Authors
Agricultural Biotechnology Research Institute, Center of Iran (ABRII), Isfahan, Iran
Abstract
Keywords
فلفل دلمهای با نام علمی ((Capsicum annum L. گیاهی یکساله متعلق به خانواده Solonaceae است که زیستگاه اصلی آن کشور مکزیک و آمریکای جنوبی است (Sanatombi and Sharma, 2007). این گیاه دارای خواص دارویی بسیار ارزشمند بوده، در درمان بسیاری از بیماری‌ها، از جمله: بیماری‌های قلبی، فشار خون بالا، چاقی، دیابت و افزایش اشتها کاربرد دارد
(Nuez et al., 1996). در رویکرد سنتی، این گیاه به وسیله بذر تکثیر می‌گردد. تکثیر و ازدیاد فلفل در ایران معمولاً از طریق کاشت بذرهای وارداتی از دیگرکشورها صورت می‌گیرد که این بذرها، با قیمت بالا وارد شده، ضمن تحمیل هزینه بر اقتصاد، کشور را با مشکلات و محدودیت‌های وارداتی نیز مواجه میکند. به همین جهت، استفاده از تکنیک‌های مختلف کشت بافت در جهت تکثیر فلفل و تولید گیاهانی با کیفیت بالا و عاری از عوامل بیماریزا می‌تواند گامی مهم در جهت رفع مشکلات موجود در مسیر تولید و تکثیر آن، کاهش هزینه‌های اولیه کشت و کار این گیاه، ترغیب تولیدکنندگان به سرمایه‌گذاری در این زمینه و در نهایت، ایجاد زمینه مناسب اشتغال کشاورزی گردد. تاکنون پژوهشگران مختلفی در سطح دنیا تلاش کرده‌اند تا از طریق تکنیک‌های مختلف کشت بافت، روش مناسب و مقرون به صرفه‌ای برای ازدیاد فلفل دلمهای پیدا کنند(Phillips and Hustenberger, 1985; Harini, 1993; Christopher and Rajam, 1996; Hyde and (Phillips, 1996; Hussain et al., 1999). تکثیر این گیاه با استفاده از تکنیک کشت بافت از قسمت‌های مختلف گیاه، از جمله: جوانه‌های انتهایی، جوانه‌های جانبی، ساقه، هیپوکوتیل و کوتیلدون گزارش شده است (Agrawal et (al., 1989، ولی اکثر روش‌های ریزازدیادی فلفل به شدت وابسته به رقم (C. baccatum, C. frutescens and C.praetermissum) خاصی بوده و در مورد ارقام دیگر کارایی چندانی نداشته است (Agrawal et al., 1989).
در این تحقیق، برای اولین بار تکثیر فلفل دلمهای و ریزازدیادی آن از طریق کشت ریزنمونه حاصل از میانگره در رقم مورد اشاره در ایران، انجام گردید. همچنین، ریشهدار شدن شاخساره‌های تولیدی، مقاومسازی گیاهچهها جهت سازگاری با محیط طبیعی و انتقال آنها به شرایط گلخانه نیز ارزیابی گردید.
مواد و روش‌ها
آمادهسازی و کشت بذرها
در ابتدا به منظور ضدعفونی نمودن سطحی، بذور به مدت 60 ثانیه در الکل 96% غوطهور گردیده، پس از سه بار شستشو با آب مقطر استریل، به مدت 20 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم (20%) به همراه یک قطره تویین 20% قرار گرفتند. در مرحله بعد بذرها سه مرتبه با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. برای جوانه‌زنی، بذرها در یک ارلن حاوی50 میلیلیتر محیط پایه MS |(Murashige and (Skoog, 1962 استریل کشت داده شده، در اتاق رشد تحت فتوپریود 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی با شدت نور 2400 لوکس و دمای C°24 به مدت 5 هفته نگهداری شدند.
