نویسندگان
1 مرکز تحقیقات زیست فناوری کاربردی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، تهران، ایران
2 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Taxus baccata L. is the main and almost the sole source of paclitaxel, which is an anti neoplastic agent and is used as a cure for treatment of breast and ovary cancer. Since production of this drug is almost a destructive process and yew is an endangered plant, it is required to optimize its tissue culture and micropropagation system. In order to produce embryo derived callus 16 combinations of two plant growth regulators; 2,4-D (0, 0.5, 1 and 1.5 mg/L) and Kinetin (0, 0.1, 0.5 and 1 mg/L) were used to study its effects on callus formation and growth in Taxus baccata. It was determined that 1.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L kinetin was the best combination for callus growth. Increasing 2,4-D concentration, however, promoted callogenesis while kinetin only in a narrow range had positive effect on callus initiation.
کلیدواژه‌ها [English]
گیاه سرخدار با نام علمی Taxus baccata L. تنها جنس از تیره Taxaceae و دارای کاربرد اقتصادی است (Datta and Jha, 2001). پس از کشف پاکلی تاکسول در سرخدار در سال 1971 میلادی (Dewick, 2009) و افزایش ناگهانی تقاضا و فروش آن در اواخر دهه 90 میلادی برای درمان سرطان‌های رحم و پستان Mastropaolo et al., 1995)؛ Phisalaphong and Linden, 1999؛ (Jennewein and Croteau, 2001 به علت برداشت زیاد از ذخایر آن، این گیاه در معرض انقراض قرار گرفته است (Stierle et al., 1995). با توجه به محدودیت منابع و حفاظت شده بودن این گیاه در ایران باید به دنبال راهکارهای زیست فناورانه جهت تولید پاکلی تاکسول بود به ویژه آن که تولید آن با روش شیمیایی از نظر اقتصادی عملا امکان‌پذیر نیست (Hezari and Croteau, 1997؛ Hezari et al., 1997؛ Walker et al., 2002). کشت بافت گیاهی یکی ازمنابع پایدار برای تولید ترکیبات ضد سرطان است و تولید ترکیبات ضد سرطان توسط کشت کالوس شماری از گیاهان به اثبات رسیده است (Wickremesinhe and Arteca, 1993). بنابراین نخستین گام برای تولید پاکلی تاکسول می‌تواند کشت بافت سرخدار باشد. کالوس‌های سرده سرخدار با استفاده از جدا کشت‌هایی از بافت‌های مختلف از جمله: پوست، شاخه، اجزای دانه، ساقه‌های جوان و برگ‌ها القا شده است Wickremesinhe and Arteca, 1993)؛ Son et al., 1999؛ (Agrawal et al.,2003. از این میان ساقه‌ها، بهترین منبع جداکشت‌ها بوده‌اند و کالوس‌های حاصل از آن رشد سریعی داشته‌اند. ترکیب محیط مهم‌ترین بخش در القای کالوس، رشد یاخته و همچنین تشکیل متابولیت در کشت بافت و یاخته گیاهی است (Mihaljevic et al., 2002؛ Bruňáková et al., 2004؛ Hussain et al., 2013). اجزا، غلظت و ترکیب تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی نقش مهمی در القا کالوس دارد و عموماً محیط دارای 1 تا 2 میلی‌گرم بر لیتر 2 و 4- دی کلروفنوکسی استیک اسید (2,4-D) یا ترکیب آن با سایر تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی دارای این ویژگی بوده است. تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی نظیر کینتین و نفتالن استیک اسید (NAA) نیز استفاده می‌شوند
