پاسخ‌های فیزیولوژیک سلول‌های جداکشت گیاه جعفری به میدان مغناطیسی ایستا

میدان‌های مغناطیسی از جمله تنش‌های غیرزیستی هستند که حاصل عصر تکنولوژی بوده، امروزه توجه بسیاری از محققان را به خود جلب کرده‌اند. این میدان‌ها هم به صورت طبیعی و هم به صورت نتیجه‌ای از تکنولوژی بشر امروزی، در زندگی روزمره انسان حضور داشته‌اند (Belyavskaya, 2004). در مورد آثار میدان‌های مغناطیسی بر سیستم‌های زنده، گزارش‌های ضد و نقیضی وجود دارد. از گذشته‌های بسیار دور انسان به تأثیر میدان مغناطیسی بر سیستم گردش خون واقف بود و برای درمان برخی از بیماری‌های خونی از آن بهره می‌برده است (Santwani, 1981). تحقیقات دیگری نشان داده‌اند که میدان‌های مغناطیسی شدید باعث ابتلا به لوسمی در کودکان شدهکه با تخریب ملاتونین (melatonin) غده صنوبری (pineal)همراه است (Henshaw and Reiter, 2005). گزارش‌هایی نیز در زمینه تأثیر میدان در عالم پروکاریوتی و نیز گیاهی وجود دارد. در ٦٧ درصد مطالعات انجام شده، میدان مغناطیسی باعث کاهش درصد جوانه‌زنی شده است (Belyavskaya, 2004). در گیاه توتون درصد جوانه‌زنی بذرها، تحت تأثیر میدان مغناطیسی ۱۵/٠ تسلا (T) افزایش نشان می‌دهد. جوانه‌زنی بذر‌های کاهو تحت تأثیر میدان مغناطیسی صفر تا 10 میلی‌تسلا افزایش یافت (Aladjadjiyan, 2002). با این حال، مکانیسم تأثیر میدان‌های مغناطیسی بر سلول‌های زنده هنوز به طور دقیق مشخص نشده است، ولی باید گفت که آثار مهاری یا تحریکی میدان مغناطیسی بر رشد بافت‌ها به عواملی نظیر گونه و اندام گیاهی، فرکانس و نوع میدان، مدت زمان تیمار و سایر عوامل تنش‌زا بستگی دارد (Kato et al., 1989). برخی تحقیقات نشان داده است که میدان مغناطیسی می‌تواند به تولید و یا افزایش طول عمر رادیکال‌های آزاد اکسیژن (ROS) منجر شود. تجمع این رادیکال‌ها می‌تواند به تنش اکسیداتیو منجر شود (Belyavskaya, 2004; Sahebjamei et al., 2007). تنش اکسیداتیو باعث تغییر در فعالیت آنزیم‌ها، بیان ژن و آزاد سازی کلسیم از ذخایر سلولی می‌شود. همچنین، این تنش می‌تواند بر ساختار غشا، رشد سلول و مرگ سلول‌ها تأثیرگذار باشد (Green et al., 1999). این رادیکال‌ها می‌توانند نقش دوگانه‌ای داشته باشند. به طوری که از یک سو باعث تخریب در سلول شود و از سوی دیگر، خود به عنوان مولکول سیگنال باعث به راه افتادن مکانیسم‌های دفاعی در سلول می‌شوند(Belyavskaya, 2004; Ghanati et al., 2007). میدان مغناطیسی در سطح آنزیمی می‌تواند باعث افزایش فعالیت آنزیم‌هایی چون کاتالاز، کاتالاز، پلی فنل اکسیداز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز شود (Pandolfini et al., 1992).

