بررسی محتوای ترکیبات آنتی‌اکسیدانی گیاه Isatis cappadocica در سطوح مختلف آرسنیک و فسفر

آرسنیک یک شبه فلز سمّی و غیرضروری برای گیاهان است که از طریق منابع طبیعی (فعالیت‌های زمین‌شناسی و آتشفشان‌ها) و منابع مصنوعی (استفاده از حشره‌کش‌ها، علف‌کش‌ها و غیره) محیط زیست را آلوده می‌کند (Gunes et al., 2009). انسان از طریق فعالیت‌های معدن‌کاری در مناطق آلوده و مصرف آب آشامیدنی و مواد غذایی آلوده به آرسنیک در معرض این سمّ خطرناک قرار می‌گیرد (Zhao et al., 2009). اگرچه آلودگی آرسنیک بیشتر متعلق به کشورهای جنوب شرقی آسیا است ولی در مناطقی از ایران (استان‌های کردستان و خراسان) نیز آلودگی خاک و آب به این آلاینده گزارش شده است (Karimi et al., 2010).

آرسنیک و فسفر هر دو متعلق به گروه پانزده جدول تناوبی عناصر شیمیایی هستند که به دلیل ویژگی‌های شیمیایی مشابه، رفتار مشابهی در خاک و گیاهان دارند (Lihong and Guilan, 2009). بنابراین، بررسی دقیق اثر متقابل آرسنیک و فسفر در فرآیندهای جذب و انتقال آنها در گیاهان می‌تواند اطلاعات مفیدی را در ارتباط با مکانیسم‎های سازگاری و مقاومت به غلظت‌های مختلف آرسنیک فراهم ‎کند.

فلزات سنگین یا به طور مستقیم از طریق واکنش هابر-وییز یا به طور غیر مستقیم باعث تولید انواع گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) و در نتیجه ایجاد تنش اکسیداتیو در گیاهان می‌شوند (Mithofer et al., 2004). مکانسیم‌های غیر مستقیم شامل تأثیر متقابل فلزات با سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی خود گیاهان است (Srivastava et al., 2004) که می‌تواند بر اثر اختلال در زنجیره انتقال الکترون (Qadir et al., 2004) یا
بر هم خوردن متابولیسم عناصر ضروری رخ دهد (Dong et al., 2006). یکی از آثار آرسنیک در گیاهان، تولید ROS است (Hartley-Whitaker et al., 2001). شواهد نشان می‌دهند که فعالیت انواع ROS سبب بروز خسارات فراوان از جمله پراکسیداسیون لیپیدها، اکسیداسیون پروتئین‌ها، بی رنگ شدن کلروپلاست‌ها و رنگدانه‌ها می‌گردند Herbinger et al., 2002)؛ (Mittler, 2002. گیاهان برای مقابله با تنش‌های اکسیداتیو دارای یک سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانی با کارآیی بالا شامل آنزیم‌ها و ترکیبات آنتی‌اکسیدانی نظیر کاروتنوئید، فلاونوئید و آنتوسیانین هستند که می‌تواند رادیکال‌های آزاد را خنثی یا جاروب نماید (Hosseini and Pourakbar, 2013). یکی از صدمات اکسیداتیو مهم، تخریب مولکول کلروفیل است. به دنبال این تخریب، گیاه رنگی به نظر می‌رسد که دلیل آن افزایش و قابل مشاهده شدن رنگیزه‌های محافظ مانند کاروتنوئیدها (گزانتوفیل، کاروتن و لیکوپن) و آنتوسیانین است (Chalker-Scott, 2002). کاروتنوئیدها در این شرایط قادرند انرژی زیاد طول موج‌های کوتاه را گرفته، اکسیژن یک‌تایی را به سه‌‌تایی تبدیل کرده و با گرفتن رادیکال‌های اکسیژن تولید شده، نقش آنتی‌اکسیدانی خود را ایفا کنند (Inze and Montagu, 2000). ترکیبات فنلی شامل گروه بزرگی از متابولیت‌های ثانویه هستند که بسیاری از ترکیبات حلقوی نظیر ترکیب‌های فنل، فلاونوئیدها، کاروتنوئیدو آنتوسیانین و حتی آمینو اسیدهای حلقوی مثل تریپتوفان، تیروزین و پرولین را شامل می‌شوند. این ترکیب‌ها دارای نقش‌های متعدد اکولوژیکی و فیزیولوژیکی نظیر نقش‌های دفاعی و آنتی‌اکسیدانی هستند (André et al., 2009). فلاونوئیدها می‌توانند از تنش‌های اکسیداتیو جلوگیری کنند، بدین معنا که توان پاک‌سازی انواع گونه‌های فعال اکسیژن را دارند. آنتوسیانین‌ها نیز مشابه فلاونوئیدها، رنگیزه محافظ هستند که گیاه را در برابر تنش محافظت می‌کنند (Chalker-Scott, 2002). گزارش شده است که محتوای آنتوسیانین تحت شرایط تنش اکسیداتیو افزایش می‌یابد، این افزایش به علت نقش حفاظت نوری آنتوسیانین به وسیله حذف مستقیم گونه‌های فعال اکسیژن طی تنش اکسیداتیو است (Zhang et al., 2010).

