نویسندگان
1 گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده علوم کشاورزی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران
2 گروه زراعت، پژوهشکده ژنتیک و زیستفناوری کشاورزی طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران
3 گروه مهندسی کشاورزی، پژوهشکده گیاهان و مواد اولیه دارویی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران
4 گروه باغبانی، دانشکده علوم کشاورزی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران
چکیده
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
To find out the role and effects of exogenous nitric oxide (NO) application in reducing oxidative damage induced by salinity stress in purple coneflower (Echinacea purpurea L.) seed germination, a compeletly randomized design in factorial arrangment with three replications was conducted in Plant Physiology Laboratory of the Genetics and Agricultural Biotechnology Institute of Tabarestan, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University in 2012. The crop seeds were pre-soaked in 0.1 mM of sodium nitroprusside (SNP 0.1 as nitric oxide donor) solution as well as in distilled water (SNP 0 as control) for 20 hs just before the onset of the experiment. Then, pre-treated seeds were subjected to different levels of salinity (0, 50, 75, 100, 125, 150 mM NaCl solution) to germinate. Results showed that the SNP0.1 treatment in saline conditions had significant effect on germination percentage. Different levels of salinity significantly reduced germination rate, germination vigor and index. Pretreated with exogenous NO increased the activity of SOD, POD and APX as compared with SNP0. Accordingly, the highest activity of SOD (116.3 μM g-1 FW), POD (1.7 μM g-1 FW. min.) and APX (50.1 μM g-1 FW. min.) was related to the 125, 50 and 125 Mm NaCl, respectively. Significant and adverse effects of NO were seen on CAT activity. Exogenous NO, as an antioxidant, also reduced peroxidation of membrane lipids (MDA) and delayed the oxidation of proteins. Overall, it could be concluded that sodium nitroprusside as NO donor could improve coneflower seed germination characteristics in saline condition and increase salinity tolerance by means of scavenging of free ROS radicals.
کلیدواژهها [English]
شوری یکی از تنشهای غیرزیستی مهم و فراگیر در کشاورزی امروزی است که رشد و عملکرد بسیاری از گیاهان شیرینرُست را کاهش میدهد (Parida and Das, 2005). پیشبینی شده است که تا سال 2050 احتمالاً بیش از 50 درصد زمینهای فاریاب جهان تحت تأثیر شوری قرار خواهند گرفت (Wang et al., 2003) که نشاندهنده تهدیدی جدی برای تولید پایدار غذا بهویژه در مناطق خشک و نیمهخشک است (Paranychianakis and Chartzoulakis, 2005).
جنس Echinacea گیاهی علفی و چندساله از خانواده گلستاره (Asteraceae) است که خاستگاه آن شمال آمریکا است و تاکنون 9 گونه و چهار رقم از آن معرفی شده است (Stanisavijevic et al.,2009). سه گونه: E. angustifolia، E. pallida و E. purpurea به عنوان گونههای مهم دارویی از این جنس شناخته شدهاند که از ریشه و اندام هوایی آنها به عنوان داروهای گیاهی استفاده میشود (Bauer and Wagner, 1991).
گونه E. purpurea گیاهی با گلهای مخروطی شکل و به رنگ ارغوانی تا صورتی است (Mrozikiewicz et al., 2010) که در فلور ایران وجود ندارد ولی به دلیل اهمیت گستردهای که دارد، بذر آن در سال 1372 به ایران وارد و نام سرخارگل برای آن برگزیده شد (Omidbaigi, 2002). این گیاه، تحمل بالایی به دامنه گستردهای از شرایط آب و هوایی و اقلیمی، درجات مختلف رطوبتی و دمایی و شرایط محیطی خاکی از جمله خشکی نشان داده است (Sabra et al., 2012a). این ویژگیها در کنار تقاضای روزافزون صنایع دارویی برای استفاده از این گیاه، ضرورت کشت گسترده آن را در جهان (Stanisavijevic et al.,2009) و در ایران برجسته میکند. با وجود این، گرچه مطالعاتی در شرایط شوری روی این گیاه انجام شده است ولی چندان زیاد نیست.
برای نمونه، در دو پژوهشی که تحمل شوری سرخارگل با چند گیاه دیگر مقایسه شد، با توجه به شرایط محیط رشد گیاهان (از نظر دما و شدت نور) تحمل متوسط (Zollinger et al., 2007) و پایین
(Niu and Rodriguez, 2006) برای این گیاه گزارش شد. در این دو پژوهش، گیاهان در معرض ترکیب کلرید سدیم (NaCl) و کلرید کلسیم (CaCl2) قرار گرفتند. بنابراین، با توجه به تأثیر کلسیم بر کاهش برخی از آثار نامطلوب شوری در برخی گیاهان (Cramer et al., 1985)، تأیید اثر کلرید سدیم بر گیاه سرخارگل در این دو مطالعه دشوار بوده است.
بذر سرخارگل توان رویشی اندکی دارد و رشد اولیه آن نیز بسیار کند است (Omidbaigi, 2002). بنابراین، وجود بستر مناسب برای رشد و جوانهزنی بذر آن ضروری به نظر میرسد. از آن جا که تأثیر شوری عمدتاً بر جوانهزنی بذر و ابتدای رشد گیاهچه است (Grim and Campbell, 1991)، این موضوع میتواند ضرورت تعیین آستانه تحمل این گیاه به شوری برای جلوگیری از تأخیر در آغاز جوانهزنی و بهبود استقرار گیاهچه را ایجاب نماید.
