Authors
1 Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, University of Zabol, Zabol, Iran
2 Department of Plant Sciences, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
Abstract
Keywords
الیسیتورها ترکیباتی با منشأ زیستی و یا غیر زیستی هستند که از طریق القای پاسخهای دفاعی باعث بیوسنتز و انباشت متابولیتهای ثانویه میشوند (Zhao et al., 2005). الیسیتورهای زیستی شامل پلیساکاریدها، پروتئینها، گلیکوپروتئینها و یا قطعات دیواره سلولی قارچها، گیاهان (سلولوز و پکتین) و میکروارگانیسمها (کیتین و گلوکان) هستند (Vasconsuelo and Boland, 2007). الیسیتورهای زیستی ممکن است دارای ترکیبی مشخص مانند کیتین و کیتوزان، یا نامشخص مانند همگنای قارچ و عصاره مخمر و مجموعهای از ترکیبات زیستی باشند. به طور کلی، استفاده از الیسیتورها در پژوهشهای زیستفناوری متابولیتهای ثانویه گیاهی دو هدف اصلی را دنبال میکند: نخست کسب یافتههایی در زمینه مسیرهای بیوسنتزی که به تشکیل و تنظیم متابولیتهای ثانویه منجر میشود. دوم افزایش تولید متابولیتهای ثانویه برای کاربرد تجاری. در طبیعت، گیاهان به حمله پاتوژنها، حشرات، علفخواران و دیگر تنشهای زیستی و غیر زیستی از طریق فعال کردن مکانیسمهای دفاعی شامل القای تشکیل متابولیتهای ثانویه نظیر فیتوالکسینها، پاسخهای فوق حساسیتی و سدهای دفاعی ساختاری مانند رسوب لیگنین در دیواره سلولی پاسخ میدهند (Vasconsuelo and Boland, 2007). الیسیتورها ممکن است ژنهای جدیدی را فعال کنند که آنزیمها و در نهایت مسیرهای بیوسنتزی مختلفی را راهاندازی کنند و باعث تشکیل متابولیتهای ثانویه شوند. شروع پاسخهای دفاعی در گیاه شبکهای از ترارسانی علامت را القا میکند که با تشخیص مولکولهای الیسیتور توسط پذیرندهها شروع میشود. الیسیتورهای قارچی و ترکیبات اصلی دیواره سلولی بسیاری از گونههای قارچی مانند کیتین و کیتوزان باعث افزایش میزان متابولیتهای ثانویه، به ویژه آنهایی که در سازوکارهای دفاعی گیاه نقش دارند، میشوند (Kang et al., 2004؛ (Pu et al., 2009. لیگنانها گروه بزرگی از متابولیتهای ثانوی هستند که در بسیاری از گیاهان ساخته میشوند. این ترکیبات معمولاً از دو واحد فنیل پروپانوئیدی تشکیل میشوند و در مکانیسمهای دفاعی گیاهان در برابر علفخوران و عوامل بیماریزا نقش دارند و فعالیت زیستی متنوعی از خود نشان میدهند. فنیل پروپانوئیدها مولکولهای کوچک فنلی هستند که یک حلقه فنیلی و یک زنجیره سه کربنی دارند. این ترکیبات از مسیر بزرگ فنیل پروپانوئیدی سنتر میشوند (Dixon and Srinivasa Reddy, 2003). عامل ایجاد طعم، بو و مزه در اسانس هستند و نقشهای متفاوتی را در گیاهان ایفا میکنند. بسیاری از آنها در دفاع در برابر گیاهخواران، عوامل بیماریزا نقش دارند و یا در حفاظت مکانیکی، جذب عوامل گردهافشان و پراکنده کردن میوه یا در کاهش رشد گیاهان رقیب دخالت دارند Iijima et al., 2004)؛ (Taize and Zeiger, 2006. فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) که آغاز کننده نخستین مرحله از بیوسنتز فنیل پروپانوئیدهاست، پل ارتباطی بین متابولیتهای اولیه و برخی ازمتابولیتهای ثانویه است (Yu et al., 2006). مهمترین مرحله در بیوسنتز فنلها، دآمیناسیون فنیل آلانین و تولید سینامیک اسید است
