کاهش تبلور سلولز با ایجاد جهش حذفی با‌ روش CRISPR/Cas9 در جایگاه P-CR زیرواحد CESA4 صنوبر سفید (Populus alba L.)

نیری, شهنوش; باغبان کهنه روز, بهرام; رافت, سید عباس

doi:10.22108/ijpb.2022.135394.1303

کاهش تبلور سلولز با ایجاد جهش حذفی با‌ روش CRISPR/Cas9 در جایگاه P-CR زیرواحد CESA4 صنوبر سفید (Populus alba L.)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

¹ گروه علوم و زیست فناوری گیاهی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

² گروه به‌نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز ، ایران

³ گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

10.22108/ijpb.2022.135394.1303

چکیده

سلولز فراوان‌ترین هموپلی‌ساکارید خطی در طبیعت است که به‌علت طبیعت نیمه‌بلورین و ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی منحصربه‌فرد برای بهره‌برداری در صنایع چوب و خمیر کاغذ، تولید سوخت زیستی و نانوسلولز همواره موردتوجه پژوهشگران و سرمایه‌گذاران بوده است. با این‌حال، استحکام بالای دیواره سلولی و تبلور بالای سلولز همچنان از مهمترین مسایل چالش‌ برانگیز در تولید سلولز و تجزیه آن در صنایع تولید بیواتانول و نانوسلولز هستند. در این پژوهش، تغییرات ساختاری دیواره سلولی، محتوای ترکیبات لیگنوسلولز، شاخص تبلور (CrI) و درجه پلیمریزه شدن (DP) الیاف سلولز ناشی از جهش حذف با روش ویرایش ژن CRISPR/Cas9 در اسیدآمینه‌های پرولین 435 و تریپتوفان 436 ناحیه حفاظت‌شده گیاهی (P-CR) زیرواحد CESA4 در گیاه صنوبر سفید بررسی شد. بر اساس نتایج، گیاه نسل T0 ویراسته ژنی هموزیگوس PalCESA4^{P435del_W436del} سالم با قابلیت رشد طبیعی به دست آمد که از نظر مساحت دیواره سلولی (89/21 درصد)، ضخامت دیواره سلولی(5/7 درصد)، محتوای سلولز (تقریباً 44 درصد) و میزان تبلور سلولز (5/19 درصد) نسبت به گیاه شاهد کاهش معنی‌داری نشان داد. یافته‌های این تحقیق سرآغازی برای تولید چوب‌های ویراسته ژنی با ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی مطلوب میکروفیبریل‌های سلولزی برای بهره‌برداری اقتصادی در گونه‌های مختلف گیاهی است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

زیست‌مولکولی گیاهی

عنوان مقاله [English]

Reduction of cellulose crystallization by CRISPR/Cas9 -mediated mutagenesis in the P-CR domain of CESA4 subunit of white poplar (Populus alba L.)

نویسندگان [English]

Shahnoush Nayeri ¹
Bahram Baghban Kohnehrouz ²
Seyed Abbas Rafat ³

¹ Department of Plant Sciences and Biotechnology, Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Shahid Beheshti University, Tehran-19839, Iran

² Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz-51666, Iran

³ Department of animal sciences, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz-51666, Iran

چکیده [English]

Cellulose is the most abundant linear homopolysaccharide in nature, which has always raised great attention from investigators and industrial investors for use in wood and paper pulp industries, biofuel, and nanocellulose products due to its semi-crystalline nature and unique physicochemical properties. However, the cell wall recalcitrance and high cellulose crystallinity of wood biomass are the most challenging issues during cellulose extraction and its saccharification in bioethanol and nanocellulose production industries. Here, we have investigated the effect of CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis on the Pro435 and Try436 residues at the binding site of PalCESA4-specific P-CR domain from white poplar. As the result, we generated a PalCESA4P435del_W436del homozygous T0 mutant plant with normal growth that showed a significant decrease in cell wall area (21.89%), cell wall thickness (7.5%), cellulose content (~ 44%), and cellulose crystallinity (19.5%) compared to the WT plant. Our findings reveal a promising approach to achieving genetically edited woods with suitable physicochemical properties of cellulose microfibrils in different plant species for industrial applications.
Introduction
Cellulose is the most abundant linear homopolymer in wood biomass of woody plants. Due to its semi-crystalline nature, it uses in various industrial applications, including wood and paper, textile, pharmaceutical and medicinal, agriculture, biofuel, and bio-nanomaterials (Littlewood et al., 2014; Trache et al., 2020). Despite its wide applications, high cellulose crystalization is the most important challenge in the production processes of bioethanol and nanocellulose from wood biomass (Vermerris and Abril, 2015). As the previous reports associated with the cellulose biosynthesis pathway in Arabidopsis and poplar, the CrI and DP of cellulose, the number of microfibrils in the cell wall architecture is highly influenced by the arrangement of cellulose synthase A (CESA) subunits during the formation of the cellulose synthase complex (CSC) (Luan et al., 2011; Scanlon and Timmermans, 2013; Speicher et al., 2018). In our previous study, we identified the strong binding site containing four amino acids Pro435, Trp436, Pro437, and Gly438 in the P-CR domain of poplar CESA4 subunit, which is involved in the CESA4 and CESA8 heterodimerization. The CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis in Trp436 and Pro437 residues could alter plant growth and photosynthesis rates, a cell wall thickness of xylem and phloem cells, lignocellulose content, CrI, and DP of cellulose fibers in poplar (Nayeri et al., 2022).

