پاسخ‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی گیاه چای ترش (Hibiscus sabdariffa) به تنش خشکی در حضور هورمون سالیسیلیک اسید

گیاهان در شرایط طبیعی و زراعی، پیوسته در معرض تنش‌های مختلف محیطی قرار دارند. تنش عبارت است از عاملی خارجی که به‌طور نامطلوبی بر زندگی گیاهان اثر می‌گذارد و می‌تواند بروز پاسخ‌‌هایی ویژه‌ را در همة مراتب فیزیولوژیک موجود زنده موجب شود. یکی از مهم‌ترین تنش‌های محیطی، تنش خشکی است که به تنش آبی نیز معروف است. تنش خشکی یکی از مهم‌ترین تهدیدهای محیطی است که به‌شدت بر تولید و عملکرد گیاهان اثر می‌گذارد (Anjum et al., 2011b). تنش خشکی توقف رشد ریشه و بخش هوایی و همچنین کاهش سطح برگ‌ها و در کل کاهش رشد و نمو گیاه را سبب می‌شود (Anjum et al., 2011a; Zheng et al., 2016). علاوه‌بر این، تنش خشکی می‌تواند به تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن (ROS) در سلول‌های گیاهی و بروز تنش اکسیداتیو منجر شود (Asada, 2006). سازگاری به تنش‌های محیطی از جمله خشکی تغییراتی را در همة سطوح فیزیولوژیک موجود زنده از سطح آناتومیک و مورفولوژیک تا سطح سلولی، متابولیک و مولکولی موجب می‌شود. تعدیل اسمزی با سنتز و تجمع مواد حل شوندة سازگار مانند پرولین و قندهای محلول سازگاری فیزیولوژیک و متابولیک مهمی برای گیاهان برای مقاومت در برابر خشکی در نظر گرفته می‌شود (Morgan, 1984). تجمع اسمولیت‌ها نه‌تنها می‌تواند به تنظیم اسمزی منجر شود بلکه از ساختار مولکول‌های زیستی و غشاها محافظت می‌کنند (Yancey et al., 1982; Hare et al., 1998). همچنین اسمولیت‌ها جاروب‌کننده‌های رادیکال‌های آزاد هستند و مولکول‌های DNA را از آسیب‌های آن‌ها حفظ می‌کنند (Ashraf and Foolad, 2007). تجمع این ترکیبات همگام با کاهش محتوای آب خاک و افزایش سطوح خشکی، افزایش می‌یابد‌(Nakayama et al., 2007; Xiang et al., 2007; Ohashi et al., 2009). افزایش و تجمع قندهای محلول، حفظ فشار اسمزی را در سلول‌های برگ و در نتیجه، جذب آب از خاک‌های خشک را باعث می‌شود و بدین ترتیب، با حفظ فشار تورژسانس سلول، تبادلات گازی و رشد را در محیط‌های خشک ممکن می‌کند (White et al., 2000). ترکیبات فنلی نیز نقش مهمی در جاروب‌کردن رادیکال‌های آزاد اکسیژن ایفا و گیاهان را در برابر آثار مخرب این رادیکال‌ها حفظ می‌کنند(Petridis et al., 2012).

سالیسیلیک اسید ترکیب فنلی گیاهی است که شبه‌هورمون در نظر گرفته می‌شود و نقش مهمی در ساز‌کار‌‌های دفاعی در برابر تنش‌های مختلف زیستی و غیرزیستی ایفا می‌کند (Yalpani et al., 1994; Szalai (et al., 2000. به‌کاربردن سالیسیلیک اسید به‌صورت خارجی، می‌تواند بر بسیاری از فرایندهای فیزیولوژیک و تکوینی از جمله روابط آبی گیاه(Ying et al., 2013)، فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان (Janda et al., 1999; Hayat et al., 2008, Hayat et al., 2010)، رنگیزه‌های فتوسنتزی(Rajasekaran and Blum, (1999 و رشد گیاهان(Sakhabutdinova et al., (2003; Bandurska and cieslak, 2012 اثر بگذارد. این ترکیب می‌تواند آنزیم‌هایی ویژه‌ را در مسیر متابولیک پرولین القا کند و میزان پرولین را در شرایط تنش افزایش دهد (Misra and Saxena, 2009). علاوه بر این، گیاهانی که با سالیسیلیک اسید تیمار می‌شوند، عموما مقاومت بهتری نسبت به تنش خشکی نشان می‌دهند (Al-Hakimi and Hamada, 2001). اثبات شده است که این مولکول، ماده‌ای ضدتعرق است و با ممانعت از باز شدن روزنه‌ها، مقاومت را نسبت به خشکی سبب می‌شود (Larque- Saavedra, 1978). تشخیص ارتباط بین تیمار سالیسیلیک اسید و تعدیلات متابولیک، هنگام تنش در گیاهان، ضروری است.

