابر با طول مسیر نور (معمولاً 1 سانتی‌متر) و V برابر با حجم نهایی مخلوط واکنش (بر حسب میلی‌لیتر) است.

 

اندازه­گیری فسفر و نیتروژن

عصاره­گیری: ابتدا مقدار 1 گرم از نمونه­های پودر شده را در بوته­های چینی ریخته و سپس به مدت ۱۲-۴ ساعت در کوره­ی الکتریکی با دمای ۵۵۰ درجه سانتی­گراد سوزانده شده تا به خاکستر تبدیل شوند. پس از سرد­شدن کامل نمونه­ها، آب مقطر به همراه 5 میلی لیتر اسید کلریدریک 2 نرمال به خاکستر به آن اضافه شد. نمونه­ها به مدت نیم ساعت در حمام آبی در دمای ۱۰۰ درجه سانتی­گراد حرارت داده شدند و سپس محتویات بوته به بالن ژوژه­۵۰ میلی­لیتری منتقل و با آب مقطر به حجم ۵۰ میلی لیتر رسانده شدند. در انتها نمونه­ها توسط کاغذ واتمن ۴۲ صاف شده و در ظروف پلاستیکی کوچک درب­دار در یخچال تا زمان مصرف نگهداری شدند (Ugulu, 2015).  

برای اندازه­گیری فسفر، 5 میلی­لیتر عصاره گیاهی به یک فلاسک 25 میلی­لیتری منتقل و به آن پنج میلی­لیتر محلول آمونیوم وانادات اضافه شد. مقدار جذب نمونه­ها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 470 نانومتر اندازه­گیری شد. همچنین مقدار فسفر توسط منحنی­ استاندارد فسفات پتاسیم محاسبه شد (Olsen & Wateanabe, 1963).

 نیتروژن کل: در این توسط اسید سولفوسالیسیلیک غلیظ، کل ترکیبات حاوی نیتروژن موجود در بافت‌های گیاهی، در اثر حرارت و مجاورت با کاتالیزور به سولفات آمونیوم تبدیل شده و سپس با تقطیر مخلوط حاوی سولفات آمونیوم و در مجاورت سود 10 نرمال، گاز آمونیاک متصاعد می شود که بعد از سرد شدن توسط اسید بوریک جمع آوری شده وبا استفاده از یک اسید رقیق تیتر شد. حجم اسید مصرفی متناسب با مقدار نیتروژن موجود در نمونه­های گیاهی است (Kjeldahl, 1983).

رنگیزه­های فتوسنتزی: ابتدا پنج گرم بافت تازه گیاهی در هاون با 10 میلی لیتر استون 80% هموژن و سپس مخلوط به دست آمده به مدت 10 دقیقه در 2000 دور سانتریفیوژ شد. جذب نمونه­ها در طول موج 480، 510، 645 و 663 نانومتر خوانده و مقدار رنگیزه­ها محاسبه شد (Arnon, 1949).  

تحلیل آماری: در این پژوهش کلیه سنجش­ها در 4 تکرار انجام شد. تجزیه و تحلیل داده­ها توسط نرم افزار SPSS 16 با آزمون ANOVA دو طرفه (کمترین تفاوت معنی دارLSD) با سطح معنی‌داری 05/0< P انجام شد. علاوه بر این، از نرم افزار Excel  برای رسم نمودارها استفاده شده است.

 

نتایج‌

مشاهدات میکروسکوپی

 نتایج حاصل از مشاهدات میکروسکوپی نشان داد که ابتدا باکتری­ها در سطح لایه­ی اپیدرم ریشه مستقر شده و پس از آن باکتری­ها به درون سلول­های ریشه راه یافتند. پس از عبور از لایه اپیدرم، باکتری­ها به لایه پارانشیم نفوذ کرده و کلنی تشکیل دادند. در نهایت کلنی­های کوچک و بزرگ و با آرایش منفرد و پراکنده از باکتری­ها در سلول­های ریشه مشاهده شد (شکل 1).

 

شکل 1- تشکیل کلنی باکتریایی در ریشه گیاه برنج تلقیح یافته با باکتری A.brasiliensis بعد از 24ساعت

Figure 1- Colony formation in rice root inoculated with Azosperilum braziliensis after 24 hours

 

فاکتورهای رشد

 بررسی و تحلیل داده­های به دست آمده نشان داد که اثر تیمار غلظت­های مختلف نیتروژن بر صفات رشدی مورد بررسی معنی­دار است. علاوه بر این، با افزایش غلظت نیتروژن در محیط کشت، صفات مورد بررسی افزایش معنی­داری را در مقایسه با نمونه شاهد نشان دادند. بالاترین مقدار صفات رشدی اندازه­گیری شده در تیمار با نیتروژن کامل (N) مشاهده شد. همچنین کمترین مقدار فاکتورهای رشد در نمونه شاهد (محیط کشت فاقد نیتروژن) مشاهده شد. از سوی دیگر، این نتایج نشان داد در تیمار شاهد تلقیح گیاهچه­ها تحت آزوسپریلوم (AB)، سبب افزایش معنی­دار در فاکتورهای رشد نشده است. همچنین بررسی داده­ها در سایر نمونه­ها نیز نشان داد که تفاوت معنی­داری در مقدار فاکتورهای رشد در نمونه­های تلقیح شده با آزوسپریلوم در مقایسه با نمونه تیمار نشده در همان غلظت نیتروژن تیمار شده وجود ندارد. بهترین مقدار فاکتورهای رشد در تیمار غلظت کامل نیتروژن و در نمونه­های تلقیح شده با آزوسپریلوم مشاهده شد (جدول 1).

 

 

فاکتورهای بیوشیمیایی

نتایج حاصل از اندازه­گیری مقدار قند محلول در اندام هوایی گیاهچه­های برنج هاشمی تلقیح شده و تلقیح نشده با A. brasilense در تیمار با غلظت‌های مختلف نیتروژن (نیتروژن کامل، یک دوم نیتروژن و یک چهارم نیتروژن) نشان داد که سطوح قند با افزایش غلظت نیتروژن در هر دو تیمار تلقیح یافته و تلقیح نشده افزایش یافته است (شکل 2). همچنین نتایج نشان داد گیاهچه­های در شرایط تلقیح یافته محتوای قند بالاتری نسبت به گیاهچه­های تلقیح نشده داشتند. از سوی دیگر، نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که در تیمار با غلظت یک چهارم نیتروژن (N/4) مقدار قند محلول در هر دو نمونه تلقیح شده و تلقیح نشده اختلاف معنی‌داری را با یکدیگر نشان نمی­دهند. بالاترین مقدار قند محلول (53/6 میلی گرم در هر گرم وزن تر) در گیاهچه­های تیمار شده با نیتروژن کل و در تلقیح با باکتری مشاهده شد (شکل A2).