تنش شوری با خسارت اکسیداتیو القا شده توسط ROSها، میتواند اختلال در متابولیسم سلول از طریق پراکسیداسییون لیپیدهای غشا، اکسیداسیون پروتئینها، بازدارندگی فعالیت آنزیمها و خسارت به نوکلئیک اسیدها را به دنبال داشته باشد (Turkan and Demiral, 2009). ترکیب آلدهیدی ناشی از پراکسیده شدن لیپیدهای غشا، با اندازهگیری مالون دی آلدهید (MDA) سنجش و برآورد شده است (Xu et al., 2008). خسارت اکسیداتیو به پروتئینها شامل تغییرات آمینو اسیدها در جایگاههای ویژه، قطعه قطعه شدن زنجیر پپتیدی، تغییر بار الکتریکی و در نهایت مستعد شدن پروتئین برای پروتئولیز گزارش شده است (Noctor and Foyer, 1998). با وجود این، گیاهان برای کاهش این آثار مخرب، سازوکارهای مختلفی را در خود ایجاد کرده و توسعه دادهاند که نمونهای از آنها تولید آنزیمهای حذف کننده ROSها از جمله سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT) و پراکسیدازهای متنوعی نظیر آسکوربات پراکسیداز (APX) است (Tanouet al., 2009). با توجه به ماهیت این مشکل گسترده در گیاه، یافتن روشی که بتواند گیاهان را از تجمع ROS و خسارتهای اکسیداتیو بعدی محافظت کند، از اهمیت ویژهای برخوردار است.
سدیم نیترو پروساید (SNP) یک ترکیب رها کننده نیتریک اکسید (NO) است که نقش آن در گیاهان به عنوان ترکیبی مهم در پژوهشها مورد توجه است Beligni and Lamattina, 2001)؛ Arasimowicz and Floryszak-Wieczorek, 2007؛ Lei et al., 2007؛ (Li et al., 2008. رادیکال آزاد NO، یک مولکول فعال زیستی است که در تنظیم بسیاری از کارکردهای سلولی متنوع در گیاه از محدوده رشد ریشه تا پاسخهای سازشی به تنشهای زیستی و غیرزیستی نقش دارد (Besson-Bard et al., 2008). گزارش شده که NO میتواند با واکنش با ROSها و افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان، نقش مهمی در محافظت گیاهان از تنشهای اکسیداتیو داشته باشد (Arasimowicz and Floryszak-Wieczorek, 2007؛ Li et al., 2008؛ Zheng et al., 2009). در رابطه با تأثیر NO در کاهش آثار تنش شوری، Uchida و همکاران (2002) با کاربرد غلظت یک میکرومولار SNP در گیاهچههای برنج، Lei و همکاران (2007) با کاربرد غلظت 2/0 میلیمولار SNP در گیاهچههای گندم و Li و همکاران (2008) با کاربرد غلظت 50 میکرومولار SNP در گیاهچههای جو، محافظت در برابر خسارت اکسیداتیو و افزایش تحمل به تنش اسمزی را گزارش کردند. Nasibi و همکاران (2009) در بررسی گیاه گوجهفرنگی تحت تنش خشکی، کاهش فعالیت برخی از آنزیمها نظیر: SOD، POD و APX را در غلظت 2/0 میلیمولار SNP گزارش کردند و این کاهش را احتمالاً به تنش نیتروزاتیو ایجاد شده در این غلظت مربوط دانستند. برخی پژوهشها نشان دادهاند که NO با جانشینی اثر نور یا شکست خواب بذر سبب افزایش جوانهزنی شده است Misra and Dwivedi, 2004)؛ Besson-Bard et al., 2008). با توجه به اهمیت درک پاسخهای فیزیولوژیک و بیوشیمیایی سرخارگل به تنش شوری در ارزیابی امکان استفاده از آب یا خاک شور در تولید این گیاه (Sabra et al., 2012a, b) و همچنین، نقش زیاد خسارتهای اکسیداتیو ناشی از وجود تنش شوری، این آزمایش با هدف بررسی نقش NO خارجی به عنوان یک آنتیاکسیدان مؤثر در کاهش آثار تنش اکسیداتیو ناشی از شوری و تحریک یا فعالسازی پاسخهای حفاظتی گیاه در شرایط شوری انجام شد.
مواد و روشها
پژوهش حاضر در سال 1391 به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار در آزمایشگاه فیزیولوژی پژوهشکده ژنتیک و زیستفناوری طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری اجرا شد. تیمارهای آزمایشی، شامل دو سطح پیشتیمار بذر (آب خالص استریل و سدیم نیترو پروساید یا SNP به عنوان دهنده NO با غلظت 100 میکرومولار) و شش بستر جوانهزنی با شوریهای متفاوت (0، 50، 75، 100، 125 و 150 میلیمولار محلول کلرید سدیم) بود. در این آزمایش، از آب خالص استریل به عنوان شاهد برای سطح صفر شوری (بستر جوانهزنی غیر شور) استفاده شد.
پیش از آغاز آزمایش، بذرها بهمدت 10 دقیقه در محلول 5/2 درصد هیپوکلریت سدیم ضدعفونی شدند. دقیقاً پیش از جوانهزنی، بذرها در آب خالص استریل و سدیم نیترو پروساید 100 میکرومولار به مدت 20 ساعت خیسانده شدند. پس از طی این مدت، بذرها تا رسیدن به وزن اولیه در دمای اتاق و شرایط تاریکی خشک شدند. برای هر تکرار، 50 بذر خیسخورده در داخل پتریدیشهایی با قطر نه سانتیمتر قرار داده شد و سپس 10 میلیلیتر از محلولهای شوری آماده شده به پتریدیشها اضافه شد. پتریدیشها با پارافیلم برای حفظ رطوبت پوشانده شدند و در دمای 1±26 درجه سانتیگراد برای 12 روز در ژرمیناتور قرار گرفتند. بذرهای جوانهزده از روز دوم در 12 روز متوالی (هر دو روز در میان) در ساعتی معین شمارش شدند. معیار جوانهزنی خروج ریشهچه به اندازه دو میلیمتر بود.