(Ali et al., 2007). بیان و فعالیت این آنزیم تحت تأثیر عوامل زیستی (باکتری، ویروس و قارچ) و غیر زیستی (کاهش یا افزایش دما، زخم و اشعه ماورای بنفش) القا میشود (Chen et al., 2006). افزایش فعالیت PAL و دیگر آنزیمهای مسیر فنیل پروپانوئیدی که به افزایش ترکیبات فنلی منجر میشود، از نخستین پاسخهای گیاهان در شرایط تنش هستند (Wen et al., 2008). مطالعات اندکی در زمینه کاربرد الیسیتورها به منظور تولید بیشتر لیگنانها در کشت درون شیشه (in vitro) وجود دارد. افزایش میزان پوروفیلوتوکسین در کشت تعلیقی Linum album پس از افزودن متیل جاسمونات گزارش شده است (Furden et al., 2005). کشت همزمان قارچهای شبه میکوریزی با کشت سلول این گونه به افزایش چهار برابری در میزان پودوفیلوتوکسین منجر شده است (Baldi et al., 2008). تولید
6- متوکسی پودوفیلوتوکسین در کشت سلول
L. nodiflorum تحت تأثیر متیل جاسمونات به میزان ده برابر افزایش یافته است (Berim et al., 2005). کیتو اولیگوساکاریدها باعث افزایش 15 برابری انباشت پودوفیلوتوکسین در کشت سلول Juniperus chinesis شدهاند (Muranaka et al., 1998). گیاه کتان سفید یکی از گونههای بومی ایران است که در اندامهای مختلف آن ترکیبات لیگنانی از جمله پودوفیلوتوکسین وجود دارد. با توجه به این که ترکیبات مختلف عصاره قارچها و مدت زمانی که سلولها در معرض الیستور قرار میگیرند، بر افزایش تولید لیگنانها تأثیر میگذارد، بدین منظور عصارههای قارچی از ردههای مختلف قارچی تهیه شد و سپس در زمانهای مختلف میزان لیگنانها بررسی شد. در ادامه، میزان ترکیباتی که دارای مسیر بیوسنتزی مشترک با لیگنانها هستند مانند لیگنین و سایر ترکیبات فنلی بررسی شد تا ارتباط مسیرهای متابولیسمی گیاه مشخص شود. به منظور درک بهتر مکانیسم اثر این تیمارها فعالیت آنزیمهای مسیر بیوسنتزی پودوفیلوتوکسین نیز بررسی شد. از آنجایی که آنزیمهای PAL و CAD که تنظیمکنندههای ابتدای مسیر بیوسنتز پودوفیلوتوکسین و لیگنانهای مرتبط با آن هستند، میزان فعالیت آنها بررسی شد تا ارتباط آنها با تغییرات میزان لیگنانها به دست آید.
مواد و روشها
جمعآوری و کشت بذرها
بذرهای کتان سفید از منطقه سوهانک
N ً19 48 °35، E ً22 32 °51 تهران جمعآوری شد. بذرها پس از شستشوی سطحی، ابتدا به مدت 10 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم یک درصد، سپس 10 دقیقه در پراکسید هیدروژن 3/3 درصد و به مدت یک دقیقه در الکل 70 درصد قرار گرفتند. در بین هر کدام از این مراحل سه بار با آب مقطر استریل آبکشی شدند. بذرهای استریل شده به مدت یک ساعت در محلول 5/0 میلیگرم در لیتر ژیبرلین (GA3) سترون شده قرار گرفتند و سپس در محیط پایه MS (Murashige and Skoog, 1962) کشت داده شدند. بذرها به مدت دو هفته در دمای 25 درجه سانتیگراد و دوره 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند و از گیاهچههای حاصل برای ایجاد قطعات جداکشت و کشتبافت استفاده شد (Esmaeilzadeh et al., 2011).
القای تولید کالوس و راهاندازی کشت سلولی
به منظور القای کالوس، قطعاتی از گیاهچه به طول 1 تا 2 سانتیمتر برش داده شدند و پس از آن قسمتهای ساقه-برگ به محیطکشت MS پایه حاوی 2 میلیگرم در لیتر نفتالن استیک اسید و 4/0 میلیگرم در لیتر کینتین منتقل شد. پس از گذشت 2 هفته القا کالوس از قطعات ساقه-برگ شروع شد. برای تهیه کشت تعلیقی 2 گرم کالوس نرم، سفید و همسن که پس از 2 ماه، 8 بار واکشت شده بود به 50 میلیلیتر محیطکشت MS با ترکیبات هورمونی یاد شده در بالا بدون آگار اضافه شد و روی شیکر با سرعت 120 دور در دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد در تاریکی نگهداری شد و هر هفته یکبار واکشت شد (Esmaeilzadeh et al., 2011).