نتایج حاصل از بررسی مقدار قند محلول در ریشه در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت های مختلف نیتروژن در شرایط تلقیح شده و تلقیح نشده نشان داد که مقدار قند محلول در ریشه گیاهچه­ها با افزایش غلظت نیتروژن در هر دو گروه افزایش می­یابد. همچنین نتایج حاضر نشان داد که اختلاف معنی­داری در غلظت­های تیمار شده در ریشه گیاهچه­های تلقیح شده نسبت به گیاهچه­های تلقیح نشده وجود دارد. همچنین با افزایش غلظت نیتروژن، مقدار قند محلول در نمونه­ها افزایش نشان داد. از سوی دیگر، در بالاترین غلظت نیتروژن به کار رفته (N) در بین دوگروه تلقیح شده و تلقیح نشده تفاوت معنی­داری دیده نمی­شود. آنالیز بیشتر نتایج نشان داد که در گروه کنترل، مقدار قند محلول در ریشه‌ی گیاهچه­های تلقیح شده بالاتر از نمونه تلقیح نشده بوده و تفاوت معنی­داری را نسبت به یکدیگر نشان می­دهند. داده­های حاضر نشان داد که بالاترین مقدار قند محلول (98/8 میلی­گرم در هر گرم وزن تر) در گیاهچه­های تیمار شده با نیتروژن کل و در تلقیح با باکتری مشاهده شد. پائین­ترین مقدار قند محلول ( 85/0 میلی­گرم در هر گرم وزن تر) نیز در تیمار شاهد و در نمونه های تلقیح نشده مشاهده شد (شکل B2).

بررسی مقدار قند کل در اندام هوایی گیاهچه‌هایی که در تیمار با غلظت­های مختلف نیتروژن قرار گرفته بودند، نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن در محیط کشت مقدار قند کل در اندام هوایی گیاهچه­ها افزایش یافت. از سوی دیگر، در تیمار شاهد و نیز نمونه­های تیمار شده با غلظت­های یک چهارم (N/4) و نصف (N/2) تفاوت معنی­داری بین نمونه­های تلقیح شده با گیاهچه­های تلقیح نشده با باکتری وجود ندارد. بالاترین مقدار قند کل در نمونه­هایی که به طور همزمان با نیتروژن کامل (N) و باکتری تلقیح شده­اند مشاهده شد. در این آزمایش بالاترین مقدار قند کل (65/17 میلی­گرم در هر گرم وزن تر) در گیاهچه­های تیمار شده با نیتروژن کل و در تلقیح با باکتری مشاهده شد (شکل C2). اندازه­گیری و بررسی مقدار قند کل ریشه در گیاهچه­های برنج هاشمی تیمار شده با غلظت­های مختلف نیتروژن نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن مقدار قند کل در ریشه گیاهچه‌ها نیز افزایش پیدا می‌کند (شکل D2). همچنین نتایج نشان دادند ریشه گیاهچه‌های تلقیح شده در مقایسه با ریشه گیاهچه‌های تلقیح نشده دارای مقدار قند کل بیشتری هستند. بر اساس نتایج حاضر، تفاوت معنی­داری بین نمونه­های تلقیح شده و تلقیح نشده در هر غلظت از نیتروژن تیمار شده وجود ندارد (شکل D2).

 

جدول 1- مقایسه اختلاف میانگین صفات رشد در گیاهچه­های برنج رقم هاشمی (Oryza sative) در تیمار با غلظت­های مختلف نیتروژن و تلقیح با باکتری آزوسپریلوم برازیلنس .(Azospirillum brazilense) نتایج میانگین 4 تکرار است. ستون‌های دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنی­داری در سطح 5% توسط آزمون کمترین تفاوت معنی­دار (LSD) نشان نمی‌دهند. Ctrl: کنترل؛ N/4: یک چهارم غلظت نیتروژن؛ N/2: نیمی از غلظت نیتروژن؛ N: غلظت نیتروژن کامل؛ AB: در شرایط تلقیح یافته؛ NI: در شرایط تلقیح نشده.

Table 1- Mean comparison of the growth parameters in rice seedlings (Hashemi cultivar) in treatment with different concentrations of Nitrogen and inoculation with Azospirillum brazilense. The results are the average of 4 replicates. Different letters show significant differences according to LSD test at P ≤ 0.05. Ctrl: Control, N/4: ¼ Nitrogen concentrations, N/2: ½ Nitrogen concentrations, N: Full Nitrogen concentration, AB: Inoculated with Azospirillum brazilense, NI: Without Inoclusion.

 

Growth parameters

AB/NI

N

N/2

N/4

Ctrl

Root length

AB

12/92±0/01 a

11/43±0/66 bc

9/64±067 c

6/05±0/40 de

 

NI

10/48±0/06 ab

9/46±0/67 bc

7/5±0/01cd

4/87±0/83 de

Aerial part length

AB

28/61±0/18 a

26/47±0/78 bc

19/98±0/19 cd

16/76±0/59 de

 

NI

24/09±0/05 ab

22/72±1/51 bc

18/83±0/16 cd

14/4±0/95 de

Fresh Root weight

AB

78/48±/012 a

73/47±1/19b

69/63±0/66 c

64/44±0/34 e

 

NI

72/4±0/14 ab

67/13±1/08bc

64/27±0/85 cd

59/59±1/21de

Aerial part fresh weight

AB

16/62±1/15 ab

15/34±1/18bc

14/04±1/46 cd

13/47±0/65 de

 

NI

14/95±0/47 ab

13/24±0/30bc

11/21±0/25 cd

10/23±0/95 de

Root dry weight

AB

0/57±0/012 a

0/53±0/015b

0/5±0/008 c

0/44±0/01 de

 

NI

0/44±0/006 ab

0/42±0/012bc

0/4±0/008 cd

0/36±0/008 de

Aerial part dry weight

AB

1/71±0/027 a

1/63±0/028b

1/55±0/012 c

1/38±0/07 e

 

