تأثیر سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات بر تولید رزمارینیک اسید و کافئیک اسید در کشت کالوس نوروزک (Salvia lerrifolia Benth.)

قسیمی حق, زیبا; جوکار, سمیه; بداقی, حجت اله; مدرس, معصومه

doi:10.22108/ijpb.2018.108819.1071

تأثیر سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات بر تولید رزمارینیک اسید و کافئیک اسید در کشت کالوس نوروزک (Salvia lerrifolia Benth.)

نویسندگان

¹ گروه علوم باغبانی و گیاه‌پزشکی، دانشکدة کشاورزی، دانشگاه صنعتی شاهرود، شاهرود، ایران

² گروه زیست‌شناسی، دانشکدة علوم، پردیس شهید هاشمی نژاد، دانشگاه فرهنگیان، مشهد، ایران

10.22108/ijpb.2018.108819.1071

چکیده

در پژوهش حاضر، کالوس‌زایی گیاه دارویی نوروزک (Salvia leriifolia Benth.) با جدا‌کشت ساقه و برگ در ترکیب اکسین‌های 1 - نفتالن استیک اسید (NAA) و2, 4-D با سیتوکینین Kin و سپس اثر الیسیتورهای سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات (50، 100، 150 میکرومولار) در کالوس بر محتوای برخی متابولیت‌های ثانویه بررسی شدند. 1 – نفتالن استیک اسید با Kin در جداکشت ساقه و برگ کالوس‌زایی نکرد؛ درحالی‌که با جدا‌کشت برگ در غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر Kin با 2 میلی‌گرم بر لیتر 2, 4-D مناسب‌ترین کالوس تولید شد. بیشترین میزان وزن تر و خشک، محتوای فنل کل و فلاونوئید در کالوس‌های تیمار‌شده با 100 میکرو‌مولار متیل‌جاسمونات مشاهده شدند؛ باوجوداین با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید، وزن تر و خشک، محتوای فنل کل، فلاونوئید، رزمارینیک اسید روند رو‌به‌افزایش داشتند و بیشترین مقدار رزمازینیک اسید و کافئیک اسید به‌ترتیب در کالوس‌های تیمارشده با سالیسیلیک اسید 100 و 150 میکرومولار مشاهده شدند. نتایج نشان دادند بهینه‌کردن غلظت الیسیتورها، بر تولید متابولیت‌های ثانویة مدنظر در نوروزک در شرایط درون‌شیشه‌ای تأثیر می‌گذارد.

کلیدواژه‌ها

20.1001.1.20088264.1397.10.1.5.8

موضوعات

فیزیولوژی گیاهی

عنوان مقاله [English]

Effect of salicylic acid and methyl jasmonate on the production of rosmarinic acid and caffeic acid in callus culture of Salvia lerrifolia Benth

نویسندگان [English]

ziba Ghasimi Hagh ¹
Somayyeh Jokar ¹
Hojatollah Bodaghi ¹
Masoomeh Modarres ²

¹ Department of Horticulture science and plant protection, Faculty of Agriculture, Shahrood University of Technology, Shahrood, Iran

² Department of Biology, Faculty of Science, Shahid Hasheminegad Campus, Farhangian University, Mashhad, Iran

چکیده [English]

In this study, callus formation of Salvia leriifolia Benth by stem and leaf explants in the combination of NAA and 2,4-D with Kin and the effect of salicylic acid and methyl jasmonate elicitors (50, 100, 150 mM) in callus on some secondary metabolites were studied. NAA in combination with Kin had no callus production in both of stem and leaf explants, while the most appropriate callus produced by leaf explant at a concentration of 1 mg/L Kin with 2 mg/L 2,4-D. The highest fresh and dry weight, total phenol and flavonoids content were observed in calluses treated with 100 μM of methylisammonate, however, with increasing salicylic acid concentration, fresh and dry weight, total phenol content, flavonoids, rosmarinic acid increased, and the highest content of rusamicin acid and caffeic acid was observed in calluses treated with 100 and 150 μM salicylic acid, respectively. According to the results, it is stated that, by optimizing the concentrations of the ellicetors, it is possible to produce the desired secondary metabolites of salvia in in vitro conditions

کلیدواژه‌ها [English]