تیمار سلولها با الیسیتورهای قارچی
نخست به منظور ایجاد کشت همگن و یکنواخت، کشت مایع سلولی تهیه شده در مرحله پیش، 6 بار واکشت شد. در هر مرحله سلولها با قیف بوخنر و در شرایط مکش جمعآوری و به محیط تازه منتقل شدند. پیش از اعمال تیمارها، دوره رشد برای سلولها تعیین شد. بدین منظور پس از انتقال سلولها به محیط جدید از روز اول تا روز پانزدهم پس از انتقال، به فاصله زمانی دو روز نمونهبرداری انجام و بر اساس وزن خشک سلولها منحنی رشد ترسیم شد. برای تهیه الیسیتورهای قارچی، ابتدا 5 الیسیتور قارچی از قارچهای Fusarium graminearum، Rhizoctonia solani، Rhizopus stolonifer، Sclerotinia sclerotiorum و Trichoderma viride مطابق روش Esmaeilzadeh و همکاران (2011) استخراج شدند. بدین ترتیب که نخست قارچهای یاد شده در محیطکشت سیبزمینی دکستروز آگار (PDA) کشت شدند و پس از 5 روز از حاشیه فعال کلونی یک یا چند قطعه به محیط مایع سیبزمینی دکستروز (PDB) منتقل شدند و به مدت 5 روز روی شیکر با سرعت 135 دور در دقیقه و دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. سپس، میسلیومهای قارچی برداشت و با آب مقطر استریل شسته شدند. هر یک از میسیلیومها در نیتروژن مایع ساییده و در آب حل شدند و در پایان، محلولی با غلظت 250 میلیگرم در لیتر از آنها ساخته شد. محلول حاصل به مدت نیم ساعت در دمای 100 درجه سانتیگراد قرار گرفت و پس از آن در rpm 10000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس، فاز محلول به مدت 10 دقیقه در دمای 120 درجه سانتیگراد اتوکلاو شد. در نهایت، محلول به دست آمده به عنوان الیسیتور قارچی استفاده شد. به منظور اعمال تیمارها، 500 میلیگرم سلول (وزن تر) از کشت تعلیقی یکنواخت و همگن کتان سفید با قیف بوخنر و در شرایط مکش برداشت شد و به پلیت حاوی 5 میلیلیتر محیطکشت مایع وارد شد. با توجه به منحنی رشد سلولی به دست آمده در روز هفتم، سلولها به طور جداگانه با غلظت یک درصد (v/v) الیسیتورهای قارچی تیمار شدند و سلولها در فواصل زمانی 1، 2، 3 و 5 روز پس از تیمار برداشت شدند. به طوری که در هر نوبت، 3 تکرار مستقل از نمونههای تیمار شده و بدون تیمار برداشت شدند.
اندازهگیری رشد سلولی
رشد سلولی با اندازهگیری وزن خشک سلولها تعیین شد. سلولها توسط نایلون مش (42 میکرومتر) با قیف بوخنر و در شرایط مکش از محیطکشت جدا و به منظور تعیین وزن تر بلافاصله وزن شدند. سپس، سلولها توسط فرآیند انجماد، در خلأ خشک و وزن خشک آنها تعیین شد.
استخراج و سنجش لیگنانها
به 50 میلیگرم وزن خشک سلول، 1 میلیلیتر متانول 80 درصد افزوده و کاملاً ساییده و همگن شد. مخلوط حاصل به مدت 15 دقیقه در حمام فراصوت قرار گرفت و سانتریفیوژ شد. محلول حاصل به تیوب جدید منتقل و فاز متانولی تبخیر شد. سپس، به رسوب باقیمانده، 1 میلیلیتر آب و 1 میلیلیتر اتیل استات افزوده و سانتریفیوژ شد. سپس، فاز اتیل استات به تیوب جدید منتقل و تبخیر شد. در پایان، رسوب خشک شده در 1 میلیلیتر متانول حل شد. عصاره حاصل برای تزریق به دستگاه HPLC (Shimadzu, Japan) با صافی 45/0 میکرون (Millipore, Bedford, MA, USA) فیلتر شد و سطح زیر منحنی عصارهها در طول موج280 نانومتر محاسبه شد. به منظور تأیید وجود پودوفیلوتوکسین و لاریسی رزینول در نمونههای بررسی شده از تکنیک LC-MS استفاده شد. جرم مولکولی اجزای نمونه با روش Electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS) به همراه سیستم LC-20AD (Shimadzu, Japan) تعیین شد.
تعیین میزان فنل کل
میزان ترکیبات فنل کل بر اساس روش رنگسنجی فولین-سیوکالتیو (Singleton and Rossi, 1965) و بر حسب منحنی استاندارد گالیک اسید در طول موج 765 نانومتر اندازهگیری شد. بدین ترتیب که ابتدا 05/0 گرم از یاختههای لیوفیلیز شده در 3 میلیلیتر متانول80 درصد همگن شد و به مدت 3 ساعت در حمام آب گرم در دمای70 درجه سانتیگراد گذاشته شد. سپس، با سرعت g 9000 به مدت 15 دقیقه (دو بار) سانتریفیوژ و عصاره متانولی از رسوب جدا شد. عصاره متانولی برای سنجش فنل کل، فلاوونوئیدها و فلاونولها استفاده شد. به 50 میکرولیتر عصاره متانولی، 500 میکرولیتر محلول فولین- سیوکالتیو اضافه شد. به مخلوط حاصل پس از 5 دقیقه، 500 میکرولیتر محلول سدیم کربنات 7 درصد اضافه شد و جذب پس از 10 دقیقه در طول موج 765 نانومتر خوانده شد. در پایان، مقدار فنل کل بر حسب میلیگرم بر گرم وزن خشک محاسبه شد.
تعیین میزان فلاونول کل
به 1 میلیلیتر از عصاره متانولی، 1 میلیلیتر از محلول کلرید آلومینیوم 2 درصد و 3 میلیلیتر از محلول سدیم استات 5 درصد اضافه شد. میزان فلاونول کل بر اساس منحنی استاندارد روتین (rutin) و در طول موج 445 نانومتر اندازهگیری شد (Akkol et al., 2008).
