نویسندگان
1 بخش بیوشیمی، دانشکده علوم، دانشگاه گیلان، رشت، ایران
2 بخش باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Quality wise, most citrus species from North of Iran are appreciated by the Iranian peaple. They, therefore, deserve commercial and research value. To protect their cells and tissues from oxidative damage, most plants produce metabolites such as carbohydrates, amino acids, anti-freeze protein and antioxidants. Determination of lipid peroxidation, and detection of anti-freeze protein were used to explore the mechanism by which a plant could resist to cold stress. In this research, two species of citrus family, citrange (Citrus sinensis) and bitter orange (Citrus sinensis x Poncirus trifoliata) were subjected to a range of temperature. Results showed that a protein with molecular weight of 23 KD was produced in both citrus species at temperature below zero degree. On the other hand, lipid peroxidation in both species increased only slightly in response to cold stresses below 0°C.
کلیدواژه‌ها [English]
گیاهان برای تحمل تنش‌های سرمایی به یک دوره سازگاری به سرما نیاز دارند. در نتیجه فرآیند سازگاری با دمای پایین، پروتیئن‌های خاصی در گیاه تولید می‌شود یا میزان آنها افزایش می‌یابد. نقش پروتئین‌های محافظت‌کننده در برابر سرما، حفاظت از پروتئین‌های درون سلولی و غشا در طی فرآیند انجماد- ذوب است
(Zhang et at., 2006). به علاوه، برخی انواع پروتئین خارج سلولی نیز در طی سازگاری سرمایی در گیاه ایجاد شده، تجمع می‌یابند (Antikainen and Griffith, 1996). پروتئین‌های تغییر دهنده دیواره سلولی، پروتئین‌های مربوط به بیماری‌زایی که گیاهان را در مقابل عوامل بیماری‌زا محافظت می‌کند و پروتئین‌های ضد انجماد یا ضد یخ (Antifreeze proteins, AFPs) توسط موجوداتی که در آب و هوای سرد زندگی می‌کنند، برای تحمل سرما و اجتناب از انجماد تولید می‌شوند. پروتئین‌های اخیر با اتصال به بلور یخ از تشکیل آن ممانعت می‌کنند. این پروتئین‌ها درگستره وسیعی از گونه‌های مناطق سرد مانند موش صحرایی (Włostowski et al., 2008) و گیاهان (Zykova et al., 2000) یافت شده‌اند. تنوع گونه‌هایی که این پروتئین‌ها را تولید می‌کنند، به همراه گوناگونی موجود که در خود این پروتئین‌ها، باعث پدیدآمدن طیف وسیعی از پروتئین‌های ضد یخ در اندازه‌ها و عملکردهای مختلف شده است (DeVries, 1986). پروتئین‌های ضد یخ از مسیرهای گوناگون مانند کاهش دمای انجماد، تعدیل یا ممانعت از رشد بلورهای یخ، جلوگیری از تبلور مجدد و محافظت غشایی سلول در برابر آسیب ناشی از سرما، موجودات زنده را در مقابل سرما محافظت می‌نمایند. مکانیسم عمل این پروتئین‌ها از طریق اثر بر رشد کریستال یخ در حال حاضر نیز مورد مطالعه است
(Griffith and Antikainen, 1996). یکی از مهمترین آثار و آسیب‌های تنش‌های سرمایی، وقوع عمل پراکسیداسیون در چربی‌های غشایی است (Bahar et al., 2005). پراکسیداسیون چربی‌ها فرآیندی است که در آن رادیکال‌های آزاد، الکترون را از لیپیدهای غشایی پلاسمایی دریافت کرده، از این طریق به سلول آسیب می‌رسانند. به دلیل اهمیت و فراوانی گونه‌های مختلف مرکبات در شمال ایران و ارتباط پروتئین ضد یخ با مقاومت به سرما و لزوم یافتن مسیری جدید برای بهبود و افزایش بهره‌وری، این تحقیق با هدف بررسی وجود AFPs و پراکسیداسیون چربی‌های غشایی در برگ انواع مرکبات انجام گرفت.