Salvia leriifolia B
Salicylic acid
methyl jasmonate
rosemaric acid
caffeic acid

اصل مقاله

مقدمه

نوروزک (Salvia leriifolia Benth.) متعلق به خانوادة نعناعیان (Lamiaceae) و گیاهی چندساله، علفی است که برگ و گل‌های معطر دارد و ازجمله گیاهان باارزش مناطق کویری ایران ازجمله استان خراسان رضوی و سمنان است. این گیاه از جنس مریم گلی (Salvia) است که 900 گونة آن در سراسر جهان شناسایی شده‌اند و حدود 17 گونه از آنها بومی ایران هستند (Hedge, 1986). ترپنوئیدها، ساپونین‌ها، فلاونوئیدها، تانن‌ها و آلکالوئیدها از متابولیت‌های ثانویة باارزش موجود در گیاه نوروزک هستند (Tabatabai Yazdi, 1995) که از این مواد، کافئیک اسید و رزمارینیک اسید با خواص آنتی‌اکسیدانی در گروه فلاونوئیدها قرار دارند (Kahkonen et al., 1999). کافئیک اسید در گونه‌های مریم گلی، واحد سازندة انواع متابولیت‌های فنلی از مونومرهای ساده تا انواع فراورده‌های الیگومری است و رزمارینیک اسید فراوان‌ترین دایمرکافئیک اسید و مهم‌ترین ترکیب فنلی است که فعالیت آنتی‌اکسیدانی گونه‌های مریم‌گلی را بیشتر به‌علت وجود این ترکیب می‌دانند (Lu and Foo 2002; Kamatou et al., 2008). استفاده از کالوس‌های حاصل از کشت‌بافت گیاهی راهکاری مناسب برای تولید پایدار با کارایی زیاد و بدون وابستگی به فصول کشت گیاهی چنین متابولیت‌هایی است. تولید کالوس در شرایط درون‌شیشه‌ای متأثر از عواملی مانند ژنوتیپ، تنظیم‌کننده‌های رشد، محیط‌کشت، نوع کربوهیدرات، نوع جدا‌کشت و شرایط محیطی است (Han et al., 2011). Modarres و همکاران (2013، 2014) در گیاه نوروزک با جدا‌کشت برگ در محیط‌کشت MS حاوی 5 میلی‌گرم بر لیتر 6 - بنزیل آمینو پورین (BAP) با 5 میلی‌گرم بر لیتر 1 – نفتالن استیک اسید (NAA) و 1 میلی‌گرم بر لیتر Kin با 3 میلی‌گرم بر لیتر 2, 4-D و با جداکشت مریستم جوانة انتهایی حاوی 1 میلی‌گرم بر لیتر Kin با 2 میلی‌گرم بر لیتر 2, 4-D کالوس‌زایی مشاهده کردند. کاربرد الیسیتورهای غیرزیستی یکی از راهکارهای مهم برای القای متابولیسم ثانویه و افزایش تولید متابولیت‌های ارزشمند درمحیط‌های کشت‌بافت است.السیتورهای غیرزیستی با فعال‌کردن سازوکارهای دفاعی، تشکیل متابولیت‌های ثانویه و پاسخ‌های بیش حساس را القا می‌کنند. عوامل مختلفی مانند غلظت الیسیتور، سن محیط‌کشت، زمان افزودن الیسیتور به محیط‌کشت و مدتی که محیط یا جدا‌کشت در معرض الیسیتور قرار می‌گیرد بر افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه تأثیر می‌گذارد (Vasconsuelo and Boland, 2007). اﻟﻴﺴﻴﺘﻮرﻫﺎﻳﻲ مانند ﺳﺎﻟﻴﺴﻴﻠﻴﻚ اﺳﻴﺪ و ﻣﺘﻴﻞ ﺟﺎﺳﻤﻮﻧﺎت در افزایش تولید ﻣﺘﺎﺑﻮﻟﻴﺖﻫﺎی ﺛﺎﻧﻮیة دارای ارزش دارویی، نقش کلیدی دارند و با سرعت‌دادن به ﺗﺸﻜﻴﻞ ﻣﺘﺎﺑﻮﻟﻴﺖﻫﺎی ﺛﺎﻧﻮیه زﻣﺎن دست‌یابی را ﺑﻪ ﻣﻘﺎدﻳﺮ زیاد ﻣﺘﺎﺑﻮﻟﻴﺖ‌ها ﻛﺎﻫﺶ می‌دهند (Singh and Dwivedi, 2018). سالیسیلیک اسید در گیاه سیاه‌دانه فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمولیاز (PAL) و ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی (Kabiri et al., 2014)؛ در کشت سلولی پونه، مادة مؤثر بتاکاریوفیلن (Darvishi et al., 2017) و در گل همیشه‌بهار مقدار فلاونوئید را افزایش داد (Pacheco et al., 2013). Samadi و همکاران (2014) با کاربرد سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات به‌تنهایی و باهم در کالوس کنگرفرنگی مشاهده کردند متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید، افزایش فنیل پروپانوئید را سبب شد؛ ولی با افزایش غلظت الیسیتورها کاهش چشمگیری در مقدار فنل کل مشاهده شد. با‌توجه‌به‌اینکه گزارشی دربارة اثر اکسین 1 – نفتالن استیک اسید با سیتوکینین Kin در جدا‌کشت ساقه و برگ و 2, 4-D با سیتوکینین Kin در جدا‌کشت ساقه پس از بهینه‌کردن کالوس‌زایی وجود ندارد، اثر الیسیتورهای غیرزیستی سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات بر محتوای فنلی، فلاونوئیدی، رزمارینیک اسید و کافئیک اسید گیاه نوروزک بررسی شد.

مواد و روش‌ها

تهیة گیاهان استریل درون‌شیشه‌ای: این آزمایش در دانشکدة کشاورزی دانشگاه صنعتی شاهرود انجام شد. برای دست‌یابی به جداکشت‌های برگ و ساقة استریل، ابتدا بذرهای گیاه نوروزک از منطقة بجستان واقع در استان خراسان رضوی در خرداد‌ماه جمع‌آوری شدند. بذرها پس از انتقال به آزمایشگاه به‌مدت سه هفته در دمای 4 درجة سانتی‌گراد نگه‌داری شدند تا نیاز سرمایی برای جوانه‌زنی بذرها رفع شود. ضدعفونی‌کردن بذرها با روش Modarres و همکاران (2007) انجام شد. برای ضدعفونی‌کردن بذرهای نوروزک پس از جداکردن پوستة سخت آنها در زیر هود، ابتدا به‌مدت 30 ثانیه در الکل 70 درصد و سپس 3 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 3 درصد قرار داده شدند؛ سپس بذرها 3 بار با آب مقطر استریل آب‌شویی شدند و پوستة نازک بذرها با پنس و سوزن‌های استریل جدا شد. در این مرحله، رویان‌های چند‌میلی‌متری با پنس و سوزن‌های استریل، با دقت از داخل لپه‌ها جدا و در شیشه‌های کشت حاوی محیط‌کشت MS کشت داده شدند و به شرایط تاریکی به‌مدت یک هفته با دمای 2±25 درجة سانتی‌گراد انتقال داده شدند. پس از یک هفته جنین‌های با رشد اولیه به اتاق رشد با دورة نوری 16 ساعت روشنایی (40 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه) و 8 ساعت تاریکی و دمای 2±25 درجة سانتی‌گراد انتقال یافتند و پس از 4 هفته گیاهان استریل نوروزک درون‌شیشه‌ای به دست آمدند.

