افزایش بیان ژن‌های آسکوربات پراکسیداز و متالوتیونین تحت تنش سرما در ارقام کلزا (Brassica napus)

گونه Brassica napus گیاهی با ارزش اقتصادی قابل توجهی است که در اروپا، کانادا و ایران به مقدار زیاد کشت می‌شود. کلزا با اختصاص ۱۵ درصد کل تولید روغن گیاهی در جهان، پس از سویا و نخل روغنی، مقام سوم را در بین دانه‌ها‌ی روغنی به خود اختصاص داده است. در برخی از ارقام کلزا، بالغ بر ٤۸ درصد وزن خشک دانه را روغن گیاهی تشکیل می‌دهد. توانایی بذر گونه‌های کلزا برای جوا‌نه‌زنی و رشد در دماهای پایین موجب شده است تا این گونه به عنوان معدود گیاهانی باشد که می‌تواند در شرایط خنک، ارتفاعات بالا و مناطق معتدله کشت شود. این گیاه در مقایسه با سایر گیاهان روغنی تا مرحله آغاز گل‌دهی به دمای بالا نیاز دارد، زیرا دمای کم همزمان با خشکی سبب کوچک ماندن دانه‌ها و کاهش درصد روغن می‌شود. کلزا می‌تواند محدوده‌ وسیعی از طول دوره روشنایی را تحمل کند، به طوری که قادر است در منطقه اقیانوس منجمد شمالی با دوره‌های روشنایی روزانه ٢٤ ساعت و همچنین در مناطقی با دوره روشنایی 8-10 ساعت رشد نماید (Kimber and McGregor, 2000؛ Kole et al., 2002؛ Asghari et al., 2007). تنش سرما، شامل دماهای سرد (صفر تا 20 درجه سانتیگراد) و انجماد (دمای کمتر از صفر درجه سانتیگراد) بر رشد و نمو و بازده گیاهان زراعی تأثیر منفی دارد. به لحاظ فیزیولوژیکی برخی از آثار این نوع تنش نظیر: کاهش موقت فتوسنتز، توقف رشد سلولی و کاهش جذب آب و مواد معدنی برگشت‌پذیر هستند و با رفع دوره سرما بهبود خواهند یافت اما برخی دیگر از آثار از جمله: نقص فتوسنتز در اثر تخریب کلروپلاست‌ها، اثر بر تنفس سلولی و پیری زودرس غیرقابل برگشت هستند. دمای پایین یا تنش سرما، به عنوان یکی از مهم‌ترین عوامل محیطی در رشد و نمو گیاهان اثر می‌گذارد و تولید گیاه را محدود می‌کنند. بسیاری از گیاهان مانند گیاهان مناطق گرمسیری، توانایی زنده ماندن در دماهای پایین را ندارند. در مقابل، گیاهان علفی مناطق معتدل بسته به گونه گیاهی در دماهای انجماد در دامنه ۵- تا ٣٠- درجه سانتیگراد زنده می‌مانند Guy, 1999)؛ Orvar et al., 2000).