در پایان جوانهزنی، برای محاسبه درصد نهایی جوانهزنی، سرعت جوانهزنی، بنیه (قدرت) جوانهزنی و شاخص جوانهزنی از رابطههای زیر استفاده شد
Ellis and Roberts, 1981)؛ (Bi and Dai, 1993:
رابطه 1:
درصد نهایی جوانهزنی = تعداد کل بذرهای جوانهزده / تعداد کل بذرهای آزمایش شده × 100
رابطه 2:
سرعت جوانهزنی = تعداد بذور جوانهزده / روز اول شمارش + تعداد بذور جوانهزده / روز آخر شمارش
رابطه 3:
بنیه جوانهزنی = تعداد بذرهای جوانهزده در روز چهارم / تعداد کل بذرهای آزمایش شده × 100
برای محاسبه شاخص جوانهزنی از رابطه 4 استفاده شد:
رابطه 4:
که در آن Gi تعداد بذر جوانهزده در روز iام و t تعداد کل روزهای جوانهزنی است.
14 روز پس از جوانهزنی، همه گیاهچههای جوان موجود در پتریدیشها جمعآوری شد و به سرعت در نیتروژن مایع قرار گرفت. گیاهچههای جمعآوری شده پس از خروج از نیتروژن مایع، در یخچال 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد تا میزان پراکسیده شدن لیپیدها، اکسیداسیون پروتئینها و فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، پراکسیداز (POD)، کاتالاز (CAT) و آسکوربات پراکسیداز (APX) موجود در آنها اندازهگیری شود.
.سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا: برای سنجش پراکسیداسیون لیپیدهای غشا، غلظت مالون دی آلدهید به عنوان محصول پراکسیده شدن اسیدهای چرب غشاها با روش Heath و Packer (1968) اندازهگیری شد. به طور خلاصه، در ابتدا، 5/0 گرم از بافت تازه برگی با نیتروژن مایع در هاون چینی آسیاب شد و به آن 5 میلیلیتر تریکلرو استیک اسید (TCA) 1 درصد اضافه شد. عصاره به دست آمده به مدت 20 دقیقه با دستگاه سانتریفیوژ (مدل 5417R، شرکت Ependorf، آلمان) با سرعت 14000 دور در دقیقه در دمای چهار درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. سپس، به 1 میلیلیتر از محلول رویی، 5 میلیلیتر محلول 20 درصد TCA حاوی 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید (TBA) افزوده شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد قرار گرفت و بلافاصله در یخ سرد شد. سپس، نمونهها مجدداً در 10000 دور در دقیقه به مدت پنج دقیقه سانتریفیوژ شدند. ماده قرمز رنگ مالون دی آلدهید-تیوباربیوتریک اسید (MDA-TBA) تولید شده در طول موج 532 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر (مدل T80+UV/VIS، شرکت
PG Instrument، انگلستان) اندازهگیری شد و جذب سایر رنگیزههای اختصاصی در 600 نانومتر خوانده شد. تعیین غلظت مالون دی آلدهید از ضریب خاموشی معادل mM-1 cm-1 155، بر حسب نانومول بر گرم بافت تازه بر اساس رابطه 5 محاسبه شد.
رابطه 5: [(A532-A600)/155]×100.
استخراج آنزیمها: 5/0 گرم بافت تازه برگ با کمک نیتروژن مایع در هاون چینی آسیاب شد و پس از آن به بافت آسیاب شده، یک میلیلیتر بافر فسفات 50 میلیمولار (اسیدیته=7) حاوی EDTA 5/0 مولار و PVPP 2 درصد اضافه گردید. محلول حاصل در دمای چهار درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه با سرعت 14000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس، محلول رویی برای بررسی فعالیت آنزیمهای SOD، POD، CAT و APX و همچنین میزان پروتئین کل مورد استفاده قرار گرفت.
.اندازهگیری فعالیت آنزیمها
فعالیت آنزیم SOD: سنجش فعالیت آنزیم SOD با روش Rao و Sresty (2000) اندازهگیری شد. محلول واکنش آنزیمی شامل 935 میکرولیتر بافر فسفات 50 میلیمولار حاوی EDTA 1/0 میلیمولار، متیونین 13 میلیمولار و NBT 75 میکرومولار و 15 میکرولیتر ریبوفلاوین 12/0 میلیمولار و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی استخراج شده بود. کووتهای حاوی مخلوط واکنش به مدت 15 دقیقه در حالی که بهآرامی تکان داده میشدند در معرض نور فلورسانس قرار گرفتند، سپس جذب نمونهها در طول موج 560 نانومتر ثبت شد. برای سنجش فعالیت این آنزیم علاوه بر کووتهای نمونه و بلانک از کووت شاهد نیز استفاده شد. برای خواندن نمونهها،کووت شاهد همراه با نمونهها در معرض نور قرار گرفته، کووت بلانک در تاریکی قرار داده میشود. سپس، جذب آن با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 560 نانومتر خوانده و فعالیت آنزیمی بر حسب میکرومول بر گرم بافت تازه محاسبه شد.
فعالیت آنزیم POD: برای سنجش فعالیت آنزیم POD از روش Nickel و Cunningham (1969) استفاده شد. 490 میکرولیتر هیدروژن پراکسید 225 میلیمولار و 490 میکرولیتر محلول گایاکول 45 میلیمولار با هم مخلوط و به آن 20 میکرولیتر عصاره آنزیمی اضافه شد. تغییرات جذب در طول موج 470 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. در محلول بلانک بهجای عصاره آنزیمی، بافر فسفات 50 میلیمولار استفاده شد. فعالیت آنزیمی بر حسب میکرومول بر گرم بافت تازه در دقیقه محاسبه شد.
فعالیت آنزیم CAT: برای سنجش فعالیت آنزیم CAT از روش Cakmak و Marschner (1992) استفاده شد. 20 میکرولیتر عصاره آنزیمی با 980 میکرولیتر از بافر فسفات حاوی هیدروژن پراکسید 2 میلیمولار مخلوط شدند و تغییرات جذب آنها در طول موج 240 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. فعالیت آنزیمی بر حسب میکرومول هیدروژن پراکسید بر گرم بافت تازه در دقیقه محاسبه شد.