کشت تک گره
ظروف حاوی گیاهچههای 5-4 هفته‌ای (با اندازه تقریبی 5/1- 1 سانتی‌متر) حاصل از کشت بذرها در شرایط استریل از ارلن خارج شدند. در مرحله بعد، ساقه آنها به شیوه‌ای برش داده شد که هر ریزنمونه حاصل دارای 1 گره باشد. سپس هر 5 ریزنمونه به صورت عمودی در ظروف کشت حاوی 50 میلیلیتر از محیط پایه MS حاوی غلظتهای متفاوت از تنظیمکنندههای مختلف رشد گیاهی واکشت شدند. این تنظیمکنندههای رشد شامل سیتوکینین‌های BAP (2-1 -0 میلی‌گرم بر لیتر) و Kin
(2-1 -0 میلی‌گرم بر لیتر) و اکسینهایIBA (5/0-2/0-0 میلی‌گرم بر لیتر) و یا NAA (5/0-2/0-0 میلی‌گرم بر لیتر) بودند (جدول 1).
جدول 1- تنظیمکنندههای رشدگیاهی مورد استفاده در آزمایش
|
محیط‌کشت پایه |
BAP (میلی‌گرم بر لیتر) |
IBA (میلی‌گرم بر لیتر) |
NAA (میلی‌گرم بر لیتر) |
|
MS |
0 |
0 |
- |
|
MS |
1 |
2/0 |
- |
|
MS |
2 |
5/0 |
- |
|
|
|
|
|
|
MS |
0 |
- |
0 |
|
MS |
1 |
- |
2/0 |
|
MS |
2 |
- |
5/0 |
|
|
|
|
|
|
|
Kin (میلی‌گرم بر لیتر) |
|
|
|
MS |
0 |
|
|
|
MS |
1 |
0 |
- |
|
MS |
2 |
2/0 |
- |
|
|
|
5/0 |
- |
|
|
|
|
|
|
MS |
0 |
- |
0 |
|
MS |
1 |
- |
2/0 |
|
MS |
2 |
- |
5/0 |
علاوه بر هورمونهای یاد شده، همه محیط‌کشت‌ها دارای 3 درصد ساکارز، 6 گرم در لیتر آگار و4/0% زغال فعال نیز بودند. pH محیطها در 8/5 تنظیم شده، عمل سترونسازی آنها در اتوکلاو با فشار 1 اتمسفر و دمای C°121 برای مدت 20 دقیقه انجام گردید. ریزنمونههای کشت شده در اتاق رشد با شرایط ذکر شده در بالا و به مدت 4 هفته نگهداری شدند. پس از آن که گیاهچهها به مطلوب رشد خود رسیدند، برای انجام دور بعدی کشت تکگره استفاده شدند و یا مقاومسازی شده، به گلخانه انتقال داده شدند.
سازگارسازی و انتقال به گلخانه
قبل از کشت گیاهچههای حاصل در شرایط گلخانه، عمل سازگارسازی آنها در فیتوترون صورت گرفت. برای این کار، گیاهچهها در شرایط in vitro به گلدانهای حاوی ترکیب پیتماس و کوکوپیت با نسبت 1/3 منتقل شده و در فیتوترون تحت شرایط رطوبت نسبی 75 درصد، دمای C°25 و شرایط نوری 3000 لوکس برای مدت 20 روز نگهداری شدند. در مرحله بعد، گیاهچههای سازگار شده به گلخانه منتقل گردیده، تحت شرایط درجه حرارت شب 12 درجه سانتی‌گراد، طول روز 16 ساعت و طول شب 8 ساعت قرار گرفتند.
این طرح به‌صورت چند آزمایش فاکتوریل مجزا با طرح پایه کاملاً تصادفی و 3 تکرار به اجرا در آمد. ظروف حاوی گیاهچههای کشت شده به صورت تصادفی (نقشه چیدن تصادفی ظروف با استفاده از برنامه نرم‌افزاری Excel تهیه گردید) در داخل اتاق رشد قرار گرفتند.
