تأثیر مثبت آلومینیم در فعال کردن سیستم آنتی‌اکسیدان ریشه‌های گیاه لیسیانتوس (Eustoma grandiflora L.)

تجمع آلومینیم محلول در خاک‌های اسیدی (5pH <) سبب ایجاد سمّیت و کاهش رشد گیاه می‌گردد .(Yamamoto et al., 1994) یکی از فرآیند‌های بیوشیمیایی گیاهان در شرایط تنش، تولید مقادیر فراوان گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) نظیر آنیون سوپر اکسید (O₂^.-)، پراکسید هیدروژن (H₂O₂) و رادیکال هیدروکسیل (OH^.) و در نتیجه آن ایجاد تنش اکسیداتیو است (Ogawa et al., 2000). مکانیسم فیزیولوژیک سمّیت آلومینیم به طور کامل مشخص نیست؛ با این حال، گزارش‌های زیادی نقش آن را در تولید گونه‌های فعال اکسیژن مولکولی و ایجاد تنش اکسیداتیو تأیید می‌کنند. در کشت سلولی گیاه آرابیدوپسیس و تنباکو، تیمار آلومینیم سبب افزایش بیان ژن‌های مختلف (پراکسیداز، گلوتاتیون S-ترانسفراز و سوپر اکسید دیسموتاز) شد(Richards et al., 1998; Yamamoto et al., 2002). در برخی گیاهان تجمع‌دهندة آلومینیم، نظیر چای تیمار با این یون سبب بهبود روند رشد گردید (Matsumoto et al., 1976; Konishi et al., 1985). بررسی‌های انجام شده بر روی کشت سلولی چای و نیز قلمه‌های ریشه‌دار شده این گیاه نشان داده است که عدم سمّیت آلومینیم در چای و حتی تحریک رشد آن با این یون، ممکن است به علت تأثیر مثبت آلومینیم در افزایش کارآیی سیستم ایمنی و افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان باشد .(Ghanati et al., 2005) تاکنون گزارشی از تحمل گیاه لیسیانتوس (Eustoma grandflora L.) نسبت به آلومینیم دیده نشده است، اما مطالعات انجام شده بیانگر افزایش ماندگاری گلدانی، افزایش جذب آب و وزن تر گل‌های بریده این گیاه در تیمار با سولفات آلومینیم است(Liao et al., 2001, Farrokhzad et al., 2006). این تحقیقات اثر مثبت سولفات آلومینیم بر ماندگاری گلدانی شاخه‌های گل لیسیانتوس را به تأثیر بازدارندة آلومینیم بر رشد میکروارگانیسم‌ها در طول زندگی گلدانی مربوط دانسته‌اند؛ حال آن که احتمال ایجاد تغییر در فعالیت‌های آنزیمی سیستم آنتی‌اکسیدان و ساختار غشای این گیاه در تیمار با آلومینیوم (همان‌گونه که در مورد گیاه چای مشاهده شده است) وجود دارد. لذا در تحقیق حاضر، نحوه تأثیر این یون (Al⁺³) بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در قلمه‌های ریشه‌دار شده گیاه لیسیانتوس بررسی شده است.