آسکوربات پراکسیداز (APX) یکی از آنزیم‌های آنتی‌اکسیداتیو است که به عنوان سیستم دفاعی گیاهان نقش کلیدی در برابر تنش‌های مختلف دارد. آنزیم APX یک پروتئین متصل به گروه پروستیک هِم است که در آن آهن نقش مهمی را در جایگاه کاتالیتیکی ایفا می‌کند. این آنزیم نقش مهمی را در تنظیم غلظت هیدروژن پراکسید در سلول‌ها دارد و هیدروژن پراکسید را به عنوان ماده مضر برای گیاهان تجزیه می‌کند. تجزیه آسکوربات پراکسید از مسیر آسکوربات گلوتاتیون در گیاهان صورت می‌گیرد. آسکوربات به عنوان دهنده الکترون عمل می‌کند و نقش حفاظتی در برابر تنش اکسیداتیو دارد. آنزیم‌های APX به دو صورت سیتوزولی و کلروپلاستی وجود دارد، APX کلروپلاستی خود به دو نوع متصل به غشای تیلاکوئید و استرومایی تقسیم می‌شود. این آنزیم‌ها از لحاظ اسیدیته بهینه، وزن مولکولی و سوبسترا متفاوت هستند Ishikawa et al., 1997)؛ Dąbrowska et al., 2007). مطالعات نشان داده است که عوامل متعددی مانند تجمع ایزوتیوسیانات و روی نیز می‌تواند د رتشدید تنش اکسیداتیو نقش داشته باشد و باعث القا مسیر گلوتاتیون و افزایش فعالیت آنتی‌اکسیدانی مانند آسکوربات پراکسیداز شوند Hosseini and Pourakbar, 2013)؛ Tavakoli Zanyani et al., 2013). آنزیم متالوتیونین (MTL) دارای جرم مولکولی٤ تا ۸ کیلودالتون بوده، پروتئین‌های غنی از سیستئین است که می‌تواند به فلزات متصل گردد. گزارش‌های قبلی نشان داده است که متالوتیانین در پاسخ به تنش اکسیداتیو در گیاه آرابیدوپسیس تالیانا نقش دارد. در تنش‌هایی چون سرما، خشکی و شوری بیان ژن Mtl القا می‌شود، به ویژه تحت تنش سرما، میزان H₂O₂ افزایش می‌یابد که در این حالت محصول ژن Mtl، H₂O₂ را پاکسازی کرده، باعث حفاظت گیاه می‌شود (Lanfranco et al., 2002). این پروتئین قابلیت اتصال به یون‌های فلزی فیزیولوژیک نظیر روی و مس را دارد همچنین می‌تواند از طریق بنیان‌های تیول با اتصال به فلزات سنگین با منشأ خارجی احتمالاً در تحمل سمّیت فلزات نیز مؤثر باشد (Perales-Vela et al., 2006). برای دستیابی به کمّیت پروتئین متالوتیونین از دو روش می‌توان استفاده کرد بدین ترتیب که در صورت در دسترس بودن پادتن اختصاصی از طریق سنجش الیزا و در صورت تعیین دقیق ساختار و درصد محتوای سیستئین آن از طریق سنجش میزان گلوتاتیون کاهیده در حضور 5 و 5- دی تیو بیس -2- نیترو بنزوییک اسید می‌توان استفاده کرد (Tanguy et al., 2002). در پژوهش حاضر، فعالیت آنزیم APX2 و میزان بیان ژن‌های Apx2 و Mtl در دو رقم کلزای مقاوم و حساس به سرما بررسی شده است.

مواد و روش‌ها

مواد گیاهی: دو رقم SLMO46 (مقاوم به سرما) و Quantum (حساس به سرما) از دانشکده کشاورزی دانشگاه محقق اردبیلی تهیه گردید (Asghari et al., 2007). بذر این ارقام در دمای ٣۷ درجه سانتیگراد جوانه زده، در شرایط گلخانه‌ای در گلدان‌های مجزا و در چهار تکرار کشت داده شدند و در مرحله‌ شش تا هشت برگی (پنج هفته)، نمونه‌های شش برگی شاهد پس از انجماد در ازت مایع به فریزر با دمای ۸٠- درجه سانتیگراد منتقل گردید. نمونه‌های شش برگی گروه تیمار به مدت ٢٤ ساعت تحت تنش سرما (٢- درجه سانتیگراد) قرار گرفت و برگ‌های تیمار شده نیز برای مطالعات مولکولی پس از انجماد در ازت مایع در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری گردید.

.سنجش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز: برگ‌های تازه نمونه‌های شاهد و تیمار از هر دو رقم، با وزن 10 میلی‌گرم در آون چینی سرد همراه با خرده شیشه و بافر Tris-HCL (50 میلی‌مولار با اسیدیته برابر با 8/7) له شدند. پس از سانتریفیوژ (مدل 5415R، شرکت eppendorf، ساخت آلمان) به مدت 20 دقیقه با سرعت 12000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد، فاز رویی جمع‌آوری و برای سنجش فعالیت آنزیمی به کار گرفته شد. فعالیت آنزیمی در حضور 50 میلی‌مولار بافر سدیم فسفات سرد (اسیدیته=7)، 5/0 میلی‌مولار آسکوربات، 1/0 میلی‌مولار پراکسید هیدروژن و 1/0 میلی‌مولار EDTA در حجم نهایی 3/0 میلی‌لیتر ارزیابی شد. با افزودن پراکسید هیدروژن فعالیت آنزیمی آغاز شد و جذب نمونه در طول موج 290 نانومتر در فاصله‌های زمانی 40 ثانیه ثبت شد و نتایج در ضریب خاموشی مولی mmol^-1 cm^-1 8/2 ضرب شده، فعالیت آسکوربات پراکسیداز به دست آمد (Braga et al., 2009).