تعیین میزانفلاونوئید کل
سنجش فلاونوئید کل نیز بر اساس منحنی استاندارد روتین (rutin) سنجیده شد. به 1 میلیلیتر از عصاره متانولی، 250 میکرولیتر از محلول کلرید آلومینیوم 10 درصد و 250 میکرولیتر پتاسیم استات یک مولار اضافه کرده و جذب نمونهها در طول موج 415 نانومتر ثبت شد (Akkol et al., 2008).
سنجش و اندازهگیری لیگنین
میزان لیگنین با معرف استیل بروماید مطابق با روش (Iiyama and Wallis, 1999) تعیین شد. بدین ترتیب که به 6 میلیگرم پودر خشک، 5/2 میلیلیتر استیل بروماید 25 درصد اضافه و به مدت 30 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد قرار داده شد و پس از آن به مدت 5 تا 10 دقیقه در آب یخ قرار گرفت. نمونهها با کاغذ صافی واتمن شماره یک صاف شدند. به بخش مایع، 5 میلیلیتر سدیم هیدروکسید 2 نرمال و 6 میلیلیتر استیک اسید گلایسیال اضافه شد. در پایان، جذب نمونهها در طول موج 280 نانومتر خوانده شد.
تعیین فعالیت فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) و سینامیل الکل دهیدروژناز (CAD)
روش استخراج پروتئین محلول
یک گرم از سلول کتان سفید در 2 میلیلیتر بافر پتاسیم فسفات 1/0 مولار با اسیدیته 8، حاوی 1 گرم پلی وینیل پیرولیدون و 50 میکرولیتر دیتیوتریتول کاملاً ساییده شد تا به حالت همگن در آمد. مخلوط حاصل در g20000 به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. محلول رویی با دقت جدا و برای سنجش غلظت پروتئین و نیز فعالیت آنزیم استفاده شد. غلظت پروتئین نمونهها با روش Bradford (1976) تعیین گردید.
روش سنجش فعالیت آنزیم PAL
برای سنجش فعالیت PAL، به 150 میکرولیتر از عصاره پروتئین استخراج شده، 200 میکرولیتر محلول فنیل آلانین 1/0 مولار در بافر پتاسیم فسفات با اسیدیته 8 و 650 میکرولیتر پتاسیم فسفات بافر 1/0 مولار با اسیدیته 8 اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد که دمای بهینه برای فعالیت آنزیم PAL است، قرار داده شد. سپس، 50 میکرولیتر از HCl 6 مولار برای غیر فعال کردن PAL به مخلوط اضافه شد. شستشوی نمونه با 5 میلیلیتر از اتیل استات انجام شد. سپس، نمونه در معرض جریان هوا تبخیر و به رسوب حاصل 1 میلیلیتر از سدیم هیدروکسید 05/0 مولار اضافه شد. غلظت سینامیک اسید با اندازهگیری مقدار جذب در طول موج 290 نانومتر و به منحنی استاندارد سینامیک اسید تعیین شد. یک واحد از فعالیت PAL برابر با یک میکروگرم از سینامیک اسید تولید شده در ساعت است (Ochoa-Alejo and Gomez-Peralta, 1993).
روش سنجش فعالیت آنزیم CAD
برای سنجش فعالیت آنزیمی از روش Garden (2003) با اندکی تغییرات استفاده شد: برای سنجش فعالیت CAD، به 25 میکرولیتر از عصاره پروتئین استخراج شده، 900 میکرولیتر بافر تریس 1/0 مولار با اسیدیته 8/8 و 50 میکرولیتر +NADP 2 میلیمولار اضافه و به مدت 5 دقیقه در دمای 30 درجه سانتیگراد قرار داده شد. سپس، به مخلوط حاصل 25 میکرولیتر کونیفریل الکل 2 میلیمولار اضافه و جذب آن در طول موج 390 نانومتر اندازهگیری شد.
تحلیل دادهها
همه آزمایشها با سه تکرار از کمینه سه نمونه مستقل انجام شد. مقایسه میانگینها با نرمافزار SPSS نسخه 18 و آزمون دانکن برای تعیین معنیدار بودن تفاوتها در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.
نتایج
تعیین منحنی رشد سلول
پیش از اعمال تیمارهای مورد نظر میزان رشد سلولها طی 15 روز در کشت تعلیقی بررسی شد (شکل 1). نتایج نشان داد که پس از کشت، وزن خشک سلولها شروع به افزایش کرده، این روند تا روز نهم ادامه داشت. پس از این زمان، وزن کاهش یافت. شیب رشد یاختهای در روز هفتم افزایشی بود که در این زمان یاختهها در اواسط دوره لگاریتمی بوده، به شدت در حال تقسیم هستند. در این زمان حجم توده یاختهای به حد مناسبی رسیده، بنابراین روز هفتم به عنوان زمان افزودن تیمار انتخاب شد.
شکل 1- منحنی رشد یاختهای در کشت تعلیقی کتانسفید در محیطکشت MS. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است. حرف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد است.