مکانیسم پیشنهادی دیگر برای نحوه عمل میدان مغناطیسی از طریق تأثیر بر مواد دارای خاصیت مغناطیسی است که مهم‌ترین این مواد عبارتند از مواد فرّومگنتیک نظیر آهن و مواد دیامگنتیک نظیر نشاسته. آهن به عنوان عنصری ضروری برای گیاهان دارای نقش دوگانه‌ایست، به طوری که از یک طرف در واکنش‌های اکسیداسیون-احیا و ساختار بسیاری از آنزیم‌های داخل سلولی نظیر کاتالاز، پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز شرکت می‌کند و از سوی دیگر، از طریق واکنش هابر-وایس گونه‌های فعال اکسیژن تولید می‌کند (Dat et al., 2000). بنابراین، تنظیم محتوای آهن سلولی بسیار حایز اهمیّت است. فرّیتین از جمله مولکول‌های مهم دخیل در تنظیم هموستازی آهن است که در تمام سلسله‌های موجودات زنده یافت می‌شود (Theil, 1987; Briat et al., 1995; Chasteen and Harrison, 1999). فرّیتین با اکسید کردن Fe⁺² به Fe⁺³، آهن را در هسته مرکزی خود ذخیره می‌کند (Laulhère and Briat, 1993) و همچنین به عنوان ماده‌ای با گشتاور مغناطیسی (magnetic moment) نامزد مناسبی برای مطالعه بر‌هم‌کنش آهن و میدان مغناطیسی در سلول‌های زنده است (Cespedes and Ueno, 2009). تأثیر میدان مغناطیسی 30 میلی‌تسلا بر سیستم‌های زیستی در گذشته روی سلول‌های گیاهی و جانوری بررسی شده است (Ghanati et al., 2007; Ishiwata et al., 2008). شدت میدان 30 میلی‌تسلا به عنوان کمترین آستانه شدت میدان برای جابجایی مواد مغناطیسی در موجودات زنده معرفی شده است 2003) (Takashima et al.,.

گیاه جعفری (Ptroselinum crispum) از خانواده چتریان (Apiaceae) است که در بسیاری از نقاط جهان و ایران دارای اهمیّت غذایی و دارویی است (Ozsoy-Sacan et al., 2006). این گیاه حاوی مقادیر بالای آهن، کلسیم، منیزیم، ویتامین C و A است (Pennington and Church, 1985).

هدف این مطالعه بررسی تأثیر میدان مغناطیسی بر محتوای آهن و فرّیتین در سلول‌های جداکشت گیاه جعفری است. علاوه بر این، فعالیت سه آنزیم آنتی‌اکسیدانی سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز و کاتالاز نیز بررسی شده است.

مواد و روش‌ها

شرایط رشد سلولی و تیمار سلول‌ها با میدان مغناطیسی ایستا

پس از نگهداری سلول‌ها در محیط‌کشت‌های مختلف و چند بار واکشت آنها وزن کالوس‌ها اندازه‌گیری و نتایج به دست آمده با هم مقایسه شد. بر اساس نتایج به دست آمده، محیط‌کشت LS تغییر یافته (Sahebjamei et al., 2007) به عنوان بهترین محیط انتخاب شد. برای تولید کالوس از بذرهای گیاه جعفری کشت شده در محیط‌کشت LS تغییر یافته (محیط‌کشت حاوی mgL^-1 15/0 کینتین، mgL^-1 5/1 تیامین،
mgL^-1 75/0 پیریدوکسین، mgL^-1 75/0 نیکوتینیک اسید، و اسیدیته 8/5) استفاده شد. کالوس‌های به دست آمده از بخش هوایی چندین بار واکشت شد. برای تهیه کشت تعلیقی حدود 2 گرم کالوس به 30 میلی‌لیتر محیط‌کشت LS مایع اضافه و هر دو هفته واکشت شد.

به منظور تعیین وزن خشک گونه‌های مورد بررسی، نمونه‌ها به مدت 48 ساعت در آون 70 درجه سانتیگراد نگهداری و سپس وزن خشک آنها اندازه‌گیری شد.

در بررسی حاضر، سلول‌ها در روز دهم پس از واکشت، مشابه تحقیقات گذشته (Shabrangi et al., 2011)، به مدت 4 ساعت، تحت تأثیر میدان مغناطیسی ایستا (30 میلی‌تسلا) قرار گرفتند. پس از اتمام تیمار، سلول‌ها برداشت شده و برای انجام تحلیل‌های بیوشیمیایی در نیتروژن مایع (٨٠- درجه سانتیگراد) فریز و نگهداری شدند.

اندازه‌گیری محتوای آهن کل

2 گرم نمونه گیاهی در کوره به مدت 2 ساعت در دمای 250 درجه سانتیگراد و سپس 2 ساعت در دمای 550 درجه سانتیگراد خاکستر شد. خاکستر حاصل در مخلوط کلریدریک اسید غلیظ و آب (1:1) هضم و سپس روی شن داغ (110 درجه سانتیگراد) خشک شد. 5 میلی‌لیتر اسید کلریدریک 1 نرمال به آن اضافه شد تا کل محتوای آهن هضم شده و آهن کل با دستگاه جذب اتمی سنجیده شد (Katyal and Sharma, 1980).