اخیراً گیاهIsatis cappadocicaبه عنوان یک گیاه بیش انباشتگر آرسنیک معرفی شده و نشان داده شده است که تحت شرایط آزمایشگاهی این گیاه به عنوان نخستین بیش انباشتگر آرسنیک در گیاهان نهان‌دانه است که می‌تواند غلظت بالایی از آرسنیک را در اندام‌های هوایی خود انباشت کند (Karimi et al., 2009). این گیاه بومی غرب کشور ایران است و می‌تواند به عنوان یک گیاه بیش انباشتگر آرسینک در فرآیند گیاه‌پالایی مناطق آلوده غرب کشور مورد استفاده قرار گیرد. با توجه به اثر متقابل فسفر و آرسنیک در جذب و متابولیسم هر یک از آنها در گیاهان و کارآیی بسیار زیاد گیاه I. cappadocica در انباشت آرسنیک، بررسی محتوای ترکیبات آنتی‌اکسیدانی آن در غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر می‌تواند پژوهشگران را در پیشبرد بهتر مطالعات مکانیسم‌های مقاومت در این گیاه یاری کند. لذا، مطالعه حاضر به منظور بررسی مکانیسم بخش غیر آنزیمی دفاع آنتی‌اکسیدانی گیاه I. cappadocica در شرایط رشد در محیط‌های حاوی غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر انجام شد.

مواد و روش‌ها

کشت گلدانی: بذرهای گیاه I. cappadocica از منطقه معدنی آلوده به آرسنیک زرشوران در استان آذربایجان غربی جمع‌آوری گردید. ابتدا بذرهای گیاه با سدیم هیپوکلریت 1 درصد ضد عفونی و سپس با آب مقطر شستشو شدند. بذرهای استریل شده در داخل گلدان‌هایی که از قبل با پرلیت و ماسه به نسبت 2 به 1 پُر شده بودند قرار گرفت، سپس گلدان‌ها به گلخانه دانشگاه رازی، با شرایط محیطی نیمه کنترل شده شامل دمای متناوب 18 تا 25 درجه سانتیگراد (شب و روز)، رطوبت نسبی 45 درصد، تناوب نوری 16 ساعت نوری و 8 ساعت تاریکی و شدت نوری حدود 150 میکرومول فوتون در متر مربع، انتقال داده شدند. پس از جوانه‌زنی، گلدان‌ها هر هفته دو بار با محلول غذایی تغییر یافته هوگلند 50 درصد با pH برابر با 6 تغذیه شدند که ترکیب آن عبارت بود از: 5/0 میلی‌مولار KNO₃، 75/0 میلی‌مولار Ca(NO₃)₂، 2/0 میلی‌مولار MgSO₄، 15 میکرومولار H₃BO₃، 2 میکرومولار MnCl₂، 1 میکرومولار ZnSO₄، 5/0 میکرومولار CuSO₄، 50 میکرومولار FeEDTA، 2/0 میکرومولار.NaMoO₄ پس از رسیدن به مرحله چهار برگی، گلدان‌ها به گروه‌های سه گلدانی (هر تیمار، سه تکرار) تقسیم شدند و به مدت 4 هفته، هر هفته دو بار به آنها تیمارهای 0، 50، 200، 800 و 1200 میکرومولار آرسنات (Na₂HASO₄) و 5، 50، 200، 800 و 1600 میکرومولار فسفات (KH₂PO₄) اضافه شد. پس از اتمام زمان تیمار، گیاهان از درون گلدان‌ها بیرون آورده شد و بخش هوایی آنها جدا و به منظور انجام مراحل بعدی، جمع‌آوری گردید.

اندازه‌گیری محتوای کاروتنوئید: برای تعیین محتوای کاروتنوئید در نمونه‌ها، مقدار 2/0 گرم از بافت تر برگ با استون 80 درصد ساییده شد. سپس، حجم محلول با استون به 20 میلی‌لیتر رسید. محلول به دست آمده به مدت 10 دقیقه با سرعت 4000 دور و در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ گردید. پس از آن، جذب محلول رویی به وسیله دستگاه اسپکترفتومتر (مدل Bausch & Lomb 70، آمریکا) در طول موج 470 نانومتر ثبت گردید. در نهایت، به منظور محاسبه کاروتنوئید از رابطه 1 استفاده گردید:

رابطه 1:   میزان کاروتنوئید=

.اندازه‌گیری محتوای فلاونوئید و آنتوسیانین: برای اندازه‌گیری میزان فلاونوئید و آنتوسیانین از روش Nogués و Baker (2000) استفاده گردید. به این ترتیب که مقدار 5/0گرم از بافت تر را در 5 میلی‌لیتر متانول اسیدی (شامل الکل متیلیک 5/99 درصد و هیدرو کلریک اسید خالص به نسبت 99 به 1) به خوبی ساییده و سپس محلول همگن حاصل را به مدت 30 دقیقه با سرعت 4000 دور و در دمای 4 درجه سانتیگراد، سانتریفیوژ شد و جذب عصاره بالایی توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج‌های 300 و 520 نانومتر به ترتیب برای فلاونوئید و آنتوسیانین ثبت شد. مقدار آنتوسیانین از رابطه A=ebc به دست آمد. در این رابطه، A: شدت جذب، b: عرض کووت برابر با 1 سانتی‌متر، c: غلظت آنتوسیانین (مول بر گرم) و
:e ضریب خاموشی برابر با mol^-1 Cm^-1 33000 است. همچنین، میزان فلاونوئید با استفاده از رابطه 2 بر حسب درصد محاسبه گردید (V= حجم عصاره).

رابطه 2:   Fla = (OD₃₀₀ nm) V/700 ´ 100

.اندازه‌گیری محتوای پراکسید هیدروژن(H₂O₂): برای تعیین محتوای پراکسید هیدروژن، از روش Sergiev و همکاران (1997) با اندکی تغییر استفاده شد. 2/0 گرم از بافت برگی با 3 میلی‌لیتر تری کلرو استیک اسید 1/0 در هاون چینی ساییده شد و عصاره حاصل در 12000 دور، به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ گردید. سپس، 5/0 میلی‌لیتر از مایع رویی برداشته و به 5/0 میلی‌لیتر بافر فسفات 2/0 مولار و 1 میلی‌لیتر یدید پتاسیم 1 مولار اضافه شد. جذب مخلوط ذکر شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 390 نانومتر خوانده شد و در نهایت میزان H₂O₂ با استفاده از ضریب خاموشی Mm^-1 cm^-1 28 محاسبه و به صورت میکرومول بر گرم وزن تر بیان گردید.

اندازه‌گیری میزان آرسنیک: برای اندازه‌گیری غلظت آرسنیک کل در نمونه‌های گیاهی از روش Meharg و Jardine (2003) استفاده شد. به 2/0 گرم از نمونه‌های خشک برگی، 1 میلی‌لیتر نیتریک اسید غلیظ اضافه گردید. پس از نگهداری مخلوط حاصل به مدت 24 ساعت در دمای اتاق، 1 میلی‌لیتر آب اکسیژنه اضافه شد. در مرحله بعد، لوله‌های آزمایش در بن ماری با دمای 70 درجه سانتیگراد، به مدت نیم ساعت قرار گرفتند. سپس به دمای 100 درجه سانتیگراد، یک ساعت تا بخار شدن کل نیتریک اسید موجود در نمونه، منتقل شدند. پس از سرد شدن، محلول حاصل صاف گردید و با آب مقطر به حجم 50 میلی‌لیتر رسید. سپس، به 1 میلی‌لیتر از محلول رقیق شده هر یک از نمونه‌ها 5 میلی‌لیتر کلریدریک اسید 10 درصد، 5 میلی‌لیتر یدید پتاسیم 10 درصد و 5 میلی‌لیتر آسکوربیک اسید 5 درصد اضافه گردید. در نهایت، آرسنیک موجود در نمونه‌ها به وسیله دستگاه طیف‌سنج جذب اتمی (مدل Shimadzu, 6200، شرکت Shimadzu، ژاپن) به همراه تولید هیدرید (دستگاه تولید هیدرید، مدل FIG 100، شرکت Shimadzu، ژاپن) اندازه‌گیری شد.

اندازه‌گیری میزان فسفر: برای سنجش فسفر از روش خاکستر خشک استفاده گردید. بدین منظور، به 5/0 گرم ماده خشک گیاهی 2 میلی‌لیتر نیتریک اسید (1:2) اضافه شد و پس از صاف کردن با آب مقطر به حجم 100 میلی‌لیتر رسید. از محلول به دست آمده، 25 میلی‌لیتر برداشته و به بالن ژوژه 50 میلی‌لیتری انتقال داده شد. با توجه به pH اسیدی نامشخص محلول، با اضافه نمودن آمونیاک (1:1)، pH به 8/7 رسانده شد. پس از خنثی شدن محلول با اضافه کردن نیتریک اسید (1:2)، pH در محدوده 5/1 تا 2 تنظیم شده، سپس با افزودن 15 میلی‌لیتر معرف آمونیوم وانادات، پس از تشکیل کمپلکس زرد رنگ، حجم محلول با آب مقطر به 50 میلی‌لیتر رسانده شد. سپس، مقدار جذب هر محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 450 نانومتر ثبت گردید. به کمک منحنی حاصل از مقدار جذب محلول‌های استاندارد (دی هیدروژن فسفات پتاسیم)، غلظت فسفر در نمونه‌های گیاهی سنجش شد.

تحلیل داده‌ها: آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب بلوک کامل تصادفی با سه تکرار انجام شد. تحلیل داده‌های حاصل از مراحل مختلف این تحقیق با نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 16 صورت گرفت. همچنین برای مقایسه میانگین‌ها، از آزمون دانکن استفاده گردید و نمودارها توسط نرم‌افزار Excel ترسیم شدند.