تأثیر اکسین‌های 1 – نفتالن استیک اسید و 2, 4-D با Kin در کالوس‌زایی از جداکشت‌های ساقه و برگ: برای بهینه‌کردن کالوس‌زایی، چهار آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با پنج تکرار و در هر تکرار با پنج جدا‌کشت ساقه یا برگ در محیط‌کشت MS حاوی 30 گرم بر لیتر ساکارز انجام شدند. 1 – نفتالن استیک اسید با چهار غلظت (صفر، 1، 2 و 3 میلی‌گرم بر لیتر) و 2, 4-D با پنج غلظت (صفر، 1، 5/1، 2 و 5/2) با سه غلظت سیتوکینین Kin (صفر، 3/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) استفاده شد. از گیاهان نوروزک چهارهفته‌ای استریل، جدا‌کشت‌های ساقه و برگ 1 سانتی‌متری تهیه شدند. جدا‌کشت‌ها برای تولید کالوس در تاریکی با دمای 25±2 درجة سانتی‌گراد قرار داده شدند. پس از گذشت چهار هفته صفات مورفولوژیک کالوس‌ها اندازه‌گیری شدند.

اندازه‌گیری صفات مورفولوژیک کالوس‌ها: پس از گذشت 4 هفته (اوایل هفتة پنجم) ویژگی‌های ظاهری کالوس‌ها مانند درصد کالوس‌زایی، رنگ، شکل و نوع کالوس یادداشت‌‌برداری شدند. درصد کالوس‌زایی براساس نسبت تعداد جداکشت‌های دارای کالوس به تعداد کل جدا‌کشت‌های کشت‌شده در یک ظرف کشت به دست آمد. میانگین وزن آنها به‌صورت میانگین مجموع وزن تر بررسی شد. برای اندازه‌گیری وزن خشک، کالوس‌های مدنظر در ورق آلومینیومی بسته‌بندی شدند و به‌مدت 36 ساعت در آون با دمای 80 درجة سانتی‌گراد قرار داده شدند و درنهایت، وزن کالوس محاسبه شد.

القای الیسیتورهای سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات: پس از بهینه‌کردن کالوس‌زایی، برای بررسی اثر الیسیتورهای سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات (صفر، 50، 150 و 200 میکرومولار) آزمایشی به‌صورت طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار (هر تکرار با پنج جداکشت) انجام شد. با‌توجه‌به ناپایداری این دو ماده در دمای زیاد، پس از اتوکلاو‌کردن محیط‌کشت در زیر هود لامینار و در شرایط استریل، زمانی‌که دمای محیط‌کشت به حدود 45 درجة سانتی‌گراد رسید با فیلتر سلولزی 2/0 میکرون، استریل و به محیط‌کشت اضافه شدند. جدا‌کشت‌های تیمار‌شده به اتاقک رشد تاریک با همان شرایط نگهداری کالوس انتقال یافتند.

اندازه‌گیری فنل کل: سنجش فنل کل با روش فولین - سیوکالتیو انجام شد (Singleton and Rossi, 1965). ابتدا 5/0 گرم از کالوس‌های تازه در 3 میلی‌لیتر متانول 80 درصد همگن شد و به‌مدت 3 ساعت در بن ماری (مدلWNB 14، شرکت Memmert، آلمان) با دمای 70 درجة سانتی‌گراد قرار داده شد؛ سپس با سرعت 9000 دور در دقیقه به‌مدت 15 دقیقه (دو بار) سانتریفیوژ (مدل 5810R، شرکت Eppendorf، آلمان) و عصارة متانولی از رسوب جدا شد. این عصاره برای سنجش فنل کل و فلاونوئید استفاده شد. به 50 میکرولیتر عصارة متانولی، 500 میکرولیتر معرف فولین - سیوکالتیو اضافه شد. به مخلوط حاصل، پس از 5 دقیقه 500 میکرو‌لیتر محلول سدیم کربنات 7 درصد اضافه و جذب پس از 10 دقیقه با دستگاه اسپکتوفتومتر (مدل 2150، شرکت Unico، آمریکا) با طول‌موج 765 نانومتر خوانده شد . میزان ترکیبات فنلی برمبنای مقدار جذب ناشی از واکنش عصاره با معرف فولین - سیوکالتیو و براساس مقایسة آن با محلول‌های استاندارد گالیک اسید محاسبه شد. برای شاهد نیز به‌جای عصاره از متانول 80 درصد استفاده شد. آزمایش سه بار تکرار و میانگین آنها گزارش شد.

اندازه‌گیری فلاونوئید کل: سنجش فلاونوئید کل نیز براساس نمودار استاندارد Rutin سنجیده شد. به یک میلی‌لیتر از عصارة متانولی 251 میکرولیتر از محلول آلومینیوم کلرید 10 درصد و 250 میکرولیتر پتاسیم استات یک مولار اضافه و جذب نمونه‌ها در طول‌موج 415 نانومتر خوانده شد و مقدار فلاونوئید مطابق با رابطة به‌دست‌آمده از نمودار استاندارد محاسبه شد (Akkol et al., 2008).