اندازه‌گیری محتوای فرّیتین

نمونه‌های فریز شده روی یخ در بافر استخراج ساییده شدند (Lukac et al., 2009) و با استفاده از کیت الایزا (ELISA) طبق روش Flowers و همکاران (1986) ارزیابی شدند. به طور خلاصه، یک گرم نمونه روی یخ و در بافر استخراج (10 میلی‌مولار بافر سدیم فسفات، 100 میلی‌مولار کلرید سدیم، پلی وینیل پیرولیدین 2 درصد و یک میلی‌مولار فنیل متان سولفونیل فلوراید، اسیدیته 2/7) ساییده، سپس در دمای 4 درجه سانتیگراد (دور g 15000 و به مدت 10 دقیقه) سانتریفیوژ شد. 50 میکرولیتر از محلول رویی و استاندارد به پلیتی که با آنتی‌بادی آنتی‌فرّیتین پوشیده شده بود، افزوده و سایر مراحل بر اساس دستورالعمل شرکت پیشتاز-طب انجام شد. محتوای فرّیتین بر اساس برهم‌کنش آنتی‌ژن-آنتی‌بادی و جذب در 450 نانومتر با استفاده از الایزا ریدر (ELISA reader) سنجیده شد.

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD) .

به منظور استخراج آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (Giannopolitis and Ries, 1977) سلول‌های منجمد شده در بافر HEPES-KOH با اسیدیته 8/7، حاوی EDTA (1/0میلی‌مولار) عصاره‌گیری شد. همگنای حاصل در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد (g15000 به مدت 15 دقیقه). بخش رویی حاصل برای سنجش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز استفاده شد. به عصاره آنزیمی حاصل برای سنجش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز بافر HEPES-KOH (50 میلی‌مولار) با اسدیته 8/7 حاوی EDTA (1/0 میلی‌مولار)، Na₂CO₃ (50 میلی‌مولار) با اسیدیته 2/10، L-متیونین (12 میلی‌مولار)،‌ (NBT) نیترو بلو تترازولیوم (75 میلی‌مولار)، ریبوفلاوین (یک میکرومولار) اضافه شد. عصاره آنزیمی به مقدار مناسب یک واحد فعالیت SOD به عنوان مقدار آنزیمی در نظر گرفته شد که منجر به مهار 50 درصدی نیترو بلو تترازولیوم (NBT) در 560 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد (Sahebjamei et al., 2007).

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) .

سلول‌های منجمد شده گیاه جعفری در بافر سدیم فسفات (50 میلی‌مولار با اسیدیته 8/7) حاوی آسکوربات 5 میلی‌مولار، دی تیو تریتول (DTT) 5 میلی‌مولار، EDTA (5 میلی‌مولار)،‌ کلرید سدیم (100 میلی‌مولار) و 2 درصد Polyvinylpyrrolidin (PVP) عصاره‌گیری شد. همگنای حاصل در دور g15000، به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. از بخش رویی برای سنجش فعالیت آسکوربات پراکسیداز استفاده شد. ترکیب واکنش شامل بافر سدیم فسفات 50 میلی‌مولار حاوی همه ترکیبات بالا، H₂O₂ (44 میکرومولار) و عصاره آنزیمی به مقدار مناسب بود. فعالیت آنزیمی APX توسط کاهش در جذب در طول موج 290 نانومتر با استفاده از ضریب ثابت 8/2 مول بر سانتی‌متر و به ازای هر میلی‌گرم پروتئین در عصاره آنزیمی محاسبه شد (Nakano and Asada, 1987).

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز

مقدار 200 میلی‌گرم از سلول جداکشت منجمد شده، در بافر سدیم فسفات 25 میلی‌مولار (اسیدیته1/6) عصاره‌گیری و مخلوط حاصل در g12000 و دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. از محلول رویی برای سنجش فعالیت آنزیمی استفاده شد. به 100 میکرولیتر از عصاره آنزیمی بافر فسفات 25 میلی‌مولار (اسیدیته 8/6) و H₂O₂ (10 میلی‌مولار) اضافه شد. فعالیت کاتالاز با توجه به روند تجزیه H₂O₂ و در نتیجه، کاهش جذب در 240 نانومتر سنجیده، به ازای میلی‌گرم پروتئین عصاره آنزیمی محاسبه شد (Cakmak and Horst, 1991).

تحلیل داده‏ها

تمامی آزمایش‌ها با 3 تکرار از حداقل ٣ نمونه مستقل انجام شد. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه ۱۶ و آزمون توکی (Tukey) برای تعیین معنی‌دار بودن تفاوت‌ها در سطح ٠۵/٠P≤ انجام شد. ضریب همبستگی با استفاده از اندکس پیرسون تعیین شد.