Furmanowa et al., 1997)؛ (Ashrafi et al., 2010. در بررسی تأثیر نوع و غلظت قندها و ترکیب هورمونی بر کال‌زایی در سرخدار معمولی مشخص شده است که در محیط B5 گامبورگ از بین ترکیب‌های مختلف (0، 5/0، 1، 2 و 4 میلی‌گرم بر لیتر) 2,4-D و NAA (0، 5/0، 1، 2 و 4 میلی‌گرم بر لیتر) و (0، 1/0، 2/0، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) کینتین، ترکیب 1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D و 1/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین بهترین ترکیب هورمونی برای کال‌زایی بوده است (Wickremesinhe and Arteca, 1993). در مقایسه 2,4-D و NAA مشخص شد که در برگ‌ها 2,4-D بهتر از NAA عمل می‌کند اما در ساقه‌ها بین این دو تفاوت چندانی مشاهده نشده است (Qorbanli and Delavar, 2001). غلظت‌های اندک کینتین (1/0 و 2/0 میلی‌گرم بر لیتر) بهتر از غلظت‌های بالای کینتین (5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) عمل می‌کند (Qorbanli and Delavar, 2001). پیشتر نشان داده شده است که در محیط دارای 2 میلی‌گرم بر لیتر کینتین و غلظت‌های مختلف اکسین یا هیچ گونه کال‌زایی در جداکشت سرخدار صورت نمی‌گیرد یا میزان کالوس تولید شده بسیار اندک است اما در محیط‌های حاوی 2/0 میلی‌گرم در لیتر کینتین درصد کال‌زایی بسیار بالا است (Wickremesinhe and Arteca, 1993). در این کشت‌ها هیچ گونه اندام‌زایی مشاهده نشده است که علت آن ممکن است در ارتباط با استفاده از 2,4-D یا NAA باشد زیرا گزارش شده است که این هورمون‌ها موجب توقف اندام‌زایی و تمایزیابی بافت‌ها شده، کال‌زایی را تسریع می‌کند (Qorbanli and Delavar, 2001). در سرخدار هیمالیایی گزارش شده است محیط MS پایه حاوی 5 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 25/0 میلی‌گرم در لیتر کینتین بهترین ترکیب هورمونی برای رشد کالوس ساقه بوده است و برای کالوس برگ 25/0 میلی‌گرم در لیتر کینتین و 3 میلی‌گرم در لیتر NAA ترکیب هورمونی بهینه بوده است (Datta and Jha, 2001). در Taxus × media Var. Hatfieldii مشخص شد پیکلورام در محیط White-Rangaswamy (WR) با غلظت 10 میکرومولار رشد کالوس را تا 8/5 برابر افزایش داده است ضمن آن که بر تولید تاکسان‌ها تأثیری نداشته است (Furmanowa et al., 1977).
در بررسی اثر تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی و غلظت آهن روی جداکشت‌های سرشاخه و رویان Taxus baccata در محیط MS حاوی 3 میلی‌گرم بر لیتر NAA و 5/0 میلی‌گرم بر لیترکینتین به همراه 100 میلی‌گرم بر لیتر آرژنین و 5/2 درصد سوکروز، در 4/86 درصد جدا کشت‌های رویان و 100 درصد جداکشت‌های شاخه جوان کالوس القا شد که توان رشد این کالوس‌های القا شده در پاسخ به توان ژنتیکی و ترکیب محیط کشت تغییر می‌کند. در رویان‌های بالغ 100 درصد القا کالوس در محیط MS حاوی 3 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D، 5/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین و 2 درصد سوکروز به دست آمده است. بهترین القای کالوس‌های به دست آمده از ساقه به میزان 100 درصد در محیط MS حاوی 3 میلی‌گرم بر لیتر NAA و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین و 5/2 درصد سوکروز رخ داد. رویان‌های حاصل از تخم بازدهی بالایی برای القای کالوس دارند و دودمان‌های کالوس حاصل از رویان رشد سریعی دارند. همچنین، رویان‌های حاصل از تخم به دلیل ناهمسان بودن شمار کافی از دودمان‌های متفاوت یاخته‌ای حتی در یک درخت فراهم می‌کنند که به دلیل توان رشد و میزان پاکلی تاکسول متنوع می‌توانند منبعی برای کال‌زایی و کشت یاخته‌ای فراهم کنند (Mihaljevic et al.,2002).
با توجه به این موارد، ترکیبات هورمونی متفاوت، محیط‌های گوناگون و قندهای متفاوت برای القا و رشد کالوس برای گونه‌های متفاوت سرخدار استفاده شده است. علاوه بر تفاوت بین گونه‌ها درون هر گونه نیز واریته‌های گوناگون نیز متفاوتند و پاسخ هر ژنوتیپ به ترکیبات گوناگون محیط رشد می‌تواند متفاوت باشد (Bruňáková et al.,2004). بنابراین، در پژوهش حاضر، تأثیر غلظت‌های مختلف 2,4-D و کینتین بر کال‌زایی و رشد کالوس به دست آمده از کشت رویان سرخدار ایرانی مطالعه شد.
مواد و روش‌ها.