به همین جهت، برای اعمال تنش سرما، گیاهچه‌های 10-20 سانتی‌متری دو گونه از مرکبات، نارنج
(Citrus aurantium) و سیترنج (Citrus sinensis x Poncirus trifoliata)از مؤسسه تحقیقات مرکبات در رامسر تهیه و پس از انتقال به آزمایشگاه در مخلوط ماسه و پرلیت به نسبت 4:1 کشت گردیدند. سپس گیاهان به دستگاه ژرمیناتور با دمای 20 درجه سانتیگراد، رطوبت 75% و طول روز 16 ساعت منتقل شدند. دما طی دوره‌های 2 ساعتی از 20 درجه سانتیگراد به ترتیب به 15، 10، 5 و 3 درجه سانتیگراد کاهش یافته، در هر یک از این دماها به مدت 24 ساعت ثابت ماند تا گیاهچه‌ها برای اعمال دماهای زیر صفر به تدریج سازگار شوند. سپس دماهای صفر، 3- ، 6- و 9- روی گیاهچه‌ها اعمال شد. برگ هر دو گونه در هاون با نیتروژن مایع ساییده شد تا کاملاً هموژنیزه شود. برگ‌های هموژنیژه بلافاصله توزین و به میکروتیوب منتقل گردیدند. سپس بافر فسفات و بتا مرکاپتو اتانول به میکروتیوب اضافه و در سانتریفوژ یخچال‌دار در صفر درجه سانتیگراد با rpm 14000 برای 15 دقیقه سانتریفوژ شدند. محلول رویی به میکروتیوب جدید منتقل و مجدداً سانتریفیوژ و محلول رویی برداشته شد (Rehman, 2009). کروماتوگرافی مایع پروتئین با سرعت بالا
(Fast protein liquid chromatography, FPLC) و سپس پلی آکریل آمید ژل الکتروفورز (SDS-PAGE) ناپیوسته برای تخلیص استفاده شد. پس از تزریق عصاره سلولی برگ مرکبات به دستگاه FPLC قسمت‌های جدا شده توسط کروماتوگرافی در میکروتیوب جمع شده، با توجه به پیک‌های کروماتوگرام، برای تأیید خلوص الکتروفورز انجام گرفت (DeVries, 1986). سنجش پراکسیداسیون چربی‌ها بر اساس واکنش مالون دی آلدئید (MDA)، به عنوان محصول دوم پراکسیداسیون لیپیدها، با تیوباربیتوریک اسید (TBA) در حضور تری کلرو استیک اسید (TCA) انجام شد. روش Liu برای پراکسیداسیون لیپیدی انجام و از طریق فرمول (1) مقدار پراکسیداسیون محاسبه گردید (Liu et al., 1997).
فرمول (1)
A532 و A600 جذب نمونه در 532 و 600 نانومتر و عدد 155 ضریب جذب مولی MDA بر حسب mM-1cm-1 (Heath and Packer, 1968) هستند. نتیجه به صورت μmol g-1FW نشان داده شده است. بررسی‌های انجام گرفته در این تحقیق بر روی دو گونه نارنج و سیترنج نشان دادند که AFPs بر اثر قرار گرفتن در دماهای زیر صفر در این دو گونه از مرکبات تولید می‌شوند. پس از چندین بار تخلیص AFP با استفاده از کروماتوگرافی FPLC مشخص شد که بعضی از نمونه‌های جمعآوری شده از FPLC بر خلاف بقیه با قرار گرفتن در فریزر به مدت چندین ساعت دچار انجماد نمی‌شوند. برای اطمینان، تعدادی از نمونه‌های یخ زده و نزده را روی ژل الکتروفورز برده، مشخص شد که نمونه‌های یخ نزده در ناحیه تقریباً 23 کیلو دالتون باندی را تشکیل می‌دهند که این باند در نمونه‌های یخ زده مشاهده نمی‌شود (شکل 1).
شکل 1 - ژل اکریل آمید سیترنج Citrus sinensis x Poncirus trifoliata. از چپ به راست ستون اول: (M مارکر وزن مولکولی پروتئین؛
ستون دوم: (P.C عصاره سیترنج قبل از FPLC و ستون‌های بعد فراکشن‌های جمعآوری شده F= frozen) و(UF= unfrozen پس از FPLC با استفاده از ستون دی اتیل آمینو اتیل. ستون‌های مربوط به نمونه‌های یخ زده و نزده حاصل از آزمایش‌های تکراری برای تأیید هستند.