نتایج و بحث

افزایش آهن در داخل سلول از یک سو از طریق واکنش فنتون، مقدار Fe⁺² و رادیکال‌های آزاد داخل سلول را افزایش می‌دهد که این رادیکال‌ها می‌توانند به تخریب غشاها، پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک منجر شوند (Becana and Moran, 1998) و از سوی دیگر، افزایش آهن باعث به راه افتادن مکانیسم‌های دفاعی در داخل سلول می‌شود که حاصل آن کاهش محتوای آهن و حفظ هموستازی آن است. از جمله این مکانیسم‌هاریال ذخیره شدن آهن در اندامک‌هایی نظیر واکوئل و یا در مولکول‌هایی نظیر فیتوفرّیتین است Briat et al., 1995)؛ Chasteen and Harrison, 1999). علاوه بر این، آهن به عنوان ماده‌ای فرّومگنتیک تحت تأثیر میدان مغناطیسی قرار می‌گیرد. تحقیقات گذشته نشان داده است که میدان‌های مغناطیسی با افزایش اکسیداسیون لیپید‌های غشایی قادر به تغییر نفوذپذیری یون‌ها از خلال غشای سلول‌ها هستند (Vaezzadeh et al., 2006). با وجود این، تحقیقات انجام شده روی تغییر محتوای آهن تحت تأثیر میدان‌های مغناطیسی اندک است (Dhawi and Al-Khayri, 2009). در این آزمایش، جذب آهن در پاسخ به میدان مغناطیسی کاهش یافت (شکل 1). این کاهش می‌تواند ناشی از تغییر نفوذپذیری غشای سلولی و یا تغییر در عملکرد کانال‌های یونی تحت تأثیر میدان مغناطیسی باشد، به طوری که احتمالاً فسفولیپیدهای موجود در غشای پلاسمایی (که دارای خاصیت دیامگنتیک هستند)، تحت تأثیر میدان مغناطیسی قرار گرفته، جهت قرارگیری آنها در غشا تغییر کرده، در نتیجه، شیوه قرارگیری کانال‌های موجود در غشا نیز تغییر می‌کند (Yao et al., 2005; Hajnorouzi et al., 2011; Radhakrishnan and Kumari, 2012). از سوی دیگر نتایج نشان داد که به دنبال کاهش محتوای آهن سلولی، میزان فیتوفرّیتین نیز کاهش می‌یابد (شکل 1).

شکل 1- محتوای آهن کل سلولی و میزان فرّیتین در سلول‌های جدا‌کشت گیاه جعفری در پاسخ به تأثیر میدان مغناطیسی ایستای 30 میلی‌تسلا به مدت 4 ساعت مقادیر، میانگین کمینه 3 تکرار ± SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 05/0≥P است. ضریب همبستگی میان محتوای آهن و محتوای فرّیتین در این آزمایش بیش از 88 درصد است.

برخی مطالعات نشان می‌دهد که رابطه مستقیمی بین محتوای فرّیتین و mRNA فرّیتین با میزان آهن سلول وجود دارد (Van der Mark et al., 1983; Lescure et al., 1991)، بنابراین، کاهش جذب آهن خود می‌تواند علتی برای کاهش میزان فرّیتین باشد. به طوری که مطالعات آماری نشان می‌دهد که ضریب همبستگی میان محتوای آهن و محتوای فرّیتین حدود 88 درصد است. از طرفی Belyavskaya (1981) پیشنهاد می‌کند که کاهش محتوای فیتوفرّیتین تحت تأثیر میدان مغناطیسی احتمالاً به علت مهار بیوسنتز فیتوفرّیتین باشد و یا از فیتوفرّیتین برای سنتز سایر پروتئین‌های حاوی آهن استفاده شده باشد.

علاوه بر فیتوفرّیتین که با جمع‌آوری آهن آزاد سلولی باعث کاهش احتمال وقوع واکنش فنتون و در نتیجه کاهش تولید ROS می‌شود، سلول‌ها قادرند از طریق آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی نیز محتوای رادیکال‌های آزاد داخل سلولی را کاهش دهند
(Kos et al., 2008). مطالعات دیگر نشان می‌دهد که جمع‌آوری رادیکال‌های اکسیژن تولید شده توسط SOD یا سایر مسیرها، علاوه بر سیستم غیر آنزیمی می‌تواند از طریق آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی نظیر کاتالاز یا APX انجام شود (Sahebjamei et al., 2007). میدان‌های مغناطیسی همچنین می‌توانند بر الکترون‌های جفت نشده فلزات موجود در ساختار این آنزیم‌ها و تغییر ساختار فضایی آنها بر فعالیت زیستی آنزیم‌ها تأثیر گذارند. SOD و APX و کاتالاز از جمله آنزیم‌هایی هستند که به علت داشتن آهن در ساختار خود می‌توانند تحت تأثیر میدان مغناطیسی قرار گیرند (Sahebjamei et al., 2007; Celik et al., 2010).