Materials and Methods
The CESA4-specific sgRNA (5′-CAGGATGGTACCCCCATGGCCTGG-3′) was designed using CRISPRdirect, CHOPCHOP, and CRISPOR-Tefor tools. The genome sequence data of P. trichocarpa v 4.1 was used to determine the sgRNA on-target and off-target sites. The molecular cloning of the recombinant CRISPR/Cas9 expression vector (Figure 1) was performed according to the method described by Nayeri et al., 2022. The pulvini tTCL explants from the petioles of 4th nodes close to apical buds of P. alba L. were transformed using competent bacterial cells of Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 as described by Nayeri et al., 2022. The T0 plants were screened and validated using PCR analysis of bar and pcoCas9 genes. The bacterial contaminations of to plants were examined using PCR analysis of the Vir G gene. The screening of T0 mutants and identification of mutation types in the PalCESA4-sgRNA target site gene were performed using heteroduplex PCR genotyping methods (Guo et al., 2018), amplification of PCR fragments using mutation site-specific primers (MSBSP-PCR) (Bhattacharya and Van Meir, 2019) and sanger sequencing analysis. The sequence data of primer sets were presented in Table 1. The wood anatomy of the T0 mutant was investigated using light microscopy (LM) and field emission scanning electron microscopy (FE-SEM) analysis. The contents of lignocellulosic components were determined according to the TAPPI international standard guidelines. The cellulose crystallinity index (CrI) and its degree of polymerization (DP_N, DP_W, PDI) were determined using XRD analysis patterns and gel permeation chromatography (GPC), respectively. The statistical analysis was performed using one-way ANOVA analysis of variance and mean comparison based on LSD posthoc's minimum significant difference using SPSS IBM v. 22.0 (SPSS Inc, Chicago, USA). The maximum significance level was set at 5% (p-value ≤0.05).

Results and discussion
As shown in the PCR analysis results, 14 out of 15 regenerated T0 plantlets had DNA bands of PCR products belonging to bar and pcoCas9 genes. Furthermore, 11 out of 14 T0 plants showed a lack of DNA bands from the PCR2 products (196 bp), which indicates homozygous or biallelic mutations in T0 mutants. In the rest of the T0 plants, no mutation or heterozygous mutations were observed due to the sharp DNA bands from the PCR2 products. The heteroduplex genotyping results showed the double DNA band of CESA-PCR3 fragments (160 bp) in 5% agarose gel, indicating heterozygous mutation in the T0 mutant poplar. However, the DNA hybridization in potent biallelic/homozygous T0 mutants indicates homozygous mutation in all 11 T0 mutants. Among the T0 mutants, we identified a homozygous T0 mutant plant (L7) with double deletion mutations in P435 and W436 residues (Figure 3E). As the wood anatomy analysis results, the V_d value of the homozygous palCESA4^{P435del_W436del} (L7) T0 plant showed a significant decrease of 74.85% compared with the WT. The cell wall area (21.89%), cell wall thickness (7.5%), cellulose content (approximately 44%), and CrI of cellulose (19.5%) significantly decreased. According to the previous reports, the knockdown or knockout of PtriCESA4, PtriCESA7a/b, and PtriCESA8a/b genes cause a remarkable decrease in the thickness of the cell wall and cellulose content (~90%), resulting in the production of unhealthy and abnormal mutants (Abbas et al., 2020; Xu et al., 2021). Our previous findings reveal that substitution and deletion of Trp436 and Pro437 residues in the binding site of CESA4-specific P-CR domain led to a 13-25% decrease in the cellulose CrI from wood biomass of T0 poplar mutant (Nayeri et al., 2022).

Conclusion
These findings can be used in the production of gene-edited plants using the CRISPR/Cas9 system with desirable traits such as low cellulose crystalization, leading to saving in costs and time in the pure cellulose extraction process and preparation of cellulose-based biomaterials. Therefore, this isa promising technology for the mass production of cellulose-based products, which increases export volume and develop new and environmental-friendly technologies in the country.

Acknowledgement
This article was extracted from the final report of the research project under contract number 346/27/D, which was applied to the research grant of the University of Tabriz, Tabriz, Iran. Our special thanks to Iranian Research Institute for Information Science and Technology (IranDoc) for technical and financial suports of our genetic engineering lab, the center of graduate education, faculty of agriculture, university of Tabriz, Tabriz-51666, Iran IR.