به طوری که در این شکل ملاحظه می‌شود، در همه نمونه‌های مقاوم به یخ‌زدگی (Unfrozen, UF) پروتئینی با وزن مولکولی 22-24 کیلو دالتون ظاهر شده که در نمونه سالم وجود ندارد. این پروتئین می‌تواند نوعی خاص از پروتئین‌های ضد یخ باشد که بر اثر تنش سرمایی در گیاه ایجاد شده است. احتمال داده می‌شود که این باند مربوط به حضور پروتئین ضد یخ در نمونه باشد. شایان ذکر است که نمونه نارنج (Citrus aurantium) ژل اکریل آمید مشابهی داشت (نشان داده نشده است)، همچنین مشخص شد که با اعمال دماهای زیر صفر پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی نیز اتفاق می‌افتد. نتایج حاصل از پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی نشان دادند که این پدیده در هر دو گونه با کاهش دما، افزایش می‌یابد. شیب این افزایشدر گونه نارنج بسیار بیشتر از نوع هیبریدی سیترنج بود که نشان‌دهنده حساسیت بیشتر این گونه در مقابل تنش سرمایی است. پروتئین‌های ضد یخ (AFPs) در موجودات مقاوم به انجماد، از قبیل ماهی، حشرات، باکتری‌ها و گیاهان تولید می‌شوند. از جمله گیاهانی که در آنها AFP تولید می‌شود، می‌توان به گندم زمستانی (Zykova et al., 2000)، انگور(Zhang et al., 2006) هلو و مرکبات اشاره کرد (Hara et al., 2004). تحقیقات نشان داده‌اند که در گونه‌های مرکبات تحت تنش سرما، یک سری از mRNA های مخصوص (Thomashow, 1999) و برخی از پلی‌پپتیدها تجمع می‌یابند (DeVries, 1986). mRNA نوع CUCOR19 که محصول ترجمه آن شبیه یکی از پروتئین‌های دهیدرین پونسیروس است و از خود فعالیت ضد یخی نشان می‌دهد، در Citru unshiu طی آزمایشی کلون و مشخص گردید که پروتئین مزبور در برگ‌های این درخت پس از اعمال سرما تجمع می‌یابد (Hara, et al., 2001). برخی از پروتئین‌های ویژه از نواحی آپوپلاست گندم زمستانی پس از قرارگیری این گیاه در معرض دمای سرد جداسازی و خالص شدند (Zykova et al., 2000). این بررسی‌ها
تأیید کننده نتایج تحقیق حاضر در مورد ایجاد نوعی پروتئین ضد یخ در تنش‌های سرمایی است. لازم به توضیح است که فعالیت پروتئین‌های ضد یخ (AFPs) به وسیله روش بررسی مورفولوژی بلورهای یخ در حضور AFP نیز اندازهگیری می‌شود. در این روش، شکل بلورهای یخ به غلظت AFP و فعالیت ویژه آن بستگی دارد
(Duman, 1994). تحقیقات نشان داده که ممکن است شدت تنفس در اثر سرما بالا رود؛ با افزایش تنفس، جذب اکسیژن در ساعات اولیه سرما بسیار بالا می‌رود، در حالی که خروج دی اکسید کربن (CO2) به مقدار کمتری صورت می‌گیرد (McKersie, 1991). بنابراین، ممکن است اکسیژن به شکل اکسیژن‌های فعال، از جمله سوپراکسید و ترکیبات اکسید شده تک اکسیژنه در بافت سرمازده تبدیل شود. به علاوه، مقادیر گونه‌های فعال اکسیژن، از جمله پراکسیدها در طی چرخه انجماد-ذوب افزایش یافته، این عوامل نیز باعث افزایش پراکسیداسیون لیپیدی می‌شوند (Gülen et al., 2008). بر اساس یافته‌های این تحقیق، غلظت MDA، محصول پراکسیداسیون لیپیدها، در دماهای پایین افزایش نشان می‌دهد که
تأیید کننده اثر سرما در افزایش پراکسیداسیون لیپیدهاست. مقدار MDA حاصل از این تحقیق (148/0 و 135/0 میکرومول به ازای گرم وزن نمونه تازه به ترتیب برای نارنج و سیترنج در 6- درجه سانتیگراد، کمتر از نتایج گزارش شده برای Vaccinium myrtillus است (60-80 میکرومول/گرم) (Taulavuori et al., 2001) که مؤید ایجاد پروتئین ضد یخ در این دو گونه مرکبات و افزایش مقاومت در مقابل پراکسیداسیون لیپیدهاست. اندازهگیری سایر ترکیبات (از قبیل دی ان ها و تری ان های کونژوگه) در کنار بررسی MDA می‌تواند توجیه نتایج را بهبود بخشد (Blokhina et al., 1999).
)