نتایج
در این مطالعه، اثر افزودن غلظتهای مختلف هورمونهای سیتوکینین (BAP، (Kin به تنهایی، یا در ترکیب با هورمونهای اکسین (NAA، IBA) به محیط پایه MS در رشد ریزنمونههای فلفل دلمهای حاصل از تکگره بررسی گردید. در شروع کار، از محیط‌کشت MS به همراه BAP و IBA بدون زغال فعال استفاده شد، نتیجه نشان داد ریزنمونهها، 2 هفته پس از کشت در این محیط بدون تولید ریشه در انتها کالوس‌دار شدند ( شکل 1) (جدول 2).
جدول 2- اثر تنظیمکنندههای رشدگیاهی بر پارامترهای رشد در ریزنمونههای فلفل دلمهای
|
تعداد ریشه در هر ریزنمونه |
طول ریشه (cm) |
طول ساقه (cm) |
تعداد شاخه فرعی |
زغال فعال 4/0% |
IBA (میلی‌گرم بر لیتر) |
BAP (میلی‌گرم بر لیتر) |
|
13/1 |
00/3 |
13/1 |
04/0 |
+ |
0 |
0 |
|
78/0 |
2/0 |
78/0 |
027/0 |
- |
0 |
0 |
|
20/1 |
00/4 |
20/1 |
29/0 |
+ |
0 |
1 |
|
83/0 |
35/0 |
83/0 |
09/0 |
- |
0 |
1 |
|
18/1 |
00/6 |
18/1 |
44/0 |
+ |
0 |
2 |
|
81/0 |
3/0 |
81/0 |
2/0 |
- |
0 |
2 |
|
14/1 |
00/2 |
14/1 |
34/0 |
+ |
0 |
0 |
|
86/0 |
2/0 |
86/0 |
04/0 |
- |
0 |
0 |
|
19/1 |
00/3 |
19/1 |
18/0 |
+ |
2/0 |
1 |
|
81/0 |
3/0 |
81/0 |
05/0 |
- |
2/0 |
1 |
|
18/1 |
00/3 |
18/1 |
26/0 |
+ |
5/0 |
2 |
|
75/0 |
35/0 |
75/0 |
07/0 |
- |
5/0 |
2 |
+ : زغال فعال اضافه شده به محیط
- : فاقد زغال فعال
شکل 1- تولید کالوس در انتهای ریزنمونه تک گره فلفل دلمهای، 2 هفته پس از کشت در محیط MS با ترکیبات هورمونی مختلف از BAP و IBA ، فاقد زغال فعال
برای رفع این مشکل، در مرحله بعد، 4/0% زغال فعال به محیطهای کشت باززایی اضافه شد. پاسخ ریزنمونهها به این محیط مثبت بود و همان‌طور که در شکل 4 نشان داده شده، این ریزنمونهها بدون اینکه هیچ حالت کالوسی در انتهای آنها مشاهده شود، بخوبی رشد کرده، حتی برخی از آنها ریشهدار هم شدند (جدول 4) . مقایسه میان تأثیر حضور و عدم حضور زغال فعال بر پارامترهای باززایی در گیاه فلفل در شکل‌های 2 و 3 نشان داده شده است.
شکل 2- اثر زغال فعال در محیط باززایی فلفل بر پارامترهای رشد (طول ریشه و ساقه)
شکل 3- اثر زغال فعال در محیط باززایی فلفل بر پارامترهای رشد (تعداد شاخه و ریشه)
شکل 4- رشد مناسب ریزنمونههای فلفل حاصل از تک گره در محیط باززایی حاوی زغال فعال با ترکیب هورمونی BAP 2 میلی‌گرم بر لیتر و IBA 5/0 میلی‌گرم بر لیتر،30 روز پس از کشت
با گذشت 35 روز از کشت تک گرههای فلفل دلمهای در محیطهای مختلف، هر گیاهچه 2-3 شاخه تولید نمود. آزمایشها نشان داد که نوع هورمونها و غلظتهای مختلف آنها تأثیرات متفاوتی بر پارامترهای رشدی، چون: طول ساقه، تعداد شاخه فرعی، برگ و ریشه، طول ریشه و درصد ریشهزایی ریزنمونههای کشت شده فلفل داشته است (جدول 3).