.طراحی آغازگر: با استفاده از توالی ژن‌های Apx2 و Mtl که در بانک ژنی (NCBI) ثبت شده بود و از طریق هم‌ردیف‌سازی ژن‌ها و تشخیص نواحی حفاظت شده، آغازگرهای مورد نظر طراحی گردید. ژن آکتین گیاهی به عنوان شاهد در نظر گرفته شد (جدول ۱).

جدول ١- مشخصات آغازگرهای طراحی شده. F: توالی رفت، R: توالی برگشت

استخراج RNA:RNA تام برگ‌های گیاه شاهد و گیاه تیمار حاصل از سه تکرار هر دو رقم با استفاده از کیت RNX-Plus (سیناژن-ایران) و مطابق دستورالعمل شرکت سازنده آن استخراج گردید. RNA تام حاصل توسط دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج‌های ٢٦٠ و ٢۸٠ نانومتر از نظر کمّیت و کیفیت ارزیابی سپس روی ژل آگاروز یک درصد بررسی شد.

سنتز cDNA: برای سنتز cDNA، ٦ میکروگرم از RNA تام به عنوان الگو تحت واکنش RT-PCR قرار گرفت. این واکنش شامل: 01/0 مولار DTT، ۵/٠میکروگرم oligo(dt)₁₈، 5/0 میلی‌مولار dNTPs (سیناژن- ایران)،٢٠ واحد مهار کننده‌ RNase و ٢٠٠ واحد آنزیم M-Mulv-RT (هر دو از شرکت فرمنتاز-آلمان) در حجم نهایی ٢٠ میکرولیتر به اجرا در آمد (Zahri et al., 2005). مخلوط الگو و آغازگرها تا ۷٠ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه تیمار و به سرعت سرد شد، سپس سایر واکنشگرها اضافه شده، به ترتیب در دمای ٤٢ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه، ٣۷ درجه سانتیگراد به مدت ۷۵ دقیقه و در نهایت، ۷٢ درجه سانتیگراد به مدت ١٠ دقیقه تیمارگردید. این واکنش در سه تکرار و به همراه یک واکنش فاقد آنزیم نسخه‌بردار معکوس (برای بررسی آلودگی DNA) انجام گرفت. بدین ترتیب، زنجیره‌ نخست cDNA سنتز و به عنوان الگوی PCR به کار گرفته شد.

مطالعه کمّی بیان ژن‌های هدف: واکنش
PCR real time با استفاده از الگوی زنجیره اولیه cDNA حاصل از سه تکرار و کیت PCR SYBER GREEN I kit (شرکت Qiagen، ساخت آمریکا) در دو مرحله و با دستگاه Rotor gene RG-3000 (شرکت Corbett Research، ساخت استرالیا) برای تکثیر ژن‌های Apx2، Mtl و Act انجام شد. واکنش qPCR طی یک برنامه دو مرحله‌ای شامل ٩٥ درجه سانتیگراد به مدت ٥ دقیقه و مرحله دوم شامل ٩٥ درجه سانتیگراد به مدت ٥ ثانیه و ٥٠ درجه سانتیگراد به مدت٣٠ ثانیه انجام شد. داده‌های حاصل از چرخه آستانه تکثیر (Noctor and Foyer, 1998) با روش ارزشیابی 2^-∆∆CT به عنوان شاخص میزان بیان نسبی ژن‌ها و طی رابطه 1 بررسی شد (Livak and Schmittgen, 2001). در این رابطه، target، act و Ct به ترتیب نشان دهنده ژن هدف، ژن شاهد (آکتین) و چرخه آستانه است. در این روش، میزان بیان ژن‌های Apx2 و Mtl بر اساس ژن آکتین به عنوان ژن خانه‌دار با بیان ثابت نرمال گردید.

رابطه 1:

∆∆CT= [(Ct _target-Ct _act)_{time x}-(Ct _target-Ct _act) _{time 0}].

برای ارزیابی واکنش تکثیر، از بررسی منحنی ذوب محصول و سپس الکتروفورز در سطح آگاروز استفاده شد. در پایان واکنش qPCR، با افزایش تدریجی دما از 55 تا 95 درجه سانتیگراد و ثبت مستمر کاهش فلورسنس ناشی از افتراق دو رشته DNA، منحنی ذوب حاصل می‌شود. در پایان، محصول حاصل از طریق تعیین توالی تأیید گردید.