مواد و روش‌ها

کشت گیاه و انجام تیمار

برای انجام تحقیق، قلمه‌های ریشه‌دار شده گیاه لیسیانتوس از بازار گل و گیاه استان تهران تهیه شد. قلمه‌ها به مدت 10 روز به منظور سازگاری و خروج مواد جذبی خود در محلول غذایی تغییر یافته هوگلند (2/1) با ترکیب زیر (مقادیر بر حسب میلی‌مول) قرار گرفتند:
Ca (NO₃)₂.4H₂O, 2.5; KNO₃, 2.5; KH₂PO₄, 0.5; Fe-EDTA, 0.003; H₃BO₃, 0.0005; MgSO₄.7H₂O, 1; Mn (MnCl₂.), 0.0005; Zn (ZnCl₂), 0.00005; Cu (CuCl₂.2H₂O), 0.00002; Mo (Na₂MoO4), 0.00002 و 6pH=. محلول غذایی هر 5 روز تعویض می‌شد. پس از این مراحل تیمار آلومینیم (AlCl₃.6H₂O) در غلظت 88/0 میلی‌مولارانجام شد و نمونه‌ها (حداقل سه گیاه شاهد و سه گیاه تیمار شده) در فواصل زمانی 24 و 96 ساعت پس از تیماردهی جمع‌آوری شدند. تعیین میزان غلظت آلومینیم بر اساس نتایج تحقیقات قبلی و منابع موجود صورت گرفت Liao et al., 2001)؛ (Farrokhzad et al., 2006. پس از شستشو با آب مقطر، ریشه قلمه‌ها از محل یقه گیاه جدا گردید. نمونه‌ها با نیتروژن مایع منجمد شده و تا زمان انجام آنالیزهای بیوشیمیایی در دمای 80- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. آنالیز‌های بعدی بر روی نمونه‌های فوق در 3 تکرار مستقل صورت گرفت.

سنجش‌های بیوشیمیایی

برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز (SOD) نمونه‌های منجمد شده (200 میلی‌گرم وزن تر)، در 3 میلی‌لیتر بافر HEPES–KOH (8/7pH=) حاوی 1/0 میلی‌مول EDTA ساییده و سپس با دور g × 12000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد (تمام مراحل فوق در دمای 4 درجه سانتی‌گراد انجام شد). بخش شناور رویی حاصل برای سنجش فعالیت آنزیم با روش فتوشیمیایی (Cakmak and Horst, 1991) استفاده گردید. 3 میلی‌لیتر مخلوط واکنش حاوی: 50 میلی‌مول بافر HEPES–KOH (8/7pH=)، 1/0 میلی‌مول EDTA، 50 میلی‌مول Na₂CO₃ با (2/10pH=)، 12 میلی‌مول L- متیونین، 75 میکرو‌مول NBT (Nitro Blue Tetrazoliumchloride)، یک میکرو‌مول ریبوفلاوین (Riboflavin) و 300 میکرو لیتر عصاره آنزیمی تهیه شد. لوله‌ها به مدت 10 دقیقه در معرض نور قرار گرفتند. سپس دانسیته نوری آن توسط اسپکتروفتومتر )مدل Cintra 6،GBC، ساخت استرالیا( در560 نانومتر اندازه‌گیری شد. یک واحد فعالیت SOD بر اساس مقدارآنزیم مورد نیاز برای مهار 50 % احیا NBT محاسبه شد. به منظور اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز نمونه‌های منجمد شده (200 میلی‌گرم وزن تر)، در3 میلی‌لیتر بافر فسفات سدیم 25 میلی‌مول (8/6=pH) ساییده و با دور g × 12000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد (مراحل فوق در 4 درجه سانتی‌گراد انجام شد). از بخش شناور رویی حاصل برای سنجش فعالیت کاتالاز (CAT) استفاده شد.3 میلی‌لیتر مخلوط واکنش حاوی: بافر فسفات سدیم 25 میلی‌مول (8/6pH=)، 10 میلی‌مول H₂O₂ و عصارة آنزیم تهیه شد و سپس روند واکنش با کاهش جذب در240 نانومتر در مدت یک دقیقه دنبال شد. فعالیت آنزیم بر حسب تغییرات جذب به نسبت میلی گرم پروتئین عصاره بیان گردید (Cakmak and Horst, 1991).