جدول 3- اثر تنظیمکنندههای گیاهی ( BAP،Kin،IBA ، (NAA حاوی زغال فعال بر میانگین اندازه‌های پارامترهای رشدی در 4 ریزنمونههای فلفل دلمهای پس از 35 روز
|
هورمونهای رشد |
تعداد شاخه فرعی |
طول ساقه (cm) |
تعداد برگ |
فاصله میانگره (cm) |
ریشهزایی (%) |
تعداد ریشه در هر ریزنمونه |
طول ریشه (cm) |
|
BAP |
08/0** |
29/8** |
48/30** |
19/0** |
26/10008** |
29/36** |
03/197** |
|
Kin |
00/0ns |
81/6** |
36/14ns |
08/0* |
85/271ns |
91/1ns |
87/11ns |
|
IBA |
00/0ns |
25/0ns |
62/9ns |
00/0ns |
52/498** |
89/20** |
95/22** |
|
NAA |
00/0ns |
91/0ns |
61/47ns |
01/0ns |
86/487* |
14/0ns |
94/2ns |
|
BAP+IBA |
00/0ns |
59/0ns |
75/4ns |
06/0* |
8/1127* |
09/12* |
35/7ns |
|
BAP+NAA |
00/0ns |
47/1ns |
43/40ns |
02/0* |
8/1691** |
93/6* |
08/20* |
|
Kin+IBA |
00/0* |
57/0ns |
18/1ns |
02/0ns |
85/551** |
37/1ns |
91/7* |
|
Kin+NAA |
00/0ns |
54/0ns |
31/6* |
04/0ns |
07/444* |
29/3ns |
35/16* |
ns: معنی دار نیست.
*: در سطح 05/0p≤ معنی‌دار است.
**: در سطح 01/0p≤ معنی‌دار است.
به‌عنوان یک نتیجه مهم، در آزمایش ما نشان داده شد که در هفته چهارم پس از کشت تکگره، حداکثر تعداد جوانه‌ها در محیط پایه MS حاوی 2 میلی‌گرم بر لیترBAP و فاقد هر گونه اکسین به دست آمد. در این مطالعه، تأثیر معنی‌دار از IBA بر روی تعداد ریشه و درصد ریشهزایی مشاهده نگردید، لیکن حضور IBA در محیط‌کشت افزایش طول ریشه را باعث گردید (جدول 4).
جدول 4- اثر تنظیمکنندههای رشد گیاهی به همراه زغال فعال بر پارامترهای مختلف رشد ریزنمونههای فلفل دلمهای 35 روز پس از کشت در شرایط 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی
|
BAP (میلی‌گرم برلیتر) |
IBA (میلی‌گرم برلیتر) |
تعداد برگ |
فاصله میانگره (cm) |
تعداد ریشه در هر ریزنمونه |
طول ریشه (cm) |
درصد ریشهزایی (%) |
|
0 |
0 |
h93/2 |
25/0 abc |
67/1f |
20/2e |
33/11e |
|
0 |
2/0 |
gh 73/3 |
17/0c |
47/2d |
07/2e |
67/22de |
|
0 |
5/0 |
dg 80/4 |
18/0bc |
47/3c |
80/4abc |
33/25de |
|
1 |
0 |
d13/5 |
25/0abc |
27/2d |
47/4bcd |
33/23de |
|
1 |
2/0 |
cd 20/5 |
29/0abc |
67/2d |
33/3bcde |
60/21de |
|
1 |
5/0 |
d 07/5 |
22/0bc |
07/4b |
07/3cde |
00/36cd |
|
2 |
0 |
a07/8 |
36/0a |
60/3c |
47/2de |
67/50ab |
|
2 |
2/0 |
ab87/6 |
22/0bc |
17/4b |
87/8a |
67/40abc |
|
2 |
5/0 |
bc40/6 |
31/0ab |
07/5a |
40/5ab |
00/54a |
داده‌های دارای حروف مشترک از نظر آماری معنی‌دار نیستند.
