نویسندگان
گروه زیستشناسی و مرکز تحقیقات گیاهان دارویی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه شاهد، تهران
چکیده
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Solanaceous plant, Datura innoxia, has valuable tropane alkaloids pharmaceutical effects. In this study, seed zygotic embryos were cultured in vitro and plantlets were produced and explants with single internodes and two auxiliary buds from the produced plantlets were cultured in B5 medium with different concentrations of IAA (0.5, 1, 1.5, 2 mg/L), NAA (0.5, 1, 1.5, 2 mg/L) and BA (0.5, 1, 1.5 mg/L) to investigate the effects of the growth regulators on callus production, organogenesis and total alkaloid contents. Concentrations of the last two hormones were used reciprocally. Total alkaloid concentrations of calli were identified by UV spectrophotometer at 258 nm and callus total alkaloid contents and were compared with the content of plantlets. Results showed that, in the presence of both NAA and BA, explants formed callus and increase of NAA concentrations, in turn, increased callus weights and total alkaloid contents as well. IAA had no significant effect on callus and organ induction. Comparison of total alkaloid contents of calli with shoots and roots of Datura innoxia plantlets in hormone free B5 medium, showed that the alkaloid contents of calli were lower than differentiated tissues in hormone free B5 medium, but the use of NAA and BA hormones caused an increase in alkaloid contents of calli as compared with in vitro cultured organs.
کلیدواژهها [English]
تیرة سیبزمینی (Solanaceae) دارای جنسهای متعددی، نظیر: Atropa، Hyoscyamus، Duboisia،ScopoliaوDatura است (Boitel-Conti et al 2000; Zhang et al., 2004). ترکیبات فعال بیولوژیک که در همة این گیاهان تولید میشود، از نوع تروپان آلکالوئیدها هستند که وجود آنها در ردهبندی شیمیایی (کموتاکسونومی) تیرة سیبزمینی نیز استفاده میشود ((Berkov and Zayed, 2004. تاتوره تماشایی(Datura innoxia) گیاهیعلفی، ایستاده، به بلندی یک متر و بعضاً بیشتر، یکساله و یا به صورت درختچههایی چند ساله با ساقه بسیار منشعب است. دارای کپسولهای تخم مرغی شکل که حدود 3 سانتیمتر قطر دارند و با خارهای نازک و محکمی به طول 2- 4 میلیمتر پوشیده شدهاند (شایا، 1369). برگها متناوب، بیضی شکل، دندانهدار و بدبو هستند. از بغل شاخهها یا در قسمتهای انتهای شاخه، گلهای بزرگ قیفی شکل به رنگ سفید یا بنفش میروید. میوه آن به صورت کپسولی است که محتوی دانههای قهوهای رنگی است )زمان، 1370). این گونه مثل سایر گونههای جنس تاتوره بیش از 50 نوعتروپان آلکالوئید سنتز میکند و به همین دلیل، یکی از گیاهان دارویی ارزشمند با استفادههای متعدد در طب سنتی به شمار میرود. (Berkov and Zayed, 2004). هیوسیامین یکی از تروپان آلکالوئیدهای اصلی تیرة سیبزمینی است که دارای آثار ضد کولینرژیک، ضد اسپاسم و اثر بر اعصاب پاراسمپاتیک است. اسکوپولامین نیز به علت فعالیت زیستی مشابه و بالایی که دارد، با ارزش است و البته آثار جانبی کمتری بر سیستم اعصاب مرکزی دارد و این امر بر ارزش آن میافزاید (Verpoorte et al., 2007). تروپان آلکالوئیدهایی نظیر هیوسیامین و اسکوپولامین، از نظر ساختمانی به یکدیگر شباهت دارند و از حدواسطی مشترک که کاتیونی از N- متیل پیرولینیوم
(N-methylpyrrolinium) است، مشتق میشوند (Berkov and Zayed, 2004). این دو آلکالوئید عمدتاً در سلولهای جوان ریشه سنتز شده، به بخشهای هوایی گیاه انتقال مییابند. در بیشتر گیاهان تیرة سیبزمینی معمولاً هیوسیامین آلکالوئید عمده است، در حالیکه اسکوپولامین فقط به مقدار کمی تولید میشود. در گیاه تاتوره تماشایی تجمع تروپان آلکالوئیدها در ریشهها، برگها، ساقهها، گلها و دانهها دیده میشود (Zayed et al., 2006). بیشترین قسمت مورد استفاده این گیاه در طب سنتی، برگها و دانهها هستند )صمصام شریعت، 1383(. دو تروپان آلکالوئید اصلی ذکر شده در این گیاهتوزیع مشابهی در اندامها ندارند؛ به طوری که در ساقه بیشتر اسکوپولامین و در ریشه بیشتر هیوسیامین یافت میشود (Zayed et al., 2006.