نتایج

.تأثیر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر میزان وزن خشک بخش هوایی: میزان وزن خشک در غلظت‌های مختلف آرسنیک (به جز تیمار 1200 میکرومولار) روند کاهشی محسوسی نداشت که این امر بیانگر مقاومت بالای گیاه در مقابله با تنش آرسنیک است. بیشترین میزان وزن خشک بخش هوایی در مقایسه با سایر تیمارها، تیمار 50 میکرومولار آرسنیک و 1600 میکرومولار فسفر بود که 52/2 برابر کمترین میزان، مربوط به تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر بود. در تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر، کاهش محسوسی در میزان وزن خشک بخش هوایی مشاهده نشد به طوری که با سایر تیمارها اختلاف معنی‌داری داشت. از سوی دیگر، با افزایش غلظت فسفر، روند افزایشی در میزان وزن خشک بخش هوایی مشاهده شد (شکل 1).

.میزان انباشت آرسنیک در بخش هوایی، تحت تأثیر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر: با اعمال تیمارها، میزان فلز تجمع یافته بین حداقل 0965/2 (تیمار 0 میکرومولار آرسنیک، 50 میکرومولار فسفر) و حداکثر 937/700 میلی‌گرم در کیلوگرم وزن خشک (تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر) متغیر بود. غلظت آرسنیک تجمع یافته در تیمارهای 1200 میکرومولار آرسنیک، افزایش معنی‌داری نسبت به سایر تیمارها داشت (شکل 2). در سطوح پایین فسفر (5 و 50 میکرومولار) میزان آرسنیک تجمع یافته نسبت به سایر تیمارها بیشتر بود اما به دنبال افزایش سطوح فسفر، میزان تجمع آرسنیک کاهش یافته است که این امر می‌تواند به دلیل افزایش رقابت و اثر متقابل بین این دو عنصر باشد. علت وجود مقادیر اندک آرسنیک در تیمارهای فاقد آرسنیک، نشان دهنده خطای آزمایش در مراحل مختلف شامل آبیاری، برداشت و عصاره‌گیری است.

.میزان تجمع فسفر در بخش هوایی، تحت تأثیر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر: میزان فسفر تجمع یافته در بخش هوایی گیاه بین حداقل 62/16 (تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک، 5 میکرومولار فسفر) و حداکثر 31/123 میلی‌گرم برکیلوگرم وزن خشک (تیمار 0 میکرومولار آرسنیک، 1600 میکرومولار فسفر) متغیر بوده است. با افزایش غلظت آرسنیک (Mµ 200£)، میزان جذب و تجمع فسفر روند کاهشی یافت. از سوی دیگر، در سطوح بالای فسفر (Mµ 50£) به موازات افزایش غلظت آرسنیک در هر تیمار، میزان تجمع فسفر به طور محسوسی کاهش پیدا کرده است. این کاهش در غلظت‌های 800 و 1200 میکرومولار آرسنیک با شدت بیشتری صورت گرفته است به نحوی که با سایر تیمارها اختلاف معنی‌داری داشت (شکل 3).

.تأثیر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای پراکسید هیدروژن: بیشترین میزان پراکسید هیدروژن در مقایسه با سایر تیمارها، تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک، 5 میکرومولار فسفر با 9285/18 میکرومول بر گرم وزن تر است که 3/5 برابر کمترین میزان، مربوط به تیمار 0 میکرومولار آرسنیک، 50 میکرومولار فسفر است (شکل 4). محتوای پراکسید هیدروژن بخش هوایی تحت اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک، دارای روند افزایشی در تیمارهای 50، 200، 800 و 1200 میکرومولار است، به نحوی که در تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر، محتوای پراکسید هیدروژن 82/4 برابر تیمار
0 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر است. اما با افزایش سطوح فسفر، این روند افزایشی کاهش یافته به طوری که کاهش میزان پراکسید هیدروژن در تیمارهای 50، 200، 800 و 1600 میکرومولار محسوس است.

.تأثیر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای کاروتنوئید: با توجه به شکل 5، به موازات افزایش غلظت آرسنیک به ویژه در تیمارهای بالاتر از 50 میکرومولار محتوای کاروتنوئیدروندی افزایشی پیدا کرده، اما با افزایش سطوح فسفر، این روند افزایشی به طور نسبی رو به کاهش رفته است به طوری که کاهش نسبی محتوای کاروتنوئید در تیمارهای 50، 200، 800 و 1600 میکرومولار (به جز در تیمار 50 میکرومولار آرسنیک، 50 میکرومولار فسفر، 200 میکرومولار آرسنیک، 200 میکرومولار فسفر و 800 میکرومولار آرسنیک، 1600 میکرومولار فسفر) مشهود است. بیشترین میزان کاروتنوئید در مقایسه با سایر تیمارها، مربوط به تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر است که 66/1 برابر کمترین میزان، متعلق به تیمار 200 میکرومولار آرسنیک و 1600 میکرومولار فسفر است.