برای سنجش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) 200 میلی‌گرم نمونه منجمد شده در3 میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم 50 میلی‌مول (6pH=) حاوی 1/0 میلی‌مول EDTA ساییده و سپس با دور g × 12000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد (تمام مراحل فوق در 4 درجه سانتی‌گراد انجام شد). بخش شناور رویی حاصل به منظور سنجش فعالیت APX استفاده شد. 3 میلی‌لیتر مخلوط واکنش حاوی: بافر فسفات پتاسیم 50 میلی‌مول (6pH=) حاوی 1/0 میلی‌مول EDTA، 5/0 میلی‌مول آسکوربیک اسید ، 1 میلی‌مول H₂O₂ و 200 میکرولیتر عصاره آنزیمی تهیه و اکسیداسیون آسکوربات در طول موج 290 نانومتر به مدت یک دقیقه سنجیده شد. فعالیت آنزیم بر حسب تغییرات جذب به نسبت میلی‌گرم پروتئین عصاره بیان گردید (Nakano and Asada, 1981).

سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز در سه حالت محلول، یونی وکووالانی متصل به دیواره بررسی گردید. به منظور سنجش فعالیت پراکسیداز محلول که در پاسخ‌های استرسی گیاه نقش دارد، از گایاکول (guaiacol) و در حالت یونی و کووالانی که در فرآیندهای چوبی و چوب پنبه‌ای شدن سلول‌ها دخالت دارند، از سیرینگالدازین (Syringaldazine) به عنوان الکترون‌دهنده استفاده شد. نمونه‌های منجمد شده (400 میلی‌گرم وزن تر) در 3 میلی‌لیتر بافر Tris–maleat 50 میلی‌مول (6pH=) ساییده و سپس با دور g × 12000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد (تمام مراحل فوق در 4 درجه سانتی‌گراد انجام گرفت). به دنبال مراحل استخراج، بخش شناور رویی حاصل برای سنجش پراکسیداز محلول (SPO) و رسوب آن برای سنجش پراکسیداز یونی وکووالانی استفاده شد (Ghanati et al., 2005).

به منظور سنجش فعالیت پراکسیداز محلول 3 میلی‌لیتر مخلوط واکنش شامل: بافر فسفات پتاسیم 60 میلی‌مول (1/6pH=)، 28 میلی‌مول گایاکول و 5 میلی‌مول پراکسید هیدروژن (H₂O₂) تهیه شد و سپس با افزودن عصاره آنزیمی دانسیته نوری آن در 470 نانومتر به مدت 1 دقیقه اندازه‌گیری شد. فعالیت آنزیم بر حسب تغییرات جذب به نسبت میلی‌گرم پروتئین عصاره بیان گردید (Pandolfini et al., 1992).

پراکسیداز یونی (IPO) و کووالانی(CPO): رسوب حاصل از مرحله قبل با محلول کلرید کلسیم (CaCl₂) 2/0 مولار به مدت 2 ساعت انکوبه و با دور  g× 12000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. از بخش شناور رویی برای سنجش فعالیت پراکسیداز یونی (IPO) و رسوب آن برای پراکسیداز کووالانی (CPO) استفاده شد. 3 میلی‌لیتر مخلوط واکنش حاوی: بافر سدیم فسفات 60 میلی‌مول با (6pH=)، 6/41 نانو مول سیرینگالدازین و 16 میلی‌مول پراکسید هیدروژن (H₂O₂) و عصاره آنزیمی تهیه شد و فعالیت پراکسیداز یونی بر حسب تغییرات جذب آن در530 نانومتر به مدت یک دقیقه به نسبت میلی‌گرم پروتئین عصاره و فعالیت پراکسیداز کووالانی بر حسب تغییرات جذب آن در530 نانومتر به مدت 1 دقیقه به نسبت میلی‌گرم وزن خشک دیواره بیان شد (Ghanati et al., 2005).

محتوای پروتئین‌ها با روش برادفورد (Bradford, 1976) با استفاده BSA (Bovine Serum Albumin) در غلظت‌های 50 تا 100 میکروگرم در میکرولیتر به عنوان استاندارد تعیین شد.