NI

1/49±0/026 ab

1/42±0/023bc

1/41±0/012 cd

0/99±0/07 de

Total dry weight

AB

19/42±0/064 a

18/2±0/20b

17/19±0/23 c

15/79±0/6 e

 

NI

17/28±0/095 ab

16/33±0/46bc

14/32±0/20 cd

13/52±0/58 de

Total fresh weight

AB

95/39±0/10 a

88/77±0/57b

84/56±0/68 c

76/53±2/34 de

 

NI

86/49±0/26 ab

80/47±0/43bc

76/66±0/39 cd

72/83±1/82 de

Relative growth

AB

0.60±0.02 a

0.55±0.04 c

0.52±0.07 c

0.45±0.03 e

 

NI

0.53±0.072 ab

0.51±0.048 cd

0.46±0.051 cd

0.39±0.023 de

 

نتایج حاصل از سنجش مقدار پروتئین محلول در ریشه گیاهچه­های مورد بررسی نشان داد که در هر دو گروه گیاهچه­های تلقیح شده و تلقیح نشده، با افزایش غلظت نیتروژن مقدار پروتئین محلول در ریشه افزایش می­یابد. همچنین نتایج حاضر نشان دادند، اگر چه مقدار پروتئین محلول ریشه در تمام غلظت­ها در گیاهچه­های تلقیح شده در مقایسه با گیاهچه­های تلقیح نشده بالاتر هستند، امّا تفاوت معنی­داری بین این دو گروه وجود ندارد. بالاترین مقدار پروتئین محلول در گیاهچه­های تلقیح شده با باکتری که با غلظت کامل نیتروژن تیمار شده­اند به مقدار 72/0 میلی­گرم در هر گرم وزن تر مشاهده شد (شکل A3). از سوی دیگر نتایج حاصل نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن در محیط کشت، مقدار پروتئین کل افزایش می­یابد، امّا تفاوت معنی­داری بین نمونه‌های تلقیح شده و تلقیح­نشده با باکتری وجود ندارد. در این آزمایش بالاترین مقدار پروتئین کل (5/7 میلی­گرم در هر گرم وزن تر) در گیاهچه­های تیمار شده با نیتروژن کل و در تلقیح با باکتری مشاهده شد. همچنین پائین­ترین مقدار پروتئین کل ( 5/3 میلی­گرم در هر گرم وزن تر) نیز در تیمار شاهد و در نمونه­های تلقیح نشده مشاهده شد (شکل B3).

 

آنزیم­های آنتی اکسیدانت

بررسی فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمارهای مختلف نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن فعالیت آنزیم افزایش می­یابد. همچنین این نتایج نشان داد که تلقیح گیاهچه­ها با باکتری آزوسپریلیوم سبب افزایش معنی­دار در فعالیت آنزیم کاتالاز در مقایسه با نمونه­های تلقیح نشده می­شود. علاوه بر این، بالاترین میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (8/2 میکرومول در دقیقه در هر گرم وزن تر) در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت کامل نیتروژن و در تلقیح با باکتری دیده شده است. با این وجود، پائین­ترین میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (32/1 میکرومول در دقیقه در هر گرم وزن تر) در گیاهچه­های شاهد تلقیح نشده دیده شده است (شکل A4). بررسی فعالیت آنزیم پراکسیداز در گیاهچه های برنج هاشمی تلقیح شده و تلقیح نشده با A. brasilense در غلظت­های مختلف نیتروژن نشان داد با افزایش غلظت نیتروژن میزان فعالیت آنزیم نیز افزایش یافته و تفاوت معنی­داری بین نمونه‌های مختلف وجود دارد. نتایج حاضر نشان داد که بالاترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز ( 75/20 میکرومول در دقیقه در هر گرم وزن تر) در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت کامل نیتروژن و در تلقیح با باکتری دیده شده است. از سوی دیگر، پائین­ترین میزان فعالیت این آنزیم (60/9 میکرومول در دقیقه در هر گرم وزن تر) گیاهچه­های شاهد تلقیح نشده دیده شده است (شکل B4).

 

شکل 2- مقدار قند محلول در اندام هوایی، قند محلول در ریشه، قند کل در اندام هوایی و قند کل در ریشه در گیاهچه­های برنج (Oryza sative) رقم هاشمی در تیمار با غلظت­های مختلف نیتروژن و تلقیح با باکتری آزوسپریلوم برازیلنس .(Azospirillum brazilense) نتایج میانگین 4 تکرار است. ستون‌های دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنی­داری در سطح 5% توسط آزمون کمترین تفاوت معنی­دار (LSD) نشان نمی‌دهند. Ctrl: کنترل؛ N/4: یک چهارم غلظت نیتروژن؛ N/2: نیمی از غلظت نیتروژن؛ N: غلظت نیتروژن کامل؛ AB: در شرایط تلقیح یافته؛ NI: در شرایط تلقیح نشده.

Figure 2- The amount of Aerial part soluble sugar, Root soluble sugar, Aerial part total sugar and Root total sugar in rice seedlings Hashemi Cultivar inoculated or uninoculated with A. brasiliensis in treatment with different concentarations of Nitrogen. The results are the average of 4 replicates. Different letters show significant differences according to LSD test at P ≤ 0.05. Ctrl: Control, N/4: ¼ Nitrogen concentrations, N/2: ½ Nitrogen concentrations, N: Full Nitrogen concentration, AB: Inoculated with Azospirillum brazilense, NI: Without Inoclusion.

 

شکل 3- مقدار پروتئین محلول و پروتئین کل در گیاهچه­های برنج (Oryza sative) رقم هاشمی در تیمار با غلظت­های مختلف نیتروژن و تلقیح با باکتری آزوسپریلوم برازیلنس .(Azospirillum brazilense) نتایج میانگین 4 تکرار است. ستون‌های دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنی­داری در سطح 5% توسط آزمون کمترین تفاوت معنی­دار (LSD) نشان نمی‌دهند. Ctrl: کنترل؛ N/4: یک چهارم غلظت نیتروژن؛ N/2: نیمی از غلظت نیتروژن؛ N: غلظت نیتروژن کامل؛ AB: در شرایط تلقیح یافته؛ NI: در شرایط تلقیح نشده.