چای ترش (Hibiscus sabdariffa L.) گیاهی علفی از خانوادة پنیرک (Malvaceae) است. این گیاه علاوه بر مصرف غذایی، به‌دلیل داشتن فیبر و ویژگی‌های دارویی نیز استفاده می‌شود (Da-Costa-(Rocha et al., 2014. با وجود مطالعات متعدد دربارة تنش خشکی و تاثیر هورمون سالیسیلیک اسید در این گیاه، تاکنون پژوهشی دربارة برهم‌ کنش تیمار خشکی با سالیسیلیک اسید در آن، انجام نشده است. تشکیل و تجمع قندهای محلول و انتقال آن‌ها به واکوئل‌های سلول‌های برگ گیاهان در معرض تنش خشکی، در نتیجة برخی بر هم کنش‌های متابولیسمی انجام می‌شود (Campos et al., 1999). بنابراین، هدف از پژوهش حاضر، تشخیص ارتباط تیمار سالیسیلیک اسید با رشد گیاه چای ترش و تجمع قندهای محلول و نشاسته در آن، بر اثر تنش خشکی است.

مواد و روش‌ها

مواد گیاهی و تیمار خشکی:بذر گیاه
H. sabdariffa از مرکز تحقیقات کشاورزی استان سیستان و بلوچستان تهیه و در سینی‌های حاوی کوکوپیت به صورت خزانه، در گلخانه کشت شد. پس از سه هفته از کاشت، گیاهچه‌های دارای دو یا سه برگ، همسان‌سازی و به گلدان‌های پلاستیکی یک‌لیتری دارای مقادیر برابر کوکوپیت (یک کیلوگرم) منتقل شدند؛ سپس در دمای 1±29 درجة سانتیگراد و شدت نور 300-250 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه قرار گرفتند. گیاهچه‌ها تا روز 30 پس از کاشت با محلول غذایی هوگلند به‌طور مرتب آبیاری شدند. اعمال تیمارهای خشکی و سالیسیلیک اسید بر گیاهان در قالب طرح بلوک‌های کاملا تصادفی به‌صورت فاکتوریل با شش تکرار برای هر تیمار انجام شد. سه روز پیش از اعمال تیمار خشکی، غلظت‌های صفر و 500 میکرومولار محلول سالیسیلیک اسید روی برگ‌های گیاهان اسپری شدند. تیمارهای خشکی با کاهش پتانسیل اسمزی محلول‌های غذایی به مقادیر صفر، 05/0-، 1/0-، 5/0-، 75/0- و 1- مگاپاسکال با پلی اتیلن گلیکول 6000، با تیمارهای سالیسیلیک اسید در فواصل زمانی 5 روزه و به‌مدت 20 روز بر گیاهان اعمال شد. میزان پلی اتیلن گلیکول 6000 لازم برای کاهش پتانسیل اسمزی محلول‌ها، با رابطة 1 تعیین شد (Michel and Kaufmann, 1973).

Ψs = -(1.18 × 10^-2) C - (1.18 × 10^-4 ) C² + (2.67 × 10^-4) CT + (8.39 × l0^-7) C²T                  رابطة 1

در این فرمول، Ψs بیان‌کنندة پتانسیل اسمزی محلول، C، غلظت پلی‌اتیلن‌گلیکول 6000 بر‌حسب گرم در هر کیلوگرم محلول غذایی و T دمای محلول بر‌حسب درجة سانتیگراد است.

گیاهانی که محلول هوگلند معمولی را با پتانسیل اسمزی صفر و غلظت صفر سالیسیلیک اسید دریافت کرده بودند، شاهد در نظر گرفته شدند. پس از این مدت، گیاهان برای بررسی پاسخ‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی به سطوح مختلف تنش خشکی و تیمار سالیسیلیک اسید، جمع آوری و آزمایش شدند. نیمی از نمونه‌های گیاهی برای انجام تحلیل‌های فیزیولوژیک شامل تعیین وزن تر و خشک ریشه‌ها و بخش هوایی و نسبت طول به پهنای برگ استفاده شدند. برگ‌های نیم دیگر نمونه‌ها برای انجام تحلیل‌های بیوشیمیایی استفاده شدند.

تعیین محتوای نسبی آب برگ‌ها: محتوای نسبی آب‌برگ (RWC) با روش Whetherley (1950) تعیین شد. مقدار 5/0 گرم از بافت برگ‌های جوان از هر تیمار برداشته و وزن تر (FW) آن‌ها اندازه‌گیری شد؛ سپس این نمونه‌ها به‌مدت 4 ساعت در آب مقطر قرار داده شد و وزن بافت تورژسانس یافته (Tw) تعیین شد. این نمونه‌ها برای از دست دادن کامل آب در آون با دمای 70 درجة سانتیگراد قرار داده شدند و وزن خشک (DW) آن‌ها نیز اندازه‌گیری شد. در نهایت، محتوای نسبی آب برگ‌ها با رابطة 2 بر حسب درصد محاسبه شد.