نمونه‌برداری از جنگل دول آرام، شهرستان علی‌آباد کتول در دو نقطه سنگ سوراخ با ارتفاع 1250 متر و جنی دره در محدوده ارتفاعی 1480 تا 1500 متر از سطح دریا انجام گرفت.بذرهای جمع‌آوری شده متعلق به درختانی با طول عمر حدودا 100 سال بودند. برای تهیه محیط کشت، نمک‌های ماکرو، میکرو و آهن بر اساس ترکیب MS تهیه شد (Murashige and Skoog, 1962)، سپس 50 میلی‌گرم بر لیتر آسکوربیک اسید، 2 میلی‌گرم بر لیتر گلیسین و 30 گرم بر لیتر سوکروز افزوده شد. 2,4-D در چهار سطح (0، 5/0، 1 و 5/1 میلی‌گرم بر لیتر) و کینتین در چهار سطح (0، 1/0، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) به محیط کشت اضافه شد. بدین ترتیب بر اساس جدول مربع لاتین 16 تیمار از ترکیب این دو تنظیم‌کننده رشد گیاهی جهت بررسی اثر آنها بر کال‌زایی در کشت رویان سرخدار استفاده شد. اسیدیته محیط با NaOH 1/0 نرمال در حدود 05/0 ± 8/5 تنظیم شد. مقدار فیتوآگار 7 گرم بر لیتر بود. بذرهای سرخدار پس از جداکردن آریل، با آب لوله‌کشی شستشو شد، خشک شد و برای کشت 1 تا 2 دقیقه در اتانول 70 درصد همزده شد، سپس از اتانول جدا شدند. پس از تبخیر اتانول پوست بذر شکسته و از اندوسپرم جدا گردید. رویان از اندوسپرم جدا شد و در هر ظرف ویال حاوی 20 میلی‌لیتر محیط کشت، 3 رویان و در مجموع 15 رویان در 5 تکرار در هر تیمار کشت شد. درب کلیه ظروف با ورقه آلومینیوم بسته شد، سپس در تاریکی و دمای 24 درجه سانتیگراد به مدت 45 روز نگهداری شدند. پس از این مدت برداشت کالوس‌ها جهت سنجش وزن تر و خشک انجام شد.
نرخ کال‌زایی با توجه به نسبت جداکشت‌های کال‌زا به تعداد کل جدا کشت‌ها در هر تیمار محاسبه شد و در نرم‌افزار Excel به آرک سینوس تبدیل شد. آنالیز واریانس در نرم‌افزار JMP® و آزمون دانکن در نرم‌افزار MSTAT-C با دقت 95 درصد انجام گرفت. نتایج هر سه در نرم‌افزار JMP® بر اساس آزمون فاکتوریل با دقت 95 درصد تحلیل آماری شد. اختلاف میانگین‌ها با آزمون دانکن با دقت 95 درصد در MSTAT-C تحت DOS تحلیل و گراف‌ها در Excel رسم شد. گراف اثر عوامل تیمار روی شاخص‌ها توسط MSTAT-C تحت ویندوز و / یا JMP® رسم شد.
نتایج.
در بررسی نتایج حاصل از وزن تر کالوس‌ها مشخص شد که وزن تر تنها تحت تأثیر 2,4-D قرار گرفته است و کینتین و ترکیب 2,4-D و کینتین اثر معنی‌داری نداشته است (شکل 1).
در بررسی نمودار اثر غلظت‌های مختلف 2,4-D و کینتین بر وزن تر کالوس‌ها در پاسخ به کینتین در محدوده 0 تا 1/0 میلی‌گرم بر لیتر هیچ تغییری نشان نداد وپس از آن با افزایش غلظت تا 5/0 میلی‌گرم بر لیتر وزن تر کاهش نشان داد وپس از این غلظت تا 1 میلی‌گرم بر لیتر ثابت ماند (شکل 2)، اما 2,4-D رشدی خطی نشان داد و بالاترین وزن تر در محیط حاوی 5/1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D حاصل شد (شکل 3).