اندازه‌گیری رزمارینیک اسید: عصاره‌گیری و سنجش رزمارینیک اسید با روش Tepe (2007) انجام شدند. در این روش 5/0 گرم کالوس تر پس از توزین، در 20 میلی‌لیتر اتانول 50 درصد به‌خوبی ساییده و به‌مدت یک ساعت در بن ماری 70 درجة سانتی‌گراد نگه‌داری شد. پس از آن با روتاری (شرکت دنا، ایران)، حلال اتانول از محلول حذف و باقی‌مانده‌های کالوس در 20 میلی‌لیتر اتانول 70 درصد حل شد. در این مرحله محلول به‌مدت 24 ساعت در فریزر 20- درجة سانتی‌گراد نگه‌داری شد. درنهایت، محلول برای فیلترشدن، دو مرتبه از کاغذ صافی واتمن شمارة 1 عبور داده شد و محلول صاف حاصل از آن تا زمان سنجش رزمارینیک اسید به یخچال با دمای 4 درجة سانتی‌گراد منتقل شد. برای سنجش، عصاره‌های گرفته‌شده درون سل‌های پلاستیکی سه میلی‌لیتری ریخته و جذب آنها در طول‌موج 327 نانومترخوانده شد. غلظت رزمارینیک اسید در هر نمونه با نمودار استاندارد رزمارینیک اسید برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر محاسبه شد. برای شاهد از اتانول 70 درصد استفاده شد.

اندازه‌گیری کافئیک اسید: برای سنجش کافئیک اسید، روش Sauvestyو همکاران (1992) استفاده شد. نمونه‌ها روی یخ و با متانول 80 درصد با نسبت حجمی - وزنی 5/1 تا ایجاد یک محلول همگن ساییده شدند. همگنای حاصل به‌مدت سه ساعت در دمای 40 درجة سانتی‌گراد هم زده شد؛ سپس به‌مدت 45 دقیقه با سرعت 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ و از روشناور حاصل برای سنجش کافئیک اسید استفاده شد. 1 میلی‌لیتر از عصاره‌های متانولی 80 درصد برداشته و به آن 1 میلی‌لیتر معرف آرنو )سدیم مولیبدات 10 درصد و سدیم نیترات درصد)، 1 میلی‌لیتر سدیم هیدروکسید 1 مولار و 1 میلی‌لیتر هیدروکلریک اسید 1/0 مولار افزوده شد تا حجم نهایی به 10 میلی‌لیتر رسید؛ سپس نمونه‌ها ورتکس شدند و بلافاصله جذب آنها در 490 نانومتر خوانده شد. در نمونة شاهد به‌جای عصاره، 1 میلی‌لیتر متانول 80 درصد اضافه شد.

نتایج و بحث

اثر اکسین 1 – نفتالن استیک اسید با Kin در کالوس‌زایی با جداکشت ساقه و برگ: جدا‌کشت‌‌های ساقه و برگ گیاه نوروزک پس از چهار هفته در غلظت‌های مختلف 1 – نفتالن استیک اسید و Kin،کالوس‌زایی نشان ندادند. در گیاه S. nemoroza با جدا‌کشت برگ مطابق با نتایج این آزمایش کالوس‌زایی مشاهده نشد (Ewa and Halina, 2004)؛ درحالی‌که در S. canariensis با جداکشت ساقه در محیط حاوی 1 – نفتالن استیک اسید در ترکیب با 6 - بنزیل آمینو پورین کالوس‌زایی مشاهده شد (Mederos-Molin, 2004).

اثر اکسین 2, 4-Dبا Kin در کالوس‌زایی با جدا کشت‌های ساقه و برگ: نتایج محاسبة میزان کالوس‌زایی در ساقه در غلظت‌های مختلف Kin و 2, 4-D نشان دادند در غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر 2, 4-D هیچ کالوس‌زایی مشاهده نشد؛ درحالی‌که بیشترین میزان کالوس‌زایی و وزن تر و خشک در تیمار 2 میلی‌گرم بر لیتر2, 4-D با 3/0 میلی‌گرم بر لیترKin به دست آمد. نتایج بافت کالوس‌ها هیچ تفاوتی بین تیمارها نشان ندادند و کالوس‌ها متراکم بودند؛ ولی رنگ کالوس‌ها در تیمار 1 و 3/0 میلی‌گرم بر لیتر Kin به‌ترتیب در غلظت‌های 5/1 و 2 میلی‌گرم بر لیتر 2, 4-D کرمی و در سایر تیمارها سفید بودند (جدول 1).

نتایج محاسبة میزان کالوس‌زایی در برگ در غلظت‌های مختلف Kin و 2, 4-D نشان دادند در غلظت 1 و 5/1 میلی‌گرم بر لیتر2, 4-D هیچ کالوس‌زایی مشاهده نشد. بیشترین میزان کالوس‌زایی و وزن تر و خشک در تیمار 2 میلی‌گرم بر لیتر2, 4-D با 1 میلی‌گرم بر لیترKin به دست آمد. در همة تیمارها کالوس‌های کرم‌رنگ و متراکم مشاهده شدند (جدول 2).

جدول1- مقایسة مقدار کالوس‌زایی و ویژگی‌های کالوس‌های حاصل از جداکشت‌های ساقه در محیط MS حاوی 2, 4-D و Kin

نوع تیمار (میلی‌گرم بر لیتر)	مقدار کالوس‌زایی پس از سه هفته (درصد)	وزن تر کالوس (گرم)	وزن خشک کالوس (گرم)	ویژگی‌های بافت کالوس
2, 4-D 0, Kin0	0^e	0^e	0^d	-
2, 4-D 1, Kin 0.3	0^e	0^e	0^d	-
2, 4-D 1, Kin 1	0^e	0^e	0^d	-
2, 4-D 1.5, Kin 0.3	33/58±8/1^c	31/0 ±02/0^b	025/0±003/0^b	سفید‌رنگ، متراکم
2, 4-D 1.5, Kin 1	57±5/1^c	09/0±01/0^d	004/0±001/0^c	کرم‌رنگ، متراکم
2, 4-D 2, Kin 0.3	67/66±3/1^b	32/0±036/0^b	025/0±002/0^b	کرم‌رنگ، متراکم
2, 4-D 2, Kin1	33/58±4/1^c	25/0±03/0^c	024/0±001/0^b	سفید‌رنگ، متراکم
2, 4-D 2.5, Kin 0.3	75±7/2^a	03/1±08/0^a	083/0±005/0^a	سفید‌رنگ، متراکم
2, 4-D 2.5, Kin 1	52±1/1^d	27/0±01/0^c	021/0±002/0^b	سفید‌رنگ، متراکم

مقادیر، میانگین پنج تکرار (هر تکرار پنج جداکشت) ± SE هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار با آزمون LSD هستند.