فعالیت آنزیم APX: برای سنجش فعالیت آنزیم APX از روش Aono و همکاران (1995) استفاده شد. 770 میکرولیتر بافر فسفات 50 میلیمولار با اسیدیته=7 با 100 میکرولیتر EDTA 1/0 میلیمولار، 100 میکرولیتر آسکوربیک اسید 5 میلیمولار و 10 میکرولیتر هیدروژن پراکسید 1/0 میلیمولار مخلوط شدند. سپس، با افزودن 20 میکرولیتر عصاره آنزیمی، منحنی تغییرات جذب در طول موج 290 نانومتر خوانده شد. فعالیت آنزیمی بر حسب میکرومول آسکوربیک اسید بر گرم بافت تازه در دقیقه محاسبه شد.
سنجش میزان پروتئین کل: سنجش غلظت پروتئین محلول با روش Bradford (1976) با دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج 595 نانومتر خوانده شد.
تحلیل دادهها: برای تجزیه آماری دادههای به دست آمده، از نرمافزار SAS نسخه 9 استفاده شد. مقایسه میانگین تیمارها با آزمون LSD انجام شد و 05/0>P به عنوان سطح معنیدار بودن تفاوتها در نظر گرفته شد. نمودارها، با نرمافزار SigmaPlot نسخه 12 رسم شد.
نتایج
نتایج تجزیه واریانس دادهها نشان داد که برهمکنش تیمارهای شوری × پیشتیمار بذرها بر درصد نهایی جوانهزنی بذر سرخارگل معنیدار است (جدول 1). نتایج برشدهی با استفاده از پیشتیمار نشان داد که درصد نهایی جوانهزنی در پیشتیمار با آب خالص در سطح احتمال یک درصد و در پیشتیمار با نیتریک اکسید (سدیم نیترو پروساید 1/0 میلیمولار) در سطح احتمال پنج درصد معنیدار است (جدول 2). نتایج برشدهی با تیمارهای شوری هم نشان داد که درصد نهایی جوانهزنی به غیر از تیمار شوری صفر (بستر غیر شور) که در سطح احتمال پنج درصد معنیدار بود، در سایر بسترهای شور معنیدار نیست (جدول 3). مقایسه میانگین دادههای برهمکنش پیشتیمار و شوری نشان داد که بیشترین درصد جوانهزنی (7/66 درصد) به پیشتیمار با آب خالص در شرایط عدم شور (تیمار شاهد) مربوط است (شکل 1). پیشتیمار بذرهای سرخارگل با نیتریک اکسید (سدیم نیترو پروساید 1/0 میلیمولار) توانست تنها در غلظتهای بالاتر شوری (100-150 میلیمولار NaCl)، موجب افزایش درصد جوانهزنی بذرها نسبت به پیشتیمار با آب خالص شود به طوری که کمترین درصد جوانهزنی (18 درصد) در پیشتیمار بذور با آب خالص (شاهد) در سطح 150 میلیمولار محلول کلرید سدیم به دست آمد که آمادهسازی بذور با NO توانست میزان آن را به 7/24 درصد در این غلظت از بستر شور افزایش دهد (شکل 1).
جدول 1- نتایج تجزیه واریانس تأثیر تیمارهای آزمایشی بر ویژگیهای جوانهزنی مطالعه شده. ns= عدم تفاوت معنیدار، * و **= بهترتیب معنیدار در سطح احتمال پنج و یک درصد
|
منابع تغییر |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
|||
|
درصد نهایی جوانهزنی |
سرعت جوانهزنی |
بنیه جوانهزنی |
شاخص جوانهزنی |
||
|
پیشتیمار |
1 |
8/18ns |
2/56ns |
4/173ns |
1/12ns |
|
شوری |
5 |
**6/1266 |
**9/600 |
**8/1388 |
**1/130 |
|
پیشتیمار × شوری |
5 |
*5/267 |
4/33ns |
9/86ns |
8/10ns |
|
خطای آزمایش |
24 |
6/90 |
3/30 |
2/108 |
8/7 |
|
ضریب پراکندگی |
- |
15 |
17 |
20 |
19 |
جدول 2- برشدهی برهمکنش تیمارهای شوری × پیشتیمار با استفاده از پیشتیمار روی درصد نهایی جوانهزنی
|
تیمار |
درجه آزادی |
سطح معنیدار |
|
پیشتیمار با آب خالص |
5 |
0001/> |
|
پیشتیمار با نیتریک اکسید (SNP 0.1) |
5 |
022/0 |
جدول 3- برشدهی برهمکنش تیمارهای شوری × پیشتیمار با استفاده از شوری. FGP: درصد نهایی جوانهزنی، MDA: مالون دی آلدهید، PRO: پروتئین، SOD: آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز، POD: آنزیم پراکسیداز، CAT: آنزیم کاتالاز، APX: آنزیم آسکوربات پراکسیداز
|
تیمارهای شوری (میلیمولار) |
درجه آزادی |
سطح معنیدار |
||||||
|
FGP |
MDA |
PRT |
SOD |
POD |
CAT |
APX. |
||
|
0 |
1 |
046/0 |
0001/> |
0001/> |
0001/> |
0001/> |
006/0 |
0001/> |
|
50 |
1 |
060/0 |
0001/> |
0001/> |
0001/> |
0001/> |
0001/> |
0001/> |
|
75 |
1 |
276/0 |
0001/> |
0001/> |
052/0 |
0001/> |
0001/> |
205/0 |
|
100 |
1 |
126/0 |
0001/> |
0001/> |
0001/> |
0001/> |
147/0 |
035/0 |
|
125 |
1 |
116/0 |
0001/> |
0001/> |
0001/> |
0001/> |
0001/0 |
0001/> |
|
150 |
1 |
448/0 |
0001/> |
0001/> |
0001/> |
0001/> |
0001/> |
0001/> |
شکل 1- اثر برهمکنش سدیم نیترو پروساید و شوری بر درصد نهایی جوانهزنی بذر سرخارگل. مقادیر، میانگین سه تکرار ± SE (انحراف معیار) است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون LSD است.