شکل 1- رابطه وزن تر کالوس حاصل از رویان T. baccata و ترکیب تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D و کینتین. مقادیر میانگین 5 تکرار ±SE است. در هر یک از مجموعه تیمارهای 2,4-D و کینتین حروف مشترک بیانگر نبود اختلاف معنی‌دار در سطح P<0.05 است.
|
شکل 2- اثر کینتین بر وزن تر کالوس حاصل از کشت رویان T. baccata |
شکل 3- اثر 2,4-D بر وزن تر کالوس حاصل از کشت رویان T. baccata |
همچنین مشخص شد محیط دارای 5/1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D+ 1/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین بهترین ترکیب هورمونی را از نظر افزایش وزن تر کالوس‌های ایجاد شده داشته است اما تفاوتی معنی‌دار بین این ترکیب و ترکیب‌های: 5/0 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D+ 0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین، 1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D+ 1/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین، 5/1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D+ 5/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین، 5/1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D+ 0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین مشاهده نشد. ضعیف‌ترین نتایج متعلق به نسبت بالای کینتین به 2,4-D بود. مشخص شد که در محیط‌های حاوی غلظت اندک کینتین و بالای 2,4-D کالوس‌ها رشدی سریعی دارند و ساختار کالوس نرم و سست است اما در محیط دارای غلظت کینتین بالا کالوس سفت است. در مواردی که کالوس ایجاد نشد رویان‌ها سفید باقی ماندند و در غلظت کم کینتین به نظر می‌رسید که رویان‌ها اندکی رشد یافته و حجیم شده‌اند.
در غلظت صفر تنظیم‌کننده‌های رشد انتظار ایجاد کالوس نمی‌رفت اما با طولانی شدن زمان تاریکی پس از رشد پیش‌رسی که رویان‌ها در محیط بدون هورمون نشان دادند کال‌زایی در آنها القا شد. در بررسی اثر تنظیم‌کننده‌ها و ترکیب آنها بر وزن خشک کالوس بر اساس آزمون فاکتوریل نتایج اثر تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی 2,4-D و کینتین بر وزن تر تأیید شد و 2,4-D تنها عامل مؤثر بر وزن خشک کالوس‌ها شناخته شد (شکل‌های 4 و 5).
همراه با افزایش غلظت کینتین، تغییرات وزن خشک کالوس روندی کاهشی و بسیار آهسته نشان داد (شکل 6).
روند اثر 2,4-D بر وزن خشک کالوس تا غلظت 5/0 میلی‌گرم بر لیتر افزایش سریع نشان داد و در غلظت‌های بالاتر، اندکی از سرعت آن کاسته شد اما روند افزایش خود را به خوبی حفظ کرد.
در ترکیب دو تنظیم‌کننده 2,4-D و کینتین، بر اساس آزمون دانکن ترکیب 5/1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D+ 1/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین و ترکیب 2 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D + 0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین بهترین نتایج به دست آمد، هر چند اختلاف معنی‌داری بین آنها و 9 ترکیب محیط دیگر مشاهده نشد. ضعیف‌ترین نتیجه در ترکیب 0 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D+ 1 میلی‌گرم بر لیتر کینتین به دست آمد وتفاوت معنی‌دار بین آن و 8 ترکیب دیگر مشاهده نشد. در بررسی اثر عوامل هورمونی بر نرخ کال‌زایی رویان سرخدار مشخص شد که 2,4-D و کینتین هر دو مؤثر بوده‌اند اما ترکیب این دو تأثیر معنی‌داری بر کال‌زایی نداشته است (شکل 7).
شکل 4- رابطه وزن خشک کالوس حاصل از رویان T. baccata و ترکیب تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D و کینتین. مقادیر میانگین 5 تکرار ± SE است. در هر یک از مجموعه تیمارهای 2,4-D و کینتین حروف مشترک بیانگر نبود اختلاف معنی‌دار در سطح P<0.05 است.
|
شکل 5- اثر 2,4-D بر وزن خشک کالوس حاصل از کشت رویان T. baccata |
شکل 6- اثر کینتین بر وزن خشک کالوس حاصل از کشت رویان T. baccata |
شکل 7- نرخ کال‌زایی رویان T. baccata و ترکیب تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D و کینتین. مقادیر میانگین 5 تکرار ±SE است. در هر یک از مجموعه تیمارهای 2,4-D و کینتین حروف مشترک بیانگر نبود اختلاف معنی‌دار در سطح P<0.05 است.
در بررسی اثر کینتین مشخص شد که این تنظیم‌کننده در محدوده غلظت 0 تا 1/0 میلی‌گرم بر لیتر تأثیر معنی‌داری بر نرخ کال‌زایی ندارد اما پس از آن روندی افزایشی را در پیش می‌گیرد به طوری که در غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر بالاترین نرخ کال‌زایی مشاهده می‌شود (شکل 8).