برای سنجش میزان پراکسیداسیون لیپید‌های غشا، غلظت مالون دی آلدهید به عنوان محصول نهایی این واکنش در نظر گرفته و  سنجیده شد. 200 میلی‌گرم از ریشه نمونه‌های گیاهی در محلول 10 درصد (حجم/ وزن) تری کلرو استیک اسیدساییده شد.پس از سانتریفیوژ کردن نمونه‌ها به یک میلی‌لیتر بخش بر رو شناور حاصل تیوباربیتوریک اسید 25/0 درصد افزوده شد و مخلوط حاصل در دمای 70 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه قرار گرفت و بلافاصله در یخ سرد شد. دانسیته نوری نمونه‌ها در طول موج 532 و 600 نانومتر تعیین شد. میزان MDA با استفاده از ضریب جذب ثابت mM^-1cm^-1 155=ε
و تفاوت جذب در دو طول موج ذکر شده محاسبه شد (Cakmak and Horst, 1991).

برای تعیین میزان لیگنین ابتدا جداسازی دیواره سلولی انجام گرفت. به این منظور، نمونه‌های منجمد شده (یک گرم) در آب مقطر، هموژن و سپس با دور 1000 در 10 دقیقه، سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل 2 بار با اتانول مطلق و هر بار به مدت 30 دقیقه شستشو داده شد و پس از هر بار شستشو با استفاده از خلأ، روی قیف بوخنر، کاغذ صافی و نایلون مِش صاف شد. رسوب حاصل یک شب در محلول 10 برابر حجم کلروفرم- متانول (2:1) قرار گرفت و پس از صاف کردن، رسوب با استون 10 برابر حجم شسته و خشک شد. ماده خشک دیواره حاصل ساییده و از الک 150 میکرونی عبور داده شد. پودر حاصل به منظور تعیین لیگنین موجود در دیواره سلولی با استفاده از روش استیل بروماید محاسبه شد. به 6 میلی‌گرم پودر ساییده شده دیواره سلولی، 5/2 میلی‌لیتر مخلوط استیل بروماید 25 درصد در استیک اسید و 1/0 میلی‌لیتر پرکلریک اسید 70 درصد افزوده شد و سپس به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 70 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت و در فواصل 10 دقیقه‌ای تکان داده شد. مخلوط لوله‌ها پس از سرد شدن در یخ به بالن ژوژه‌های 25 میلی‌لیتری حاوی 5 میلی‌لیتر هیدروکسید سدیم (NaOH) 2 نرمال و 6 میلی‌لیتر استیک اسید، اضافه و با استیک اسید به 25 میلی‌لیتر رسانده شد. محتوای لیگنین با اندازه‌گیری جذب در 280 نانومتر و با ضریب مخصوص  g^-1Lcm^-120 تعیین شد (Iiyama and Wallis, 1990).

به منظور سنجش میزان جذب آلومینیم 2/0 گرم از نمونه‌های گیاهی دردمای 350 درجه سانتی‌گراد و سپس در 550 درجه سانتی‌گراد و هر بار به مدت 2 ساعت داخل کوره قرار گرفت. پس از سرد شدن به نمونه‌ها 1 میلی‌لیتر از مخلوط آب مقطر- HCl (1: 1) اضافه شد. سپس نمونه‌ها در حمام شن در دمای 110 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت و پس از خشک شدن، 5 میلی‌لیتر HCl 1 نرمال به آنها افزوده و محلول شفاف و بی‌رنگ مشاهده شد. پس از تهیه نمونه‌های استاندارد در غلظت‌های مختلف 50 ، 100، 250 و 500 میکرو مول میزان جذب آلومینیم توسط دستگاه جذب اتمی (ICP-OES, VISTA-PRO, Varian, Australia) تعیین گردید.