 RWC (%) = (FW – DW ) / (TW – DW ) × 100 رابطة 2:

استخراج و اندازه‌گیری رنگیزه‌های فتوسنتزی: برای استخراج کلروفیل‌ها و کاروتنوئید کل، مقدار 1 گرم از بافت برگ در یک هاون سرد با 15 میلی‌لیتر استون 80 درصد ساییده و سپس از کاغذ صافی عبور داده شد. محلول صاف‌شده برای اندازه‌گیری میزان رنگیزه‌ها به کار رفت. بقایای حاصل از استخراج رنگیزه‌ها، پس از خشک‌شدن برای اندازه‌گیری کربوهیدرات‌ها و پروتئین استفاده شد. میزان کلروفیل‌ها با روش اسپکتروفتومتری و با رابطه‌های 3 تا 5 (Arnon, (1949 اندازه‌‌گیری شد.

 Chl a (mg/ml) = 0.0127 A₆₆₃- 0.00269 A₆₄₅ رابطة 3:

Chl b (mg/ml) = 0.0229 A₆₄₅ - 0.00468 A₆₆₃ رابطة 4:

Total Chl (mg/ml) = A₆₅₂/34.5                 رابطة 5:

میزان کاروتنوئید کل نیز با روش Lichtenthaler و Buschmann (2001) در طول موج 470 نانومتر و با رابطة 6 اندازه‌گیری شد.

Total Car (µg/ml) = (1000A₄₇₀-1.82Chl a-85.02Chl b)/198                                      رابطة 6:

استخراج و اندازه‌گیری پروتئین‌های کل: استخراج پروتئین کل با روش Stone و Gifford (1997)، با تغییراتی انجام شد. در این روش، 10 میلی‌گرم از بقایای بافتی عاری از رنگیزه‌های فتوسنتزی با 5/0 میلی‌لیتر بافر نمونه (Laemmli, 1970) در میکروتیوب مخلوط شدند. ترکیب بافر نمونه عبارتست از: باز تریس 06/0 مولار با 8/6pH=، 2 درصد سدیم دودسیل سولفات (SDS) و 10 درصد گلیسرول. نمونه‌ها به‌مدت یک ساعت در بن‌ماری 90 درجة سانتیگراد قرار داده شدند و هر 10 دقیقه به‌شدت مخلوط شدند؛ سپس نمونه‌ها به‌مدت 15 دقیقه در g 10000 سانتریفیوژ شدند. پس از سانتریفیوژ، فاز بالایی که حاوی همة پروتئین‌های استخراج شده بود برای اندازه‌گیری پروتئین کل به کار رفت. اندازه‌گیری پروتئین کل با روش Markwellو همکاران (1981) با نمونة استاندارد آلبومین انجام شد.

استخراج و اندازه‌‌گیری قندهای محلول: استخراج قندهای محلول کل با روش Omokolo و همکاران (1996) انجام شد. بدین منظور، به 40 میلی‌گرم از بقایای بافتی عاری از رنگیزه‌های فتوسنتزی، مقدار 5 میلی‌لیتر اتانول 80  درصد اضافه شده و به‌مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 70 درجة سانتیگراد قرار گرفت. فاز رویی جدا شد و عمل استخراج با اتانول 80  درصد چهار مرتبة دیگر تکرار شد. رسوب باقیمانده، پس از خشک‌شدن برای اندازه‌‌گیری نشاسته استفاده شد. عصاره‌های حاصل، با تبخیر اتانول تغلیظ شد و به حجم مشخصی کاهش یافت. این عصاره­ها پس از سانتریفیوژ در g 5000 به‌مدت 10 دقیقه برای اندازه‌گیری انواع قندهای محلول شامل قندهای احیایی، غیراحیایی و کل استفاده شدند.

قندهای محلول کل با روش آنترون ارزیابی شدند (McCready et al., 1950). برای اندازه‌گیری قند کل، 2/0 میلی‌لیتر از عصارة تغلیظ‌شده، با 3 میلی‌لیتر معرف آنترون (150 میلی‌گرم آنترون در 100 میلی‌لیتر سولفوریک اسید 13 مولار) مخلوط شد و به‌‌مدت 20 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 100 درجة سانتیگراد قرار گرفت. پس از سرد‌شدن نمونه‌ها، میزان جذب هر یک از آن‌ها در طول موج 620 نانومتر اندازه‌گیری شد. میزان قندهای محلول کل با منحنی استاندارد گلوکز محاسبه شد.