Figure 2- The amount of Soluble Protein and Total Protein in rice seedlings Hashemi Cultivar inoculated or uninoculated with A. brasiliensis in treatment with different concentarations of Nitrogen. The results are the average of 4 replicates. Different letters show significant differences according to LSD test at P ≤ 0.05. Ctrl: Control, N/4: ¼ Nitrogen concentrations, N/2: ½ Nitrogen concentrations, N: Full Nitrogen concentration, AB: Inoculated with Azospirillum brazilense, NI: Without Inoclusion.

 

 

 

اثر تیمار نیتروژن بر مقدار فسفر و نیتروژن

 بررسی اثر تیمارهای مختلف بر مقدار فسفر گیاهچه­های برنج هاشمی تلقیح شده و تلقیح نشده با باکتری نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن مقدار فسفر گیاهچه­ها افزایش می­یابد، اما اختلاف معنی داری بین گیاهچه­های تلقیح شده و گیاهچه های تلقیح نشده وجود ندارد. بالاترین مقدار فسفر در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت کامل نیتروژن و در تلقیح با باکتری ( 89/6 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) دیده شد (شکل A5). بررسی اثر تیمار­های مختلف نشان داد که افزایش غلظت نیتروژن در محیط کشت سبب افزایش معنی­داری در مقدار نیتروژن گیاهچه­ها در تمامی غلظت­ها نسبت به کنترل می­شود. نتایج بیشتر نشان داد که در تیمار شاهد وتیمار با غلظت­های N/2 و نیتروژن کامل بین گیاهچه­های تلقیح شده و گیاهچه­های تلقیح نشده اختلاف معنی­داری وجود دارد. بالاترین مقدار نیتروژن ( 9/8 درصد وزن خشک) در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت کامل نیتروژن و در تلقیح با باکتری دیده شد. پایین­ترین مقدار نیتروژن ( 22/1 درصد وزن خشک) در گیاهچه­های شاهد تلقیح نشده مشاهده شد (شکل B5).

 

شکل 4- فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز در گیاهچه­های برنج (Oryza sative) رقم هاشمی در تیمار با غلظت­های مختلف نیتروژن و تلقیح با باکتری آزوسپریلوم برازیلنس .(Azospirillum brazilense) نتایج میانگین 4 تکرار است. ستون‌های دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنی­داری در سطح 5% توسط آزمون کمترین تفاوت معنی­دار (LSD) نشان نمی‌دهند. Ctrl: کنترل؛ N/4: یک چهارم غلظت نیتروژن؛ N/2: نیمی از غلظت نیتروژن؛ N: غلظت نیتروژن کامل؛ AB: در شرایط تلقیح یافته؛ NI: در شرایط تلقیح نشده.

Figure 4- The enzyme activity of Catalase and Peroxidase in rice seedlings Hashemi Cultivar inoculated or uninoculated with A. brasiliensis in treatment with different concentarations of Nitrogen. The results are the average of 4 replicates. Different letters show significant differences according to LSD test at P ≤ 0.05. Ctrl: Control, N/4: ¼ Nitrogen concentrations, N/2: ½ Nitrogen concentrations, N: Full Nitrogen concentration, AB: Inoculated with Azospirillum brazilense, NI: Without Inoclusion.

 

 

شکل 5- مقدار فسفر و نیتروژن در گیاهچه­های برنج (Oryza sative) رقم هاشمی در تیمار با غلظت­های مختلف نیتروژن و تلقیح با باکتری آزوسپریلوم برازیلنس .(Azospirillum brazilense) نتایج میانگین 4 تکرار است. ستون‌های دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنی­داری در سطح 5% توسط آزمون کمترین تفاوت معنی­دار (LSD) نشان نمی‌دهند. Ctrl: کنترل؛ N/4: یک چهارم غلظت نیتروژن؛ N/2: نیمی از غلظت نیتروژن؛ N: غلظت نیتروژن کامل؛ AB: در شرایط تلقیح یافته؛ NI: در شرایط تلقیح نشده.

Figure 5- The amount of Phosphor and Nitrogen in rice seedlings Hashemi Cultivar inoculated or uninoculated with A. brasiliensis in treatment with different concentarations of Nitrogen. The results are the average of 4 replicates. Different letters show significant differences according to LSD test at P ≤ 0.05. Ctrl: Control, N/4: ¼ Nitrogen concentrations, N/2: ½ Nitrogen concentrations, N: Full Nitrogen concentration, AB: Inoculated with Azospirillum brazilense, NI: Without Inoclusion.

 

 

 

رنگیزه­ های فتوسنتزی

 بررسی اثر تیمار­های مختلف بر گیاهچه های برنج هاشمی تلقیح شده و تلقیح نشده با A. brasiliensis نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن مقدار کلروفیل a در گیاهچه­ها افزایش می­یابد. از سوی دیگر، این افزایش در همه غلظت­ها در گیاهچه­های تلقیح شده اختلاف معنی­داری را با نمونه کنترل نشان می­دهد، امّا در ارتباط با گیاهچه‌های تلقیح نشده این اختلاف تنها در غلظت­های کامل و یک دوم نیتروژن معنی­دار است. بررسی­های بیشتر نشان داد، اگرچه اختلاف معنی­دار در مقدار کلروفیل a بین گیاهچه­های تلقیح شده و گیاهچه های تلقیح نشده در گروه کنترل وجود دارد ولی با افزایش غلظت نیتروژن در محیط کشت، در هیچ یک از غلظت­های به کار رفته تفاوت معنی­داری بین گیاهچه­های تلقیح شده و گیاهچه های تلقیح نشده وجود ندارد (شکل A6). همچنین پژوهش حاضر نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن مقدار کلروفیل b افزایش می یابد. از سوی دیگر، در همه غلظت­های به کار رفته اختلاف معنی­داری در گروه گیاهچه­های تلقیح شده در مقایسه با کنترل مشاهده می­شود، امّا در ارتباط با گیاهچه­های تلقیح نشده این اختلاف تنها در غلظت­های کامل و یک دوم نیتروژن معنی­دار می‌باشد. همچنین با افزایش غلظت نیتروژن تنها در غلظت نیتروژن کامل بین گیاهچه­های تلقیح شده و گیاهچه­های تلقیح نشده اختلاف معنی­دار مشاهده شد. همچنین نتایج حاضر نشان داد که بالاترین مقدار کلروفیل b (35/1 میلی­گرم بر گرم وزن تر) در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت کامل نیتروژن و در تلقیح با باکتری دیده شد. از سوی دیگر، کمترین مقدار کلروفیل b (16/0 میلی گرم بر گرم وزن تر) در گیاهچه­های شاهد تلقیح نشده مشاهده شد (شکل B6). نتایج حاصل از سنجش کلروفیل کل گیاهچه­های برنج هاشمی تلقیح شده و تلقیح نشده با A. brasiliensis نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن مقدار کلروفیل کل گیاهچه­ها نیز افزایش می­یابد. همچنین نتایج حاضر نشان داد که اختلاف معنی­داری در مقدار کلروفیل کل بین گیاهچه­های تلقیح شده و گیاهچه­های تلقیح نشده در گروه کنترل وجود دارد، امّا در تیمار N/4 تفاوت معنی­داری بین دو گروه تلقیح شده و تلقیح نشده وجود ندارد. با افزایش بیشتر غلظت نیتروژن (تیمار N/2 و N/4) مجددا تفاوت معنی­داری در مقدار کلروفیل کل بین دو گروه تلقیح شده و تلقیح نشده با باکتری وجود دارد. در این تیمار ها مقدار کلروفیل کل به طور معنی­داری در نمونه­های تلقیح شده بالاتر از گیاهچه­های تلقیح نشده بوده است. بالاترین مقدار کلروفیل کل (65/1 میلی­گرم بر گرم وزن تر) در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت کامل نیتروژن و در تلقیح با باکتری و پائین‌ترین مقدار کلروفیل کل (43/0 میلی گرم بر گرم وزن تر) در گیاهچه­های شاهد تلقیح نشده مشاهده شد (شکل C6).