بر پایه نتایج تجزیه واریانس دادهها، سطوح مختلف شوری موجب کاهش خطی و بسیار معنیدار سرعت جوانهزنی، بنیه بذر و شاخص جوانهزنی بذور سرخارگل شد (جدول 1). بر پایه نتایج مقایسه میانگینها (جدول 4)، بیشترین سرعت جوانهزنی (2/34)، بنیه بذر (7/53) و شاخص جوانهزنی (2/17) در تیمار شاهد به دست آمد. افزایش شوری تا 150 میلیمولار کلرید سدیم، سبب کاهش سرعت جوانهزنی، بنیه جوانهزنی و شاخص جوانهزنی به ترتیب بهمیزان: 5/5، 5/10 و 8/3 نسبت به تیمار شاهد شده است (جدول 4). در پژوهش حاضر آمادهسازی بذور با دهنده NO، تأثیر معنیداری بر این شاخصها نداشت.
جدول 4- اثر پیشتیمار نیتریک اکسید بر ویژگیهای جوانهزنی بذر سرخارگل در بستر شور. مقادیر، میانگین سه تکرار ± SE (انحراف معیار) است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون LSD است.
|
تیمار شوری (میلیمول کلرید سدیم) |
ویژگیهای جوانهزنی |
||
|
سرعت جوانهزنی |
بنیه جوانهزنی |
شاخص جوانهزنی |
|
|
0 |
2/34±61/4a |
7/53±95/6a |
2/17±24/2a |
|
50 |
3/24±22/2b |
8/42±01/3ab |
3/13±88/0b |
|
75 |
2/19±98/0bc |
5/37±68/4bc |
3/12±02/1bc |
|
100 |
5/14±61/1cd |
2/28±01/4cd |
2/9±02/1cd |
|
125 |
5/12±92/0d |
8/23±51/2d |
8±46/0d |
|
150 |
5/5±06/1e |
5/10±25/2e |
8/3±61/0e |
با توجه به نتایج به دست آمده از تجزیه واریانس دادهها، برهمکنش تیمارهای شوری وپیشتیمار بذرها سبب افزایش معنیدار محتوای MDA به عنوان محصول نهایی پراکسیداسیون لیپیدی غشا در بذر سرخارگل شده است (جدول 5). برشدهی این برهمکنش با استفاده از شوری نشان داد که میزان MDA در همه بسترهای شور در سطح احتمال یک درصد معنیدار شده است (جدول 3). میانگینهای به دست آمده از دادههای برهمکنش بین تیمارها نشان داد که بیشترین مقدار MDA برابر با 6 نانومول بر گرم بافت تازه مربوط به پیشتیمار با آب خالص در غلظت 150 میلیمولار کلرید سدیم بود (شکل 2). بر اساس نتایج مقایسه میانگین دادههای برهمکنش، پیشتیمار نیتریک اکسید برونزاد سبب کاهش در اکسیداسیون لیپیدهای غشای سلول و محتوای مالون دی آلدهید در بذور سرخارگل شد به طوری که بیشترین کاهش MDA (8/4 نانومول بر گرم بافت تازه) مربوط به پیشتیمار بذور با سدیم نیترو پروساید در سطح شوری زیاد (150 میلیمولار کلرید سدیم) بود (شکل 2).
در شکل 3 مشاهده میشود که در سطوح مختلف تنش شوری، مقدار پروتئین بذور سرخارگل به طور چشمگیری کاهش یافته است. کمترین میران پروتئین (2/8 میلیگرم بر گرم بافت تازه) در شوری 150 میلیمولار کلرید سدیم به دست آمد که در مقایسه با تیمار شاهد (عدم شوری) برابر با 5/22 میلیگرم بر گرم پروتئین در بافت تازه، 57 درصد کاهش داشت. استفاده از نیتریک اکسید در تمامی بسترهای شور، سبب افزایش معنیدار محتوای پروتئین برگها شد (جدول 5 و شکل 3) نتایج برشدهی با استفاده از تیمارهای شوری نشان داد که مقدار پروتئین در تمام غلظتهای شور و در بین شیوههای پیشتیمار بسیار معنیدار شده است (جدول 3). با توجه به نتایج مقایسه میانگین دادهها، مقدار پروتئین موجود در عصاره نمونههایی که با نیتریک اکسید در شرایط شور تیمار شدند نسبت به بذوری که تیمار آنها با آب خالص (سدیم نیترو پروساید صفر) بوده است، افزایش نشان داد؛ بیشترین افزایش، 76 درصد مربوط به غلظت 150 میلیمولار محلول کلرید سدیم نسبت به پیشتیمار با آب خالص بود (شکل 3).
جدول 5- نتایج تجزیه واریانس تأثیر تیمارهای آزمایشی بر ویژگیهای بیوشیمیایی مورد مطالعه. ns= عدم تفاوت معنیدار، * و **= بهترتیب معنیدار در سطح احتمال پنج و یک درصد. MDA: مالون دی آلدهید، PRO: پروتئین، SOD: آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز، POD: آنزیم پراکسیداز، CAT: آنزیم کاتالاز، APX: آنزیم آسکوربات پراکسیداز.
|
منابع تغییر |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
|||||
|
MDA |
PRO |
SOD |
POD |
CAT |
APX |
||
|
پیشتیمار |
1 |
**76/6 |
**7/698 |
**2/579 |
**05/1 |
**34/1 |
**5/499 |
|
شوری |
5 |
**37/3 |
**9/240 |
**1/478 |
**05/1 |
**5/14 |
**2/442 |
|
پیشتیمار×شوری |
5 |
**24/0 |
**5/21 |
**2/119 |
**08/0 |
**45/0 |
**8/48 |
|
خطای آزمایش |
24 |
006/0 |
84/1 |
81/0 |
00008/0 |
007/0 |
769/0 |
|
ضریب پراکندگی |
- |
2 |
7/3 |
2/1 |
4/1 |
2/2 |
1/3 |
شکل 2- اثر برهمکنش سدیم نیترو پروساید و شوری بر تغییرات مالون دی آلدهید بذر سرخارگل. مقادیر، میانگین سه تکرار ± SE (انحراف معیار) است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون LSD است.