ترکیبات مؤثره این گیاه دارای آثار پاراسمپاتیک (مشابه دستگاه عصبی) و بیهوشکنندگی هستند و بنابراین، از برخی از آنها مانند آتروپین در ایست قلبی و کند کاری سینوسهای قلب و قبل از بیهوشی برای کاهش ترشحات مجاری تنفسی و غدد استفاده میشود. از هیوسین برای تخفیف اسپاسمهای عضلات صاف، مانند عضلات صاف دستگاه گوارش استفاده میشود (شهراز و غازیانی، 1381). این گیاه برای درمان لاغری، تنگی نفس و اسهال بهکار میرود و همچنین مسکن، کنترلکنندة تب و ضد انگل نیز هست. تحقیق برای افزایش بازده تولید آلکالوئیدهای تروپانی در سیستم کشت در شیشه به تجربه متغیرهای بسیاری، نظیر: تأثیر هورمونهای گیاهی، عناصر پرمصرف و کم مصرف، قندها و سایر عوامل فیزیکی منجر شده است. اکسینها گروهی از هورمونهای گیاهی هستند که در غلظتهای مختلف باعث طویل شدن ساقه و میان گره، فعال سازی تقسیم سلولی، طویل شدن سلولها، تروپیسم، چیرگی رأسی و ریشهزایی میشوند (لاهوتی، 1376). سیتوکینینها نیز گروهی دیگر از هورمونها با اثر محرک رشد به شمار میروند و به ویژه فرآیند تقسیم را در سلولها تحریک میکنند. این هورمونها فعالیتهای زیادی را در ریختزایی گیاه تنظیم مینمایند و معمولاً باعث تقسیم سلولی، حذف چیرگی رأسی، تمایز ساقه و به تأخیر انداختن پیری میشوند (Arteca, 1996). مطالعه آثار هورمونهای رشد و ترکیبات مختلف دیگر بر تولید اندام و کالوس گیاه تاتوره در گذشته نیز صورت گرفته است (Ajungla et al., 2009; Iranbakhsh et al., 2007; Zayed et al., 2007).
یکی از زمینههای پژوهشی مورد توجه در ارتباط با گیاهان دارویی، اعمال تیمارهایی برای افزایش ترکیبات مؤثره آنها در شرایط درون شیشهای است. در این پژوهش نیز با توجه به اهمیت دارویی گیاه تاتوره تماشایی، ابتدا به بررسی شرایط تشکیل اندام و کالوس از قطعات جداکشت حاصل از رشد رویان آن در شیشه با استفاده از محیطکشت B5 پرداخته شد. به این منظور، اثر غلظتهای مختلفی از هورمونهای بنزیل آدنین (BA)، نفتالن استیک اسید (NAA) و ایندول استیک اسید (IAA) بر قطعات جداکشت حاصل از گیاهچههای بهدست آمده از رویان بررسی گردید. به منظور بررسی اثر این هورمونها بر محتوای آلکالوئید تام کالوس، استخراج آلکالوئید صورت گرفت و بهترین مکمل هورمونی (با استفاده از این سه هورمون) در شرایط درونشیشهای برای تولید کالوسهایی با محتوای آلکالوئیدی بالاتر مشخص شد.