 

شکل 6- مقدار کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل گیاهچه­های برنج (Oryza sative) رقم هاشمی در تیمار با غلظت­های مختلف نیتروژن و تلقیح با باکتری آزوسپریلوم برازیلنس .(Azospirillum brazilense) نتایج میانگین 4 تکرار است. ستون‌های دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنی­داری در سطح 5 توسط آزمون کمترین تفاوت معنی­دار (LSD)  نشان نمی‌دهند.  Ctrl: کنترل؛ N/4: یک چهارم غلظت نیتروژن؛ N/2: نیمی از غلظت نیتروژن؛ N: غلظت نیتروژن کامل؛ AB: در شرایط تلقیح یافته؛ NI: در شرایط تلقیح نشده.

Figure 6- The amount of Chlorophyll a, Chlorophyll b and Total chlorophyll in rice seedlings Hashemi Cultivar inoculated or uninoculated with A. brasiliensis in treatment with different concentarations of Nitrogen. The results are the average of 4 replicates. Different letters show significant differences according to LSD test at P ≤ 0.05. Ctrl: Control, N/4: ¼ Nitrogen concentrations, N/2: ½ Nitrogen concentrations, N: Full Nitrogen concentration, AB: Inoculated with Azospirillum brazilense, NI: Without Inoclusion.

 

 

 

بحث‌

در پژوهش حاضر، اثر غلظت­های مختلف نیتروژن بر برخی فاکتورهای بیوشیمیایی و رشد گیاهچه­های برنج تلقیح شده با باکتری A. brasiliensis مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاضر نشان داد که گیاهچه­های تلقیح شده از رشد بهتری در مقایسه با نمونه تلقیح نشده برخوردار بوده و غلظت­های بالاتر نیتروژن نتایج بهتری را به همراه داشتند. نتایج حاضر نشان داد که تلقیح با A. brasiliensis کارایی استفاده از نیتروژن را به ویژه در غلظت­های بالاتر افزایش می­دهد. نتایج پژوهشگران مختلف بر روی غلات و به ویژه برنج نشان دادند گیاهان تلقیح شده با A. brasiliensis، زیست توده و محتوای نیتروژن بالاتری را در تیمار با غلظت­های مختلف نیتروژن نشان می­دهند (Saubidet et al., 2002; Garcia et al., 2010). همچنین پژوهش حاضر نشان داد تلقیح گیاهچه‌ها با A. brasiliensis بر نرخ رشد نسبی اثر مثبت دارد. نتایج دیگر پژوهشگران نشان دادند این امر ممکن است به علّت تولید هورمون­های گیاهی مانند اسید ایندول استیک (IAA) باشد (Tien et al., 1976).  

پژوهش حاضر نشان داد که اگر چه اختلاف معنی­داری بین فاکتورهای رشد در تیمار شاهد (نیتروژن صفر) بین دو گروه تلقیح­شده و تلقیح نشده وجود ندارد، امّا گیاهان تلقیح شده همچنان عملکرد نسبتاً بهتری (دارای فاکتور رشد بیشتری) نسبت به گیاهان تلقیح نشده داشتند که این امر با یافته­های سایر پژوهشگران همخوانی دارد. آنها نشان دادند که تلقیح با A. brasiliensis محتوای نیتروژن و عملکرد را حتی در شرایط محدود نیتروژن بهبود می‌بخشد (Pedraza et al., 2009). همچنین نتایج Skonieski et al. (2019) نشان دادند تلقیح A. brasiliensis کارایی استفاده از نیتروژن (NUE) و عملکرد ذرت را در تیمار با کودهای حاوی نیتروژن کم افزایش می‌دهد که این امر می­تواند در ترویج کشاورزی پایدار مفید باشد. یافته‌های حاضر نشان دادند با افزایش غلظت نیتروژن، محتوای قند به طور نسبی افزایش یافته است. علاوه بر این، گیاهان تلقیح شده مقدار قند بالاتری نسبت به گیاهان تلقیح نشده نشان دادند. در این راستا بعضی پژوهشگران نشان دادند تلقیح تحت A. brasiliensis، سبب بهبود جذب نیتروژن و متابولیسم کربوهیدرات در برنج شده و در نهایت به افزایش عملکرد دانه و محتوای نیتروژن بالاتر می­شود. نتایج این پژوهشگران نشان دادند در دسترس قرار گرفتن مقادیر بالاتر نیتروژن به همراه تلقیح باکتریایی تجمع قند را در بافت­های هوایی و ریشه افزایش می­دهد. احتمالاً تلقیح باکتریایی جذب نیتروژن، کارایی فتوسنتز و سنتز قند را افزایش می­دهد (Pedraza et al., 2009). همچنین نتایج برخی از پژوهشگران نشان دادند تلقیح به طور قابل توجهی فعالیت آنزیم نیتروژناز و تبدیل نیتروژن خاک را بهبود بخشیده که منجر به افزایش زیست توده و محتوای قند در بافت­های گیاهی می­شود (Pedrosa et al., 2020; Zhang et al., 2018).

