بررسی تغییرات عملکرد و ترکیبات اسانس گیاه مرزه (Satureja hortensis) در واکنش به تیمارهای مختلف مس و روی

هادیان, جواد; عسگری لجایر, حمایت; متشرع‌زاده, بابک; قربانپور, منصور

بررسی تغییرات عملکرد و ترکیبات اسانس گیاه مرزه (Satureja hortensis) در واکنش به تیمارهای مختلف مس و روی

نویسندگان

¹ گروه مهندسی کشاورزی، پژوهشکده گیاهان و مواد اولیه دارویی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

² گروه مهندسی خاک‌شناسی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

³ گروه مهندسی خاک‌شناسی، پردیس کشاورزی و منابع، طبیعی، دانشگاه تهران، کرج، ایران

⁴ گروه گیاهان دارویی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه اراک، 83498-38156، اراک، ایران

چکیده

مس و روی از عناصر کم مصرف ضروری برای گیاه است که نقش‌های ساختاری و عملکردی متعددی در فرآیندهای متابولیکی گیاهان دارند. در این مطالعه، با توجه به اهمیت زیاد گیاه مرزه (Satureja hortensis) در زمینه‌های دارویی و صنعتی، اثر سطوح مختلف عناصر مس و روی بر تغییرات محتوا، عملکرد و ترکیبات شیمیایی اسانس این گیاه بررسی شد. تیمارهای آزمایش شامل مقادیر مختلف مس (0، 5 و 25 میلی‌گرم در کیلوگرم از منبع سولفات مس) و روی (0، 10 و 50 میلی‌گرم در کیلوگرم از منبع سولفات روی) و ترکیبی از تمام سطوح عناصر بودند. نمونه‌های اسانس پس از استخراج، با دستگاه‌های GC و GC/MS تحلیل شدند. در تحقیق حاضر، بیشترین محتوا و عملکرد اسانس در غلظت‌های 5 و 10 میلی‌گرم در کیلوگرم سولفات مس و سولفات روی و کمترین محتوا و عملکرد اسانس در غلظت‌های 25 و 50 میلی‌گرم در کیلوگرم سولفات مس و سولفات روی به دست آمد. آنالیز اسانس گیاه نشان داد که ترکیبات کارواکرول، گاما ترپینن، پاراسیمن و دلتا تری کارن از ترکیبات عمده اسانس هستند که به ترتیب در در غلظت‌های 5 و 10، 25 و 50 میلی‌گرم در کیلوگرم سولفات مس و 0، 5، 10 و 25 میلی‌گرم در کیلوگرم سولفات روی مشاهده شدند. مقایسه محتوا، عملکرد و ترکیبات اسانس در گیاهان تحت تیمارهای مختلف با گیاهان شاهد نشان داد که مقدار این شاخص‌ها و به ویژه مونوترپن‌های اکسیژنه با کاربرد سطوح اندک مس و روی افزایش و با کاربرد سطوح بالاتر همین عناصر از مقدار آنها کاسته شد.

کلیدواژه‌ها

20.1001.1.20088264.1394.7.24.6.4

عنوان مقاله [English]

Evaluation of essential oils content and yield of Satureja hortensis in response to different copper and zinc treatments

نویسندگان [English]

Javad Hadian ¹
Hemayat Asgari Lajayer ²
Babak Motesharezade ³
Mansour Ghorbanpour ⁴

¹ Department of Agricultural Engineering, Medicinal Plants and Drugs Research Institute, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran

² Department of Soil Science, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran

³ Department of Soil Science Engineering, Faculty of Agricultural Engineering and Technology, College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran

⁴ Department of Medicinal Plants, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Arak University, 38156-8-8349, Arak, Iran

چکیده [English]

Copper (Cu) and zinc (Zn) are the important trace elements for plant growth, which also play key roles in many structural and biochemical function in plants. In this study, regarding the high importance of the Savory (Satureja hortensis) plants in pharmaceuticals and food industries, the effects of different levels of Cu and Zn on essential oils content, yield and composition of reference plant were undertaken to investigate. The employed treatments were considered as Cu (0, 5, 25 mg kg-1 soil from CuSO4.5H2O) and Zn (0, 10, 50 mg kg-1 soil from ZnSO4.2H2O) as well as their combination. Isolated essential oil (EO) was analyzed using GC and GC-MS apparatus. The results revealed that the highest and the lowest EO content and yield are obtained in Cu5Zn10 and Cu25Zn50 treatments, respectively. The GC-MS analysis showed that carvacrol, Î³-terpinene, p-cymene and delta-3-carene are the main EO constituents and found in Cu5Zn10, Cu25Zn50, Cu25Zn10 and Cu5Zn0 treatments, respectively. The comparison of EO content, yield and compositions of plants treated with different Cu and Zn levels indicated that this characteristics and especially oxygenated monoterpenes value are increased with the low levels of employed elements and subsequently decreased with increasing the elements dosages.

کلیدواژه‌ها [English]

Essential oils
Sesquiterpenes
Zinc
Copper
Satureja hortensis
Monoterpenes

اصل مقاله

مرزه تابستانه (Satureja hortensis L.) از گیاهان دارویی و معطر مهمی است که به طور گسترده در ایران کشت می‌شود (Ghannadi, 2002). این گونه به همراه مرزه زمستانه تنها گونه‌های این جنس هستند که به عنوان سبزی، ادویه یا گیاه دارویی کشت می‌شوند (Gulluce et al.,2003). گیاه مرزه به طور سنتی برای درمان بیماری‌های مختلف نظیر: گرفتگی عضلات، دردهای عضلانی، تهوع، سوء هاضمه، اسهال و بیماری‌های عفونی کاربرد دارد (Hajhashemi et al., 2002). خواص ضد اسپاسم، آنتی‌اکسیدان، آرام‌بخش و ضد میکروبی این گیاه نیز اثبات شده است (Gulluce et al.,2003). اسانس گیاه مرزه به طور گسترده به عنوان آنتی‌اکسیدان و عامل ضد میکروبی در صنایع غذایی و دارویی استفاده می‌شود (Hadian et al., 2010). ترکیب کارواکرول، گاما ترپینن و پاراسیمن ترکیبات عمده گیاه مرزه گزارش شده است Gulluce et al.,2003)؛ Hadian et al., 2010). تأثیر عناصر کم مصرف در گیاهان دارویی و معطر به خوبی شناخته نشده است (Abugassa et al., 2008). در حال حاضر ثابت شده است که عناصر کم مصرف نقش مهمی در تشکیل ترکیبات شیمیایی فعال موجود در گیاهان دارویی دارند (Murch et al., 2003). مس و روی از عناصر کم مصرف ضروری هستند که جزو فلزات سنگین نیز طبقه‌بندی می‌شوند و نقش‌های ساختاری و عملکردی فراوانی در فرآیندهای متابولیکی گیاهان دارند، اما هم کمبود و هم مقدار اضافی آنها در خاک به عنوان عامل محدود کننده رشد برای گیاهان محسوب می‌شود (Grejtovsky et al., 2006).