ریزنمونههای ریشهدار نشده حاصل از مرحله باززایی جهت القای ریشهزایی به محیط پایه حاوی هورمونهای IBA (5/0 میلی‌گرم بر لیتر) یاNAA (5/0 میلی‌گرم بر لیتر) منتقل شدند. حدود 80% از ریزنمونهها در این محیط ریشهدار شدند (جدول 5).
جدول 5- اثر نوع اکسین بر ریشه‌دهی در محیط حاوی 4/0% زغال فعال
|
ریشهزایی (%) |
طول ریشه (cm) در هر ریزنمونه |
تعداد ریشه در هر ریزنمونه |
نوع و غلظت اکسین (میلی‌گرم بر لیتر) |
|
|
|
|
|
|
|
IBA |
|
|
- |
- |
- |
|
0 |
|
|
- |
- |
- |
|
2/0 |
|
|
4/84 |
22/5 |
61/1 |
|
5/0 |
|
|
|
|
|
|
NAA |
|
|
- |
- |
- |
|
0 |
|
|
5/48 |
- |
- |
|
2/0 |
|
|
- |
02/4 |
71/2 |
|
5/0 |
|
جهت واکشت نمودن گیاهچهها از بهترین محیط حاصل از نتایج به دست آمده استفاده گردید. این امر باعث شد که در مدت زمان نسبتاً کوتاهی تعداد زیادی گیاهچه باززایی شده فلفل دلمهای تولید شود. این گیاهچهها پس از سازگاری در فیتوترون، به گلخانه منتقل شدند (شکل 5). حدود 90-70 % از گیاهچههای تولید شده در شرایط کشت بافت مورد اشاره، در شرایط گلخانه نیز زنده مانده، رشد مطلوبی از خود نشان دادند.
شکل 5- گیاهچه حاصل از محیط‌کشت MS به همراه 2 میلی‌گرم BAP بر لیتر و 5/0 میلی‌گرم IBA بر لیتر
سازگار شده در فیتوترون، آماده انتقال به محیط طبیعی
بحث
تاکنون مطالعاتی در زمینه باززایی فلفل دلمهای و اثر هورمونهای مختلف بر ریزازدیای آن در خارج از کشور گزارش شده است (Arroyo and Revilla, 1991; Christopher and Rajam, 1994; Ezura et al., 1993; Szasz et al. 1995; Gunay and Rao, 1978 Phillips and Hubstenberger, 1985; Agrawal et al., 1988). در این مطالعات، اثر ارقام، هورمونها و ریزنمونههای مختلف، از جمله: ریشه، کوتیلدون، هیپوکوتیل و ساقه بر باززایی این گیاه بررسی و مطالعه شده است. در مجموع، به نظر می‌رسد، که کارا بودن روش‌های ارائه شده در این مقالات، به شدت به رقم مورد مطالعه بستگی داشته است.
در مراحل ابتدایی آزمایش از محیطهای بدون زغال فعال برای باززایی ساقه دارای تکگره استفاده گردید که نتیجه آن عدم رشد مناسب شاخه، کالوسی شدن قاعده ریزنمونه و عدم تولید ریشه بود (به دلیل فنل تولید شده توسط ریزنمونه است، که ازرشد گیاه ممانعت میکند). برای حل این مشکل، زغال فعال به میزان 4/0% به محیط‌کشت باززایی حاوی هورمونهای رشد اضافه شد. زغال فعال اثر قابل ملاحظه‌ای در رشد ریزنمونهها و القای تولید ریشه در آنها داشت، ضمن این که مانع تولید کالوس در قاعده ریزنمونههای کشت شده در محیط شد. از آنجا که زغال فعال بعنوان یک ماده جاذب رنگ و متابولیتهای مختلف شناخته میشود، احتمال می‌رود افزودن آن به محیط باعث جذب ترکیبات فنلی و دیگر مواد بازدارنده رشد از محیط‌کشت شده باشد اثر مثبت زغال فعال بر تکثیر گیاهان از طریق کشت بافت توسط دانشمندانی، همچون Pan وVan Staden (2004) و Dennis (2008) تأیید شده است. اثر زغال فعال احتمالاً نتیجه‌ای است از خصوصیات این ماده مؤثره برای باند شدن و جذب فنولیک‌ها و دیگر عواملی که می تواند از تکثیر ریزنمونهها ممانعت کند، این مواد اکسید شده سمّی بوده، منجر به قهوه‌ای یا کالوسی شدن بافت گیاهی و محیط‌کشت می‌گردند و موجب کاهش سرعت رشد و در نهایت در رشد گیاه به صورت محرک و یا بازدارنده نقش مهمی دارند.