نتایج پژوهش حاضر نشان داد افزایش غلظت نیتروژن به‌طور معنی­داری سبب افزایش پروتئین محلول و کل در ریشه گیاهچه‌های برنج نسبت به شاهد می‌شود که با یافته­های سایر پژوهشگران مطابقت دارد. از سوی دیگر، مقایسه گیاهچه‌های تلقیح‌شده و تلقیح‌نشده با A. brasiliensis نشان داد که تلقیح باکتری، علیرغم افزایش اندک مقدار پروتئین محلول و کل (در هر غلظت از نیتروژن) از نظر آماری تفاوت معنی­داری را ایجاد نمی‌کند. این نتایج نشان‌دهنده آن است که اثر تلقیح باکتری ممکن است در شرایطی با غلظت‌های بالاتر نیتروژن به‌طور مؤثرتری نمایان شود یا آنکه نیازمند تعامل‌های بیشتری با سایر عوامل محیطی باشد (Wang et al., 2019). به عبارت دیگر، این امر یک تناقض رایج در کشاورزی و فیزیولوژی گیاهی است و الزاماً افزایش مقدار نیتروژن در گیاه به معنی افزایش مقدار پروتئین نیست. این موضوع می­تواند نشان دهنده وجود یک یا چند عامل محدود کننده باشد که مانع استفاده کامل گیاه از نیتروژن برای ساخت پروتئین باشد. به عنوان مثال می­توان به کمبود برخی عناصر معدنی مانند مولیبدن و یا مرحله رشد گیاه اشاره کرد. به این معنی که در مراحل اولیه رشد، گیاه ممکن است نیتروژن را جذب و به شکل نیترات یا اسید آمینه ذخیره کند و سپس در مرحله رشد زایشی آن را به سرعت به پروتئین تبدیل نماید (Hernandez et al., 2009).

 نتایج حاضر نشان داد که فعالیت آنزیم کاتالاز با افزایش غلظت نیتروژن (در هر دو شرایط تلقیح شده و تلقیح نشده) افزایش یافته است. امّا در نمونه­های تلقیح شده توسط باکتری، فعالیت بالاتری را نسبت به گیاهچه­های تلقیح نشده در تمام سطوح نیتروژن نشان داد که این نتایج با سایر گزارش­های منتشر شده مطابقت دارد. این یافته‌ها نشان دادند که تلقیح با A. brasiliensis سبب افزایش تحمل تنش اکسیداتیو در برنج می­شود. این شواهد نشان‌دهنده آن است که این باکتری انعطاف­پذیری گیاه را در تیمار با غلظت­های مختلف نیتروژن بهبود بخشیده و توانایی آنها را برای حذف گونه­های فعال اکسیژن (ROS) تولید شده در طول متابولیسم نیتروژن افزایش می­دهد (Garcia et al., 2010).

همچنین داده‌های حاضر نشان دادند فعالیت آنزیم پراکسیداز در تیمار با غلظت­های بالاتر نیتروژن و در هر دو شرایط تلقیح شده و تلقیح نشده افزایش می­یابد. داده­های Zhang و همکارانش نیز نشان دادند تلقیح A. brasiliensis سبب افزایش فعالیت پراکسیداز در برنج شده که در نهایت منجر به رشد بهتر و جذب نیتروژن می‌شود. افزایش فعالیت پراکسیداز در گیاهان تلقیح شده، نقش این باکتری را در بهبود توانایی گیاه در سم زدایی پراکسید هیدروژن به عنوان محصول جانبی تنش اکسیداتیو، به ویژه در شرایطی که مقدار  نیتروژن قابل دسترس محدود می­باشد را برجسته می­کند (Zhang et al., 2018).

نتایج به دست آمده در این پژوهش نشان داد که تیمار نیتروژن و نیز تلقیح باکتریایی تأثیر مثبتی بر سطوح فسفر و نیتروژن داشتند. در این راستا گزارش­ها نشان دادند برهم­کنش بین تیمار نیتروژن و تلقیح A. brasiliensis جذب عناصر معدنی و رشد را در سیب زمینی بهبود بخشیده است. همچنین نتایج آن­ها نشان دادند گیاهان تلقیح شده می­توانند با بهبود کارایی جذب مواد مغذی، کمبود نیتروژن را نیز جبران کنند (Fernandes et al., 2023).

داده­های حاضر نشان دادند محتوای فسفر به ویژه در نمونه­های تیمار شده با غلظت­های پائین نیتروژن افزایش یافته است. این امر نشان می­دهدکه A. brasiliensis نقش کلیدی در بهبود حلالیت فسفر ایفا می­کند که با یافته­های سایر پژوهشگران تطابق دارد (Almari & Mostafa, 2009; Madhaiyan et al., 2010).

نتایج حاصل از پژوهش جذب نیتروژن و فسفر در گیاه ذرت تلقیح شده با A. brasiliensis در تیمار با سطوح مختلف نیتروژن نشان داد که مقدار نیتروژن و فسفر به ویژه در غلظت­های بالاتر نیتروژن افزایش می­یابد. این امر نشان­دهنده آن است که تیمار نیتروژن تأثیر مثبتی بر جذب مواد مغذی حتی در سطوح بالای نیتروژن دارد. الگوهای مشابه مشاهده شده در هر دو پژوهش نشان دادند این باکتری نقش مهمی در بهبود کارایی مصرف مواد مغذی ایفا کرده و آن را به یک روش ارزشمند برای افزایش جذب فسفر و نیتروژن در برنج و سایر محصولات غلات تبدیل می­کند (Palheta, 2021).