تأثیر الیسیتورهای قارچی بر رشد سلولی
رشد سلول تحت تأثیر همه الیسیتورها پس از گذشت 5 روز به طور معنیداری کاهش یافت. در بین الیسیتورهای بررسی شده بیشترین میزان کاهش رشد تحت تأثیر عصاره قارچ S. sclerotiorum به میزان 50 درصد سلولهای شاهد مشاهده شد (شکل 2).
تأثیر الیسیتورهای قارچی بر میزان پودوفیلوتوکسین و لاریسی رزینول
نتایج بررسی لیگنانها در زمانهای مختلف پس از اعمال تیمار نشان داد که بیشترین میزان پودوفیلوتوکسین و لاریسی رزینول در سلولهای تیمار شده با الیسیتورهای قارچی به استثنای S. sclerotiorum در روز پنجم پس از تیمار وجود دارد، در حالی که عصاره قارچ
S. sclerotiorum در روز سوم پس از اعمال تیمار باعث القای بیشترین میزان لیگنانها شد و پس از آن در روز پنجم میزان لیگنانها در حد سلولهای شاهد کاهش یافت. در بین الیسیتورهای قارچی بررسی شده، بیشترین میزان تولید پودوفیلوتوکسین در سلولهای تیمار شده با
F. graminearum به میزان شش برابر نمونههای شاهد مشاهده شد، در حالی که R. stolonifer باعث القا بیشترین میزان لاریسی رزینول به میزان هفت برابر نمونههای شاهد شد (شکلهای 3 و 4).
|
شکل 2- تأثیر الیسیتورهای قارچی بر رشد سلولی در کشت تعلیقی کتان سفید. الیسیتورهای قارچی در روز هفتم از دوره رشد به محیطکشت اضافه شد و نمونهها طی 5 روز برداشت شدند. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است. حرف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد است. |
|
شکل 3- تغییرات میزان پودوفیلوتوکسین تحت تأثیر الیسیتورهای قارچی در کشت تعلیقی کتان سفید. الیسیتورهای قارچی در روز هفتم دوره رشد به محیطکشت اضافه شد. سلولها در زمانهای 1، 2، 3 و 5 روز پس از تیمار برداشت شدند. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است. حرف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد است. |
|
شکل 4- تغییرات میزان لاریسی رزینول تحت تأثیر الیسیتورهای قارچی در کشت تعلیقی کتان سفید. الیسیتورهای قارچی در روز هفتم دوره رشد به محیطکشت اضافه شد. سلولها در زمانهای 1، 2، 3 و 5 روز پس از تیمار برداشت شدند. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است. حرف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد است. |
تأثیر الیسیتورهای قارچی بر فنل کل، فلاونول و فلاونوئیدها
نتایج تحلیل واریانس میزان فنل کل نشان داد که الیسیتورهای قارچی یک روز پس از افزوده شدن در محیطکشت تعلیقی باعث افزایش میزان فنل کل میشوند. این روند افزایشی تا روز پنجم نیز ادامه پیدا کرد و به بیشترین میزان رسید (جدول 1). بیشترین میزان فنل کل در سلولهای تیمار شده با S. sclerotiorum مشاهده شد که به میزان 5/1 برابر نمونههای شاهد بود. بررسی میزان فنل کل در سلولهای شاهد نشان داد میزان ترکیبات فنلی با شیب ملایمی رو به افزایش است. میزان فلاونولها نیز بررسی شد. مقدار فلاونولها در سلولهای تیمار شده با T. viride و S. sclerotiorum پس از گذشت دو روز نسبت به سلولهای شاهد افزایش معنیداری را نشان داد و در روز پنجم به بیشترین میزان رسید. در حالی که در سلولهای تیمار شده با R. solani و R. stolonifer میزان فلاونولها پس از گذشت سه روز افزایش معنیداری نشان داد. میزان فلاونول در سلولهای تیمار شده با
F. graminearum نسبت به شاهد اختلاف معنیداری نشان نداد (جدول 2). در سلولهای شاهد میزان فلاونولها تا پایان دوره آزمایش به آرامی رو به افزایش بود.
تحلیل واریانس میزان فلاونوئیدها نشان داد که میزان فلاونوئیدها یک روز پس از افزودن T. viride و S. sclerotiorum افزایش معنیداری داشت و این روند تا پایان دوره آزمایش ادامه یافت، به طوری که بیشترین میزان آن پنج روز پس از اعمال تیمار بود (جدول 3). در سلولهای تیمار شده با R. solani، R. stolonifer و F. graminearum میزان فلاونوئیدها پس از گذشت دو روز افزایش معنیداری را نشان داد و در روز پنجم به بیشترین میزان رسید. در بین الیسیتورهای استفاده شده بیشترین میزان فلاونوئیدها در سلولهای تیمار شده با
S. sclerotiorum و T. viride مشاهده شد.
جدول 1- تأثیر الیسیتورهای قارچی بر فنل کل در کشت تعلیقی کتان سفید. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است. حرف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد است.