به منظور سنجش میزان آسکوربات کل و دهیدروآسکوربات، نمونه‌های ریشه منجمد شده (200 میلی‌گرم وزن تر)، در 3 میلی‌لیتر سولفوسالیسیلیک اسید 5 درصد (حجم/ وزن)ساییده شد. سپس نمونه‌ها در 12000 دور به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شدند. به بخش شناور رویی حاصل 800 میکرولیتر فسفات پتاسیم 150 میلی‌مولار با 4/6=pH افزوده شد. به مخلوط فوق به ترتیب: 100 میکرولیتر آب مقطر، 200 میکرولیتر تری کلرو استیک اسید 10 درصد (حجم/ وزن)، 200 میکرولیتر اورتوفسفریک اسید 44 درصد (حجم/ حجم)، 200 میکرولیتر بی پیریدین 4 درصد (حجم/ وزن) و 100 میکرولیتر کلرید آهن 3 درصد (حجم/ وزن) افزوده و سپس به مدت 30 دقیقه در دمای 60 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. پس از گذشت این زمان، میزان دهیدروآسکوربات نمونه‌ها در دانسیته نوری 525 نانومتر تعیین شد.

به منظور اندازه‌گیری میزان آسکوربات کل، به مخلوط فوق 50 میکرولیتر دای تایاترایاتول (DTT) 10 میلی‌مولار اضافه شد و سپس به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت. پس از این مرحله 50 میکرولیتر N- اتیل مالیمید 5/0 درصد به نمونه‌ها افزوده و دانسیته نوری آنها در 525 نانومتر تعیین شد (Sreenivasulu et al., 2000).

آنالیزهای آماری

کلیة آزمایش‌ها در سه تکرار مستقل و هریک با سه نمونه انجام گرفت. از نرم‌افزار Excel برای محاسبه میانگین، انحراف معیار و رسم نمودارها استفاده شد. تحلیل داده‌ها و معنی‌دار بودن اختلاف بین آنها با آزمون t
(T-test) در سطح 0.05≥P انجام شد.

نتایج

فعالیت آنزیم‌های سیستم آنتی‌اکسیدان

فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز در تیمار آلومینیم در ریشه افزایش معنی‌دار نشان داد (شکل A‌1). در مقایسه با نمونه‌های شاهد، فعالیت آنزیم کاتالاز نیز در ریشه در تیمار با آلومینیم افزایش معنی‌دار داشت (شکل B‌1). همان‌طور که در شکل C1 مشاهده می‌شود، تیمار آلومینیم سبب افزایش معنی‌دار فعالیت آسکوربات پراکسیداز ریشه شد. افزایش فعالیت آنزیم‌های جاروب‌کنندة ترکیبات ROS سبب کاهش میزان H₂O₂ می‌شود که سوبسترای اصلی سنتز لیگنین و تولید و تجمع ترکیبات فنلی است.

شکل 1- تأثیر آلومینیم بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت در قلمه‌های ریشه‌دار شده لیسیانتوس، SOD (A)، CAT (B) و APX (C). داده‌ها میانگین سه تکرار و میله‌های عمودی نشان‌دهندة انحراف معیار است. در هر گروه حروف غیر یکسان نشان‌دهندة تفاوت معنی‌دار در سطح P≤0.05 است.

شکل 2- تأثیر آلومینیم بر فعالیت پراکسیداز در قلمه‌های ریشه‌دار شده لیسیانتوس. فعالیت آنزیم در سه بخش محلول SPO (A)، یونیIPO (B) و کووالانی CPO (C) تعیین شد. داده‌ها میانگین سه تکرار و میله‌های عمودی نشان‌دهندة انحراف معیار است. در هر گروه حروف غیر یکسان نشان‌دهندة تفاوت معنی‌دار در سطح P≤0.05 است.

شکل 3- اثر آلومینیم بر پراکسیداسیون لیپید در قلمه‌های ریشه‌دار شده لیسیانتوس. داده‌ها میانگین سه تکرار و میله‌های عمودی نشان‌دهندة انحراف معیار است. در هر گروه حروف غیر یکسان نشان‌دهندة تفاوت معنی‌دار در سطح P≤0.05 است.