تأثیر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای فلاونوئید: همان طور که در شکل 6 ملاحظه می‌شود، بیشترین محتوای فلاونوئید در بخش هوایی مربوط به تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک، 5 میکرومولار فسفر با میزان 014/4 درصد و کمترین آن متعلق به تیمار 0 میکرومولار آرسنیک، 1600 میکرومولار فسفر با میزان 97/1 درصد است. محتوای فلاونوئید در اکثر تیمارها به موازات افزایش غلظت آرسنیک، افزایش یافته و به دنبال آن با افزایش سطوح فسفر در هر کدام از تیمارها ( به جز تیمارهای 200 میکرومولار آرسنیک، 800 میکرومولار فسفر و 800 میکرومولار آرسنیک، 800 میکرومولار فسفر)، روند کاهشی پیدا کرده است، به نحوی که افزایش غلظت فسفر در محیط تا حدودی توانسته محتوای فلاونوئید گیاه را در غلظت‌های پایین آرسنیک (کمتر از 1200 میکرومولار) کاهش دهد.

.تأثیر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای آنتوسیانین: در تیمارهای اعمال شده، محتوای آنتوسیانینبین حداقل 98/3 (میانگین تیمارهای 0 میکرومولار آرسنیک، 5 و 200 میکرومولار فسفر) و حداکثر 03/13 میکروگرم برگرم وزن تر (تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر) متغیر بوده است. بیشترین محتوای آنتوسیانین در تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک، 5 میکرومولار فسفر مشاهده گردید، به طوری که محتوای آن تقریباً 27/3 برابر کمترین میزان، مربوط به میانگین تیمارهای 0 میکرومولار آرسنیک، 5 و 200 میکرومولار فسفر است. محتوای آنتوسیانین در تمام تیمارها با افزایش غلظت آرسنیک در محیط، افزایش یافته و به دنبال آن با افزایش سطوح فسفر در هر تیمار، روند کاهشی پیدا کرده است، به نحوی که افزایش غلظت فسفر در محیط توانسته محتوای آنتوسیانین گیاه را در اغلب غلظت‌های آرسنیک کاهش دهد. این نکته جالب توجه است که این روند کاهشی در تیمارهای بالای آرسنیک با سرعت بیشتری صورت گرفته است. برای مثال، می‌توان به تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک، 800 میکرومولار فسفر اشاره کرد که محتوای آنتوسیانین در آن نسبت به تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک، 5 میکرومولار فسفر 15/2 برابر کاهش پیدا کرده است. همچنین، حضور آرسنیک در محیط حتی در سطح 50 میکرومولار، باعث افزایش 84/2 برابری محتوای آنتوسیانین نسبت به میانگین تیمارهای 0 میکرومولار آرسنیک گردید (شکل 7).

شکل 1- اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر میزان وزن خشک گیاه I. cappadocica، حروف مشابه در هر ستون بیانگر معنی‌دار نبودن اثر تیمارها بر میانگین وزن خشک بخش هوایی، با استفاده از آزمون دانکن است. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است.

شکل 2- اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر میزان انباشت آرسنیک گیاه I. cappadocica.، حروف متفاوت در هر ستون بیانگر معنی‌دار بودن اثر تیمارها بر میانگین انباشت آرسنیک در بخش هوایی گیاه، با استفاده از آزمون دانکن است. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است.

شکل 3- اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر میزان تجمع فسفر گیاه I. cappadocica.، حروف متفاوت در هر ستون بیانگر معنی‌دار بودن اثر تیمارها بر میانگین انباشت آرسنیک در بخش هوایی گیاه، با استفاده از آزمون دانکن است. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است.

شکل 4- اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای پراکسید هیدروژن (H₂O₂)گیاه I. cappadocica. حروف متفاوت در هر ستون بیانگر معنی‌دار بودن اثر تیمارها بر میانگین محتوای پراکسید هیدروژن، با استفاده از آزمون دانکن است. مقادیر میانگین سه تکرار، ± SE است.

شکل 5- اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای کاروتنوئید گیاه I. cappadocica.، حروف متفاوت در هر ستون بیانگر معنی‌دار بودن اثر تیمارها بر میانگین محتوای کاروتنوئید گیاه، با استفاده از آزمون دانکن است. مقادیر میانگین سه تکرار، ± SE است.

شکل 6- اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای فلاونوئید گیاه I. cappadocica.، حروف مشابه در هر ستون بیانگر معنی‌دار نبودن اثر تیمارها بر میانگین محتوای فلاونوئید گیاه، با استفاده از آزمون دانکن است. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است.

شکل 7- اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای آنتوسیانین گیاه I. cappadocica.، حروف متفاوت در هر ستون بیانگر معنی‌دار بودن اثر تیمارها بر میانگین محتوای آنتوسیانین گیاه، با استفاده از آزمون دانکن است. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است.