نتایج به دست آمده در این بررسی نشان داد که در شرایط مورد آزمایش در سلول‌های جعفری، فعالیت آنزیم SOD از ٣±۲۷ در گروه شاهد به ۲±٣۶ در گروه تیمار شده با میدان مغناطیسی افزایش یافته است (جدول 1) که مشابه نتایجی است که Celik و همکاران (2010) به دست آوردند. نتایج آنها نشان داد که طی تیمار با میدان مغناطیسی مقدار رادیکال‌های آزاد افزایش می‌یابد و این افزایش خود می‌تواند به افزایش فعالیت SOD منجر شود. افزایش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز احتمالاً موجب افزایش H₂O₂ می‌شود. به منظور جلوگیری از آثار نامطلوب افزایش H₂O₂، سلول با استفاده از سایر آنزیم‌ها یا سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی H₂O₂ را جاروب می‌کند.

جدول 1- فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز در پاسخ به میدان مغناطیسی 30 میلی‌تسلا. میزان فعالیت آنزیم SOD و APX به ترتیب بر اساس اختلاف جذب در ۵۶٠ و ۲٩٠ نانومتر بر میلی‌گرم پروتئین بیان شد. ^* نشان‌دهنده معنی‌دار بودن در سطح 05/۰≥P است.

در این تحقیق، اندازه‌گیری فعالیت APX نشان داد که APX که یکی از آنزیم‌های جمع کننده ROS است، در پاسخ به میدان مغناطیسی از ۲±٨۶ در گروه شاهد به ۲±۵٠ در گروه تیمار کاهش یافت (جدول 1). این کاهش همراه با کاهش محتوای آهن سلولی است و ضریب همبستگی آن با محتوای آهن سلول بیش از 90 درصد است (جدول 2). افزایش رادیکال‌های آزاد خود می‌تواند به تنظیم فعالیت APX منجر شود. به طوری که پیشنهاد شده در حضور میدان مغناطیسی 30 میلی‌تسلا فعالیت آنزیم APX و همچنین، بیان ژن یاد شده از طریق افزایش ROS مهار می‌شود (Sahebjamei et al., 2007).

جدول 2- همبستگی میان محتوای آهن در داخل سلول با فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی (Pearson Index)

گزینه مناسب دیگر برای جمع‌آوری و تجزیه H₂O₂ کاتالاز است. همان طور که در شکل 2 دیده می‌شود، فعالیت آنزیم کاتالاز در پاسخ به میدان مغناطیسی افزایش یافته است.

شکل 2- فعالیت آنزیم کاتالاز در سلول‌های جداکشت گیاه جعفری در پاسخ به میدان مغناطیسی ایستا 30 میلی‌تسلا. ^* نشان‌دهنده معنی‌دار بودن در سطح 05/۰≥P است.

طبق واکنش‌هایی که در زیر آمده است افزایش فعالیت SOD به افزایش تولید  H₂O₂منجر می‌شود که خود پیش‌ماده اصلی لازم برای فعالیت کاتالاز است (Chen and Pan, 1996). بنابراین، به نظر می‌رسد در پاسخ به میدان مغناطیسی، فعالیت کاتالاز در سلول‌ها افزایش یافت تا H₂O₂ تولید شده توسط SOD را کاهش دهد و بدین ترتیب از آثار مخرب ناشی از تجمع آن جلوگیری کند (Celik et al., 2010).

بنابراین، همان طور که انتظار می‌رود یکی از مکانیسم‌های تأثیر میدان‌های مغناطیسی بر سیستم‌های زنده از طریق بر هم‌کنش با مولکول‌ها یا عناصر دارای ویژگی‌های مغناطیسی است که در این میان آهن و مولکول‌های زیستی حاوی آهن گزینه‌های مناسبی برای بررسی این بر هم‌کنش‌ها هستند. همچنین، میدان‌های مغناطیسی احتمالاً با تأثیر بر ساختار فضایی آنزیم و یا تغییر میزان و سرعت اتصال سوبسترا به آنزیم (Batcioglu et al., 2002)، آثار خود را بر فعالیت آنزیم‌ها اعمال می‌کنند. بدین ترتیب، با توجه به حضور آهن در ساختار آنزیم‌های کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز، یکی از مکانیسم‌های احتمالی تغییر فعالیت این آنزیم‌ها در پاسخ به میدان مغناطیسی از طریق تأثیر بر آهن و به دنبال آن تغییر ساختار فضایی آنزیم است.