مواد و روشها
کشت رویان و قطعات جداکشت حاصل از آن
بذر گیاهتاتوره تماشایی از پایههای خودروی این گیاه در شمال غربی تهران (طول"52 ´22 °51 شرقی و عرض"21 ´46 °35 شمالی) جمعآوری شد. بذرها پس از جمعآوری در سایه و دمای اتاق خشک شدند و سپس توسط الکل 70 % به مدت 1 دقیقه و آب ژاول 20% به مدت 20 دقیقه سترون شدند. رویانها از بذرهای سترون جدا و برای رشد در محیطکشت B5 حاوی 30% سوکروز و یک میلیگرم در لیتر GA3 کشت داده شدند (Gamborg et al., 1968). شایان ذکر است که کشت بذر در همین محیط، به دلیل سختی پوسته آن موفقیتآمیز نبود و به همین دلیل به کشت رویان مبادرت گردید. پس از گذشت 4 هفته از رشد، قطعات جدا کشت شامل یک میان گره، به همراه دو جوانه جانبی از گیاهچههای حاصل به محیطهای کشت B5 حاوی غلظتهای 0، 5/0، 1، 5/1 و 2 میلیگرم در لیتر نفتالن استیک اسید (NAA)، غلظتهای 0، 5/0، 1 و 5/1 میلیگرم در لیتر و بنزیل آدنین (BA) غلظتهای 0، 5/0، 1، 5/1 و 2 میلیگرم ایندول استیک اسید (IAA) انتقال یافتند. اثر غلظتهای دو هورمون NAA و BA به صورت متقابل نیز بررسی شد. کشت در همه تیمارهای هورمونی با سه تکرار انجام شد و پس از گذشت 4 هفته تمامی نتایج حاصل از کشت قطعات جداکشت رشد کرده در محیطهای مذکور از نظر وزن کالوس، وزن اندام هوایی و وزن ریشه بررسی شد. محتوای آلکالوئید تام در کالوسهای حاصل از کاربرد همزمان دو هورمون NAA و BA سنجیده شد. دادههای حاصل توسط نرمافزار MSTAT-C مورد تجزیه واریانس قرار گرفت و مقایسه میانگینها توسط آزمون LSD انجام شد.
استخراج و سنجش آلکالوئید تام
آلکالوئید تام از یک گرم از بافت تر مورد بررسی پس از ساییده شدن در 50 میلی لیتر اتانل به مدت 20 ساعت در دمای اتاق روی شیکر استخراج شد. تفاله بافت توسط کاغذ صافی از عصاره جدا شد و تبخیر اتانول به وسیلة دستگاه تبخیر در خلأ (Rotary Evaporator) صورت گرفت. با افزودن سولفوریک اسید v/v 5% و دی اتیل اتر به تهماندة عصاره با نسبت مساوی، فاز آبی حاوی آلکالوئید جدا شد و شست و شو با دی اتیل اتر به منظور رنگبری عصاره انجام گرفت. سایر مراحل با افزایش pH تا 10 توسط هیدروکسید سدیم N10، انتقال به قیف جداکننده (decanter) و افزودن 110 میلیلیتر کلروفرم در سه مرحله (30+40+40) و هر بار جمع کردن فاز کلروفرمی حاوی آلکالوئید، تبخیر کلروفرم توسط دستگاه تبخیر در خلأ تا خشک شدن کامل ادامه یافت (Dashek, 1997). در نهایت، آلکالوئیدهای موجود در ته مانده توسط متانول حل شد. عصارة حاصل توسط اسپکتروفتومتر بررسی گردید. به این منظور، منحنی استاندارد توسط ماده استاندارد آتروپین سولفات در طول موج 258 نانومتر رسم گردید و چگالی نوری (OD) هر یک از نمونهها در همین طول موج خوانده شد. سپس با استفاده از فرمول خط منحنی استاندارد، مقدار آلکالوئید تام در هر نمونه بر حسب میلی گرم بر گرم وزنتر بافت محاسبه شد. شایان ذکر است که به منظور قابلیت انجام بررسی آماری، استخراج آلکالوئید از سه تکرار از هر نمونه به طور مجزا انجام شد.