در پژوهش حاضر، القای کالوس در ساقه و برگ گیاهان نوروزک 4 هفته‌ای (5 تا 6 برگی) حاصل از کشت رویان، انجام شد که با نتایج گزارش‌های قبلی در گونه‌های جنس Salvia هم‌راستا است (Kintzios et al., 1999; Mederos-Molina, 2004). در هر دو جدا‌کشت ساقه و برگ، القای کالوس در غلظت‌های زیاد 2, 4-D انجام شد و غلظت‌های کمتر از 2 میلی گرم بر لیتر در برگ تأثیری نداشتند؛ هرچند با جداکشت ساقه در غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر 2, 4-D کالوس‌زایی مشاهده شد. بیشترین میزان کالوس‌زایی در جدا‌کشت ساقه، 75 در صد و در برگ، 100 درصد بود که علاوه‌بر کالوس‌زایی فراوان در برگ، کالوس‌ها بزرگ‌تر و بهتر بودند. Mederos-Molina (2004) و Kintzios و همکاران (1999) نتایج مشابهی در گونة canariensis گزارش کردند. به‌طورکلی استفادة هم‌زمان از 2, 4-D و Kin با نسبت‌های زیاد 2, 4-D به Kin بر کالوس‌زایی در جداکشت های برگ گیاه نوروزک تأثیر بسزایی دارد پس نوع، غلظت اکسین و جداکشت بر کالوس‌زایی مؤثر هستند. به نظر می‌رسد شرایط محیطی انتخاب‌شده برای القا و رشد کالوس مناسب بوده‌اند؛ به‌طوری‌که کالوس‌ها بافت متراکم و رنگ سفید تا کرمی به

جدول 2- مقایسة مقدار کالوس‌زایی و ویژگی‌های کالوس‌های حاصل از جداکشت‌های ساقه در محیط MS حاوی 2, 4-D وKin

نوع تیمار (میلی‌گرم بر لیتر)	مقدار کال‌زایی پس از سه هفته (درصد)	وزن تر کالوس (گرم)(گرم)	وزن خشک کالوس (گرم)	ویژگی‌های بافت کالوس
2, 4-D 0,Kin0	0^e	0^e	0^d	-
2, 4-D 1,Kin 0.3	0^e	0^e	0^d	-
2, 4-D 1,Kin 1	0^e	0^e	0^d	-
2, 4-D 1.5 ,Kin 0.3	0^e	0^e	0^d	-
2, 4-D 1.5 ,Kin 1	0^e	0^e	0^d	-
2, 4-D 2 ,Kin 0.3	4/65±8/8^c	24/0±06/0^d	017/0±004/0^c	کرم رنگ، متراکم
2, 4-D 2 ,Kin 1	100±0^a	3/2±12/0^a	163/0±009/0^a	کرم رنگ، متراکم
2, 4-D 2.5 ,Kin 0.3	22±5/4^d	29/0±04/0^c	021/0±002/0^c	کرم رنگ، متراکم
2, 4-D 2.5 ,Kin 1	69/81±9/8^b	76/0±08/0^b	082/0±006/0^b	کرم رنگ، متراکم

دست آوردند. تفاوت در کارایی 2, 4-D نسبت به 1 – نفتالن استیک اسید در پژوهش حاضر ممکن است از یک‌سو به ساختار این ترکیبات و از سوی دیگر به تخصصی‌شدن گیرنده‌های اکسین در بافت‌‌های مختلف گیاهان برای نوع اکسین مربوط باشد که 2, 4-D ترکیبی فنوکسی است؛ درحالی‌که 1 – نفتالن استیک اسید ترکیبی نفتالینی است (Moore, 1989).

صفات مورفولوژیک کالوس‌های تیمارشده با الیسیتورها: نتایج به‌دست‌آمده از این آزمایش، نشان دادند الیسیتورهای سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات تأثیری بر میزان کالوس‌زایی نداشتند و در همة محیط‌ها 100 درصد کالوس‌زایی مشاهده شد. بررسی جداکشت‌ها نشان داد نخستین توده‌های کالوس، 10 روز پس از کشت ایجاد شدند و با روند افزایش دوره تا چهار هفته کالوس‌های بزرگ تشکیل شدند. رنگ کالوس‌ها با گذشت زمان از سبز به کرمی در حال تغییر بود که البته تغییر رنگ به کرمی در جدا‌کشت‌های تیمار‌شده با سالیسیلیک اسید کمتر و در تیمار متیل جاسمونات و شاهد بیشتر بودند. سالیسیلیک اسید از فعالیت آنزیم ACC سنتاز ممانعت می‌کند که به کاهش تولید اتیلن منجر می‌شود و به‌دنبال آن از تخریب کلروفیل در سلول‌ها جلوگیری می‌شود (Li et al., 1992). اثر کمتر متیل جاسمونات بر جلوگیری از تغییر رنگ کالوس نسبت به سالیسیلیک اسید ممکن است به‌علت محافظت‌کنندگی غیریکسان کلروفیل a و b و توانایی کمتر متیل جاسمونات در حفظ محتوای کلروفیل b باشد (Hanaka et al., 2015).