قندهای احیایی با روش Miller (1959) اندازه‌گیری شدند. برای اندازه‌گیری قندهای احیایی، مقدار 5/1 میلی‌لیتر از عصارة تغلیظ‌شدة حاوی قندهای محلول، با 5/1 میلی‌لیتر از معرف دی نیترو سالیسیلیک اسید (یک گرم دی نیترو سالیسیلیک اسید، 2/0 گرم فنل، 05/0 گرم سدیم سولفیت و 1 گرم سدیم هیدروکساید در 100 میلی‌لیتر آب مقطر) مخلوط شد و به‌مدت 20 دقیقه در حمام آب گرم در دمای 90 درجة سانتیگراد قرار گرفت؛ سپس بلافاصله 5/0 میلی‌لیتر از محلول پتاسیم سدیم تارتارات 40 درصد به آن افزوده و پس از سرد‌شدن لوله‌ها، جذب نمونه‌ها در طول موج 575 نانومتر خوانده شد. مقدار قندهای احیایی با منحنی استاندارد گلوکز اندازه‌گیری شد.

قندهای غیر‌احیایی با روش Handel (1968) اندازه‌گیری شدند. بدین‌منظور، مقدار 1/0 میلی‌لیتر از عصارة الکلی تغلیظ‌شده با 1/0 میلی‌لیتر محلول پتاسیم هیدروکسید 30 درصد مخلوط و به‌مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم در دمای 100 درجة سانتیگراد قرار داده شد. پس از سرد‌شدن لوله‌ها، 3 میلی‌لیتر معرف آنترون به آن افزوده شد و به‌مدت 20 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 40 درجة سانتیگراد قرار گرفت؛ سپس جذب هر‌ یک از نمونه‌ها در طول موج 620 نانومتر خوانده شد. مقدار قندهای غیر‌احیایی با منحنی استاندارد سوکروز اندازه‌گیری شد.

استخراج و اندازه‌گیری میزان نشاسته: استخراج و اندازه‌گیری نشاسته با روش McCready و همکاران (1950) انجام شد. برای استخراج نشاسته، به بقایای بافتی حاصل از استخراج قندهای محلول، 2/0 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه شد و در یخ قرار گرفت و سپس به آن 26/0 میلی‌لیتر پر کلریک اسید 52 درصد اضافه و 15 دقیقه در یخ نگهداری شد. مخلوط حاصل پس از افزودن
4/0 میلی‌لیتر آب مقطر به‌مدت 10 دقیقه با سرعت g10000 سانتریفیوژ شد. فاز بالایی به لولة آزمایش منتقل و در یخ نگهداری شد. رسوبات باقی‌مانده نیز با
1/0 میلی‌لیتر آب مقطر و 13/0 میلی‌لیتر پرکلریک اسید 52 درصد مجدداً استخراج و پس از سانتریفیوژ، فاز بالایی آن به لولة اول منتقل شد و در‌ نهایت حجم فاز محلول درون لولة آزمایش با آب مقطر به 2 میلی‌لیتر رسید و از آن برای اندازه‌گیری نشاسته استفاده شد.

برای اندازه‌گیری نشاسته، 2/0 میلی‌لیتر از عصارة حاوی نشاسته، با 3 میلی‌لیتر از معرف آنترون مخلوط شد و به مدت 20 دقیقه در دمای 100 درجة سانتیگراد قرار گرفت. پس از سرد شدن لوله‌ها، جذب نمونه‌ها در طول موج 620 نانومتر خوانده شد. مقادیر، با نمودار استاندارد گلوکز محاسبه و برای تعیین میزان نشاسته در 9/0 ضرب شد.

تحلیل آماری: همة‌ نتایج به‌صورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار (Standard deviation, SD) بیان شدند. وجود تفاوت آماری معنی‌دار بین نمونه‌های شاهد و تیمار‌شده با سطوح مختلف خشکی و سالیسیلیک اسید در قالب طرح فاکتوریل با تحلیل واریانس (ANOVA) و آزمون دانکن در سطح 05/0 (P<0.05) تعیین شد.

نتایج و بحث.