داده­های حاضر نشان داد که تیمار توام نیتروژن و تلقیح باکتریایی می­توانند محتوای کلروفیل را در مقایسه با گیاهان تلقیح نشده افزایش دهند. همچنین در این راستا نتایج برخی از پژوهشگران نشان دادند تلقیح باکتریایی کارایی استفاده از نیتروژن و زیست توده را در برنج افزایش داده و منجر به تولید بیشتر کلروفیل می­شود ( Zhang et al., 2018). در پژوهش حاضر اثر تیمار غلظت­های بالاتر نیتروژن بر مقدار کلروفیل a و b در مقایسه با شاهد بارزتر بود. این امر با یافته‌های سایر پژوهشگران بر روی گیاه ذرت مطابقت دارد. همچنین آنها نشان دادند که تلقیح در غلظت­های بالاتر نیتروژن موثرتر است. به عبارتی دیگر، به ویژه در پژوهش حاضر، در گیاهان تلقیح شده که غلظت‌های بالای نیتروژن تیمار شده­اند، مقدار کلروفیل b به طور قابل‌توجهی افزایش یافته است ( Galindo et al., 2022).

 

نتیجه ­گیری کلی

نتایج حاضر نشان داد تلقیح گیاهچه­های برنج با A. brasiliensis می­تواند به طور محسوس پاسخ‌های فیزیولوژیکی آن را، به‌ویژه در شرایط کمبود نیتروژن، افزایش ‌دهد. در تمام غلظت­های نیتروژن به کار رفته، رشد گیاهان تلقیح­شده با باکتری بهبود یافته و محتوای پروتئین بالاتر و فعالیت آنزیمی بالایی را در مقایسه با گیاهان تلقیح نشده نشان دادند. این امر پتانسیل باکتری برای بهبود جذب مواد مغذی و تحمل تنش را برجسته می­کند. این یافته­ها نشان دادند A. brasiliensis می‌تواند در محیط‌هایی با دسترسی محدود نیتروژن کود زیستی مؤثری باشد و سبب ترویج شیوه‌های کشاورزی پایدار و کاهش اتکا به کودهای شیمیایی نیتروژن­دار شود.

 

سپاسگزاری

پژوهش حاضر با حمایت مالی حوزه تحصیلات تکمیلی دانشگاه گلستان انجام شده است.