بیشترین وزن تر و خشک به‌ترتیب 167/4 و 2750/0 گرم در تیمار 100 میکرومولار متیل جاسمونات مشاهده شدند و کمترین وزن تر (83/1 گرم) در کالوس شاهد و کمترین وزن خشک (1643/0 گرم) در تیمار 50 میکرومولار متیل جاسمونات حاصل شد. وزن تر و خشک کالوس‌ها با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید روند رو‌به‌افزایش داشتند (شکل 1). نتایج پژوهش حاضر با گزارش‌های قبلی مبنی بر ارتباط مستقیم بین سالیسیلیک اسید، تحریک سلول‌ها و فعالیت متابولیسم اولیه در کالوس روناس مطابقت دارند (Bulgakov et al., 2002). نوع ترکیب، غلظت سالیسیلیک اسید و گونة گیاه، تعیین‌کنندة وجود یا نبود ارتباط مستقیم بین غلظت‌های القا‌کنندگی و القای فعالیت‌های متابولیسمی اولیه هستند که به افزایش وزن سلول‌ها منجر می‌شوند (Namdeo, 2007). تیمارهای متیل جاسمونات 100 و 150 میکرو‌مولار نسبت به شاهد وزن تر و خشک کالوس‌ها را افزایش دادند. در کشت کالوس‌های رودندرون هندی، افزایش وزن تر و خشک کالوس با افزایش غلظت متیل جاسمونات همراه بود که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد (Suan See et al., 2011). برخی از بررسی‌ها نشان دادند استفاده از غلظت‌های زیاد جاسمونات اثر تحریک‌کنندگی و بازدارندگی بر رشد و فعالیت متابولیک گیاهان دارد و آثار بازدارندگی مشابه آبسزیک اسید و اتیلن از خود نشان می‌دهد که تأییدکنندة نتایج پژوهش حاضر در غلظت 150 میکرومولار متیل جاسمونات است (Swiatek et al., 2003 and Chong et al., 2005).

شکل 1- تاثیر سالیسیلیک اسید (SA) و متیل جاسمونات بر وزن تر(A) و وزن خشک (B)کالوس برگ گیاه نوروزک. مقادیر، میانگین سه تکرار (هر تکرار پنج جدا کشت)± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون LSD است.

با‌توجه‌به شکل 2 بیشترین میزان فنل و فلاونوئید کل در کالوس‌های تیمارشده با غلظت 100 میکرو‌مولار متیل جاسمونات وکمترین میزان، در کالوس‌های شاهد مشاهده شد. محتوای فنل و فلاونوئید کل با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید روند رو‌به‌افزایش نشان دادند؛ به‌طوری‌که این مقادیر در غلظت 150 میکرو‌مولار سالیسیلیک اسید به‌ترتیب حدود 5/3 و 2 برابر شاهد افزایش نشان دادند (شکل 2). افزایش محتوای فنل کل و فلاونوئید با تیمار سالیسیلیک اسید در پژوهش حاضر با نتایج بررسی‌های قبلی در شیرین‌بیان (Shabani and Ehsanpour, 2010)، گل همیشه‌بهار (Pacheco et al., 2013)، کنگر‌فرنگی (Samadi et al., 2014) و سیاه‌دانه (Kabiri et al., 2014) مطابقت دارد و با غلظت‌های متیل جاسمونات، با پژوهش‌های Samadi و همکاران (2014)، Mehrabani و همکاران (2013) و Kim و همکاران (2006) هم‌راستا است؛ زیرا چالکون سنتاز که پیش‌ساز فلاونوئیدها را تولید می‌کند با متیل جاسمونات القا می‌شود (Pinot et al., 1998).

شکل 2- تاثیر سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات بر فنل (A)وفلاونوئید کل (B)کالوس برگ گیاه نوروزک. مقادیر، میانگین سه تکرار (هر تکرار پنج جدا کشت)± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون LSD است

نتایج پژوهش حاضر نشان دادند مقدار کافئیک اسید در گیاه نوروزک به‌طور‌طبیعی بسیار ناچیز است؛ درحالی‌که با تیمار سالیسیلیک اسید افزایش چشمگیری نسبت به شاهد داشته است؛ ولی با افزایش غلظت، روند رو‌به‌کاهش داشته است و بیشترین کاهش، در غلظت 50 میکرو‌مولار مشاهده شد. نتایج مربوط به اثر متیل جاسمونات بر محتوای کافئیک اسید نشان دادند تنها غلظت 150 میکرو‌مولار متیل جاسمونات میزان کافئیک اسید را نسبت به شاهد افزایش داد (شکل 3-A). نتایج مقایسة میانگین اثر سالیسیلیک اسید بر محتوای رزمارینیک اسید نشان دادند با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید، مقدار رزمارینیک اسید نیز روند رو‌به‌افزایش داشته است؛ به‌طوری‌که با غلظت 150 میکرومولار سالیسیلیک اسید، بیشترین میزان رزمارینیک اسید حاصل و کمترین میانگین در شاهد مشاهده شد. همة تیمارهای متیل جاسمونات نیز افزایش میزان رزمارینیک اسید را نسبت به شاهد سبب شدند؛ ولی نسبت به تیمارهای سالیسیلیک اسید تأثیر کمتری بر افزایش محتوای این ماده داشتند (شکل 3-B).

داده‌های حاصل از سنجش مقدار کافئیک اسید در پژوهش حاضر با نتایج گزارش‌های قبلی در کنگرفرنگی (Samadi et al., 2014) وگیاه Salvia miltiorrhiza (Dong et al., 2010) هم‌راستا هستند. بسیاری از بررسی‌ها نشان می‌دهند افزودن سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات خارجی

شکل 3- تاثیر سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات بر کافئیک اسید (A)و رزمارینیک اسید (B) کالوس برگ گیاه نوروزک. مقادیر، میانگین سه تکرار (هر تکرار پنج جدا کشت)± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون LSD است.