بحث

شکل‌های قابل استفاده گیاهی آرسنیک (آرسنات و آرسنیت) می‌توانند در محلول خاک توسط گیاهان جذب شوند و به بخش هوایی، میوه‌ها و بذرهای گیاهان از طریق آبیاری با آب‌های آلوده، راه یابند (Kim et al., 2009). مطالعات مختلف نشان داده است که حضور فسفات در مراحل رشد گیاه، آثار زیادی بر جذب و تجمع آرسنیک دارد (Tu and Ma, 2003). برخلاف آرسنیک، فسفر جزو عناصر ضروری مورد نیاز گیاه به شمار می‌آید. آرسنات (5+) به عنوان آنالوگ فسفات توسط سیستم انتقال دهنده فسفات در گیاه، جذب می‌شود (Macnair et al., 1992) و فسفات به عنوان مهار کننده رقابتی مؤثری برای جذب آرسنات به شمار می‌رود. بنابراین، چگونگی توزیع آرسنیک و فسفر در گیاه می‌تواند به عنوان یک سرنخ برای فهم بیشتر مکانیسم بیش انباشت آرسنیک در گیاه I. cappadocica باشد. به دلیل جذب آرسنیک توسط سیستم با تمایل بالای فسفر و اشباع شدن سیستم در غلظت‌های کم فسفر، سطوح بالای آرسنیک در محیط می‌تواند باعث کاهش میزان جذب فسفر توسط گیاه شده و احتمالاً در غلظت‌های بسیار سمّی (بالاتر از 1200 میکرومولار) و افزایش شدت تنش اکسیداتیو و به دنبال آن تخریب ساختار غشای سلول موجب از کار افتادن این ناقل غشایی می‌گردد. تاکنون در تمام گونه‌های گیاهی مطالعه شده، نشان داده شده است که جذب آرسنات از طریق سیستم‌های انتقال دهنده فسفات صورت می‌گیرد (Meharg and Hartley-Whitaker, 2002). در مطالعه حاضر مشخص شد که گیاه بیش انباشتگر I. cappadocica از این قاعده مستثنی نیست. نتایج تحقیق حاضر با نتایج حاصل از مطالعه Ma و همکاران (2006) مطابقت دارد.

گیاهان برای مقابله با تنش اکسیداتیو ناشی از حضور آرسنیک در محیط از مکانسیم‌های دفاعی استفاده می‌کنند. مکانسیم‌های دفاعی، اغلب از همکاری آنزیم‌ها و ترکیبات آنتی‌اکسیدانی مانند فلاونوئید (Sakihama et al., 2002)، کاروتنوئید (Müller et al., 2006) و غیره تشکیل شده‌اند. ترکیبات آنتی‌اکسیدان در حفظ تعادل سلول‌های گیاهی نقش بسیار مهمی را ایفا می‌کنند (Vaidyanathan et al., 2003). زیرا این متابولیت‌ها توانایی واکنش مستقیم با انواع ROS و جمع‌آوری آنها را دارند (Israr and Sahi, 2006)، به طوری که کاهش فعالیت برخی از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان نظیر سوپر اکسید دیسموتاز با افزایش میزان آنها جبران می‌گردد (Esfandiari et al., 2008). به علاوه، آنتی‌اکسیدان‌ها به عنوان کوآنزیم آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان عمل می‌کنند (Guo et al, 2005). برخی از پژوهشگران افزایش میزان آنتی‌اکسیدان‌ها را عامل اصلی مقاومت گیاهان به تنش‌های محیطی می‌دانند Herbinger et al., 2002)؛ Esfandiari et al., 2008). با توجه به این که امروزه نقش دفاعی متابولیت‌های ثانویه تقریباً پذیرفته شده است، اما هنوز بررسی سازوکار تأثیر تنش‌های محیطی بر تولید این مواد، تصویر پیچیده و پُر ابهامی پیش روی ما می‌گذارد. شواهد زیادی نشان می‌دهند که در شرایط تنش تولید برخی از این ترکیبات تا چندین برابر افزایش می‌یابد (Koc et al., 2010). در پژوهش حاضر، افزایش میزان برخی از آنتی‌اکسیدان‌های غیر آنزیمی (کاروتنوئید، فلاونوئید و آنتوسیانین) بر اثر افزایش تنش آرسنیک مشاهده گردید که این امر ارتباط مستقیمی با ظرفیت آنتی‌اکسیدانی گیاه
I. cappadocica دارد.