نتایج
پس از گذشت چهار هفته در تمامی کشتهای حاوی غلظتهای بهکار رفته از NAA بدون حضور BA و همچنین در کشتهای حاوی غلظتهای بهکار رفته از BA بدون حضور NAA، کالوس تشکیل شد، ولی تغییر غلظت این دو هورمون تأثیر معنیداری بر وزن تر کالوس نداشت. به کارگیری همزمان این دو هورمون نیز موجب تشکیل کالوس گردید و تغییرات غلظت آنها آثار معنیداری بر وزن تر کالوس گذاشت؛ به طوری که در حضور 5/0 میلیگرم در لیتر از BA، افزایش غلظت NAA تا 1 میلیگرم در لیتر موجب افزایش معنیدار وزن تر کالوس و بیش از آن موجب کاهش معنیدار آن شد، ولی در تمام غلظتها، NAA در حضور 5/0 میلیگرم در لیتر از BA موجب افزایش معنیدار وزن تر کالوس نسبت به شاهد شد. در غلظت 1 میلیگرم در لیتر BA افزودن 5/0 میلیگرم در لیتر NAA موجب افزایش وزن و غلظتهای بیش از آن موجب کاهش وزن تر کالوس شد. در غلظت 5/1 میلیگرم در لیتر BA افزودن 5/0 میلیگرم در لیتر NAA تغییر معنیداری در وزن تر کالوس نسبت به شاهد ایجاد نکرد، ولی غلظتهای بیش از آن موجب افزایش معنیدار وزن تر کالوس گردید. شایان ذکر است حتی در مواردی که NAA اثر کاهشی بر وزن کالوس داشت، باز هم وزن آن نسبت به شاهد به طور معنیداری بیشتر بود. به عبارت دیگر، اثر افزایشی بر تولید کالوس با استفاده از هورمون NAA در حضور BA بر قطعات جداکشت میانگره تاتوره تماشایی کاملاً مشهود است (جدول 1).
تشکیل ریشه فقط در محیط فاقد هورمون و در حضور هورمون NAA به تنهایی مشاهده شد. هورمون BA به تنهایی ریشهزایی بسیار اندکی را نشان داد و کاربرد همزمان این دو هورمون مانع از تشکیل ریشه گردید. به کار بردن هورمون NAA و BA اختلاف معنیداری در وزن ریشه نسبت به شاهد ایجاد نکرد (جدول 1).
افزایش غلظت هورمونهای BA و NAA هر یک به تنهایی به طور معنیداری باعث کاهش وزن تر اندام هوایی شد. در غلظتهای متقابل، در بیشتر موارد اندام هوایی تشکیل نشد و فقط تشکیل کالوس مشاهده گردید، فقط در غلظتهای 5/1 میلیگرم در لیتر BA که در مقابل غلظتهای مختلف NAA به کار رفت، تشکیل برگهای کوچک روی کالوس مشاهده شد که وزن آنها نسبت به شاهد به طور معنیداری کمتر بود (جدول 1).
کاربرد غلظتهای مختلف هورمون IAA اثر معنیداری بر وزن تر کالوس، وزن تر اندام هوایی و وزن ریشه نشان نداد (جدول2).
محتوای آلکالوئید تام در کالوسهای تشکیل شده در حضور غلظتهای مختلف هورمون NAA نسبت به شاهد تفاوت معنیداری نداشت. در حضور غلظتهای 5/0 و 1 میلیگرم در لیتر BA که به صورت همزمان با غلظتهای مختلف NAA به کار رفت، در همه موارد تفاوت معنیداری در محتوای آلکالوئید تام کالوس نسبت به شاهد مشاهده شد. در غلظت 5/0 میلیگرم در لیتر BA افزایش غلظت NAA باعث ابتدا افزایش و سپس کاهش آلکالوئید تام شد، در حضور 1 میلیگرم در لیتر BA، افزایش غلظت NAA باعث کاهش محتوای آلکالوئید تام شد ولی در تمام موارد محتوای آلکالوئید نسبت به شاهد بیشتر بود (جدول 3).