|
|
میزان فنل کل (mg/g DW) |
|
||
|
5 |
3 |
2 |
1 |
زمان (روز) تیمار |
|
hij1±24 |
ijk1±22 |
lm5/0±3/19 |
m 1±17 |
شاهد |
|
cdef5/1±27 |
fgh5/1±6/25 |
hij1±23 |
lm5/0±19 |
Fusarium graminearum |
|
cde1±29 |
efg2±26 |
hij 2±23 |
jkl 5/1±20 |
Rhizoctonia solani |
|
bcd2±29 |
def1±3/27 |
def5/1±3/21 |
ki5/0±20 |
Rhizopus stolonifer |
|
b5/1±6/31 |
cde5/1±6/28 |
cde1±26 |
ijkl5/1±6/21 |
Trichoderma viride |
|
a1±35 |
bc1±30 |
bc1±28 |
hij1±23 |
Sclerotinia sclerotiorom |
جدول 2- تأثیر الیسیتورهای قارچی بر فلاونولها در کشت تعلیقی کتان سفید. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است. حرف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد است.
|
|
میزان فلاونول کل (mg/g DW) |
|
||
|
5 |
3 |
2 |
1 |
زمان (روز) تیمار |
|
ghij1±15 |
hijk5/0 ±3/13 |
ki1±12 |
i5/0±3/11 |
شاهد |
|
efg1/1±3/17 |
fgh5/1± 6/15 |
ijkl1±13 |
i5/0 ±3/12 |
Fusarium graminearum |
|
de1/1±6/18 |
efg2±17 |
ijkl1±13 |
i7/1 ±11 |
Rhizoctonia solani |
|
cde2±3/19 |
efg1±17 |
jkl5/1±6/12 |
i5/1 ±3/11 |
Rhizopus stolonifer |
|
abc5/1±6/21 |
def2±18 |
ghi1/1±3/15 |
i5/1±6/11 |
Trichoderma viride |
|
ab2±23 |
bcd1±20 |
efg1±17 |
i1±13 |
Sclerotinia sclerotiorom |
جدول 3- تأثیر الیسیتورهای قارچی بر فلاونوئیدها در کشت تعلیقی کتان سفید. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است. حرف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد است.
|
|
میزان فلاونوئید کل (mg/g DW) |
|
||
|
5 |
3 |
2 |
1 |
زمان (روز) تیمار |
|
ghij1±3/15 |
ijkl5/0±1/14 |
lm1±6/12 |
m5/0±6/11 |
شاهد |
|
de1/1±20 |
fg5/1±3/17 |
ghij1±6/15 |
lm5/0±14 |
Fusarium graminearum |
|
c1/1±6/22 |
ef2±19 |
ghij1±6/15 |
jklm7/1±3/12 |
Rhizoctonia solani |
|
bc2±6/23 |
cd1±22 |
ghij5/1±3/15 |
klm5/1±13 |
Rhizopus stolonifer |
|
a5/1±26 |
c2±23 |
de1/1±20 |
hij5/1±3/16 |
Trichoderma viride |
|
ab2±3/25 |
abc1±24 |
de1±3/20 |
ghij1±16 |
Sclerotinia sclerotiorom |
تأثیر الیسیتورهای قارچی بر میزان لیگنین
نتایج بررسی میزان لیگنین در کشت تعلیقی کتان سفید نشان داد که پس از گذشت یک روز از آغاز تیمار سلولها با F. graminearum، R. stolonifer،
S. sclerotiorum و T. viride و پس از گذشت دو روز از اعمال تیمار با R. solani میزان آن به طور معنیداری نسبت به شاهد افزایش یافت و این روند تا پایان دوره آزمایش ادامه یافت، به طوری که میزان لیگنین پنج روز پس از اعمال تیمار به میزان 2 تا 5/2 برابر نسبت به سلولهای شاهد افزایش یافت (جدول 4).
تأثیر الیسیتورهای قارچی بر فعالیت آنزیمهای PAL و CAD
میزان فعالیت آنزیم PAL تحت تأثیر الیسیتورهای قارچی افزایش یافت که اوج فعالیت آن پس از گذشت سه تا پنج روز مشاهده شد. در این حالت میزان فعالیت در مقایسه با شاهد بیش از دو برابر افزایش یافت. در بین قارچهای بررسی شده بیشترین میزان فعالیت تحت تأثیر عصاره F. graminearum مشاهده شد (شکل 5).
نتایج بررسی آنزیم CAD نشان داد که همانند آنزیم PAL، فعالیت CAD نیز به طور معنیداری افزایش مییابد. عصاره F. graminearum باعث بیشترین افزایش در فعایت آنزیم CAD شد. قارچهای R. solani و T. viride تأثیر چندانی بر فعالیت این آنزیم نداشتند، هر چند پس از گذشت پنج روز از زمان اعمال تیمار افزایش معنیداری نسبت به سلولهای شاهد نشان دادند که این شدت افزایش درخور توجه نبود (شکل 6).