نتایج

نتایج حاصل از سنجش فعالیت آنزیمی آسکوربات پراکسیداز در هر دو رقم SLMO46 و Quantum نشان دهنده افزایش قابل توجه در فعالیت آسکوربات پراکسیدازی استخراج بافت گیاه بود. به طوری که طی تنش سرما در ارقام SLMO46 و Quantum این فعالیت به ترتیب از 1 به 7/1 و از 9/0 به 5/1 واحد در ۱۰ میلی‌گرم برگ افزایش نشان داد، به عبارت دیگر تنش به افزایش تقریبی 60 درصدی در فعالیت آنزیمی عصاره برگ منجر گردیده است (شکل ۱).

شکل ۱- مقایسه تغییر فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز تحت تنش انجماد در دو رقم Quantum و SLMO46 که نشان دهنده افزایش معنی‌دار در فعالیت آنزیمی در نمونه‌های تیمار نسبت به شاهد. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± StD است، حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح P<0.05 است.

برای بررسی کمّی بیان ژن‌های Apx2 و Mtl به عنوان ژن‌های دخیل در مقاومت گیاه به تنش، RNA تام استخراج شده، پس از ارزیابی کمّی وکیفی هدف بررسی در qPCR قرار گرفت. پیش از آنالیز داده‌های حاصل از واکنش PCR برای بررسی میزان اختصاصی بودن محصول، پیک ذوب آن مشخص گردید. نشانگر پیک اختصاصی آکتین، apx و Mtl به ترتیب در 87، 86 و 89 درجه سانتیگراد بسته محتوای GC بود. این نتایج با بررسی در سطح ژل الکتروفورز تأیید گردید. نوار حاصل از تکثیر cDNA ژن‌های Mtl، Apx2 و Act به ترتیب برابر با حدود 200، 600 و 300 جفت باز بود.

طیف کمّی حاصل از چرخه آستانه تکثیر ژن‌های Apx2 و Mtl در مقایسه با ژن شاهد (آکتین)، نشان‌دهنده افزایش میزان الگوی mRNA ژن‌های مرتبط با تنش در هردو رقم بود. بدین منظور، مقادیر Ct، CtΔΔ و 2^-ΔΔCt برای هر یک از ژن‌ها محاسبه گردید. این داده نشان داد که در مقیاس 2^-ΔΔCt، میزان افزایش بیان ژن Apx2 در ارقام Quantum و SLMO46 به ترتیب برابر با 81/1 و 14/2 است در حالی که میزان بیان ژن Mtl به ترتیب 2/5 و 18/9 است (شکل ۲). بررسی نمودار استانداردهای واکنش نشان‌دهنده دقت خط حاصل در R2>98% بود. میزان انحراف استاندارد ∆Ct شش گروه آزمایشی شامل گروه‌های تیمار و شاهد برای سه ژن Mtl، Apx2 و آکتین بین 07/0 تا 7/1 محاسبه گردید. اعمال تنش سرما در هر دو رقم کلزا باعث افزایش قابل توجه بیان ژن‌های Apx2 و Mtl گردید اما در نمونه مقاوم میزان بیان ژن Mtl افزایش قابل توجهی نشان داد، به ویژه در رقم Quantum با ضریب 3/9 افزایش نشان داد که احتمالاً نقش برجسته‌ای در مکانیسم مقاومت این گیاه دارد.

شکل ۲- نتایج حاصل از بررسی کمّی بیان ژن‌ها آسکوربات پراکسیداز (Apx2) و متالوتیونین (Mtl) که نشان دهنده افزایش قابل توجه در بیان هر دو ژن طی تنش انجماد بود. افزایش قابل توجه در بیان ژن متالوتیونین به ویژه در رقم SLMO4 ثبت گردید. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± STD است، حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح P<0.05 است.