میانگین محتوای آلکالوئید تام اندام هوایی و ریشه گیاهچههای حاصل از کشت رویان تاتوره تماشایی در محیطکشت B5 فاقد هورمون به ترتیب 045/0 و 051/0 میلیگرم بر گرم وزن تر بهدست آمد (جدول 4). از مقایسه این مقادیر با محتوای آلکالوئید تام کالوس در محیط کشت فاقد هورمون مشخص میشود که کالوسها نسبت به بافتهای تمایز یافته حاوی آلکالوئید کمتری بودند، ولی استفاده از هورمونهای NAA و BA موجب افزایش آلکالوئید کالوس نسبت به اندام هوایی و ریشه گیاهچههای رشد یافته در شیشه شد.
آنالیز واریانس دادهها بیانگر اثر معنیدار حضور هورمونهای IAA و BA بر وزن تر کالوس، وزن تر ریشه، طول ریشه، وزن تر اندام هوایی، طول اندام هوایی و مقادیر آلکالوئید تام کالوس زیر سطح احتمال 01/0 بود.
جدول 1- اثر هورمونهای NAA و BA بر تولید کالوس و اندامزایی قطعات جداکشت. حروف نامشابه علامت وجود تفاوت معنیدار هستند.
(آزمون LSD با (P≤0.05.
|
BA (mg/L) |
NAA (mg/L) |
وزن تر کالوس (g) |
وزن تر ریشه (g) |
طول ریشه (mm) |
وزن تر اندام هوایی (g) |
طول اندام هوایی (mm) |
|
0 |
0 |
034/0 ±3/1hi |
223/0±24/0b |
39/82 ±01/27a |
665/0 ±24/0a |
7/13±24/0d |
|
5/0 |
258/0 ±3/1ghi |
130/0±24/0b |
9 ±01/27e |
061/0±24/0 cde |
1±24/0e |
|
|
1 |
269/0 ±3/1ghi |
223/0±24/0b |
55/30 ±01/27c |
307/0 ±24/0bcd |
7/27±24/0b |
|
|
5/1 |
282/0 ±3/1ghi |
250/0±24/0b |
42 ±01/27b |
322/0 ±24/0bc |
7/13±24/0d |
|
|
2 |
702/0 ±3/1gh |
097/0±24/0b |
14 ±01/27d |
036/0 ±24/0de |
5/0±24/0e |
|
|
5/0 |
0 |
008/0±3/1 i |
017/0±24/0b |
77/31±01/27c |
243/0±24/0bcde |
33/14±24/0d |
|
5/0 |
553/1 ±3/1ef |
0 ±24/0b |
0 ±01/27f |
0 ±24/0e |
0±24/0e |
|
|
1 |
426/2 ±3/1bcd |
0 ±24/0b |
0±01/27 f |
0 ±24/0e |
0±24/0e |
|
|
5/1 |
913/1 ±3/1de |
0 ±24/0b |
0±01/27 f |
0 ±24/0e |
0±24/0e |
|
|
2 |
942/0 ±3/1fg |
0 ±24/0b |
0 ±01/27f |
0±24/0 e |
0±24/0e |
|
|
1 |
0 |
115/0 ±3/1hi |
001/0±24/0b |
8 ±01/27e |
435/0 ±24/0ab |
66/17 ±24/0c |
|
5/0 |
144/3±3/1 a |
0 ±24/0b |
0 ±01/27f |
0 ±24/0e |
0±24/0e |
|
|
1 |
199/2 ±3/1cde |
0 ±24/0b |
0 ±01/27f |
0 ±24/0e |
0±24/0e |
|
|
5/1 |
357/2 ±3/1cd |
0 ±24/0b |
0 ±01/27f |
0±24/0 e |
0±24/0e |
|
|
2 |
833/2 ±3/1abc |
0 ±24/0b |
0 ±01/27f |
0 e |
0±24/0e |
|
|
5/1 |
0 |
1/0±3/1 hi |
0 ±24/0b |
33/0 ±01/27f |
269/0±24/0bcde |
5/34±24/0a |
|
5/0 |
667/0±3/1 ghi |
0 ±24/0b |
0 ±01/27f |
177/0±24/0bcde |
0±24/0e |
|
|
1 |
806/2 ±3/1abc |
0 ±24/0b |
0 ±01/27f |
0 ±24/0e |
0±24/0e |
|
|
5/1 |
09/3 ±3/1ab |
0 ±24/0b |
0±01/27 f |
139/0 ±24/0cde |
0±24/0e |
|
|
2 |
469/2±3/1abcd |
0 ±24/0b |
0 ±01/27f |
072/0 ±24/0cde |
0±24/0e |
جدول 2- اثر هورمون IAA بر تولید کالوس، ریشهزایی و اندام زایی قطعات جداکشت. حروف مشترک عدم تفاوت معنیدار را نشان میدهند
(آزمون LSD با (P≤0.05.