References

Adeleke, B. S., Babalola, O. O., & Glick, B. R. (2021). Plant growth-promoting root-colonizing bacterial endophytes. Rhizosphere, 20, 100433. https://doi.org/10.1016/j.rhisph.2021.100433.
Alamri, S. A., & Mostafa, Y. S. (2009). Effect of nitrogen supply and Azospirillum brasilense sp- 248 on the response of wheat to seawater irrigation. Saudi Journal of Biological Sciences, 16(2), 101–107. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2009.10.009
Arnon, D. I. (1949). Copper Enzyme in isolated chloroplasts. Plant physiology, 24(1), 1–15.
Bradford M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(1-2), 248-54. https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3
Elsheikh, E. A. E., El-Keblawy, A., Mosa, K. A., Okoh, A. I., & Saadoun, I. (2021). Role of endophytes and rhizosphere microbes in promoting the invasion of exotic plants in arid and semi-arid areas: A Review. Sustainability, 13(23), 13081. https://doi.org/10.3390/su132313081.
Fernandes, A. M., da Silva, J. A., Eburneo, J. A. M., Leonel, M., Garreto, F. G. de. S., & Nunes, J. G. da. S. (2023). Growth and nitrogen uptake by potato and Cassava crops can ce improved by Azospirillum brasilense inoculation and nitrogen fertilization. Horticulturae, 9(3), 301.          
https://doi.org/10.3390/horticulturae9030301
Fukagawa, N. K., & Ziska, L. H. (2019). Rice: importance for global nutrition. Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 65(Supplement), S2–S3.    
 https://doi.org/10.3177/jnsv.65.S2
Galindo, F.,S., Pagliari, P. H., da Silva, E. C., Silva, V. M., Fernandes, G. C., Rodrigues, W. L., Céu, E. G. O., de Lima, B. H., Jalal, A., Muraoka, T., Buzetti, S., Lavres, J., & Teixeira Filho, M. C. M. (2022). Co-Inoculation with Azospirillum brasilense and Bradyrhizobium sp. enhances nitrogen uptake and yield in field-grown cowpea and did not change N-fertilizer recovery. Plants, 11(14), 1847.      https://doi.org/10.3390/plants11141847
García, I. E., Di Salvo, L. P., Escobar Ortega, J. S., Boa Sorte, P. M. F., Urquiaga, S., & Teixeira, K. R. S. (2010). Field response of rice paddy crop to Azospirillum inoculation: physiology of rhizosphere bacterial communities and the genetic diversity of endophytic bacteria in different parts of the plants. Plant and Soil, 336(1–2), 351–362. https://doi.org/10.1007/s11104-010-0487-y.
Hernandez, J. A., George, S. J., & Rubio, L. M. (2009). Molybdenum trafficking for nitrogen fixation. Biochemistry, 48(41), 9711-21.
 https://doi.org/10.1021/bi901217p
Kar, M., & Mishra, D. (1976). Catalase, peroxidase, and polyphenoloxidase activities during rice leaf senescence. Plant Physiology, 57(2), 315-319.         https://doi.org/10.1104/pp.57.2.315
Kjeldahl, J. (1883). Neue methode zur bestimmung des stickstoffs in organischen Körpern. Zeitschrift Für Analytische Chemie, 22, 366–382. https://doi.org/10.1007/BF01338151
Madhaiyan, M., Poonguzhali, S., Kang, B. G., Le, Y. J., Chung, J. B., & Sa, T. M. (2010). Effect of co-inoculation of methylotrophic methylobacterium oryzae with Azospirillum brasilense and Burkholderia pyrrocinia on the growth and nutrient uptake of tomato, red pepper and rice. Plant and Soil, 328(1–2), 71–82. https://doi.org/10.1007/s11104-009-0083-1
Maehly A. C. & Chance, B. (1954). Assay of catalases and peroxidases. Methods of Biochemical Analysis, 1, 357-424.
Markwell, M. A. K., Hass , S. M., Tollbert, N. E., & Bieber, L. L. (1981). Protein determinetion in membrane and lipoprotrin sample: manual and automated procedure. Methods Enzymology, 72, 296-303. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(81)72018-4
McCready, R., Guggloz, J., Silviera, V., & Owens, H. (1950). Determination of starch and amylose in vegetables, application to peas. Analutical Chemistry, 22(9), 1156-1158. https://doi.org/10.1021/ac60045a016
Morais, P. G., Teixeira, R. F. M., Lauk, C., Theurl, M. C., Winiwarter, W., Mayer, A., Kaufmann, L., Haberl, H., Domingos, T., & Erb, K. H. (2021). Agroecological measures and circular economy strategies to ensure sufficient nitrogen for sustainable farming. Global Environmental Change, 69, 102313. https://doi.org/10.1016/j.gloenvcha.2021.102313.
Olsen, S. R., & Watanabe, F. S. (1963). Diffusion of phosphorus as related to soil texture and plant uptake1. Soil Science Society of America Journal, 27(6), 648–653. https://doi.org/10.2136/sssaj1963.03615995002700060024x
Palheta J. G. (2021). Sources and doses of nitrogen associated with inoculation with Azospirillum brasilense modulate growth and gas exchange of corn in the Brazilian Amazon. International Journal of Agriculture and Biology, 26(2), 349–358. https://doi.org/10.17957/IJAB/15.1843
Pedraza, R. O., Bellone, C. H., Carrizo de Bellone, S., Boa Sorte, P. M. F., Teixeira, K. R., & dos, S. (2009). Azospirillum inoculation and nitrogen fertilization effect on grain yield and on the diversity of endophytic bacteria in the phyllosphere of rice rainfed crop. European Journal of Soil Biology, 45(1), 36–43. https://doi.org/10.1016/j.ejsobi.2008.09.007
Pedrosa, F. O., Oliveira, A. L. M., Guimarães, V. F., Etto, R. M., Souza, E. M., Furmam, F. G., Gonçalves, D. R. P., Santos, O. J. A. P., Gonçalves, L. S. A., Battistus, A. G., & Galvão, C. W. (2020). The ammonium excreting Azospirillum brasilense strain HM053: a new alternative inoculant for maize. Plant and Soil, 451(2), 45–56. https://doi.org/10.1007/s11104-019-04124-8
Prasad, K. (2023). Symbiotic endophytes of glomalin AM Fungi, rhizobium, and PGPR potential bio stimulants to intensive global food production for sustainable agriculture system. Journal of Microbes and Research, 2(1), 2836-2187.      https://doi.org/10.58489/2836-2187/012
Saubidet, M., I., Fatta, N., & Barneix, A. J. (2002). The effect of inoculation with Azospirillum brasilense on growth and nitrogen utilization by wheat plants. Plant and Soil, 245(2), 215–222.        https://doi.org/10.1023/A:1020469603941
Sharifalsadat, Z., Aghdasi, M., Ghanati, F., & Arzanesh, M. (2023). Harmonized biochemical modification of cell walls to get permission for entrance of Azospirillum sp. to rice roots. Plant Science, 335(3), 111823. https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2023.111823
Silveira, A. P. D., Sala, V. M. R., Cardoso, E. J. B. N., Labanca, E. G., & Cipriano, M. A. P. (2016). Nitrogen metabolism and growth of wheat plant under diazotrophic endophytic bacteria inoculation. Applied Soil Ecology, 107, 313-319.   https://doi.org/10.1016/j.apsoil.2016.07.005
Skonieski, F. R., Viégas, J., Martin, T. N., Mingotti, C. C. A., Naetzold, S., Tonin, T. J., Dotto, L. R., & Meinerz, G. R. (2019). Effect of nitrogen topdressing fertilization and inoculation of seeds with Azospirillum brasilense on corn yield and agronomic characteristics. Agronomy, 9(12), 812. https://doi.org/10.3390/agronomy9120812
Thomas, J., Kim, H. R., Rahmatallah, Y., Wiggins, G., Yang, Q., Singh, R., Glazko, G., & Mukherjee, A. (2019). RNA-seq reveals differentially expressed genes in rice (Oryza sativa) roots during interactions with plant-growth promoting bacteria, Azospirillum brasilense. Plos One, 14(5), e0217309. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217309
Tien, T. M., Gaskins, M. H., & Hubbell, D. H. (1979). Plant growth substances produced by Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet (Pennisetum americanum L.). Applied and Environmental Microbiology, 37(5), 1016–1024. https://doi.org/ 10.1128/aem.37.5.1016-1024.1979
Ugulu, I. (2015). Determination of heavy metal accumulation in plant samples by spectrometric techniques in Turkey. Applied Spectroscopy Reviews, 50(2), 113-151. https://doi.org/10.1080/05704928.2014.935981
Wang, X., Liu, H., Yu, F., Hu, B., Jia, Y., Sha, H., & Zhao, H. (2019). Differential activity of the antioxidant defence system and alterations in the accumulation of osmolyte and reactive oxygen species under drought stress and recovery in rice (Oryza sativa L.) tillering. Scientific Reports, 9(1), 8543. https://doi.org/10.1038/s41598-019-44958-x
White, P. J. & Brown, P. H. (2010). Plant nutrition for sustainable development and global health. Annals of Botany, 105(7), 1073–1080.
 https://doi.org/10.1093/aob/mcq085
Xin, W., Zhang, L., Zhang, W., Gao, J., Yi, J., Zhen, X., Du, M., Zhao, Y., & Chen, L. (2019). An integrated analysis of the rice transcriptome and metabolome reveals root growth regulation mechanisms in response to nitrogen availability. International Journal of Molecular Sciences, 20(23), 5893.https://doi.org/10.3390/ijms20235893
Yoshida, S., & Coronel, V. (1975). Nitrogen nutrition, leaf resistance and leaf photosynthetic rate of the rice plant. Soil Science and Plant Nutrition, 22(2), 207-211. https://doi.org/10.1080/00380768.1976.10432983.
Zeffa, D. M., Perini, L. J., Silva, M. B., de Sousa, N. V., Scapim, C. A., Oliveira, A. L. M. de, Amaral Júnior, A. T. do., & Azeredo Gonçalves, L. S. (2019). Azospirillum brasilense promotes increases in growth and nitrogen use efficiency of maize genotypes. Plos One, 14(4), e0215332. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0215332
Zhang, J., Hussain, S., Zhao, F., Zhu, L., Cao, X., Yu, S., & Jin, Q. (2018). Effects of Azospirillum brasilense and Pseudomonas fluorescens on nitrogen transformation and enzyme activity in the rice rhizosphere. Journal of Soils and Sediments, 18(4), 1453–1465.
 https://doi.org/10.1007/s11368-017-1861-7
Journal of Plant Biological Sciences
Volume 17, Issue 3 - Serial Number 65
September 2025
Pages 67-88

Files

History

  • Receive Date: 30 September 2025
  • Revise Date: 16 November 2025
  • Accept Date: 25 November 2025

Share

How to cite

Statistics