شکل 3- اثر برهمکنش سدیم نیترو پروساید و شوری بر تغییرات پروتئین بذر سرخارگل. مقادیر، میانگین سه تکرار ± SE (انحراف معیار) است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون LSD است.
با توجه به نتایج آزمایش، غلظتهای متفاوت تنش شوری افزایش معنیداری بر فعالیت آنزیم SOD داشته است (جدول 5 و شکل 4) به طوری که با افزایش غلظت محلول کلرید سدیم به 150 میلیمولار، فعالیت این آنزیم نسبت به شرایط عدم شوری (شاهد) بهجز در غلظت 75 میلیمولار افزایش یافت (شکل 4). آمادهسازی بذور با سدیم نیترو پروساید (SNP 1/0 میلیمولار) در شرایط شور و نتایج برهمکنش آنها، افزایش فعالیت آنزیم SOD را نسبت به تیمار آب خالص نشان داد (شکل 4). نتایج برشدهی بهوسیله شوری بیانگر این است که فعالیت این آنزیم در تمام سطوح شوری به غیر از غلظت 75 میلیمولار نمک (با سطح احتمال پنج درصد) بسیار معنیدار بوده است (جدول 3). پس از ثبت بیشترین فعالیت این آنزیم (3/116 میکرومول برگرم بافت تازه) در غلظت 125 میلیمولار کلرید سدیم، فعالیت بالایی (3/110 میکرومول برگرم بافت تازه) در غلظت 50 میلیمولار کلرید سدیم به دست آمد که در مقایسه با شرایط عدم شور (شاهد) بهترتیب 5/27 درصد و 9/20 درصد افزایش داشت (شکل 4).
بر اساس نتایج به دست آمده از جدول تجزیه واریانس، برهمکنش پیشتیمار NO در غلظتهای مختلف تیمار شوری بر فعالیت آنزیم POD بسیار معنیدار بود (جدول 5). برشدهی این اثر با غلظتهای مختلف شوری گویای این است که در هر دو شیوه پیشتیمار، از نظر فعالیت این آنزیم اختلاف بسیار معنیداری وجود دارد (جدول 3). روند میانگین دادهها نشان داد که با افزایش غلظت شوری در بستر بذور سرخارگل، فعالیت آنزیم POD تا غلظت 75 میلیمولار کلرید سدیم افزایش یافت و پس از آن روند کاهش فعالیت آنزیم نسبت به شاهد (بستر غیر شور) دیده شد به طوری که کمترین فعالیت این آنزیم در بیشترین غلظت نمک کلرید سدیم (150 میلیمولار) ثبت شد (شکل 5). همچنین، NO اضافی (SNP 1/0 میلیمولار) در محیط شور موجب افزایش میزان فعالیت این آنزیم در مقایسه با پیشتیمار با آب خالص شده است به طوری که بیشینه میزان فعالیت این آنزیم (7/1 میکرومول بر گرم بافت تازه در دقیقه) در غلظت 50 میلیمولار کلرید سدیم در مقایسه با شرایط عدم شور (2/1 میکرومول برگرم بافت تازه در دقیقه) به دست آمد (شکل 5).
شکل 4- اثر برهمکنش سدیم نیترو پروساید و شوری بر فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز (SOD) در بذر سرخارگل. مقادیر، میانگین سه تکرار ± SE (انحراف معیار) است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون LSD است.
شکل 5- اثر برهمکنش سدیم نیترو پروساید و شوری بر فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD) در بذر سرخارگل. مقادیر، میانگین سه تکرار ± SE (انحراف معیار) است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون LSD است.
بر اساس یافتههای پژوهش حاضر، فعالیت آنزیم CAT در سطوح مختلف نمک کلرید سدیم روند معنیدار و معکوسی را نشان داد به طوری که با افزایش غلظت نمک، فعالیت این آنزیم در مقایسه با شاهد (صفر میلیمولار نمک) کاهش یافت (جدول 5 و شکل 6). در این آزمایش در بررسی برهمکنش غلظتهای مختلف شوری با شیوهای پیشتیمار بذرها، مشاهده شد که پیشتیمار NO برونزاد در بستر شور بذرها، نتوانست به غیر از غلظت 125 میلیمولار (افزایش اندک این آنزیم نسبت به تیمار شاهد)، فعالیت آنزیم CAT را به مانند سایر آنزیمها نسبت به پیشتیمار با آب خالص افزایش دهد (شکل 6). برشدهی بهوسیله شوری نشان داد که بهجز غلظت 100 میلی مولار نمک (عدم معنیدارشدن فعالیت آنزیم) در دیگر غلظتهای بستر شور در بین پیشتیمار بذرها اختلاف بسیار معنیدار از نظر فعالیت آنزیم CAT وجود دارد (جدول 3).