در بررسی اثر 2,4-D مشخص شد که این تنظیم‌کننده رشد تا غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر اثر افزایشی بر نرخ کال‌زایی دارد و پس از آن تا غلظت 5/1 میلی‌گرم بر لیتر نرخ کال‌زایی تقریباً ثابت می‌شود (شکل 9).
همچنین مشخص شد بیشترین نرخ کال‌زایی در ترکیب 1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D + 1 میلی‌گرم بر لیتر کینتین رخ داده است که با نتایج این دو تنظیم‌کننده رشد گیاهی به تنهایی انطباق دارد. اما از نظر آماری بین این ترکیب و 8 ترکیب دیگر تفاوت قابل توجهی مشاهده نشد. ضعیف‌ترین نتایج به ترتیب در ترکیب‌های: 5/0 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D + 1/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین و 0 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D + 1/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین مشاهده شد اما در نرخ کال‌زایی بین آنها تفاوت معنی‌داری وجود نداشت.
|
شکل 8- اثر کینتین بر نرخ کال‌زایی در کشت رویان T. baccata |
شکل 9- اثر 2,4-D بر نرخ کال‌زایی در کشت رویان T. baccata |
بحث.
در بررسی اثر 16 تیمار ترکیب 2,4-D وکینتین بر وزن تر، خشک و نرخ کال‌زایی در کالوس‌های حاصل از کشت رویان Taxus baccata مشخص شد که
2,4-D بر هر سه عامل اثر مثبت داشته است و بهترین نتایج در بیشترین غلظت آن 5/1 میلی‌گرم بر لیتر به دست آمد. گزارش شده است که در T. baccataغلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D بهترین غلظت برای تحریک کال‌زایی در محیط B5 بوده است (Qorbanli and Delavar, 2001). البته در محیط‌های مختلف نتایج گوناگونی به دست آمده است و بهترین غلظت 1 تا 2 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D به تنهایی یا ترکیب آن با سایر تنظیم‌کننده‌های رشد برای کال‌زایی و رشد کالوس گزارش شده است (Malik et al., 2011). همچنین در محیط MS، بهترین کال‌زایی در جداکشت‌های سر شاخه T. baccata در غلظت‌های 2 و 3 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D گزارش شده است (Mihaljevic et al., 2002) در حالی که در غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D در T. baccata بیش از 70 درصد جداکشت‌ها تولید کالوس نموده‌اند و با افزایش آن به 2 میلی‌گرم بر لیتر نرخ کال‌زایی به کمتر از 75 درصد کاهش یافته است. با وجود این، در سرخدار اقیانوس آرام نرخ کال‌زایی در محدوده بالاتر از 75 درصد در هر دو غلظت ثابت مانده است (Wickremesinhe and Arteca, 1993). با توجه به نمودار اثر اکسین می‌توان انتظار داشت که غلظت‌های بالاتر 2,4-D تا 2 میلی‌گرم بر لیتر و بیشتر باعث افزایش قابل توجهی در نرخ کال‌زایی و وزن تر و خشک کالوس‌ها بشود. با این حال گزارش شده است که غلظت‌های 1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D و 1/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین بهترین ترکیب برای رشد کالوس سرخدار است (Monacelli et al., 1994).
کینتین هیچ تأثیر معنی‌داری بر وزن تر و خشک نداشته است و حتی افزایش غلظت آن به 5/0 میلی‌گرم بر لیتر باعث کاهش وزن تر شده است، اما موجب افزایش نرخ کال‌زایی شد. در رویان گندم یک پروتئین خاص رویان با تمایل اتصال به سیتوکینین گزارش شده است (Moore, 1989) شاید وجود گیرنده احتمالی سیتوکینین در سطح رویان سرخدار و اتصال به کینتین باعث تحریک موقتی سیتوکنیز به ویژه در غلظت بالای کینتین شده است که پس از اشباع گیرنده‌ها این تحریک قطع شده و غلظت بالای کینتین در ادامه رشد کالوس بی‌تأثیر بوده است؛ بنابراین افزایش وزن تر و خشک مشاهده نشده است. مشخص شد که ترکیب 2,4-D و کینتین بر وزن تر، خشک و نرخ کال‌زایی بی‌تأثیر بوده است. بهتـــــرین ترکیب مؤثر بر وزن تر و خشک 5/1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D و 1/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین است. شاید اختلاف در نتایج مربوط به اثر کینتین به علت ناهمسان بودن بافت‌های رویان و وجود مراکز مریستمی متفاوت در دو انتهای رویان با پاسخ‌های متفاوت به غلظت‌های متغیر کینتین باشد.