پراکسیداسیون لیپید‌های غشا

میزان پراکسیداسیون لیپید‌های غشا در ریشه گیاهان تیمار شده با آلومینیم، در مقایسه با گیاهان شاهد کاهش معنی‌داری داشت (شکل 3).

میزان آسکوربات کل و دهیدروآسکوربات

همان‌طور که در شکل 4 مشاهده می‌شود، میزان آسکوربات کل و دهیدروآسکوربات در تیمار آلومینیم در ریشه پس از 24 ساعت افزایش معنی‌دار داشت، در حالی‌که در مقایسه با گیاهان شاهد، میزان این ترکیبات در تیمار 96 ساعته تفاوت معنی‌داری نداشت. 

مقادیر لیگنین و میزان جذب آلومینیم

میزان لیگنین در ریشه 24 ساعت پس از تیمار با آلومینیم نسبت به شاهد افزایش معنی‌داری داشت، حال آنکه پس از 96 ساعت به طور تقریبی نسبت به نمونه‌های شاهد، به نصف کاهش یافت. در پایان دوره تیمار (96 ساعت)، میزان جذب آلومینیم، به میزان 40 درصد افزایش نشان داد (جدول 1).

جدول 1- مقادیر آلومینیم و لیگنین در ریشه‌های لیسیانتوس پس از تیمار با آلومینیم. داده‌ها میانگین سه تکرار و علامت ستاره، نشان‌دهندة تفاوت معنی‌دار تیمار با کنترل در سطح P≤0.05 بر اساس آزمون T. Test است.

بحث

سمّیت آلومینیم یکی از مهمترین عوامل محدود کنندة رشد محصولات زراعی در خاک‌های اسیدی است. گونه‌های گیاهی متحمل آلومینیم با مکانیسم‌های متعدد با آثار سمّی آن مقابله می‌کنند. شواهد نشان می‌دهد که بسیاری از گونه‌های گیاهان دولپه و تک لپه با ترشح اسید‌های دی و تری کربوکسیلیک مانع از ورود آلومینیم به درون سلول‌های ریشه می‌شوند. بدین ترتیب، با ایجاد ترکیبات پایدار و غیر سمّی، آلومینیم در نوک ریشه تجمع می‌یابد (Kochian, 1995; Pineros et al. 2008).

گرچه در تحقیق حاضر ترشح اسید‌های آلی به منظور ممانعت از ورود آلومینیم توسط ریشة لیسیانتوس بررسی نشده است، ولی این امر با توجه به افزایش 40 درصدی جذب این عنصر پس از تیمار بعید به نظر می‌رسد. تیمار آلومینیم سبب تجمع پراکسیدهای لیپیدی در بافت‌ها می‌شود که نشان‌دهندة تنش اکسیداتیو است(Koshian 1995; Becana, 2007). علی‌رغم آنکه مطالعات متعددی در ارتباط با سمّیت آلومینیم صورت گرفته است؛ بررسی چگونگی تخریب اکسیداتیو اجزای سلولی، اثر آن بر سیستم آنتی‌اکسیدان و ایجاد ترکیبات ROS ضروری به نظر می‌رسد. گونه‌های فعال اکسیژن در فرآیندهای انتقال الکترون در کلروپلاست، میتوکندری و پراکسیزوم‌ها تشکیل می‌شوند. گیاهان در شرایط فیزیولوژیک، با فعالیت متابولیت‌ها و آنزیم‌های مختلف آنتی‌اکسیدان غلظت گونه‌های فعال اکسیژن را کنترل می‌کنند. ممانعت از ایجاد سمّیت توسط این ترکیبات با وجود نقش مؤثر آن‌ها در رشد، توسعه و سیگنالینگ گیاه حائز اهمیت است (Dat et al. 2000).