اثر پتانسیل اسمزی و سالیسیلیک اسید بر رشد گیاه و محتوای نسبی آب برگ: به‌ کار بردن سطوح مختلف تنش خشکی با کاهش پتانسیل اسمزی بر گیاه چای ترش، کاهش رشد این گیاه را سبب می‌شود؛ به‌طوری‌که همگام با افزایش سطح خشکی (کاهش پتانسیل اسمزی)، وزن تر و خشک بخش‌های هوایی و ریشه و همچنین نسبت طول به پهنای برگ، در مقایسه با گیاهان شاهد به‌شدت کاهش می‌یابد (جدول 1). تیمار سالیسیلیک اسید افزایش معنی‌دار در رشد گیاهان را باعث می‌شود. با وجود کاهش رشد همگام با افزایش سطح خشکی در هر دو گیاه تیمار شده یا نشده با سالیسیلیک اسید، کاهش رشد در گیاهان تیمار نشده در مقایسه با گیاهان تیمار شده بسیار شدیدتر است (جدول 1). وزن تر و خشک ریشه‌ها و بخش‌های هوایی و همچنین نسبت طول به پهنای برگ، متغیرهای مفیدی در تعیین میزان رشد گیاهان به شمار می‌روند. کاهش وزن تر و خشک گیاهان در سطوح مختلف خشکی و افزایش رشد در حضور سالیسیلیک اسید بیان‌کنندة تاثیر منفی تنش خشکی در رشد گیاهان و نقش این هورمون در کاهش آثار این تنش در گیاهان است. تیمار سالیسیلیک اسید افزایشی چشمگیر را در وزن خشک ریشة هویج هنگام سمیت بور موجب شده است (Eraslan et al., (2007. همچنین بهبود عملکرد گندم نیز در نتیجة تیمار سالیسیلیک اسید در تنش شوری گزارش شده است (Shakirova et al., 2003). به‌کار‌بردن سالیسیلیک اسید روی برگ‌های گندم و ذرت، پیچ‌خوردگی و لوله‌شدن برگ‌ها را هنگام تنش خشکی به تعویق انداخته است (Kadioglu et al., 2011; Saruhan et al., 2012). علاوه‌ بر این، میزان لوله‌شدن برگ در گیاهان ذرت تیمار شده با سالیسیلیک اسید، در مقایسه با شاهد کمتر بوده است (Saruhan et al., 2012). تاثیر مثبت سالیسیلیک اسید در رشد بخش‌های هوایی و ریشة گیاه سویا و سطح برگ گیاه نیشکر نیز پیش‌تر گزارش شده است (Dhaliwal et al., 1997; Gutierrez et al., 1998; (Zhou et al., 1999. با افزایش سطح خشکی، کاهش معنی‌داری در محتوای نسبی آب برگ‌ها در هر دو گیاه تیمار شده با سالیسیلیک اسید و شاهد مشاهده می‌شود (شکل 1). میزان نسبی آب برگ‌ها در گیاهان تیمار‌شده با سالیسیلیک اسید در مقایسه با گیاهان شاهد در پتانسیل‌های اسمزی منفی‌تر از 5/0- مگاپاسکال از نظر آماری بسیار بیشتر است. در حقیقت کاهش کمتری در محتوای نسبی آب برگ ها بر اثر پتانسیل‌های اسمزی مختلف مشاهده می‌شود. مشخص شده است که سالیسیلیک اسید انجام یک‌سری پاسخ‌های متابولیک را در گیاهان سبب می‌شود. همچنین بر روابط آبی گیاهان اثر می‌گذارد (Hayat et al., 2010). مطالعات ما نشان داد که به‌کار‌بردن سالیسیلیک اسید روی برگ‌های گیاه چای ترش، بر اثر پتانسیل‌های مختلف اسمزی، بهبود حفظ آب را در برگ‌ها موجب می‌شود. محتوای نسبی آب متغیری مفید برای ارزیابی میزان آب گیاه در نظر گرفته می‌شود (Gonzales and Gonzales-Vilar (2001. تیمار سالیسیلیک اسید افزایش پتانسیل آب و محتوای نسبی آب را در برگ‌های گیاه گوجه‌فرنگی در معرض تنش شوری سبب می‌شود (Tari et al., 2002). همچنین همبستگی قوی بین محتوای آب گیاه و تجمع اسمولیت‌ها در تنش خشکی مشاهده شده است (Farooq et al., 2009). بنابراین، بهبود محتوای نسبی آب برگ با تیمار سالیسیلیک اسید ممکن است در‌ نتیجة تعدیلات اسمزی ناشی از تجمع اسمولیت‌های سازگار در گیاه باشد.

جدول 1- ویژگی‌های رشد گیاهچه‌های چای ترش در پاسخ به پتانسیل‌های اسمزی مختلف در حالت وجود‌داشتن یا وجود‌نداشتن هورمون سالیسیلیک اسید- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر مشترک در هر ستون، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P<0.05 با استفاده از آزمون دانکن است.

شکل 1- اثر پتانسیل‌های اسمزی مختلف بر محتوای نسبی آب برگ (RWC) در حالت وجود‌داشتن یا وجود‌نداشتن هورمون سالیسیلیک اسید - مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P<0.05 با استفاده از آزمون دانکن است.