به دلیل ویژگی‌های بیش انباشتگری گیاه
I. cappadocica، تغییرات محتوای ترکیبات آنتی‌اکسیدانی بخش هوایی در این گیاه، تحت تیمارهای مختلف آرسنیک و فسفر مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل نشان دهنده افزایش میزان آرسنیک انباشته شده در بخش هوایی به موازات افزایش سطوح آرسنیک در محیط است. در گیاهان مقاوم به آرسنیک علیرغم محتوای بالای آرسنیک در بخش هوایی، عوارض آشکاری از سمّیت فلز در گیاه مشاهده نمی‌شود که احتمالاً به دلیل وجود مکانیسم‌های مقاومتی از جمله افزایش محتوای ترکیبات آنتی‌اکسیدان است. همان طور که انتظار می‌رفت، گیاه بیش انباشتگر آرسنیک I. cappadocica، در جذب آرسنیک بسیار کارآمد بود و بیش از 700 میلی‌گرم بر کیلوگرم آرسنیک (بر پایه وزن خشک) را در بخش هوایی خود انباشت کرد، که این امر نشان دهنده مقاومت بالای این گیاه نسبت به آرسنیک و وجود مکانیسم‌های کارآمد در آن به منظور سمّیت‌زدایی آرسنیک است.

به موازات افزایش غلظت آرسنیک در محیط، به ویژه در تیمارهای بالاتر از50 میکرومولار محتوای کاروتنوئید بخش هوایی گیاه I. cappadocica،روندی افزایشی پیدا کرد. هنگامی که گیاه در معرض تنش اکسیداتیو قرار می‌گیرد، انواع گونه‌های فعال اکسیژن تولید می‌شوند. در بسیاری از گیاهان سیستم‌های آنزیمی برای از بین بردن رادیکال‌ها فعال می‌شوند (Jubany- Marí et al., 2010). اما اغلب ترکیبات آنتی‌اکسیدانی پیش از آن که سیستم‌های آنزیمی وارد عمل شوند، عمل پاک‌سازی را در گیاه انجام می‌دهند. کاروتنوئیدها می‌توانند از تنش‌های اکسیداتیو جلوگیری کنند، بدین معنا که توان پاک‌سازی انواع گونه‌های فعال اکسیژن را دارند (Esfandiari et al., 2008). نقش کاروتنوئیدها به عنوان آنتی‌اکسیدان در تنش‌های اکسیداتیو مورد توجه قرار گرفته است (Zhang and Kirkham, 1996). کاروتنوئید با انرژی برانگیختگی بالا در جریان فتوسنتز از کلروفیل تولید می‌شود و رادیکال‌های آزاد را جاروب می‌کند (Arora et al., 2002). همچنین، از طریق فروکش کردن سریع وضعیت برانگیخته کلروفیل، عمل حفاظت نوری را انجام می‌دهند. گیاهI. cappadocicaاز محتوای نسبی بالای کاروتنوئید در همه تیمارها برخوردار بود. بالا بودن محتوای کاروتنوئید گیاه، نشان دهنده این مطلب است که پیش از آن که آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی فعال شوند، این ترکیب می‌تواند از طریق پاک‌سازی انواع رادیکال‌های آزاد از تنش اکسیداتیو جلوگیری کند. همچنین به دلیل نقش محافظتی کاروتنوئید از فتوسیستم گیاه و عمل حافظت نوری در شدت تنش اکسیداتیو، میزان آن با افزایش سطوح آرسنیک در محلول غذایی افزایش یافت. یافته‌های حاصل از پژوهش حاضر با نتایج حاصل از تحقیق Ma و همکاران (2006) روی Pteris ensiformis تحت تنش آرسنیک، همخوانی دارد.

در مطالعه حاضر، محتوای فلاونوئید در اغلب تیمارها به موازات افزایش غلظت آرسنیک در محلول غذایی افزایش یافت. فلاونوئیدها به دلیل نقش آنتی‌اکسیدانی خود به طور مستقیم با وارد شدن در واکنش‌های احیایی یا به طور غیر مستقیم به وسیله کلاته کردن آهن، مانع تنش اکسیداتیو می‌شوند و مانند بسیاری دیگر از پلی فنل‌ها جاروب کننده رادیکال‌های آزاد هستند، زیرا به عنوان گروه‌های قوی الکترون‌دهنده و پروتون‌دهنده عمل می‌کنند (Seyoum et al., 2006). فلاونوئیدها با شناسایی تعداد و موقعیت گروه های OH فنلی حاضر، کار پاک‌سازی رادیکالی را انجام می‌دهند Chen et al., 2002)؛ Amic et al., 2003). همچنین خواص آنتی‌اکسیدانی فلاونوئیدها به اثر بازدارندگی آنها در تنفس میتوکندریایی مربوط می‌شود (Sangtarash et al., 2009). نتایج این تحقیق بیانگر آن است که فلاونوئیدها توانایی پاک‌سازی گونه‌های اکسیژن فعال را در گیاه I.cappadocica تحت تنش آرسنیک را دارند. تجمع ترکیبات فلاونوئیدی در گیاهان مختلفی که تحت تأثیر انواع تنش‌ها بوده‌اند، گزارش شده است (Pourcel et al., 2006). بررسی میزان فلاونوئید Brassica napus در شرایط تنش آبی نشان داد که این ترکیب به عنوان متابولیت ثانویه در گیاه افزایش می‌یابد (Sangtarash et al., 2009). همچنین محققان نتایج مشابهی را نیز بر روی گیاه Stellaria longipes به دست آوردند و نشان دادند که محتوای فلاونوئید به عنوان یک ماده آنتی‌اکسیدان در تنش اکسیداتیو وارد عمل شده و میزان آن افزایش می‌یابد (Seyoum et al., 2006)، این نتایج در توافق با نتایج حاصل از تحقیق حاضر بود.