همچنین در این آزمایش، تنش شوری موجب افزایش معنیدار فعالیت آنزیم APX شده است (جدول 5 و شکل 7). علاوه بر افزایش فعالیت آنزیم APX در بستر شور بذرها، کاربرد SNP برونزاد نیز فعالیت این آنزیم را القا نمود (شکل 7)؛ برشدهی برهمکنشها به وسیله شوری نشان داد (جدول 3) که در تمامی غلظتهای نمک بهجز غلظت 75 میلیمولار، دو شیوه پیشتیمار بذرها به ایجاد اختلاف معنیدار در فعالیت آنزیم APX منجر شده است که در غلظت 100 میلیمولار با سطح احتمال پنج درصد و در سایر غلظتها در سطح احتمال یک درصد معنیدار بوده است (جدول 3). بر اساس روند مقایسه میانگین دادهها، فعالیت آنزیم APX به بیشترین مقدار خود (1/50 میکرومول برگرم بافت تازه در دقیقه) در غلظت 125 میلیمولار تیمارهای شوری رسید.
شکل 6- اثر برهمکنش سدیم نیترو پروساید و شوری بر فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) در بذر سرخارگل. مقادیر، میانگین سه تکرار ± SE (انحراف معیار) است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون LSD است.
شکل 7- اثر برهمکنش سدیم نیترو پروساید و شوری بر فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) در بذر سرخارگل. مقادیر، میانگین سه تکرار ± SE (انحراف معیار) است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون LSD است.
بحث
در پژوهش حاضر، افزایش درصد جوانهزنی بذور سرخارگل با پیشتیمار NO در سطوح بالاتر شوری میتواند نشاندهنده تأثیر مثبت NO در شوری زیاد باشد. در گزارشها بیان شده است که پیشتیمار نیتریک اکسید خارجی از یک سو با افزایش فعالیت دو آنزیم آلفاآمیلاز و بتاآمیلاز و در نتیجه تبدیل آسانتر نشاسته به قند و از سوی دیگر، از راه تأثیر بر سیستم آنتیاکسیدانی و کاهش اثر سمّی و مخرب تنش شوری سبب بهبود درصد جوانهزنی بذور در شرایط شوری میشود (Zheng et al., 2009). Amiri و همکاران (2010) در بررسی اثر شوری بر شاخصهای جوانهزنی دو گیاه دارویی سرخارگل و آرتیشو، درصد جوانهزنی این دو گیاه را به ترتیب 8 و 75 درصد در شوری 5- بار کلرید سدیم گزارش کردند. در نتایج آنها، به حساسیت سرخارگل نسبت به تنش شوری با کاهش شاخصهای جوانهزنی، رشد و زیستتوده گیاهچه تأکید شده است. Zheng و همکاران (2009) نیز در مطالعه خود در بررسی تأثیر پیشتیمار NO بر بهبود جوانهزنی بذر گندم در شرایط شور به نتایج مشابهی دست یافتند.
کاهش بنیه و شاخص جوانهزنی بذر سرخارگل در شوری زیاد ممکن است از دو راه کاهش درصد سبز گیاهچهها و درنتیجه کاهش تراکم بوته به کمتر از حد معمول و همچنین کاهش سرعت رشد گیاهچهها بر عملکرد و بازده گیاه اثر بگذارد. به علاوه، رشد گیاهچهها در محیطهای شور تحت تأثیر آثار سمیت نمک و خشکی فیزیولوژیک قرار میگیرند که اثر نامناسب بر استقرار بوتهها دارد (Farooq et al., 2006). در پژوهش حاضر، آمادهسازی بذور با دهنده NO تأثیر معنیداری بر شاخصهای جوانهزنی نداشت.
به نظر میرسد پراکسیداسیون لیپیدهای غشا در تمام سطوح شوری بررسی شده در این آزمایش و تأثیر بیشتر نیتریک اکسید بر کاهش در اکسیداسیون چربیهای غشای سلولی و درنتیجه کاهش معنیدار محتوی MDA بذرها، احتمالاً ناشی از کاهش خسارت اکسیداتیو و سالمتر ماندن غشاها در نتیجه سیستمهای آنتیاکسیدان با کارآیی بیشتر در بذور تیمار شده با NO در شرایط شوری باشد. این طور به نظر میرسد که نقش NO در جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدها، مربوط به توانایی NO در واکنش با رادیکالهای آلکوکسیل (LO) و لیپید پراکسیل (LOO) و در نتیجه، توقف زنجیره پراکسیداسیون لیپیدها باشد (Lei et al., 2007). با این حال، نقش این ماده در کاهش میزان پراکسیداسیون لیپید در مطالعات مربوط به تنش فلز سنگین کادمیوم نیز گزارش شده است Hsu and Kao, 2004)؛ Laspina et al., 2005). در مطالعات دیگر نیز به نقش حفاظتی نیتریک اکسید در برابر تنش اکسیداتیو در گیاهانی نظیر: جو (Li et al., 2008)، گندم (Zheng et al., 2009) و خیار (Shi et al., 2007) در شرایط شور اشاره شده است.
بر اساس نتایج پژوهش حاضر، میزان پروتئین در بستر شور بذرها کاهش نشان داد که این کاهش تحت تنش شوری میتواند به علت کاهش در سنتز پروتئین، تسریع پروتئولیز و واسرشت پروتئینها، اکسیداسیون آمینو اسیدها به گروههای کربونیل، افزایش نیترات، آمونیوم و آمینو اسیدهای آزاد، کاهش فعالیت آنزیمهای نیترات ردوکتاز و گلوتامین سنتتاز و تجزیه آنزیمهای درگیر در سنتز پروتئینها باشد (Moran et al., 1994؛ (Sharma and Dietz, 2009. با این وجود، استفاده از نیتریک اکسید در تمام بسترهای شور این گیاه، سبب افزایش معنیدار محتوای پروتئین برگها شد. به نظر میرسد تیمار گیاهان با SNP، نقش بهسزایی در حفاظت پروتئینها تحت تنش داشته باشد. در این پژوهش، نیتریک اکسید به عنوان یک آنتیاکسیدان مؤثر توانست با کاهش آسیبهای اکسیداتیو ناشی از شوری و القای سنتز برخی آنزیمها مانند آنزیمهای آنتیاکسیدانی، موجب تأخیر در تجزیه پروتئینها و افزایش تحمل شوری شود. نتایج به دست آمده با یافتههای Shi و همکاران (2007) در خیار و Liو همکاران (2008) در جو هماهنگی دارد.