در آزمون فاکتوریل با دقت 95 درصد مشخص شد که وزن تر تحت تأثیر تنها 2,4-D قرار گرفته است وکینتین اثری معنی‌دار نداشته است. در بررسی نمودار اثر این عوامل کینتین در محدوده 0 تا 1/0 میلی‌گرم بر لیتر هیچ تغییری نشان نداد وپس از آن با افزایش غلظت تا 5/0 میلی‌گرم بر لیتر وزن تر کاهش نشان داد و پس از این غلظت تا 1 میلی‌گرم بر لیتر ثابت ماند، اما در مورد 2,4-D رشد خطی نشان داد و بالاترین وزن تر حاصل در غلظت 5/1 میلی‌گرم بر لیتر بود. ترکیب
2,4-D و کینتین در این آزمایش مشخص می‌کند اثر بازدارنده کینتین بر اثر تحریک کننده 2,4-D چیره شده است.
در آزمون دانکن با رتبه‌بندی میانگین تیمارها مشخص شد که محیط دارای 5/1 میلی‌گرم بر لیتر
2,4-D و 1/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین بهترین ترکیب هورمونی را داشته است. ضعیف‌ترین نتایج متعلق به غلظت‌های صفر دو تنظیم‌کننده رشد یا نسبت بالای کینتین به 2,4-D به ویژه غلظت صفر 2,4-D بود.
در بررسی اثر تنظیم‌کننده‌ها و ترکیب آنها بر وزن خشک کالوس طبق آزمون فاکتوریل نتایج وزن تر تأیید شد و 2,4-D تنها عامل مؤثر بر وزن خشک کالوس‌ها شناخته شد. در بررسی اثر این عوامل، کینتین روندی کاهشی و بسیار آهسته در تغییرات وزن خشک کالوس همراه با افزایش غلظت نشان داد. روند اثر
2,4-D تا غلظت 5/0 میلی‌گرم بر لیتر افزایشی سریع نشان داد و پس از آن اندکی از سرعت آن کاسته شد اما روند افزایش خود را به خوبی حفظ کرد.
2,4-D و کینتین هر دو بر تغییرات نرخ کال‌زایی رویان سرخدار مؤثر بودند. در 2,4-D این عامل تا غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر اثر افزایشی نشان می‌دهد و پس از آن تا غلظت 5/1 میلی‌گرم بر لیتر تقریباً ثابت می‌شود.
بیشترین نرخ کال‌زایی در ترکیب 1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D + 1 میلی‌گرم بر لیتر کینتین رخ داده است که با نتایج دو عامل به تنهایی انطباق دارد. با توجه به نتایج دیگران به نظر می‌رسد با افزایش غلظت کینتین لازم است که میزان 2,4-D نیز برای افزایش نرخ کال‌زایی افزایش یابد برای مثال، نرخ کال‌زایی در کشت رویانT. baccataدر غلظت 5/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین در حالی به 100 درصد می‌رسد که غلظت 2,4-D به 3 میلی‌گرم بر لیتر افزایش یابد (Mihaljevic et al., 2002). این در حالی است که جهت رشد بهتر کالوس غلظت کمتر کینتین (1/0 میلی‌گرم بر لیتر) مورد نیاز است Monacelli et al., 1994)؛ Datta and Jha, 2001). به بیان دیگر، نسبت بهینه از این دو تنظیم‌کننده رشد برای تشکیل کالوس مورد نیاز است. در بررسی اثر 16 تیمار ترکیب 2,4-D و کینتین بر وزن تر، خشک و نرخ کال‌زایی در کالوس‌های حاصل از کشت رویان سرخدار معمولی مشخص شد که 2,4-D بر هر سه عامل اثر مثبت داشته است و بهترین نتایج در بیشترین غلظت آن 5/1 میلی‌گرم بر لیتر به دست آمده است.
سپاسگزاری.
نگارندگان از همکاری صمیمانه اداره کل محیط زیست استان گلستان و اداره محیط زیست شهرستان علی‌آباد کتول به ویژه محیط‌بانان پاسگاه محیط‌بانی سیاه رودبار تشکر و قدردانی می‌نمایند.
)