اثر پتانسیل اسمزی و سالیسیلیک اسید بر میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی برگ‌ها: میزان کلروفیل a و کلروفیل کل، بلافاصله با اعمال پتانسیل اسمزی، به‌صورت معنی‌داری کاهش یافت و در پتانسیل‌های کمتر از 1/0- و 05/0- مگاپاسکال به کمترین میزان خود رسید (شکل‌های 2-A و C). غلظت کلروفیل b در پتانسیل اسمزی کمتر از 1/0- مگاپاسکال به‌طور معنی‌دار نسبت به شاهد کاهش یافت (شکل 2-B). تیمار سالیسیلیک اسید میزان کلروفیل b و کل را در گیاهانی که در پتانسیل اسمزی صفر رشد کردند به‌صورت معنی‌دار افزایش داد؛ ولی میزان کلروفیل a از نظر آماری تغییری نکرد. به هرحال تاثیر درخور‌توجه هورمون سالیسیلیک اسید بر تجمع کلروفیل‌ها هنگام تنش خشکی، در مقایسه با گیاهان شاهد نشان‌دهندة نقش این هورمون در حفظ فعالیت فتوسنتزی، هنگام بروز این تنش است. با وجود این، در پتانسیل اسمزی
1- مگاپاسکال، تفاوت معنی‌داری در میزان کلروفیل‌ها بین گیاهان تیمار شده با سالیسیلیک اسید و شاهد مشاهده نمی‌شود. نسبت کلروفیل a/b در همة سطوح خشکی نسبت به شاهد کاهش می‌یابد که بیان‌کنندة کاهش بیشتر کلروفیل a نسبت به کلروفیل b است (شکل 2-D). این کاهش کمتر در میزان کلروفیل b، بیان‌کنندة این حقیقت است که این کلروفیل برای شکل‌گیری صحیح کمپلکس‌های جمع‌آوری‌کنندة نور در کلروپلاست‌های گیاهان عالی و جلبک‌های سبز ضروری است (Eggink et al., 2001, Eggink et al., 2004; Biswal et al., (2012. علاوه‌بر‌این، کلروفیل b می‌تواند بیان برخی از پروتئین‌های ویژة غشای تیلاکوئید را تنظیم کند و بدین‌ترتیب، افزایش اندازة کمپلکس‌های آنتنی و در نتیجه، افزایش در میزان انتقال الکترون را سبب شود (Tanaka et al., 2001; Biswal et al., 2012). تیمار گیاهان با سالیسیلیک اسید بجز در پتانسیل اسمزی 05/0- مگاپاسکال، تاثیر معنی‌داری بر این نسبت ندارد که می‌تواند نشان‌دهندة تاثیر تقریبا برابر این هورمون بر هر دو کلروفیل a و b ‌باشد. کاهش میزان کلروفیل‌ها در تنش خشکی ممکن است علامت تنش اکسیداتیو و نتیجة اکسیداسیون نوری رنگیزه‌های فتوسنتزی باشد (Anjum et al., 2011b).

شکل 2- اثر پتانسیل‌های اسمزی مختلف بر میزان کلروفیل a (A)، کلروفیل b (B)، کلروفیل کل (C) و نسبت کلروفیل a/b (D) در حالت وجود‌داشتن یا وجود‌نداشتن هورمون سالیسیلیک اسید- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P<0.05 با استفاده از آزمون دانکن است.

کاهش میزان کاروتنوئیدهای کل در پتانسیل‌های منفی‌تر از 5/0- مگاپاسکال مشاهده می‌شود (شکل 3-A). تیمار سالیسیلیک اسید تنها در پتانسیل صفر افزایش کاروتنوئیدها را موجب می‌شود و در سطوح مختلف خشکی، تغییر معنی‌داری از لحاظ آماری بین میزان کاروتنوئیدهای گیاهان تیمار شده و شاهد وجود ندارد. با وجود این، کاهش نسبت کلروفیل به کاروتنوئید (شکل 3-B) هنگام تنش خشکی بیان‌کنندة تخریب بیشتر کلروفیل‌ها در برابر کاروتنوئیدها است. افزایش این نسبت بر اثر تیمار با سالیسیلیک اسید در پتانسیل‌های اسمزی مختلف ممکن است به علت افزایش بیشتر کلروفیل در مقایسه با کاروتنوئیدها باشد (شکل 2-A و 3-A).

شکل 3- اثر پتانسیل‌های اسمزی مختلف بر میزان کاروتنوئید کل (A) و نسبت کلروفیل به کاروتنوئید (B) در حالت وجود‌داشتن یا وجود‌نداشتن هورمون سالیسیلیک اسید- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P<0.05 با استفاده از آزمون دانکن است.