به نظر میرسد مهمترین تأثیر تنش شوری پس از اختلال در وضعیت آب سلولی، تولید آنیونهای مخرب از جمله آنیونهای سوپر اکسید در میتوکندری سلول و خسارت اکسیداتیو باشد (Mittova et al., 2004) با این وجود، افزایش فعالیت آنزیم SOD پس از آمادهسازی بذرها با سدیم نیترو پروساید در شرایط شور و نقش NO در کاهش تنش اکسیداتیو القا شده با شوری احتمالاً میتواند مربوط به توانایی NO در القای آنزیم SOD و تبدیل یون سوپر اکسید به هیدروژن پراکسید و اکسیژن مولکولی باشد. زیرا اگر هیدروژن پراکسید تولید شده به موقع از سلول دفع نشود، آنیونهای سوپر اکسید واکنش داده، تولید رادیکال هیدروکسیل میکنند که بسیار سمّی و واکنشپذیر است (Shi et al., 2007). همچنین، NO میتواند به طور مستقیم با آنیون سوپر اکسید ترکیب شده و تولید رادیکال پراکسینیتریت (ONOO-) کند که سمّیت و خسارتهای آن به سلول بسیار کمتر از رادیکالهای اکسیژن است (Beligni and Lamattina, 2001). در این راستا، Sabra و همکاران (b2012) نیز در بررسی پاسخهای بیوشیمیایی سه گونه E. angustifolia،
E. pallida و E. purpureaدر غلظتهای مختلف نمک کلرید سدیم، افزایش فعالیت آنزیم SOD را تنها در گونه E. purpurea گزارش کردند.
در پژوهش حاضر، تیمار نیتریک اکسید در غلظت 1/0 میلیمولار توانست با دارا بودن خواص آنتیاکسیدانی و با دخالت در پاکسازی یون سوپر اکسید، تولید هیدروژن پراکسید درون سلولی را در شرایط تنش کاهش دهد و سبب افزایش فعالیت آنزیم POD شود. با این وجود، احتمال میرود NO برونزاد با تبدیل آنیون سوپر اکسید به هیدروژن پراکسید توسط آنزیم SOD، این آنیون را از سلول حذف کند و از سوی دیگر، با القای آنزیم پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز، سمّیت هیدروژن پراکسید را کاهش دهد (Kopyra and Gwozdz, 2003). در توافق با این نتایج، بسیاری از پژوهشها کارکرد NO را در کاهش تنش اکسیداتیو به القای فعالیت آنزیمهای حذفکننده رادیکالهای آزاد نسبت دادهاند (Uchida et al., 2002؛ Li et al., 2008؛ (Zheng et al., 2009. روند معنیدار و معکوس فعالیت آنزیم CAT با افزایش سطوح شوری در این آزمایش، مشابه با نتایج Sabra و همکاران (b2012) بود که در بررسی پاسخهای فیزیولوژیک و بیوشیمیایی گیاهچههای E. purpurea به کاهش فعالیت آنزیم CAT و روند معکوس فعالیت آن نسبت به فعالیت سایر آنزیمها در سطوح مختلف شوری دست یافتند. در بررسی فعالیت این آنزیم مشاهده شد که پیشتیمار سدیم نیترو پروساید به عنوان دهنده NO نتوانست فعالیت این آنزیم را مانند سایر آنزیمها نسبت به آب خالص (SNP0) افزایش دهد.
افزایش فعالیت آنزیم APX بذرها در بستر شور (Momeni et al., 2012) روند تقریباً مشابهی را با فعالیت آنزیم SOD و همچنین با نتایج Sabra و همکاران (b2012)، در بررسی اثر غلظتهای مختلف نمک کلرید سدیم (صفر، 50، 75 و 100 میلیمولار) بر فعالیت آنزیمی سرخارگل داشت که با افزایش غلظت نمک، افزایش فعالیت آنزیم APX را تأکید داشتند. SNP برونزاد فعالیت این آنزیم را نیز القا نمود که نتایج مشابه در ریشه کدو تحت تیمار شوری و ریشه لوبیا تحت تیمار کادمیوم (Kopyra and Gwozdz, 2003) و همچنین، در برگ گوجهفرنگی تحت تیمار خشکی (Nasibi et al., 2009) گزارش شده است.
نتیجهگیری
به طور کلی، با توجه به نتایج به دست آمده میتوان نتیجه گرفت که سرخارگل در مرحله جوانهزنی به تنش شوری تحمل پایینی دارد. در کنار این موضوع، بهبود درصد نهایی جوانهزنی بذر سرخارگل در تنش شوری زیاد در اثر استفاده از تأثیر سدیم نیترو پروساید به عنوان دهنده NO میتواند بیانگر افزایش نسبی تحمل در این مرحله باشد. یافتههای این آزمایش همچنین، نشان داد که آثار مثبت NO احتمالاً از راه اثر بر انباشت پروتئین، کاهش MDA و افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی گیاه اعمال شده که در نهایت توانسته سبب محافظت ساختمان غشای سلولی، کاهش آثار نامطلوب تنش و تحمل بذرهای سرخارگل در مرحله جوانهزنی در شرایط بستر شور شود. با این حال، با استناد به یافتههای به دست آمده از این پژوهش، میتوان استفاده از SNP را به عنوان دهنده NO برای بهبود آثار منفی شوری در مرحله جوانهزنی سرخارگل پیشنهاد کرد.
سپاسگزاری
نگارندگان از حمایت و مساعدت مالی دانشگاه گیلان و پژوهشکده ژنتیک و زیستفناوری کشاورزی طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، به خاطر اجرای این پژوهش سپاسگزاری مینمایند.
)