در پژوهش حاضر، محتوای آنتوسیانین در تمام تیمارها با افزایش غلظت آرسنیک در محیط، افزایش یافت. آنتوسیانین‌ها نیز مشابه فلاونوئیدها، رنگیزه محافظ بوده و گیاه را در برابر تنش محافظت می‌کنند (Chalker-Scott, 2002). گزارش شده است که مقدار آنتوسیانین در گیاه Begonia semperflorens تحت شرایط تنش افزایش یافته است. این افزایش به علت نقش حفاظت نوری آنتوسیانین به وسیله حذف مستقیم ROS در طول تنش اکسیداتیو است (Zhang et al., 2010). آنتوسیانین نیز به عنوان گیرنده رادیکال‌های آزاد عمل می‌کند و گیاه را در برابر تنش‌های اکسیداتیو محافظت می‌کند (Sairam et al., 1998). علت افزایش محتوای آنتوسیانین در مورد فلزات سنگینی نظیر نیکل به عملکرد هورمون اتیلن نسبت داده شده است (Qinghua and Zhujun, 2008). احتمال داده می‌شود که اتیلن با اثر بر آنزیم‌های مسیر بیوسنتزی آنتوسیانین‌ها و فلاونوئیدها از جمله فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز (PAL) ، باعث تجمع آنتوسیانین در گیاه می‌گردد (Hyodo and Yang, 1997). آنزیم PAL یکی از آنزیم‌های مهم در مسیر فنیل پروپانوئید و سنتز ترکیبات فنلی است که در پاسخ به برخی تنش‌ها القا شده، می‌تواند به عنوان آنزیم آنتی‌اکسیدان در نظر گرفته شود، زیرا دارای خاصیت به دام‌اندازی رادیکال‌های آزاد اکسیژن از طریق ترکیبات فنلی (فلاونوئید و آنتوسیانین) تولید شده، است (Tian and Li, 2007). در تحقیق حاضر، محتوای آنتوسیانین گیاه
I. cappadocica به شدت تحت تأثیر تنش آرسنیک در سطوح پایین فسفر، افزایش یافت و از این حیث بین تیمارها اختلاف معنی‌داری مشاهده گردید. این الگو برخلاف سایر آنتی‌اکسیدان‌ها (کاروتنوئید و فلاونوئید) بود. به نظر می‌رسد آرسنیک با افزایش هورمون اتیلن و متعاقب آن افزایش فعالیت آنزیم PAL در مسیر فنیل پروپانوئید، باعث تجمع آنتوسیانین شده است. از سوی دیگر، آنتوسیانین با کلاته کردن آرسنیک در داخل واکوئل، موجب کاهش سطح آرسنیک در سیتوزول شده و اثر سمّیت و تخریب حاصل از آن را کاهش می‌دهد. نتایج مطالعات Venkatesan و همکاران (2007) نیز افزایش محتوای آنتوسیانین را در گیاه چای، تحت تنش منگنز نشان می‌دهد که با یافته‌های پژوهش حاضر همخوانی دارد.

نتیجه‌گیری کلی

با توجه به نتایج حاصل از مطالعه حاضر، به دنبال افزایش سطوح آرسنیک در محیط، محتوای اغلب ترکیبات آنتی‌اکسیدانی نظیر کاروتنوئید، فلاونوئید و آنتوسیانین افزایش می‌یابد. این افزایش در غلظت‌های بالایی آرسنیک به همراه سطوح پایین فسفر کاملاً مشهود است. این ترکیبات آنتی‌اکسیدانی در حفظ تعادل سلول‌های گیاه نقش بسیار مهمی را از طریق واکنش مستقیم با انواع اکسیژن فعال و کاهش شدت تنش اکسیداتیو ایفا می‌کنند، به طوری که کاهش احتمالی میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در شدت تنش اکسیداتیو ناشی از حضور آرسنیک، می‌تواند با افزایش میزان آنها جبران گردد. در پژوهش حاضر مشخص گردید که محتوای بالای برخی از آنتی‌اکسیدان‌های غیر آنزیمی (کاروتنوئید، فلاونوئید و آنتوسیانین) بر اثر افزایش تنش اکسیداتیو ناشی از حضور آرسنیک ارتباط مستقیمی با ظرفیت آنتی‌اکسیدانی گیاه I. cappadocica دارد. ظرفیت بالا و کارآمد سیستم آنتی‌اکسیدانی یا افزایش سطوح آنتی‌اکسیدان‌ها می‌تواند باعث جلوگیری از آسیب‌های اکسیداتیو و بهبود تحمل گیاه به تنش اکسیداتیو گردد.

سپاسگزاری

نگارندگان از بخش تحصیلات تکمیلی دانشگاه رازی کرمانشاه سپاسگزاری می‌نمایند.