در این مطالعه، بهترین تیمار جهت باززایی ریزنمونههای گیاه فلفل محیط پایه دارای سیتوکینین BAP (2 میلی‌گرم در لیتر) بود که اثر مثبتی بر پارامترهای باززایی نظیر شاخه‌زایی، تولید برگ و حتی القای ریشهزایی در هر ریزنمونه داشت. در این مطالعه تأثیر معنی‌داری از IBA بر روی تعداد ریشه و درصد ریشهزایی مشاهده نگردید، لیکن حضور IBA در محیط‌کشت افزایش طول ریشه را باعث گردید.
این نتیجه، با نتایج سایر مطالعات انجام شده توسط دیگر پژوهشگران مطابقت دارد. در این راستا، نشان داده شده است که استفاده از BAP در غلظت 10 میلی‌گرم بر لیتر بهترین تیمار جهت باززایی فلفل از ریزنمونههای نوک ساقه است (Christopher and Rajam, 1994). در مطالعه دیگری نیز نشان داده شده که بهترین تیمار برای تولید انبوه فلفل با استفاده از جوانه‌های رأسی، استفاده از محیط کشت MS حاوی 5 میلی‌گرم بر لیتر BAP بوده است (Sanatombi and Sharma, 2007). مشخص شده است که استفاده از سیتوکنین دیگر؛ یعنی Kin به تنهایی یا در ترکیب با هورمونهای دیگر به اندازه BAP در باززایی گیاه نقش نداشته است و تنها تعداد کمی از ریزنمونههای گیاه فلفل در محیطهای حاوی این تنظیمکننده رشد گیاهی باززایی شدهاند (Phillips and Hubstenberger, 1985; Agrawal et al., 1989). در این مطالعه، اگر چه تأثیر مثبتی از NAA در القاء ریشه‌دهی در مرحله بعد از باززایی مشاهده گردید، لیکن در مقایسه با IBA از تأثیر کمتری برخوردار بود، دیگر تحقیقات انجام شده (Husain et al. 1999) | نیز نتایج مشابهی را بیان نموده‌اند که مؤید نتایج این مطالعه است.
ریزنمونههای باززایی شده پس از ریشهزایی در محیط حاوی IBA، جهت مقاومسازی به فیتوترون و سپس به محیط گلخانه منتقل شدند. حدود 90-70 % از گیاهچههای حاصل از کشت بافت در گلخانه ماندگاری خوبی نشان داده و رشد مطلوبی داشتند. گیاهان رشد یافته پس از طی مراحل رویشی گل داده و میوه نیز تولید نمودند. در مجموع، روش به‌کار گرفته شده در این تحقیق که از طریق کشت ساقه دارای تکگره از گیاهان حاصل از بذر یا حاصل از تکگرههای با واکشت متوالی صورت گرفت، روش مناسبی جهت ریزازدیادی و کشت انبوه این رقم است.
تشکر و قدردانی
شایسته است از آقای مهندس اسماعیل روح‌الامینی که در ایجاد زمینه علمی و امکان اجرای این طرح همکاری صمیمانه‌ای داشتند و همچنین از آقای دکتر سید علی حسینی تفرشی جهت ارائه برخی از پیشنهادهای علمی سپاسگزاری و قدردانی نماییم.
)