عنصر روی به عنوان فعال کننده و کوفاکتور برخی آنزیم‌های حیاتی گیاه از جمله کربنیک‌انیدرازها، دهیدروژنازها، آلکالین فسفاتازها، فسفولیپازها و RNA‌پلی‌مرازها در ساخت و ساز پروتئین‌ها، قندها، نوکلئیک اسیدها و چربی‌ها، فتوسنتز گیاه و بیوسنتز اکسین به عنوان یک هورمون محرک رشد نقش دارد (Figueiredo et al., 2012). مس نیز یک عنصر انتقالی است و در فرآیندهای ساخت پروتئین و کربوهیدرات نقش مهمی دارد (Marschner, 1986). در یک مطالعه، Zheljazkov و همکاران (2006) تأثیر کادمیوم، سرب و مس را بر رشد و محتوای اسانس سه گیاه دارویی ریحان، شوید و نعنا فلفلی بررسی و گزارش کردند که عملکرد نعنا فلفلی و ریحان با تیمارهای فلزات سنگین تحت تأثیر قرار نگرفت و همچنین کادمیوم و سرب عملکرد شوید را تحت تأثیر قرار ندادند، اما مس در غلظت‌های زیاد ( 60 و 150 میلی‌گرم در لیتر) عملکرد و ارتفاع گیاه شوید را کاهش داد و همچنین تیمار 150 میلی‌گرم در لیتر مس به ظهور علایم سمیت و بازدارندگی رشد در گیاه شوید منجر شد. تیمار فلزات سنگین در ترکیب شیمیایی اسانس ریحان و شوید تغییر اندکی ایجاد کرد اما این تغییرات از روند مشخصی تبعیت نمی‌کرد. مقدار اسانس نعنا فلفلی و شوید در تأثیر تیمارها کاهش معنی‌داری نداشت و فقط کاربرد مس به مقدار 150 میلی‌گرم در لیتر مقدار اسانس را به طور معنی‌داری کاهش داد (Zheljazkov et al., 2006). با کاربرد فلزات سنگین به عنوان الیسیتور می‌توان تولید متابولیت ثانویه در گیاه را افزایش داد. در پژوهش Soltaninejad و همکاران (2013) تأثیر غلظت‌های 1 و 10 میکرومولار اکسید مس و روی بر تغییرات میزان متابولیت‌های ثانویه گیاه شیرین بیان بررسی شد. بر اساس نتایج این محققان غلظت‌های 1 و 10 میکرومولار اکسید مس، میزان گلیسیریزین، ترکیبات فنلی، فلاونوییدها و آنتوسیانین‌ها به طور قابل توجهی افزایش داشت در حالی که اکسید روی تأثیر درخور توجهی بر میزان این متابولیت‌ها نداشت. گزارش شده است که کمبود مس به عنوان یک نارسایی تغذیه‌ای در گیاهان مناطق خشک و نیمه خشک و در خاک‌های قلیایی متداول است. این عنصر همچنین به عنوان یک ریزمغذی ضروری برای آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی نظیر سوپر اکسید دیسموتاز (SOD) عمل می‌کند. علاوه بر این، مس نقش کلیدی در سنتز متابولیت‌های ثانویه از جمله ترکیبات فنلی داشته، کمبود آن می‌تواند باعث کاهش سطح ترکیبات فنلی در گیاهان شود (Dicko et al., 2006).

پژوهش‌های فراوانی پیرامون تأثیر عوامل محیطی بر مقدار و نوع متابولیت‌های ثانویه گیاهان دارویی انجام شده است. اگرچه مطالعاتی در مورد تأثیر عناصر پر مصرف بر ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه مرزه انجام شده است اما در مورد تأثیر عناصر کم مصرف و فلزات سنگین بر این گیاه هنوز اطلاعات کافی وجود ندارد. لذا در پژوهش حاضر، با توجه به اهمیت عناصر روی و مس در مسیرهای متابولیسمی سنتز ترکیبات دارویی، تأثیر سطوح مختلف این عناصر و آثار متقابل آنها بر تغییرات محتوا، عملکرد و ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه مرزه (Satureja hortensis L.) بررسی شد.

مواد و روش‌ها.

کشت گلدانی: تحقیق حاضر به صورت یک آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار، در بهار سال 1391 در گلخانه گروه مهندسی علوم خاک دانشگاه تهران انجام شد. از آنجا که می‌بایست نمونه خاک مورد استفاده از نظر مس و روی در حد پایینی باشد، از عمق 0 تا 30 سانتی‌متری مناطق مختلف نمونه‌های خاک جمع‌آوری و پس از تجزیه برای انجام آزمایش به گلخانه آورده شد و پس از خشک کردن در هوای آزاد و عبور از الک 2 میلی‌متری، برخی از ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی آن از جمله بافت خاک با روش هیدرومتری (Bouyoucos, 1962)، رطوبت ظرفیت مزرعه (FC) با صفحه فشاری (Page, 1982)، اسیدیته و هدایت الکتریکی در عصاره اشباع (Haluschak,2006)، ظرفیت تبادل کاتیونی (CEC) خاک با روش باور (Page,1982)، درصد کربن آلی با روش Walkley و Black (1934)، درصد آهک با روش حجم‌سنجی (Gupta,1999)، نیتروژن کل خاک با روش هضم کجلدال (Bremner and Mulvaney,1982)، فسفر قابل استخراج با بی‌کربنات سدیم 5/0 مولار با روش اولسن (Sparks et al., 1996)، پتاسیم قابل جذب با روش استخراج با استات آمونیوم نرمال و مقدار قابل جذب روی، مس، آهن و منگنز با روش استخراج با DTPA (Sparks et al., 1996) تعیین شد (جدول 1). تیمارهای آزمایش شامل سطوح مختلف مس (صفر، 5 و 25 میلی‌گرم در کیلوگرم) از منبع سولفات مس (CuSO₄.5H₂O) و سطوح مختلف روی (صفر، 10 و 50 میلی‌گرم در کیلوگرم) از منبع سولفات روی (ZnSO₄.2H₂O) و اثر متقابل آنها بودند. برای اعمال تیمارها، عناصر مس و روی به صورت نمک‌های محلول در 200 میلی‌لیتر آب مقطر حل شد و به طور یکنواخت و به صورت لایه لایه به سطح خاک افشانه شد تا مخلوط یکدست و یکنواخت حاصل شود و در هر مرحله خاک هر گلدان به صورت جداگانه مخلوط و یکنواخت شد. پس از اعمال تیمارهای مس و روی در گلدان و رساندن رطوبت آن به حد 7/0 ظرفیت مزرعه‌ای (FC) به منظور حصول تعادل عناصر مس و روی با خاک گلدان‌ها، به مدت دو ماه انکوباسیون شد. همچنین پیش از کشت و برای جلوگیری از بروز علایم کمبود سایر عناصر در گیاه و بر اساس نتایج آزمون خاک عناصر پتاسیم به میزان70 میلی‌گرم در کیلوگرم خاک از منبع سولفات پتاسیم، فسفر به میزان 4 میلی‌گرم در کیلوگرم خاک از منبع سوپر فسفات تریپل پیش از کشت اضافه شد. همچنین عنصر نیتروژن در چهار مرحله و هر مرحله 60 میلی‌گرم نیتروژن از منبع اوره همراه با آب آبیاری به هر گلدان اضافه گردید. برای کشت از گلدان‌های پلاستیکی 4 کیلوگرمی استفاده گردید. بذر مرزه تابستانه از پژوهشکده گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی (کد بذر بانک بذر: MPIS-741) تهیه شد، سپس در خزانه کشت و پس از رسیدن به مرحله سه برگی به تعداد 4 عدد گیاهچه یکنواخت به هر گلدان منتقل شد. آبیاری گلدان‌ها تا پایان آزمایش با آب مقطر تا رسیدن به دامنه 7/0 تا 8/0 ظرفیت زراعی با روش وزنی صورت گرفت. گلدان‌ها هر هفته به طور تصادفی روی سینک گلخانه جابه‌جا شدند. در هفته دوازدهم پس از کاشت و رسیدن به مرحله گلدهی کامل، گیاهان از محل طوقه قطع شدند.