احتمالاً با اتصال به گیرنده‌های غشا سبب تولید اکسیژن‌های فعال، پروتئین کینازها، سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات می‌شود (Andi et al., 2001; Raman and Ravi, 2011) و از‌این‌رو با تأثیر مستقیم این تغییرات بر رونویسی ژن‌ها و آنزیم‌های دخیل در ساخت متابولیت‌های ثانویه، تولید این ترکیبات را افزایش می‌دهند. درواقع متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید با تأثیر بر آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز، فعال‌کردن مسیر فنیل پروپانوئیدی و افزایش تولید ترکیبات فنلی را سبب می‌شوند (Wang et al., 2009; Wen et al., 2005).

جمع‌بندی

استفاده از اکسین 1 – نفتالن استیک اسید و 2, 4-D پس از چهار هفته در کالوس‌زایی با جدا‌کشت ساقه و برگ گیاه نوروزک نشان داد اکسین 1 – نفتالن استیک اسید با غلظت‌های مصرفی با Kin کالوس تولید نکرد؛ درحالی‌که 2, 4-D در جدا‌کشت ساقه نسبت به جداکشت برگ با غلظت کمتر، کالوس تولید کرد و باتوجه‌به بافت و اندازة کالوس‌های حاصل، جدا‌کشت برگ با غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر Kin با 2 میلی‌گرم بر لیتر 2, 4-D مناسب‌ترین کالوس را تولید کرد که در بررسی اثر الیسیتورهای سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات از آن استفاده شد. در آزمایش حاضر نشان داده شد میزان تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاه نوروزک به غلظت محرک محیط بستگی دارد. همچنین افزایش محرک بیش از مقدار معمول، افزایش متابولیت‌های ثانویه را در بر ندارد؛ بلکه تولید متابولیت‌های ثانویه را کاهش می‌دهد؛ بنابراین با بهینه‌کردن غلظت محرک در محیط‌کشت، بدون دست‌ورزی در ساختار ژنتیکی گیاه میزان تولید متابولیت‌های ثانویة مدنظر افزایش می‌یابد.

سپاسگزاری

در اینجا از مسئولان و کارکنان دانشکدة کشاورزی دانشگاه صنعتی شاهرود بابت فراهم‌کردن امکانات لازم برای انجام پژوهش حاضر سپاسگزاری می‌شود.

مراجع

Akkol, E. K., Göger, F., Koşar, M. and Başer, K. H. C. (2008) Phenolic composition and biological activities of Salvia halophila and Salvia virgata from Turkey. Food Chemistry 108: 942-949.

Andi, S., Taguchi, F., Toyoda, K., Shiraishi, T. and Ichinose, Y. (2001) Effect of methyl jasmonate on harpin-induced hypersensitive cell death, generation of hydrogen peroxide and expression of PAL mRNA in tobacco suspension cultured BY-2 cells. Plant and Cell Physiology 42(4): 446-449.

‏Bulgakov, V. P., Tchernoded, G. K., Mischenko, N. P., Khodakovskaya, M. V., Glazunov, V. P., Radchenko, S. V., Zvereva, E. V., Fedoreyev, S. A. and Zhuravlev, Y. N. (2002) Effect of salicylic acid, methyl jasmonate, ethephon and cantharidin on anthraquinone production by Rubia cordifolia callus cultures transformed with the rolB and rolC genes. Journal of Biotechnology 97(3): 213-221.

Chong, T. M., Abdullah, M. A., Fadzillah, N. M., Lai, O. M. and Lajis, N. H. (2005) Jasmonic acid elicitation of anthraquinones with some associated enzymic and non-enzymic antioxidant responses in Morindaelliptic. Enzyme and Microbial Technology 36(4): 469-477. ‏

Darvishi, E., Kahrizi, D., Bahraminejad, S. and Mansouri, M. (2017) Study of yeast extract and salicylic acid elicitors effects on percentage of cell survival and the amount of beta-caryophyllene and isopulegone secondary metabolites in Pennyroyal (Mentha pulegium) cell culture. Journal of Cellular and Molecular Research 29(4): 370-381 (in Persian).

Dong, J., Wan, G. and Liang, Z. (2010) Accumulation of salicylic acid-induced phenolic compounds and raised activities of secondary metabolic and antioxidative enzymes in Salvia miltiorrhiza cell culture. Journal of Biotechnology 148(2): 99-104.

Ewa, A. and Halina, S. (2004) In vitro regeneration of Salvia nemoroza L. from shoot tips and leaf explants. In vitro Cellular and Developmental Biology Plant 40: 596-602.

Han, Y., Jin, X. L., Wu, F. B. and Zhang, G. P. (2011) Genotypic differences in callus induction and plant regeneration from mature embryos of barley (Hordeum vulgare L.). Journal of Zhejiang University-Science 12(5): 399-407.

Hanaka, A., Maksymiec, W. and Bednarek, W. (2015) The effect of methyl jasmonate on selected physiological parameters of copper-treated Phaseolus coccineus plants. Plant Growth Regulator 77: 167-177.

Hedge, I. C. (1986) Labiatae In: Flora Iranica (Ed. Rechinger, K. H.) vol. 150. Akademische Druck-U Verlagsanstalt, Graz.

Kabiri, R., Nasibi, F. and Farahbakhsh, H. (2014) Effect of exogenous salicylic acid on some physiological parameters and alleviation of drought stress in Nigella sativa Plant under hydroponic culture. Plant Protection Science 50(1): 43-51.‏

Kahkonen, M. P., Hopia, A. I., Vuorela, H. J., Rauha, J. P., Pihlaja, K., Kujala, T. S. and Heinonen, M. (1999) Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry 47(10): 3954-3962

Kamatou, G. P. P., Makunga, N. P., Ramogola, W. P. N. and Viljoen, A. M. (2008) South African Salvia species: A review of biological activities and phytochemistry. Journal of Ethnopharmacology 119: 664-672.

Kim, H. Y., Chen, F., Wang, Z. and Rajapakse, N. (2006) Effect of methyl jasmonate on secondary metabolites of sweet basil (Ocimum basilicum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry 54: 2327-2332.