جدول 4- تأثیر الیسیتورهای قارچی بر میزان لیگنین در کشت تعلیقی کتان سفید. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است. حرف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد است.
|
|
میزان لیگنین (mg/g DW) |
|
||
|
5 |
3 |
2 |
1 |
زمان (روز) تیمار |
|
jk1/0±2 |
lm05/0±6/1 |
mn1/0±4/1 |
n1/0±1/1 |
شاهد |
|
c3/0±1/4 |
def2/0±2/3 |
jk1/0±1/2 |
kl2/0±8/1 |
Fusarium graminearum |
|
c1/0±9/3 |
efg1/0±3 |
kl1/0±9/1 |
n2/0±2/1 |
Rhizoctonia solani |
|
ab 1/0±8/4 |
d1/0±3/3 |
hi1/0±7/2 |
kl1/0±8/1 |
Rhizopus stolonifer |
|
b5/0±8/4 |
de3±3/3 |
gh2/0±7/2 |
kl1/0±8/1 |
Trichoderma viride |
|
a1/0±1/5 |
def3/0±3/3 |
ij1/0±3/2 |
kl1/0±9/1 |
Sclerotinia sclerotiorom |
|
ab 4/0±9/4 |
fg2/0±3 |
jk1/0±2 |
mn1/0±4/1 |
Chitosan |
|
شکل 5- فعالیت آنزیم PAL تحت تأثیر الیسیتورهای قارچی. میزان فعالیت بر حسب سینامیک اسید تولید شده محاسبه شد. الیسیتورهای قارچی در روز هفتم دوره رشد به محیطکشت اضافه شد. سلولها در زمانهای 1، 2، 3 و 5 روز پس از تیمار برداشت شدند. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است. حرف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد است. |
|
شکل 6- فعالیت آنزیم CAD تحت تأثیر الیسیتورهای قارچی. الیسیتورهای قارچی در روز هفتم دوره رشد به محیطکشت اضافه شدند. سلولها در زمانهای 1، 2، 3 و 5 روز پس از تیمار برداشت شدند. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است. حرف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد است. |
بحث
مطالعات متعدد نشان دادهاند که الیسیتورهای قارچی باعث افزایش میزان متابولیتهای ثانویه، به ویژه آنهایی که در سازوکارهای دفاعی گیاه نقش دارند، میشوند Kang et al., 2004)؛ (Pu et al., 2009. در پژوهش حاضر، تأثیر الیسیتورهای قارچی بر رشد سلول، تولید ترکیبات فنیل پروپانوئیدی و لیگنانی بررسی شد. مطالعات نشان میدهد که الیسیتورهای قارچی باعث مهار رشد سلولهای گیاهی میشوند (Missawa, 1994). رشد سلولهای Morinda elliptica تحت تأثیر عصاره قارچ Aspergillus niger بیش از 35 درصد نسبت به نمونههای شاهد کاهش یافته است (Chong et al., 2005). کاهش رشد سلولی تحت تأثیر الیسیتورهای قارچی در کشت سلول Rhodiola sachalinesis، Taxus spp. و Catharanthus roseus نیز گزارش شده است (Chong et al., 2005). کاهش رشد سلول تحت تأثیر الیسیتورهای قارچی به علت کاهش متابولیسم اولیه و آغاز متابولیسم ثانویه است Chen et al., 2000)؛ (Wang and Wu, 2001. گزارشاتی نیز مبنی بر افزایش رشد تحت تأثیر الیسیتورهای قارچی وجود دارد. تأثیر شش الیستور قارچی بر رشد سلولی Xanthophyllomyces dendrorhous مطالعه شده است. الیسیتورهای قارچی آثار متنوعی بر رشد داشتهاند. در بین قارچهای بررسی شده، غلظت 30 میلیگرم در لیتر عصاره قارچ Mucor mucedo رشد را به میزان درخور توجهی افزایش داده، در حالی که Rubia rubra تأثیری روی رشد نداشته است (Wang et al., 2006). نتایج بررسی لیگنانها در زمانهای مختلف پس از اعمال تیمار نشان داد که بیشترین میزان پودوفیلوتوکسین و لاریسی رزینول در سلولهای تیمار شده با الیسیتورهای قارچی به استثنای S. sclerotiorum، در روز پنجم پس از تیمار مشاهده میشود، در حالی که عصاره قارچ S. sclerotiorum در روز سوم پس از اعمال تیمار باعث القای بیشترین میزان لیگنانها شده و پس از آن در روز پنجم میزان لیگنانها در حد سلولهای شاهد کاهش یافته است. بیشترین میزان آلکالوئید اجمالیسین در کشت سلول و ریشه موئین C. roseus تحت تأثیر الیسیتورهای قارچی پس از گذشت یک روز از اعمال تیمار مشاهده شد و با گذشت زمان میزان آن کاهش یافت (Namdeo et al., 2002). بنابراین، به نظر میرسد مدت زمانی که سلولها در معرض الیسیتور قرار میگیرند، نقش مهمی در بیشترین میزان تولید متابولیتهای ثانویه دارد. الیسیتورهای قارچی مختلف آثار منحصر به فردی در تولید لیگنانها دارند، به طوری که در بین الیسیتورهای قارچی بررسی شده، بیشترین میزان تولید پودوفیلوتوکسین در سلولهای تیمار شده با