جدول 1- نتایج تجزیه فیزیکی و شیمیایی خاک استفاده شده در کشت گلخانه‌ای پیش از اعمال تیمارهای مس و روی. *: DTPA-Extractable

ویژگی خاک	مقدار	ویژگی خاک	مقدار
رس (%)	46/17	منیزیم (meql^-1)	6/2
سیلت (%)	00/18	ظرفیت تبادل کاتیونی (Cmolckg^-1)	77/10
شن (%)	56/64	نیتروژن کل (%)	044/0
بافت خاک	لوم شنی	فسفر قابل جذب (mgkg^-1)	79/8
اسیدیته	4/7	پتاسیم قابل جذب (mgkg^-1)	180
هدایت الکتریکی (dSm^-1)	28/1	آهن (mgkg^-1) *	3/12
کربنات کلسیم (%)	77/6	منگنز (mgkg^-1) *	32/9
کربن آلی (%)	63/0	مس (mgkg^-1) *	63/0
درصد اشباع	1/29	روی (mgkg^-1) *	71/0
سدیم (meql^-1)	46/2	کربنات هیدروژن (meql^-1)	1/4
کلسیم (meql^-1)	4/8	کلر (meql^-1)	8/3

استخراج اسانس: به منظور تعیین مقدار اسانس اندام هوایی، در مرحله گل‌دهی کامل (هفته دوازدهم از زمان کاشت) از نیمی از گیاهان هر گلدان پس از آسیاب نمودن، به مدت 3 ساعت با روش تقطیر با آب به وسیله دستگاه کلونجر اسانس‌گیری به عمل آمد (British Pharmacopoeia, 1993). مقدار محتوای (درصد) اسانس، پس از رطوبت‌زدایی توسط سولفات سدیم خشک نسبت به وزن خشک گیاه محاسبه شد و تا زمان آنالیز دورن یخچال در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. پس از تعیین درصد اسانس، عملکرد آن نیز از حاصلضرب وزن خشک گیاه و درصد اسانس به دست آمد.

شناسایی ترکیبات اسانس: برای تجزیه و شناسایی ترکیبات تشکیل دهنده اسانس از دستگاه کروماتوگراف گازی (GC) و کروماتوگراف گاز متصل به طیف‌سنج جرمی (GC/MS) استفاده شد. شناسایی طیف‌ها به کمک محاسبه شاخص بازداری کواتس (RI) که با تزریق هیدروکربن‌های نرمال
(C₆-C₂₄) در شرایط یکسان با تزریق اسانس‌ها انجام شد و با مقادیری که در منابع مختلف منتشر گردیده بود، مقایسه شد. بررسی طیف‌های جرمی نیز برای شناسایی ترکیب‌ها انجام گردید و شناسایی‌های انجام شده، با استفاده از طیف‌های جرمی ترکیب‌های استاندارد و استفاده از اطلاعات موجود در کتابخانه‌های مختلف تأیید گردید. درصد نسبی هر کدام از ترکیب‌های تشکیل دهنده اسانس‌ها با توجه به سطح زیر منحنی آن در طیف کروماتوگرام به دست آمد و با مقادیر گزارش شده در منابع مختلف با در نظر گرفتن اندیس کواتس مقایسه گردید (Adams, 2001).

کروماتوگراف گازی (GC): برای کروماتوگرافی گازی، از دستگاه GC (مدل 6980، شرکت Agilent، آمریکا) مجهز به آشکارساز FID (یونیزاسیون شعله هیدروژن) با ستون از نوع DB-5 به طول 30 متر و قطر داخلی 25/0 میلی‌متر و ضخامت لایه فاز ساکن برابر با 25/0 میکرومتر با گاز حامل نیتروژن استفاده شد. سرعت گاز حامل برابر با 1/1 میلی‌متر بر دقیقه و برنامه دمایی دستگاه به صورت زیر تنظیم شد: ابتدا دما از 60 درجه سانتیگراد آغاز و در هر دقیقه چهار درجه سانتیگراد به آن افزوده شد تا به دمای 250 درجه سانتیگراد رسید و به مدت 10 دقیقه در این دما باقی ماند. دمای محفظه تزریق 250 درجه سانتیگراد و دمای آشکارساز 300 درجه سانتیگراد تنظیم شد.

.کروماتوگراف گازی متصل به طیف‌سنج جرمی (GC/MS):برای طیف GC/MS از دستگاه گاز کروماتوگرف متصل بهطیف‌سنج جرمی (مدل 5970، شرکت Agilent، آمریکا) و مجهز به آشکارساز FID و ستون مویی DB-5 به طول ستون 60 متر، قطر داخلی 25/0 میلی‌متر و ضخامت لایه فاز ساکن برابر با 25/0 میکرومتر با گاز حامل هلیم و ولتاژ یونیزاسیون 70 الکترون ولت استفاده شد. همچنین، دمای خط انتقال 250 درجه سانتیگراد تنظیم شد. دمای کوره با دمای ذکر شده در مورد دستگاه GC یکسان بود.

تحلیل آماری:برای تحلیل داده‌های آماری حاصل از اندازه‌گیری صفات، تعیین انحراف استاندارد (±SD) از نرم‌افزار SAS استفاده شد. مقایسه میانگین صفات مورد نظر با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد صورت گرفت.

نتایج.