اثر پتانسیل اسمزی و سالیسیلیک اسید بر میزان پروتئین کل: غلظت پروتئین‌های کل در پتانسیل‌های اسمزی منفی‌تر از 1/0- مگاپاسکال در مقایسه با شاهد به‌طور معنی‌دار افزایش می‌یابد (شکل 4). تیمار با سالیسیلیک اسید می‌تواند افزایش غلظت پروتئین‌ها را در پتانسیل اسمزی صفر سبب شود. به هر حال، بجز پتانسیل اسمزی 1/0- مگاپاسکال، هیچ تغییر معنی‌داری از نظر آماری در غلظت پروتئین‌های برگ گیاهان تیمار‌شده با سالیسیلیک اسید در مقایسه با شاهد ایجاد نمی‌شود. گزارش‌های متفاوتی دربارة میزان پروتئین‌ها در تنش خشکی ارائه شده است. برای مثال، غلظت پروتئین‌ها در گیاه گندم در تنش خشکی به‌شدت کاهش یافته است (Singh and Usha, 2003). بر‌عکس، در گونه‌های برنج،‌ افزایش غلظت پروتئین‌ها در تنش خشکی مشاهده شده است (Zulkarnain et al., 2009). همچنین در گیاهچه‌های جو در تنش شوری، میزان پروتئین‌های ریشه و بخش‌های هوایی افزایش یافته است (El-Tayeb, 2005). بنابراین، می‌توان نتیجه گرفت که تغییر در غلظت پروتئین‌های گیاه در تنش خشکی به نوع گونة گیاهی و همچنین نوع بافت بستگی دارد. وضعیت نامساعد محیطی می‌تواند بیان پروتئین‌هایی را موسوم به پروتئین‌های تنش القا کند که در محافظت از سلول‌ها در برابر تنش‌های محیطی نقش دارند. بیان این پروتئین‌ها در تنش‌های مختلف محیطی از‌جمله شوری و خشکی افزایش می‌یابد (Vierling, 1991; Bray, 1993). بنابراین، افزایش غلظت پروتئین‌های برگ گیاه چای ترش در پتانسیل‌های اسمزی منفی‌تر از 1/0- مگاپاسکال ممکن است به بیان برخی از پروتئین‌ها در تنش خشکی نسبت داده شود.

شکل 4- اثر پتانسیل‌های مختلف بر میزان پروتئین کل برگ‌ها در حالت وجود‌داشتن یا وجود‌نداشتن هورمون سالیسیلیک اسید - مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P<0.05 با استفاده از آزمون دانکن است.

اثر پتانسیل اسمزی و سالیسیلیک اسید بر میزان قندهای محلول و نشاسته: غلظت قندهای محلول شامل قندهای احیایی و کل، همگام با افزایش سطوح تنش خشکی زیاد می‌شود (شکل‌های 5-A و C). بر‌عکس، غلظت قندهای غیر‌احیایی همگام با افزایش سطوح تنش خشکی کاهش می‌یابد (شکل 5-B). افزایش قندهای احیایی و کاهش قندهای غیر‌احیایی در پتانسیل‌های منفی‌تر از 5/0- مگاپاسکال به‌طور معنی‌دار در مقایسه با شاهد اتفاق می‌افتد (شکل‌های 5-A و B). تیمارسالیسیلیک اسید در پتانسیل اسمزی صفر هیچ تغییری در میزان قندهای محلول ایجاد نمی‌کند. در‌حالی‌که، در تنش خشکی در حضور این هورمون، به‌ترتیب غلظت قندهای احیایی و غیر‌احیایی به‌شدت در مقایسه با شاهد‌ افزایش و کاهش می‌یابد. غلظت قندهای غیر‌احیایی در تنش خشکی در حضور سالیسیلیک اسید، در مقایسه با گیاهان شاهد بسیار کمتر بودند (شکل 5-B). به‌دلیل کاهش غلظت قندهای غیر‌احیایی و بر‌عکس، افزایش میزان قندهای احیایی در حضور تیمار سالیسیلیک اسید در مقایسه با شاهد، غلظت قندهای محلول کل در پتانسیل‌های اسمزی 5/0- مگاپاسکال و کمتر تفاوت معنی‌داری با شاهد نداشت (شکل 5-C). تجمع قندهای احیایی در گیاهان در معرض تنش خشکی نتیجة یک‌سری برهم کنش‌های متابولیسمی است که در تشکیل یا انتقال آن‌ها در برگ شرکت دارند (Campos et al., 1999). نتیجة تجمع قندهای محلول، در تنش خشکی، کاهش سرعت فتوسنتز است (Goldschmidt and Huber, 1992). در حقیقت، تعدیل اسمزی، ساز‌و‌کار دفاعی است که با تجمع قندهای محلول در سلول‌ها می‌تواند فشار تورژسانس آن‌ها را حفظ کند (Turner, 1997). در بیشتر گونه های گیاهی، کربوهیدرات‌های محلول به‌ویژه قندهای احیایی، نقش محافظت‌کننده‌های اسمزی را در برابر تنش کم‌آبی ایفا می‌کنند (Li and (Li, 2005. مطالعات انجام شده بر برگ‌های گیاه سویا در تنش خشکی نشان داد که غلظت هگزوزها در گیاهان در معرض تنش در مقایسه با شاهد بسیار بیشتر است و میزان سوکروز به شدت کاهش می‌یابد (Liu et al., 2004) که با نتایج ما مطابقت دارد. از سویی، افزایش انواع قندهای احیایی در تنش خشکی در حضور تیمار سالیسیلیک اسید، به حفظ فشار تورژسانس سلول و در‌نتیجه، سازگاری گیاه به تنش خشکی منجر می‌شود. بر‌خلاف نتایج ما، غلظت قندهای محلول گیاه ذرت در تنش خشکی و در حضور تیمار سالیسیلیک اسید در مقایسه با شاهد کاهش یافت که ممکن است ناشی از متابولیزه‌شدن قندهای محلول برای تشکیل ساختارهای سلولی جدید، در حضور این هورمون باشد(Khodary, 2004).