بحث

گونه فعال اکسیژن مانند رادیکال‌های آزاد اکسیژن و رادیکال‌های هیدروکسید در گیاهانی که تحت تنش‌های مختلف قرار می‌گیرند انباشته شده، به آسیب سلولی منجر می‌شوند. در گیاهان، مکانیسم‌های تجزیه گونه فعال اکسیژن متشکل از دو سیستم دفاعی آنزیمی و غیرآنزیمی است (Xiong et al., 2002). آنزیم APX نقش مهمی در تنظیم غلظت هیدروژن پراکسید در سلول‌های گیاهی ایفا می‌کند. APX آنزیمی کلیدی در چرخه‌ آسکوربات گلوتاتیون است که به تجزیه هیدروژن پراکسیداز منجر می‌شود. به نظر می‌رسد که القای بیان ژن Apx طی مرحله ابتدایی تنش اکسیداتیو نقش مهمی در حذف H₂O₂ و به حداقل رساندن خطرات اکسیداتیو نوری دارد. پیشنهاد شده است که عملکردهای H₂O₂ به عنوان پیامبر ثانویه در سلول‌های گیاهی که در معرض تنش‌های محیطی مثل سرما قرار گرفته اند عمل می‌کند. میزان بیان ژن‌های Apx در گیاهانی نظیر اسفناج و توت‌فرنگی که در معرض تنش سرما قرار گرفته‌اند افزایش می‌یابد (Noctor and Foyer, 1998؛ (Yong et al., 2008. گیاه برنج دارای دو رقم مقاوم به سرما (Xiangnuo-1) و حساس به سرما (IR-50) است. بیان ژن Apx در رقم مقاوم به سرما مشابه نمونه گیاهی در شرایط کنترل است اما در رقم حساس به سرما بیان ژن کاهش می‌یابد (Huang and Guo, 2005). بررسی بیان ژن Apx2 در برگ گیاه کلزا در رقم‌های مقاوم و حساس به سرما نتایج معناداری نشان می‌دهد، به طوری که بیان ژن Apx2 در رقم SLMO46 نسبت به رقم Quantum افزایش قابل توجهی نشان داد. دمای پایین، خشکی، شوری و عوامل ویژه نظیر: کمبود آب، پرتو اشعه فرابنفش، مکانیسم فشار، تنش شوری، دمای بالا و ... تنش‌های متداولی هستند که ﺗﺄثیرات منفی بر رشد و تولید محصولات زراعی می‌گذارد. تنش سرما در گیاه آرابیدوپسیس تالیانا به افزایش محصول گونه فعال اکسیژن منجر شده، به دنبال آن تنش اکسیداتیو باعث اختلال در متابولیسم سلول می‌شود Lanfranco et al., 2002)؛ Xiong et al., 2002). از سوی دیگر، یافته‌ها نشان داده است که که میزان رونویسی mRNA ژن متالوتیونین در گیاه آرابیدوپسیس پس از قرار گرفتن در دمای پایین افزایش می‌یابد که به افزایش در فعالیت آنزیم کاتالاز منجر می‌شود (Braga et al., 2009)‌. در برنج نیز نوعی متالوتیونین Mtl)Os) شناسایی شده است که به دنبال تنش اکسیداتیو میزان بیان آن افزایش می‌یابد (Zhu et al., 2009). بر اساس داده‌های موجود، به موازات افزایش تنش سرما در ارقام SLMO46 و Quantum علاوه بر تشدید بیان ژن Apx2، افزایش قابل توجهی در بیان ژن Mtl روی می‌دهد. پژوهش‌های پیشین نشان داده است که رقم SLMO46 نسبت به رقم Quantum در مقابل تنش سرما بسیار مقاوم است (Asghari et al., 2007). داده‌های حاصل از پژوهش حاضر نیز نشان دهنده میزان بالای بیان Mtl در رقم SLMO46 نسبت به رقم Quantum بود، به طوری که میزان ژن Mtl در رقم مقاوم به سرمای کلزا حدود دو برابر آن در رقم حساس است. این یافته‌ها و داده‌های قبلی، شاهد مهمی بر نقش ضد تنشی مسیرهای بیوشیمیایی آسکوربات پراکسیداز و متالوتیونین در گیاهان است؛ با وجود این، بیان بالای ژن‌های تنشی به ویژه Mtl در رقم SLMO46 می‌تواند با مقاومت بیشتر آن به تنش انجماد مرتبط ‌باشد.

سپاسگزاری

نگارندگان از معاونت پژوهشی و تحصیلات تکمیلی دانشگاه محقق اردبیلی به خاطر تأمین هزینه اجرای این پژوهش سپاسگزاری می‌نمایند.