محتوای و عملکرد اسانس:نتایج تأثیر تیمارهای مختلف مس و روی بر محتوای اسانس (درصد) گیاه مرزه در شکل 1 نشان داده شده است. همان طور که مشاهده می‌شود تغییرات قابل ملاحظه‌ای در نتیجه استفاده از این عناصر در محتوای اسانس گیاه حاصل نشد، اما بیشترین و کمترین درصد اسانس (18/1 و 96/0 درصد) به ترتیب در تیمارهای Cu₅Zn₁₀ و Cu₂₅Zn₅₀ به دست آمد. همچنین، نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که اثر برهم‌کنش مس و روی بر عملکرد اسانس در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار است (جدول 2). مقایسه میانگین مربوط به تأثیر مس و روی بر عملکرد اسانس در شکل 2 ارایه شده است. عملکرد اسانس با کاربرد 10 میلی‌گرم روی بر کیلوگرم خاک موجب افزایش 25/15 درصدی و با کاربرد 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم همین عنصر، کاهش 83/26 درصدی را نسبت به شاهد نشان داد. همچنین، نتایج نشان داد که افزایش 61/11 درصدی عملکرد اسانس با کاربرد 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم مس حاصل شد و کاربرد بیشتر مس در خاک (25 میلی‌گرم مس بر کیلوگرم) تأثیر معنی‌داری بر عملکرد اسانس گیاه مرزه ندارد. بیشترین و کمترین عملکرد اسانس (34/41 و 13/24 میلی‌گرم در گیاه) نیز به ترتیب در تیمارهای Cu₅Zn₁₀ و Cu₂₅Zn₅₀ به دست آمد (شکل 2).

شکل 1- تأثیر تیمارهای مختلف مس و روی بر درصد اسانس گیاه مرزه. تیمارهای آزمایش شامل سطوح مس (صفر، 5 و 25 میلی‌گرم در کیلوگرم) و روی (صفر، 10 و 50 میلی‌گرم در کیلوگرم). مقادیر میانگین 3 تکرار ± SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

شکل 2- تأثیر تیمارهای مختلف مس و روی بر عملکرد اسانس (میلی‌گرم در گیاه) مرزه تیمارهای آزمایش شامل سطوح مس (صفر، 5 و 25 میلی‌گرم در کیلوگرم) و روی (صفر، 10 و 50 میلی‌گرم در کیلوگرم). مقادیر میانگین 3 تکرار ± SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

جدول 2- نتایج تجزیه واریانس (ANOVA) اثر تیمارهای مختلف مس و روی بر ترکیبات عمده و عملکرد اسانس گیاه دارویی مرزه.^**، ^* و ns به ترتیب از نظر آماری دارای اخلاف معنی‌دار در سطح 1 و 5 درصد و عدم اختلاف معنی‌دار

میانگین مربعات					درجه آزادی	منابع تغییر
عملکرد اسانس	delta-3-carene	carvacrol	γ-terpinene	p-cymene	درجه آزادی	منابع تغییر
84/103^**	67/0^**	81/50^*	38/45^*	97/3^**	2	مس
85/268^**	97/1^**	90/40^*	98/43^**	89/8^**	2	روی
87/16^**	69/1^**	48/12^ns	14/13^**	43/1^*	4	مس × روی
72/3	009/0	52/9	38/0	32/0	18	اشتباه آزمایش
03/6	80/11	55/4	29/7	36/11		ضریب تغییرات (درصد)

.تغییرات میزان ترکیبات اسانس در نسبت‌های مختلف مس و روی: در کشت و زرع گیاهان دارویی، علاوه بر عملکرد اسانس نوع و مقدار ترکیبات تشکیل‌دهنده اسانس نیز حایز اهمیت است. نتایج تجزیه واریانس (جدول 2) نشان داد که تأثیر مس و روی بر چهار ترکیب عمده اسانس یعنی کاواکرول، گاما ترپینن، پاراسیمن و دلتا تری کارن معنی‌دار است اما اثر متقابل آنها فقط بر کارواکرول معنی‌دار نشد. با تجزیه اسانس شاخساره گیاه مزره، حدود 19 ترکیب شناسایی شد که در مجموع 84 تا 95 درصد اسانس را تشکیل می‌دهد. این تجزیه نشان دهنده اهمیت زیاد کارواکرول و گاما ترپینن در اسانس مرزه است که در این آزمایش بیشترین جزء را تشکیل می‌دهند (جدول 3). نتایج مقایسه میانگین داده‌ها (جدول 3) نشان داد که افزایش مس و روی به تنهایی تأثیر معنی‌داری بر مقدار کارواکرول ندارد. کاربرد 5 میلی‌گرم مس بر کیلوگرم خاک (Cu₅Zn₀) و 10 میلی‌گرم روی بر کیلوگرم (Cu₀Zn₁₀) به ترتیب باعث افزایش 63/7 و 50/8 درصدی در مقدار کارواکرول شد، در حالی که با کاربرد سطوح بالاتر مس و روی (به ترتیب 25 و 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم) از مقدار کارواکرول کاسته شد اما همواره بیشتر از مقدار کارواکرول در تیمار شاهد بود.

جدول 3- مقایسه ترکیبات اسانس گیاه مرزه تحت تأثیر تیمارهای مختلف مس و روی. مقادیر میانگین 3 تکرار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.

تیمار									اندیس بازدارنده	نام ترکیب
CU₂₅Zn₅₀	CU₂₅Zn₁₀	CU₂₅Zn₀	CU₅Zn₅₀	CU₅Zn₁₀	CU₅Zn₀	CU₀Zn₅₀	CU₀Zn₁₀	CU₀Zn₀.	اندیس بازدارنده	نام ترکیب
48/0bc	69/0ab	88/0a	58/0abc	67/0ab	90/0a	79/0ab	68/0ab	28/0c	933	α-pinene
45/0cd	75/0a	73/0a	53/0bcd	66/0ab	70/0ab	70/0ab	61/0abc	40/0d	974	β-pinene
47/0ab	44/0ab	44/0ab	31/0cd	41/0bc	37/0bc	40/0bc	51/0a	26/0d	981	Myrcene
53/0e	86/0cd	21/1ab	99/0bc	68/0de	41/1a	04/1bc	90/0bcd	-	999	α-phelandrene
17/0f	43/0e	50/1b	21/0f	94/0d	28/2a	14/1c	49/0e	32/0ef	1007	delta-3-carene
29/5bcd	49/6a	55/5abc	86/3ef	94/5ab	30/4de	73/4cde	06/6ab	97/2f	1014	p-cymene
21/22a	21/20ab	48/21a	90/20a	41/12d	92/17bc	04/20ab	31/17c	24/16c	1080	γ-terpinene
20/0ab	13/0ab	-	28/0a	09/0ab	-	-	17/0ab	-	1163	cis-sabinene hydrate
21/0b	34/0a	-	33/0a	-	-	-	17/0b	-	1175	linalool
-	13/0b	-	24/0a	25/0a	-	-	-	-	1225	thymyl methyl ether
17/0bc	21/0ab	20/0abc	14/0c	26/0a	-	-	20/0abc	22/0ab	1266	thymol
34/65b	02/66b	04/66b	16/67b	49/74a	57/69ab	51/66b	13/70ab	63/64b	1282	carvacrol
-	26/0b	14/0d	18/0cd	-	-	-	22/0bc	64/0a	1296	4- terpinyl acetate
15/0c	44/0a	26/0bc	20/0bc	14/0c	30/0b	-	14/0c	47/0a	1345	carvacryl acetate
-	12/0c	-	11/0c	-	38/0b	43/0b	-	61/0a	1424	β-caryophyllene
37/0abc	30/0c	43/0ab	46/0a	32/0bc	-	-	49/0a	-	1427	α-humulene
47/0b	30/0c	28/0cd	12/0de	73/0a	-	32/0bc	48/0b	-	1501	β-bisabolene
15/0c	24/0b	-	11/0c	64/0a	-	-	15/0c	-	1576	spathulenol
-	21/0a	-	19/0a	-	-	-	-	-	1580	caryophyllene oxide
72/96	64/98	20/99	24/97	69/98	16/98	11/96	72/98	07/87		Total identified