افزایش معنی‌دار فعالیت آنزیم‌های سیستم آنتی‌اکسیدان در تیمار آلومینیم در گیاه لیسیانتوس نشان می‌دهد که مکانیسم تحمل در آن مانند چای (Ghanati et al., 2005)، Andropogon virginicus L. و Miscanthus sinensis (Ezaki et al., 2008)، سرکوب تخریب اکسیداتیو با تحریک آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان نظیر سوپر اکسید دیسموتاز و کاتالاز است. دیسموتاسیون آنیون‌های سوپر اکسید توسط SOD و به دنبال آن افزایش فعالیت CAT و جاروب کردن H₂O₂ سبب تنظیم فعالیت پراکسیداز‌های مختلف سلول مانند APX می‌شود. آنزیم‌های پراکسیداز در بسیاری از فرآیند‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی نظیر کاتابولیسم اکسین، دفاع در برابر پاتوژن‌ها، اتصالات عرضی میان پروتئین‌های دیواره، برقراری پیوند میان ترکیبات دیواره سلولی، اکسیداسیون سینامیل الکل‌ها و سنتز و پلیمریزاسیون لیگنین و سوبرین نقش دارند (Law et al., 1983; Aquino-Bolaños and Mercado-Silva, 2004). در مرحله پایانی سنتز لیگنین اتصالات اکسیداتیو مونولیگنول‌ها با واکنش رادیکال‌های آزاد وابسته به H₂O₂ (به عنوان پذیرندة الکترون پراکسیداز متصل به دیواره) صورت می‌گیرد. به همین جهت، انتظار می‌رود که افزایش فعالیت کاتالاز و در نتیجه، کاهش میزان ترکیبات ROS (به طور ویژه (H₂O₂ سبب کاهش فعالیت پراکسیداز، کاهش محتوای لیگنین و کاهش میزان پراکسیداسیون لیپید شود. به این ترتیب، کاهش مقدار لیگنین در ریشه‌های لیسیانتوس پس از 96 ساعت تیمار با آلومینیم، می‌تواند در راستای افزایش چشمگیر فعالیت کاتالاز در این تیمار توجیه گردد. آسکوربات یکی از ترکیبات آنتی‌اکسیدان زیستی است که در واکنش احیای فنوکسی رادیکال‌ها به عنوان الکترون‌دهندة ثانویه نقش دارد. این ترکیب در واکنش با پراکسید هیدروژن سبب احیای رادیکال‌های فنلی می‌شود(Sanchez et al., 1997; Otter and Polle, 1994; Takahama, 1993a, b).

در تشکیل لیگنین و دی فرولات آسکوربات موجود در آپوپلاست ابتدا به دی هیدرو آسکوربات تبدیل می‌شود. فرم احیای شده آسکوربات تنها بخش اندکی از واکنش اکسیداسیون ترکیبات فنلی توسط CPO را در Kalanchoë daigremontiana ، Vigna angularis و Picea abies مهار می‌کند (Otter and Polle, 1994; Takahama, 1993a, b).

در برخی تحقیقات بر نقش پراکسیدازهای دیواره‌ای در لیگنینی شدن و همراستایی افزایش فعالیت CPO با افزایش میزان لیگنین تأکید شده است(Pandolfini et al., 1992; Wakabayashi et al., 2009). در تحقیق حاضر نیز کاهش فعالیت CPO با کاهش میزان لیگنین در تیمار 96 ساعته با آلومینیوم همراستاست، اما در تیمار 24 ساعته، علی‌رغم کاهش فعالیت CPO میزان لیگنین ریشه نسبت به شاهد افزایش یافت. ذکر این نکته نیز ضروری است که به غیر از پراکسیدازها، آنزیم‌های دیگری نظیر لاکازها نیز می‌توانند واکنش رادیکالی شدن فنلها و اتصال پراکسیدی آنها به یکدیگر را پیش ببرند .(Haroldsen et al., 2006)

بررسی فعالیت آنزیم لاکاز در بازه‌های زمانی مختلف تیمار لیسیانتوس با آلومینیم درتحقیقات آینده ممکن است بتواند توجیه مناسب‌تری برای این امر ارایه کند.