|
IAA (mg/L) |
وزن تر کالوس (g) |
وزن تر اندام هوایی (g) |
وزن تر ریشه (g) |
|
0 |
a2/0±034/0 |
a58/0±666/0 |
a58/0±223/0 |
|
5/0 |
a2/0±095/0 |
a58/0±8/0 |
a58/0±620/0 |
|
1 |
a2/0±076/0 |
a58/0±495/0 |
a58/0±607/0 |
|
5/1 |
a2/0±148/0 |
a58/0±429/0 |
a58/0±145/0 |
|
2 |
a2/0±379/0 |
a58/0±509/0 |
a58/0±183/0 |
جدول 3- محتوای آلکالوئید تام در کالوسهای تشکیل شده در محیط کشتهای حاوی BA و NAA. حروف نامشابه علامت وجود تفاوت معنیدار هستند (آزمون LSD با (P≤0.05.
|
BA (mg/L) |
NAA (mg/L) |
محتوای آلکالوئید تام |
|
|
0 |
d33/1± 034/0 |
|
0 |
5/0 |
257/0 33/1±d |
|
|
1 |
d33/1±269/0 |
|
|
5/1 |
d33/1±282/0 |
|
|
5/0 |
C33/1±552/1 |
|
5/0 |
1 |
a33/1±873/2 |
|
|
5/1 |
d33/1±633/0 |
|
|
5/0 |
a33/1±144/3 |
|
1 |
1 |
bc33/1±199/2 |
|
|
5/1 |
abc33/1±357/2 |
جدول 4- محتوای آلکالوئید تام در اندامهای هوایی و ریشه تشکیل شده در محیطکشتهای فاقد BA و NAA.
|
اندام مورد بررسی |
|
محتوای آلکالوئید تام |
|
اندام هوایی |
|
01/0± 045/0 |
|
ریشه |
|
01/0± 051/0 |
بحث
در مطالعه انجام شده توسط Dessouky و همکاران (2001) اثر غلظتهای مختلف 2 و 4- دی کلرو بنزن، کاینتین، نفتالن استیک اسید و بنزیل آدنین در کشت تعلیقی Datura stramonium و D. metel بررسی و بهترین ترکیب هورمونی برای تولید کالوس در محیطکشت مایع MS غلظت 1 میلیگرم در لیتر از هورمونهای BA و NAA پیشنهاد شده است. در پژوهش حاضر نیز بیشترین وزن تر کالوس در حضور 5/1 میلیگرم در لیتر از هورمونهای BA وNAA به دست آمد که از نظر نوع هورمونهای به کار رفته و نسبت آنها با نتایج فوق مطابقت دارد. البته، در این پژوهش، گونة مورد بررسی و محیطکشت به کار رفته متفاوت است که میتواند دلیل تفاوت غلظت هورمونها در دو بررسی باشد. در مطالعهای دیگر Ajungla و همکاران (2009) با کشت ریشة
D. metel دریافتند که غلظتهای مختلف IAA برای ریشهزایی این گیاه مناسب است، در حالی که در این مطالعه IAA اثر معنیداری بر ریشهزایی در بن اندامهای هوایی تاتوره تماشایی نداشت. در عوض، محیط B5 فاقد هورمون، ریشهزایی را تحریک نمود و حضور NAA به تنهایی نیز موجب ریشهزایی شد. به نظر میرسد عدم تطابق این نتایج ناشی از تفاوت ژنوتیپ دو گونه تاتوره باشد. تشکیل کالوسهای نیمه شفاف گیاه D. stramonium در محیطکشت MS حاوی هورمونهای NAA و کاینتین (Kin) توسط Iranbakhsh و همکاران (2007) گزارش شد. این امر به همراه نتایج حاصل از مطالعه Dessouky و همکاران (2001) و نیز پژوهش حاضر پیشنهاد میکند که جنس تاتوره برای تولید کالوس به حضور همزمان اکسین و سایتوکینین نیاز دارد. Shirin و همکاران (2007) نیز محیطکشت حاوی 1 میلیگرم در لیتر NAA و 3 میلیگرم در لیترBA را به عنوان بهترین محیط برای ایجاد کالوس از قطعات جداکشت برگ سیبزمینی معرفی نمودند. این نتیجه احتمال تعمیم پیشنهاد فوق را به تیره سیبزمینی تقویت میکند، اما Zayed و همکاران (2006) در تحقیقی بر روی اندامزایی و تولید آلکالوئیدها در تاتوره تماشایی از قطعات جداکشت ساقه در محیط کشتMS با 1 میلیگرم در لیتر BA و 5/0 میلیگرم در لیتر IAA کالوس بهدست آوردند. در پژوهش حاضر، اثر متقابل غلظتهای مختلف BA و IAA بررسی نشده است، ولی این نتایج نیز از نظر لزوم کاربرد همزمان اکسین و سایتوکینین برای تولید کالوس با نتایج این مطالعه همخوانی دارد.
تولید تروپان آلکالوئیدها در کشت بافت بستگی زیادی به ترکیب محیطکشت دارد. اثر فاکتورهای مختلف مثل منابع تغذیهای، هورمونهای رشد و شرایط رشدی مختلف بر تولید تروپان آلکالوئیدها در کشت بافت مطالعه شده است (Iranbakhsh et al., 2007). مشخص شده است که انواع و غلظتهای مختلف هورمونهای رشد مثل اکسینها و سایتوکینینها آثار مختلفی بر رشد گیاه و تولید متابولیتهای ثانویه دارند. کشت کالوسهای برگی گیاه D. stramonium توسط EL-Bahr و همکاران (1989)، افزایش رشد و محتوای آلکالوئیدی را در در حضور غلظت 1 میلیگرم در لیتر 2,4-D، NAA، Kin و BA به تنهایی یا به صورت متقابل نشان داد. نقش مستقیمی برای اکسینها و سایتوکینینها در مسیر متابولیسمی تروپان آلکالوئیدها گزارش نشده است، ولی نتایج مطالعات، وجود نقشی غیرمستقیم را برای این هورمونها تأیید میکند. در این پژوهش نیز در حضور BA با افزایش غلظت هورمون NAA افزایش محتوای آلکالوئید تام نسبت به شاهد مشاهده شد.
بررسی اندامزایی گیاه D. stramonium و تولید آلکالوئیدها توسط Zayed و همکاران (2006) در شیشه انجام شد و اعلام گردید که محتوای آلکالوئیدی در اندامهای باززایی شده بیشتر از کالوسهای سازمان نیافته است. به عبارت دیگر، تمایز بافتها موجب افزایش میزان تولید تروپان آلکالوئیدها میگردد. این نتایج با نتایج حاصل از پژوهش حاضر که نشان دهنده بیوسنتز مقادیر کمتر آلکالوئید در کالوسها نسبت به اندام هوایی و ریشه در محیط فاقد هورمون است، مطابقت دارد.
)