بیشترین مقدار کارواکرول در تیمار ترکیبی 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم مس و 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم روی (Cu₅Zn₁₀) به میزان 49/74 درصد و کمترین مقدار آن در شاهد مشاهده شد. گاما ترپینن دومین ترکیب مهم گیاه مرزه بود. کاربرد مس و روی در سطوح پایین (به ترتیب 5 و 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم) بر گاما ترپینن تأثیر معنی‌داری نداشته است (جدول 3). اما کاربرد سطوح بالاتر همین عناصر (25 میلی‌گرم بر کیلوگرم مس و 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم روی) باعث افزایش 26/32 و 39/23 درصد در میزان گاما ترپینن گردید. بیشترین مقدار این ترکیب در تیمار ترکیبی 25 میلی‌گرم بر کیلوگرم مس و 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم روی به میزان 21/22 درصد و کمترین مقدار آن در تیمار شاهد با 24/16 درصد حاصل شد. روند تغییرات مقدار پاراسیمن در پاسخ به تیمار مس و روی در جدول 3 آمده است. کاربرد سطوح 10 و 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم روی به ترتیب باعث افزایش 102 و 25/59 درصدی در میزان این ترکیب گردید. کاربرد سطوح 5 و 25 میلی‌گرم بر کیلوگرم مس نیز باعث افزایش 78/44 و 86/86 درصدی آن شد. بیشترین میزان این ترکیب در تیمار Cu₂₅Zn₁₀ به میزان 49/6 درصد و کمترین مقدار آن در تیمار شاهد به میزان 97/2درصد به دست آمد. همان طور که در جدول 3 مشاهده می‌شود، کاربرد 10 میلی‌گرم روی بر کیلوگرم بر مقدار ترکیب دلتا تری کارن تأثیر معنی‌داری نداشته است.

کاربرد بیشتر روی در خاک موجب افزایش 25/256 درصدی در مقدار این ترکیب شد. در ارتباط با تأثیر مس بر مقدار این ترکیب، نتایج نشان داد که اختلاف هر دو سطح مس (5 و 25 میلی‌گرم بر کیلوگرم) بر مقدار این ترکیب معنی‌دار شد، به طوری که سطح 5 میلی‌گرم در کیلوگرم مس بیشترین مقدار این ترکیب به میزان 28/2 درصد و با افزایش 5/612 درصدی نسبت به شاهد را ایجاد کرد اما در سطح 25 میلی‌گرم مس بر کیلوگرم نیز درصد افزایش نسبت به شاهد به 75/368 درصد کاهش یافت. کمترین مقدار این ترکیب نیز در تیمار 25 میلی‌گرم مس بر کیلوگرم و 50 میلی‌گرم روی بر کیلوگرم به دست آمد.

.تغییرات میزان ترپن‌های موجود در اسانس در پاسخ به تیمار مس و روی: مقایسه میزان ترکیبات ترپنی موجود در اسانس در نسبت‌های مختلف مس و روی در جدول 4 ارایه شده است. همان طور که مشاهده می‌شود، با کاربرد سطوح 10 و 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم روی، مقدار مونوترپن‌های هیدروکربنه و اکسیژنه در هر دو افزایش یافت. به طوری که این افزایش در مورد مونوترپن‌های هیدروکربنه چشمگیر بود و با افزایش کاربرد روی روند صعودی داشت. مونوترپن‌های اکسیژنه، با کاربرد 10 میلی‌گرم روی بر کیلوگرم افزایش یافت اما با کاربرد سطح 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم از مقدار مونوترپن‌های اکسیژنه کاسته شد اما همواره بیشتر از تیمار شاهد بود. در مورد مس نیز، روند تغییرات در میزان مونوترپن‌های هیدروکربنه و اکسیژنه، با کاربرد سطوح 5 و 25 میلی‌گرم مس بر کیلوگرم همانند روند مشاهده شده در مورد کاربرد سطوح روی بود. مقدار کلی مونوترپن‌ها نیز با اعمال تیمارهای مس و روی نسبت به شاهد افزایش داشت. بیشترین مقدار مونوترپن‌های هیدروکربنه به میزان 82/31 درصد در تیمار کاربرد 25 میلی‌گرم مس بر کیلوگرم و بدون کاربرد روی و مونوترپن اکسیژنه به میزان 26/75 درصد در تیمار کاربرد 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم مس و 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم روی مشاهده شد. همچنین کمترین مقدار آنها نیز در تیمار شاهد به ترتیب به میزان 48/20 و 98/65 درصد بود. مقدار سزکوئی‌ترپن‌ها نیز در پاسخ به تیمار مس و روی تغییراتی داشتند. به طوری که سزکوئی‌ترپن‌های هیدروکربنه با کاربرد سطوح 10 و 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم روی بیشتر از شاهد بود. با این که در تیمار 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم روی نسبت به 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم همین عنصر کاهش داشت اما در هر دو تیمار بیشتر از شاهد بود. با کاربرد 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم مس مقدار سزکوئی‌ترپن‌های هیدروکربنه نسبت به شاهد کاهش اما با کاربرد سطوح بالاتر همین عنصر (25 میلی‌گرم بر کیلوگرم) افزایش را نسبت به شاهد نشان داد. بیشترین مقدار سزکوئی‌ترپن هیدروکربنه در تیمار ترکیبی 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم مس و 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم روی به میزان 05/1 و کمترین مقدار آن نیز، در تیمار کاربرد 5 میلی‌گرم در کیلوگرم مس و عدم کاربرد روی به میزان 38/0 مشاهده شد. با این که سزکوئی‌ترپن‌های اکسیژنه در تیمار شاهد وجود نداشت اما با کاربرد تیمار مس و روی هرچند به مقدار جزیی در اسانس این گیاه دارویی ظاهر شد. مقدار کلی سزکوئی‌ترپن‌ها نیز به جز در تیمار کاربرد 5 میلی‌گرم در کیلوگرم در سایر تیمارها نسبت به شاهد افزایش داشت.