شکل 5- اثر پتانسیل‌های اسمزی مختلف بر میزان قندهای احیایی (A)، قندهای غیر‌احیایی(B) و قند کل (C) برگ‌ها ‌در حالت وجود‌داشتن یا وجود‌نداشتن هورمون سالیسیلیک اسید - مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P<0.05 با استفاده از آزمون دانکن است.

بر‌خلاف قندهای احیایی، میزان نشاستة برگ‌ها مانند قندهای غیر‌احیایی، همگام با کاهش پتانسیل اسمزی ‌در حالت وجود‌داشتن یا وجود‌نداشتن سالیسیلیک اسید به‌شدت کاهش می‌یابد (شکل 6). این کاهش در غلظت نشاسته و قندهای غیر‌احیایی، با افزایش میزان قندهای احیایی هنگام تنش کاملا مرتبط است و ممکن است به‌دلیل تجزیة نشاسته و قندهای غیر‌احیایی مانند سوکروز در تنش خشکی و تولید قندهای احیایی باشد. کاهش میزان نشاسته و قندهای غیر‌احیایی برگ مانند سوکروز در تنش خشکی، در گیاهان دیگری از جمله سویا (Huber et al., 1984) و سایر گونه‌های خانوادة Fabaceae (Keller and Ludlow, 1993) نیز گزارش شده است که ممکن است به‌دلیل کاهش سرعت فتوسنتز یا افزایش سرعت تجزیة سوکروز و نشاسته باشد. همچنین در برگ‌های نوعی لوبیا، افزایش فعالیت آنزیم‌های تجزیه‌کنندة نشاسته (مانند آمیلاز) و سوکروز (مانند اینورتاز اسیدی و سوکروز سنتاز) مشاهده شده است که می‌تواند کاهش نشاسته و سوکروز را در برگ‌ها و افزایش تجمع قندهای احیایی را باعث شود (Keller and Ludlow, 1993). تغییر در غلظت نشاستة برگ‌ها ممکن است نشان‌دهندة تغییر در نسبت‌ منبع به مخزن باشد. در‌حقیقت در تنش خشکی به‌دلیل کاهش نسبت منبع به مخزن، بخش‌بندی کربن بین سوکروز و نشاسته تغییر می‌کند و صادرات سوکروز افزایش می‌یابد و در نتیجه، غلظت نشاسته در برگ‌ها کاهش می‌یابد (Goldschmidt and Huber, 1992; Bruening and Egli, 2000). بنابراین، کاهش پتانسیل اسمزی و تیمار سالیسیلیک اسید احتمالا با تغییر در نسبت منبع به مخزن از یک‌سو و با افزایش فعالیت آنزیم‌های تجزیه‌کنندة نشاسته و سوکروز از سوی دیگر، کاهش میزان نشاسته و سوکروز را در برگ و افزایش قندهای احیایی را باعث می‌شود. با توجه به بیشتر بودن غلظت قندهای احیایی و بر عکس، کمتر بودن غلظت نشاسته و قندهای غیر احیایی در حضور سالیسیلیک اسید، نتیجه می‌گیریم که این هورمون نقش بسیار موثری در مقاومت به تنش خشکی ایفا می‌کند.

شکل 6- اثر پتانسیل‌های اسمزی مختلف بر میزان نشاستة برگ‌ها در حالت وجود‌داشتن یا وجود‌نداشتن هورمون سالیسیلیک اسید - مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P<0.05 با استفاده از آزمون دانکن است.