Kintzios, S., Nikolaou, A. and Skoula, M. (1999) Somatic embryogenesis and in vitro rosmarinic acid accumulation in Salvia officinalis and S. fruticosa leaf callus cultures. Plant Cell Reports 18: 462-466.

Li, N., Parsons, B. L., Liu, D. R. and Mattoo, A. K. (1992) Accumulation of wound-inducible ACC synthase transcript in tomato fruit is inhibited by salicylic acid and polyamines. Plant Molecular Biology 18: 477-487.

Lu, Y. and Foo, L. Y. (2002) Polyphenolics of Salvia-a review. Phytochemistry 59: 117–140.

Mederos-Molina, S. (2004) In vitro Callus induction and plants from stem and petiole explants of Salvia canariensis L. Plant Tissue Culture 14: 167-172. ‏

Mehrabani, B., Nazeri, S. and Piri, K. (2013) Evaluation of total produced phenol in Chaei Koohi (Stachys lavandulifolia Vahi.) callus culture and possibility of its enhancement using Elicitors. Journal of Agricultural Biotechnology 4(2): 77-88 (in Persian).

Modarres, M. Abrishamchi, P., Ejtehadi, H. and Ramezani, A. (2007) Propagation of Salvia leriifolia by embryo culture. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research 15(2): 129-141 (in Persian).

Modarres, M., Asili, J., Gangali, A., Iranshahy, M. and Sahebkar, A. (2014) Simultaneous rosmarinic acid, salvianolic acid b and caffeic acid in salvia leriifolia benth. root, leaf and callus extracts using a high-performance liquid chromatography with diodearray detection technique. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies 37(12): 1721-1730.

Modarres, M., Lahooti, M., Asili, J., Kafi, M. and Ramazani, A. (2013) Optimizing leaf callus culture in Salvia leriifolia for phenolic acids production. Plant Process and Function 2(2): 65-74.

Moore, T. C. (1989) Biochemistry and physiology of plant hormones. Springer Verlag, Inc., New York.

Namdeo, A. G. (2007) Plant cell elicitation for production of secondary metabolites: a review. Pharmacognosy Reviews 1(1): 69-79. ‏

Pacheco, A. C., da Silva Cabral, C., da Silva Fermino, E. S. and Aleman, C. C. (2013) Salicylic acid-induced changes to growth, flowering and flavonoids production in marigold plants. Journal of Medicinal Plants Research 7(42) :3158-3163. ‏

Pinot, F., Benveniste, I., Salaün, J. P. and Durst, F. (1998) Methyl jasmonate induces lauric acid ω-hydroxylase activity and accumulation of CYP94A1 transcripts but does not affect epoxide hydrolase activities in Vicia sativa seedlings. Plant Physiology 118(4): 1481-1486. ‏

‏Raman, V. and Ravi, S. (2011) Effect of salicylic acid and methyl jasmonate on antioxidant systems of Haematococcus pluvialis. Acta physiologiae plantarum 33(3): 1043-1049.

Samadi, S., Ghasemnezhad, A. and Alizadeh, M. (2014) Investigation on phenylalanine ammonia-lyase activity of artichoke (Cynara scolymus L.) affected by methyl jasmonate and salicylic acid in in-vitro conditions. Journal of Plant Production Research 21(4): 135-148 (in Persian).

Sauvesty, A., Page, F. and Huot, J. (1992) A simple method for extracting plant phenolic compounds. Canadian Journal of Forest Research 22(5): 654-659. ‏

Shabani, L. and Ehsanpour, A. (2010) Induction of antioxidant enzymes, phenolic and flavonoid compounds in in vitro culture of licorice (Glycyrrhiza glabra L.) using methyl jasmonate and salicylic acid. Iranian Journal of Biology 2(2): 691-703 (in Persian).

Singh, A .and Dwivedi, P. (2018) Methyl-jasmonate and salicylic acid as potent elicitors for secondary metabolite production in medicinal plants: A review. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 7(1): 750-757.

Singleton, V. L. and Rossi, A. J. (1965) Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture 16: 144-158.

Suan See, K., Bhatt, A. and Lai Keng, C. (2011) Effect of sucrose and methyl jasmonate on biomass and anthocyanin production in cell suspension culture of Melastoma malabathricum (Melastomaceae). Revista de Biología Tropical 59(2): 597-606.

Swiatek, A., Azmi, A., Witters, E. and Van Onckelen, H. (2003) Stress messenger’s jasmonic acid and abscisic acid negatively regulate plant cell cycle. Bulgarian Journal of Plant Physiology 29: 172-178.

Tabatabai Yazdi, F. (1995) Antioxidant effects of essential oil and leaf extract of Salvia leriifolia and its phytochemical identification. MSc thesis, University of Tehran, Tehran, Iran (in Persian)

Tepe, B. (2007) Antioxidant potentials and rosmarinic acid levels of the methanolic extracts of Salvia virgata (Jacq), Salvia staminea (Montbret and Aucher ex Bentham) and Salvia verbenaca (L.) from Turkey. Bioresour Technol 99: 1584–1588.

Vasconsuelo, A. and Boland, R. (2007) Molecular aspects of the early stages of elicitation of secondary metabolites in plants. Plant Science 172(5): 861-875. ‏

Wang, K., Jin, P., Cao, S., Shang, H., Yang, Z. and Zheng, Y. (2009) Methyl jasmonate reduces decay and enhances antioxidant capacity in Chinese bayberries. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57(13): 5809-5815. ‏

Wen, P. F., Chen, J. Y., Kong, W. F., Pan, Q. H., Wan, S. B. and Huang, W. D. (2005) Salicylic acid induced the expression of phenylalanine ammonia-lyase gene in grape berry. Plant Science 169(5): 928-934.