جدول 4- مقایسه مونوترپن‌ها و سزکوئی‌ترپن‌های اسانس گیاه مرزه تحت تأثیر تیمارهای مختلف مس و روی

تیمار									طبقه‌بندی ترکیبات
CU₂₅Zn₅₀	CU₂₅Zn₁₀	CU₂₅Zn₀	CU₅Zn₅₀	CU₅Zn₁₀	CU₅Zn₀	CU₀Zn₅₀	CU₀Zn₁₀	CU₀Zn₀.	طبقه‌بندی ترکیبات
63/29	89/29	82/31	42/27	73/21	91/27	85/28	53/26	48/20	مونوترپن‌های هیدروکربنه
09/66	56/67	65/66	56/68	26/75	87/69	51/66	06/71	98/65	مونوترپن‌های اکسیژن‌دار
72/95	45/97	47/98	98/95	99/96	78/97	36/95	59/97	46/86	مونوترپن‌های کل
85/0	73/0	72/0	96/0	05/1	38/0	75/0	98/0	61/0	سزکوئی‌ترپن‌های هیدروکربنه
15/0	46/0	-	3/0	64/0	-	-	15/0	-	سزکوئی‌ترپن‌های اکسیژن‌دار
1	19/1	72/0	26/1	69/1	38/0	75/0	13/1	61/0	سزکوئی‌ترپن‌های کل

بحث.

افزایش معنی‌دار عملکرد اسانس در سطوح اندک مس و روی (به ترتیب 5 و 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم)، نشان دهنده اهمیت عناصر ریزمغذی در کشت و زرع گیاه دارویی مرزه است. با مصرف مس و روی در سطوح کم به دلیل تأمین نیازهای تغذیه‌ای، افزایش کارآیی جذب سایر عناصر غذایی کم مصرف (Pande et al., 2007) و پر مصرف (Khan et al., 2002) فعال‌سازی آنزیم‌های مرتبط با تکثیر و طویل‌شدگی سلول‌ها (Figueiredo et al., 2012)، فعالیت فتوسنتزی و توسعه پوشش گیاهی افزایش می‌یابد.

بنابراین می‌توان یکی از دلایل افزایش محتوا و در نتیجه عملکرد اسانس را، افزایش عملکرد ماده خشک در سطوح کم مس و روی دانست. با توجه به تأثیر عناصر مس و روی بر رشد و نمو گیاه، می‌توان یکی از دلایل افزایش فعالیت فتوسنتزی را مرتبط با مهم‌ترین بخش فتوسنتز کننده در گیاه یعنی برگ‌ها دانست. به طوری که استفاده از عناصر غذایی باعث افزایش سطح برگ می‌شود که این افزایش به تولید بیشتر غده‌های ترشح کننده اسانس در برگ منجر می‌گردد (Sifola and Barbieri, 2006) همچنین با افزایش سطح برگ، تعداد روزنه به عنوان محل ورود دی اکسید کربن و گلوکز به عنوان پیش‌ماده مناسب در سنتز اسانس‌ها و به عنوان نتیجه فرآیند فتوسنتز زیاد شده و در نتیجه سوبسترای لازم برای سنتز اسانس در گیاه فراهم می‌شود (Sangwan et al., 2001). به این ترتیب می‌توان با کاربرد مس و روی در سطوح پایین، علاوه بر افزایش عملکرد ماده خشک، از عملکرد اسانس قابل توجهی برخوردار بود. پیش از این اثر مثبت عناصر ریزمغذی بر عملکرد اسانس نیز گزارش شده است (Hendawy and Khalid, 2005). در مورد کاهش عملکرد اسانس در غلظت زیاد مس و روی باید اظهار داشت که این امر ممکن است به علت بازدارندگی این عناصر سنگین بر رشد و نمو و کاهش رشد تحت تأثیر فلزات سنگین نسبت داده شود. نتایج تحقیق حاضر مبنی بر کاهش عملکرد اسانس در غلظت زیاد مس و روی با یافته‌های Misra و Sharma (1991) و Elzaawely و همکاران (2007) مطابقت دارد.

ترکیبات اسانس گیاه مرزه تابستانه شامل پاراسیمن، کارواکرول، تیمول و گاماترپین به عنوان ترکیبات اصلی این گیاه در مطالعات زیادی گزارش شده است. در مطالعه‌ای، Baher و همکاران (2000) کارواکرول و گاما ترپینن را ترکیبات عمده اسانس گیاه مرزه تابستانه معرفی کردند و همچنین کاهش گاما ترپینن و افزایش کارواکرول تحت تنش خشکی در نتایج آنها به اثبات رسید. همچنین Baser و همکاران (2004) اسانس مرزه تابستانه زراعی و خودرو را از 20 منطقه مختلف در ترکیه بررسی و مشاهده نمودند که در تمامی نمونه‌های زراعی، کارواکرول بیشترین درصد را به خود اختصاص داده بود اما در نمونه‌های خودرو ترکیب تیمول بیشترین درصد را داشت. Hadian و همکاران (2010) نیز گزارش کردند که کارواکرول (42-3/83 درصد)، گاما ترپینن (5/0-5/28 درصد) و پاراسیمن (1-1/17 درصد) ترکیب عمده گیاه مرزه تابستانه بود. مطالعات زیادی پیرامون تأثیر عناصر روی و مس بر ترکیبات اسانس دیگر گیاهان دارویی انجام شده است. حد بحرانی عنصر روی بر تولید منتول در گیاه نعنا ژاپنی بررسی و گزارش شده است که با افزایش روی تا 05/0 میلی‌گرم بر لیتر به طور معنی‌داری افزایش و در سطوح بالاتر کاهش معنی‌داری را نشان داد (Misra and Sharma, 1991). همچنین Aziz و همکاران (2010) افزایش ترکیبات اصلی اسانس گیاه علف لیمو را با کاربرد روی و آهن گزارش داده‌اند. بنا به گزارش آنها کاربرد محلول‌پاشی 100 پی‌پی‌ام آهن و 100 پی‌پی‌ام روی مؤثرترین تیمار برای افزایش ژرانیول و نرال (عمده‌ترین ترکیبات اسانس علف لیمو) بود. همان طور که مشاهده شد کاربرد مس و روی در سطوح پایین به عنوان عناصر ریزمغذی باعث افزایش ترکیبات عمده اسانس و بهبود کیفیت اسانس شد. همچنین کاربرد سطوح بالای این فلزات نیز نه تنها بر ترکیبات عمده اثر منفی نداشت بلکه اثر مثبت معنی‌داری نیز نداشته است. بنابراین، کشت و زرع این گیاه دارویی می‌تواند در زمین‌های کشاورزی دارای آلودگی متوسط فلزات مس و روی پیشنهاد گردد، بدون این که ترکیب اسانس تغییر قابل توجهی را داشته باشد و بر بازارپسندی آن تأثیر منفی داشته باشد. به هر حال، کاربرد تیمارهای مس و روی موجب افزایش معنی‌دار در مقدار ترکیبات آلفا پینن، بتا پینن و میرسن شد. از سوی دیگر، ترکیبات 4-ترپینل استات، کارواکریل استات و بتا کاریوفیلن با کاربرد تیمارهای مس و روی کاهش معنی‌داری نشان دادند.