F. graminearum به میزان شش برابر نمونههای شاهد مشاهده شد، در حالی که R. stolonifer باعث القای بیشترین میزان لاریسی رزینول به میزان هفت برابر نمونههای شاهد شد. Hano و همکاران (2006) نیز گزارش کردند که الیسیتورهای قارچی Botrytis cinerea، F. oxysporum و Phoma exigua به طور متمایزی باعث القای تولید ترکیبات مونولیگنولی در سلولهای کتان زراعی (L. usitatissimum) میشوند. الیسیتورهای قارچی به طور متنوعی باعث القای تولید آلکالوئیدهای مختلف در کشت سلول C.roseus شدند (Zhao et al., 2001). برای مثال، قارچهایی نظیر Penicillium citrium و P. spimulorum باعث افزایش تولید اجمالیسین شدند و عصاره قارچ
Absidia cristata باعث افزایش تولید سرپنتین شد. قارچهایی مانند A. niger و Ustilaginodia vernes باعث افزایش تولید کاتارانتین شدند. علاوه بر این، عصاره قارچ Pythium بیشترین تأثیر را در افزایش هر سه نوع آلکالوئید داشت، در حالی که عصاره قارچ Mucor تأثیر الیسیتوری ضعیفی نشان داد. ترکیبات الیسیتورهای حاصل از دیوارهای سلول قارچها بسیار پیچیده هستند و شامل پروتئینها، اولیگوساکاریدها، گلیکوپروتئینها، پپتیدها، کیتین و کیتوزان هستند (Scheel and Parker, 1990). به نظر میرسد این ترکیبات در القای متابولیتهای ثانویه نقش داشته باشند. آثار ویژه و متنوع الیسیتورهای قارچی در ارتباط با برهمکنش ویژه هر قارچ با سلول گیاهی و مسیر ترارسانی علامت مربوطه است و بنابراین پاسخهای دفاعی سلول گیاهی متناسب با هر قارچ است (Imre et al., 1998). شناسایی ترکیبات فعال عصارههای قارچی در درک مکانیسم برهمکنش سلولهای گیاهی-الیسیتورهای قارچی و پاسخهای دفاعی کمک خواهد کرد. از دیگر ترکیباتی که در پاسخ به الیسیتورهای زیستی تولید میشوند ترکیبات فنیل پروپانوئیدی هستند (Bais et al., 2004). در این پژوهش نیز میزان فنل کل، فلاونول و فلاونوئیدها تا پایان دوره رشد تحت تأثیر الیسیتورهای قارچی افزایش یافت. لیگنین از دیگر ترکیباتی است که نقش دفاعی دارد و گیاه آن را در پاسخ به تنشهای محیطی میزان افزایش میدهد (Schmitt, 2006). در پاسخ به الیسیتورهای قارچی در کشتهای تعلیقی صنوبر (De Alwis et al., 2009) و کتان (Hano et al., 2006) میزان لیگنین به طور معنیداری افزایش یافت. نتایج این بررسی نیز نشان داد که میزان لیگنین در پاسخ به الیسیتورهای قارچی افزایش مییابد. به منظور درک رابطه بین القای متابولیتهای ثانویه و الیسیتورهای قارچی، فعالیت آنزیم PAL به عنوان آنزیم تنظیمکننده کلیدی مسیر فنیل پروپانوئیدی و آنزیم CAD به عنوان آنزیم تأمینکننده سوبسترای لیگنین و لیگنان بررسی شد. آنزیم PAL که آغاز کننده نخستین مرحله از مسیر بیوسنتزی فنیل پروپانوئیدها است، پل ارتباطی بین متابولیتهای اولیه و برخی از متابولیتهای ثانوی است (Yu et al., 2006). افزایش فعالیت PAL و دیگر آنزیمهای مسیر فنیل پروپانوئیدی که به افزایش ترکیبات فنلی منجر میشوند، از نخستین پاسخهای گیاهان در شرایط تنشزا هستند (Wen et al., 2008). مطالعات نشان میدهد که فعالیت این آنزیم تحت تأثیر الیسیتورهای قارچی نیز افزایش مییابد (Hano et al., 2006). در این مطالعه نیز تحت تأثیر الیسیتورهای قارچی میزان فعالیت این آنزیم افزایش یافته که اوج فعالیت پس از گذشت سه روز مشاهده شد. آنزیم CAD در انتهای مسیر بیوسنتزی فنیل پروپانوئیدها وارد عمل میشود و تأمینکننده سوبسترای لیگنین و لیگنان است. فعالیت این آنزیم تحت تأثیر الیسیتورهای قارچی افزایش یافته، اوج فعالیت آن پس از گذشت سه روز مشاهده شد. به نظر میرسد ترکیبات فعال الیسیتورهای قارچی نقش مؤثری در القای پاسخهای دفاعی دارند که با تأثیر بر فعالیت آنزیمهای PAL و CAD باعث افزایش میزان لیگنانها و ترکیبات فنیل پروپانوئیدی در کشت تعلیقی کتان سفید میشوند.
)