در آزمایش حاضر، تیمارهای مختلف مس و روی بر ترکیب تیمول تأثیر معنی‌داری نداشتند. همچنین ترکیبات آلفا فیلاندرن، سیس سابینن هیدرات، لینالول، تیمول متیل اتر، آلفا هومولن، بتا بیسابولن، اسپاتولنول و کاریوفیلن اکسید در تیمار شاهد مشاهده نشدند و با اعمال تیمارهای مس و روی در اسانس پدیدار شدند. بررسی‌های دیگری در مورد تغییر ترکیبات اسانس به وسیله مس و سایر آلاینده‌ها گزارش شده است. به طوری که Berta و همکاران (1997) تغییرات در کمیت و کیفیت ترپن‌های موجود در گیاه کاج جنگلی را در دو محیط تمیز و آلوده (شهری) بررسی و گزارش کردند که ده ترکیب ترپن در کاج‌های روییده در محیط شهری شناسایی شد که نسبت به کاج‌های روییده در محیط سالم دو عدد بیشتر بود. همچنین در کاج‌های روییده در محیط آلوده، مقدار سیترال، کامفن، میرسن و به ویژه آلفا پینن، بسیار اندک بود، در حالی که مقدار بتاپینن، پاراسیمن، آلفا بیسابولول، اژونول، کاروون و ترپینول بالاتر از درختان روییده در محیط سالم بود. همچنین Abdelnaser و همکاران (2007) سمیت سولفات مس را بر گیاه دارویی Alpinia zerumbet بررسی و گزارش کردند که سمیت سولفات مس باعث افزایش درصد ترکیبات 1 و 8- سینئول، لینالول، کامفور، بورنئول، 4- ترپینن ال، کریپتن، آلفا ترپینل و کومین آلدهید گردید.

در رابطه با تغییر ترکیبات اسانس می‌توان اظهار نمود که با توجه به این که خاصیت آنتی‌اکسیدانی ترکیبات عمده اسانس این گیاه در مطالعات دیگر به اثبات رسیده است Choi et al., 2000)؛ Milos and Makota, 2012)، همچنین افزایش درصد ترکیبات کم یا ظهور ترکیبات جدید در غلظت‌های زیاد مس و روی که خواص آنتی‌اکسیدانی آنها اثبات شده است (Ruberto and Baratta, 2000)، می‌توان گفت که احتمالا گیاه با افزایش اسانس‌های آنتی‌اکسیدان خود، مقاومت خود را در برابر تنش اکسیداتیو القا شده توسط سطوح بالای مس و روی افزایش می‌دهد و سلول‌های خود را در مقابل شرایط تنش محافظت می‌کند. در خصوص تغییرات میزان ترپنوئیدها تحت تأثیر مس و روی باید اظهار داشت که بیوسنتز اسانس‌ها در غده‌های ترشحی اتفاق می‌افتد که از لحاظ کربن هتروتروف هستند، بنابراین وجود منبع کربن از جمله ترکیبات فتوسنتزی مانند سوکروز، گلوکز و تثبیت کربن برای بیوسنتز ترکیبات ترپنوئیدی لازم و ضروری است
(Mc-Garvey and Croteau, 1995)، بنابراین تغییرات بیوسنتز ترکیبات ترپنوئیدی از جمله مونوترپن‌ها و سزکوئی‌ترپن‌ها ممکن است به علت تغییرات بیوانرژیتیک سلول‌های گیاهی در پاسخ به فلزات مس و روی باشد و به نظر می‌رسد که یکی از دلایل اختلاف در مقدار و نوع برخی از مواد مؤثره در اسانس گیاه مورد آزمایش، مربوط به اختلاف جایگاه‌های بیوسنتزی ترکیبات از نظر بهره‌گیری از منابع انرژی باشد.

جمع‌بندی.

مقایسه عملکرد و ترکیبات اسانس گیاه مرزه (Satureja hortensis) در گیاهان تحت تیمارهای مختلف مس و روی با گیاهان شاهد نشان داد که مقدار این شاخص‌ها و به ویژه مونوترپن‌های اکسیژنه با کاربرد سطوح کم مس و روی افزایش و با کاربرد سطوح بالاتر همین عناصر از مقدار آنها کاسته شد. بنابراین، این گیاه می‌تواند به عنوان یک گیاه جانشین در اراضی کشاورزی حاوی مقادیر اندکی از این عناصر کشت شود بدون آن که فرآورده‌های تجاری و دارویی با ارزش آن آلوده به این عناصر شود.

سپاسگزاری.

نگارندگان از اعضا و کارشناسان محترم آزمایشگاه خاکشناسی دانشکده کشاورزی دانشگاه تهران به خاطر همکاری صمیمانه در اندازه‌گیری ویژگی‌های خاک قدردانی می‌نمایند.

مراجع

Abdelnaser, A., Elzaawely, T., Xuan, D. and Shinkichi, T. (2007) Changes in essential oil, kava pyrones and total phenolics of Alpinia zerumbet (Pers.) B. L. Burtt. & R. M. Sm. leaves exposed to copper sulphate. Environmental and Experimental Botany 59: 347-353.

Abugassa, I. O., Bashir, A. T., Doubali, K., Etwir, R. H., Abu-Enawel, M. and Abugassa, S. O. (2008) Characterization of trace elements in medicinal herbs by instrumental neutron activation analysis. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 278: 559-563.

Adams, R. (2001) Identification of essential oil components by gas chromatography/ quadrupole mass spectroscopy. 4^th edition, Allured Publishing Corporation, Carol Stream, USA.

Aziz, E. E., El-Danasoury, M. M. and Craker, L. E. (2010) Impact of sulphur and ammonium sulphate on dragonhead plants grown in newly reclaimed soil. Journal of Herbs Spices and Medicinal Plants16: 126-135.

Baher, Z., Mirza, M., Ghorbanli, M. and Bagher Rezaii, M. (2000) The influence of water stress on plant height, herbal and essential oil yield and composition in Satureja hortensis L.. Flavour and Fragrance Journal17: 275-277.

Baser, K., Ozek, T., Kirimer, N. and Tumen, G. A. (2004) Comparative study of the essential oils of wild and cultivated Satureja hortensis L.. Journal of Essential Oil Research 16: 422-424.

Berta, F., Supuka, J. and Chladna, A. (1997) The composition of terpenes in needles of Pinus sylvestris in a relatively clear and in a city environment. Biologia 52: 71-78.

Bouyoucos, G. (1962) Hydrometer method improved for making particle size analyses of soils. Agronomy Journal 54: 464-465.

Bremner, J. M. and Mulvaney, C. S. (1982) Nitrogen-total. Part 2, Chemical and microbiological properties. In: Methods of soil analysis (Eds. Page, A. L., Miller, R. H. and Keeney, D. R.) 595-624. 2^nd edition, American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin.

British Pharmacopoeia (1993) HMSO Publication, International edition, London.

Choi, H., Song, H., Ukeda, H. and Sawamura, M. (2000) Radical-scavenging activities of citrus essential oils and their components: detection using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl. Journal of Agricultural and Food Chemistry 48: 4156-4161.

Dicko, H. M., Gruppen, H., Traore, A. S., Voragen, A. G. J. and Berkel, W. J. H. V. (2006) Phenolic compounds and related enzymes as determinants of Sorghum for food use. Biotechnology and Molecular Biology Review 1(1): 21-38.

Elzaawely, A., Xuan, T. and Tawata, S. (2007) Changes in essential oil, kava pyrones and total phenolics of Alpinia zerumbet (Pers.) BL Burtt. & RM Sm. leaves exposed to copper sulphate. Environmental and Experimental Botany 59: 347-353.

Figueiredo, D. D., Barros, P. M,, Cordeiro, A. M., Serra, T. S., Lourenco, T., Chander, S., Oliveira, M. M. and Saibo, N. J. (2012) Seven zinc-finger transcription factors are novel regulators of the stress responsive gene OsDREB1B. Journal of Experimental Botany 63: 3643-3656.

Ghannadi, A. (2002) Composition of the essential oil of Satureja hortensis L. seeds from Iran. Journal of Essential Oil Research 14: 35-36.

Grejtovsky, A., Grejtovsky, A., Markusova, K., Eliasova, A. and Safarik, P. J. (2006) The response of chamomile (Matricaria chamomilla L.) plants to soil zinc supply. Plant, Soil and Environment 52: 1-7.

Gulluce, M., Sokmen, M., Daferera, D., Agar, G., Ozkan, G., Kartal, N., Polissiou, M., Sokmen, A. and Sahin, F. (2003) In vitro antibacterial, antifungal and antioxidant activities of the essential oil and methanol extracts of herbal parts and callus cultures of Satureja hortensis L.. Journal of Agricultural and Food Chemestry51: 3958-3965.

Gupta, P. K. (1999) Soil, plant, water and fertilizer analisis. Agro Botanica Publishers, Bikaner, India.

Hadian, J., Nejad-Ebrahimi, S. and Salehi, P. (2010) Variability of morphological and phytochemical characteristics among Satureja hortensis L. accessions of Iran. Industrial Crops and Products 32: 62-69.

Hajhashemi, V., Ghannadi, A. and Pezeshkian, S. (2002) Antinociceptive and anti-inflammatory effects of Satureja hortensis L. extracts and essential oil. Journal of Ethnopharmacology 82: 83-87.

Haluschak, P. (2006) Laboratory methods of soil analysis. Manitoba Soil Survey, Canada.

Hendawy, S. F. and Khalid, A. (2005) Response of sage (Salvia officinalis L.) plants to zinc application under different salinity levels. Journal of Applied Sciences Research 1(2): 147-155.

Khan, M., Qasim, M. and Jamil, M. (2002) Effect of different levels of zinc on the extractable zinc content of soil and chemical composition of rice. Asian Journal of Plant Sciences 1(1): 20-21.

Marschner, H. (1986) Function of mineral nutrients, Micronutrients. In: Mineral nutrition of higher plants (Ed. Marschner, H.) 269-300. Academic Press, New York.

Mc-Garvey, D. and Croteau, R. (1995) Terpenoid metabolism. The Plant Cell 7: 1015-1026.

Milos, M. and Makota, D. (2012) Investigation of antioxidant synergisms and antagonisms among thymol, carvacrol, thymoquinone and p-cymene in a model system using the Briggs-Rauscher oscillating reaction. Food Chemistry 131: 296-299.

Misra, A. and Sharma, S. (1991) Critical Zn concentration for essential oil yield and menthol concentration of Japanese mint. Fertilizer Research 29: 261-265.

Murch, S., Kamran, H., Rupasinghe, H. and Saxena, P. (2003) Nickel contamination affects growth and secondary metabolite composition of St. John's wort (Hypericum perforatum L.). Environmental and Experimental Botany 49: 251-257.

Page, A. (1982) Methods of soil analysis. Part 2, Chemical and microbiological properties- Agronomy monograph, 2^nd edition, Madison, Wisconsin.

Pande, P., Anwar, M., Chand, S., Yadav, V. K. and Patra, D. D. (2007) Optimal level of iron and zinc in relation to its influence on herb yield and production of essential oil in menthol mint. Communications in Soil Science and Plant Analysis 38: 561-578.

Ruberto, G. and Baratta, M. (2000) Antioxidant activity of selected essential oil components in two lipid model systems.Food Chemistry 69: 167-174.

Sangwan, N. S., Farooqi, A. H. A., Shabih, F. and Sangwan, R. S. (2001) Regulation of essential oil production in plants. Journal of Plant Growth Regulation 34: 3-21.

Sifola, M. and Barbieri, G. (2006) Growth, yield and essential oil content of three cultivars of basil grown under different levels of nitrogen in the field. Scientia Horticulturae 108: 408-413.

Soltaninejad, R., Razavizadeh, R. and Oloumi, H. (2013) A study on changes of some metabolites of Glycyrrhiza glabra L. seedlings treated with copper oxide and zinc oxide. Iranian Journal of Plant Biology 5(18): 67-80.

Sparks, D. L., Page, A., Helmke, P. A., Loeppert, R. H., Soltanpour, P. N., Tabatabai, M. A., Johnston, C. T. and Sumner, M. E. (1996) Methods of soil analysis. Part 3, Chemical methods. Soil Science Society of America Inc., Madison, Wisconsin.

Walkley, A. and Black, A. (1934) An examination of the Degtjareff method for determining soil organic matter and a proposed modification of the chromic acid titration method. Soil Science 37: 29-38.

Zheljazkov, V. D., Craker, L. E. B. and Xing, B. (2006) Effects of Cd, Pb and Cu on growth and essential oil contents in dill, peppermint and basil. Environmental and Experimental Botany 58: 9-16.