کلیدواژه‌ها [English]

CESA4
Cellulose crystalization
CRISPR/Cas9
Degree of Polymerization
Lignocellulose
White poplar

اصل مقاله

مقدمه

سلولز یک هموپلی‌ساکارید D-گلوکان خطی با پیوند β(1 4) است که به‌عنوان فراوان‌ترین ماده آلی طبیعت بخش زیادی از بافت دیواره سلولی گیاهان چوبی (55-42 درصد) را به خود اختصاص می‌دهد (Klemm et al., 2005; Somerville, 2006). ماهیت نیمه‌بلورین سلولز، ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی منحصربه فرد، فراوانی بالا، سهولت در دسترسی، تجدیدپذیری، سازگاری با محیط زیست از جمله مهمترین ویژگی‌های بالقوه سلولز طبیعی حاصل از بیوماس گیاهان چوبی برای بهره‌برداری در صنایع چوب و کاغذ، نساجی، علوم زیستی، کشاورزی، تولید سوخت زیستی و نانوساختارهای سلولزی است (Abitbol et al., 2016; Littlewood et al., 2014; Trache et al., 2020). درختان صنوبر Populus sp. به‌علت رشد سریع، قابلیت تکثیر رویشی، سازگاری با انواع شرایط آب و هوایی، پراکندگی جغرافیایی وسیع، عملکرد بالا در تولید بیوماس لیگنوسلولزی، منبع زیستی غنی برای تولید سلولز طبیعی به شمار می‌روند (Balatinecz et al., 2001; Etemadi et al., 2016; Ghanbary et al., 2012; Porth and El‐Kassaby, 2015). پیش‌بینی می‌شود تا سال 2025 تولید سوخت زیستی به 4/128 میلیون لیتر در سال (FAO, 2017; Littlewood et al., 2014) و تولید نانوساختارهای سلولزی مانند نانوفیبریل‌های سلولزی (CNF) و نانوکریستال‌های سلولزی (CNC) به بیش از 783 میلیون دلار (Markets and Markets, 2022) افزایش یابد. به گزارش Market and Markets (2022)، میزان صادرات سلولز از ایران در حدود 64000 دلار و واردات آن درحدود 6/30 میلیون دلار است. در ایران، به گزارش وزارت صنعت، معدن و تجارت در سال 1400 شمسی بیش از 1630 کارخانه و واحد تولیدی در صنایع کاغذ، بهداشتی آرایشی و بسته‌بندی بر اساس سلولز فعال هستند که بیش از 5 میلیون تن محصول ساخته شده از سلولز را تولید می‌کنند.

بر این اساس، صرف هزینه‌ها و زمان زیاد و دشواری تولید و تجزیه سلولز از دیواره سلولی مستحکم گیاهان با روش‌های مکانیکی، شیمیایی و زیستی از مهم‌‌ترین دلایل عدم صرفه اقتصادی در چرخه تولید صنعتی بیواتانول و نانوسلولز از بیوماس گیاهان چوبی است (Bali et al., 2016; Kumar et al., 2009). تحقیقات نشان می‌دهد، میزان استحکام و سختی دیواره سلولی توسط میزان اجزای تشکیل دهنده بیوماس لیگنوسلولزی گیاهان همچون سطح بالای لیگنین، درصد تبلور سلولز (CrI) و درجه پلیمریزه شدن سلولز (DP) تعیین می‌شود که تأثیر زیادی در میزان تولید سلولز، کیفیت استخراج و تجزیه آن دارد (Chang and Holtzapple, 2000; Laureano-Perez et al., 2005; Vermerris and Abril, 2015). در طی دو دهه گذشته، مسائل و مشکلات بیان شده، دلیلی شده است که پژوهشگران با مطالعه ژن‌های رمز کننده پروتئین‌های ساختاری و تنظیم کننده درگیر در مسیر بیوسنتز دیواره سلولی اولیه و ثانویه در گیاهان مدل مانند Arabidopsis thaliana (آرابیدوپسیس)، Oryzae sativa (برنج) و Populus trichocarpa برای ارائه راه حل مناسب گام بردارند (Bjurhager et al., 2010; Leple et al., 2007; Petersen et al., 2012; Sakamoto et al., 2018; Simmons et al., 2010). با اینحال، تغییر در ساختار دیواره سلولی به کاهش مقاومت مکانیکی، توقف رشد و تأثیر منفی در مسیر رشد و تمایز گیاه منجر می‌شود (Abbas et al., 2020; Wang et al., 2016; Wang et al., 2014; Xie and Peng, 2011). با وجود استفاده از سیستم RNA سنس و RNA آنتی‌سنس (Baucher et al., 1996; Lapierre et al., 1999; Pilate et al., 2002; Van Doorsselaere et al., 1995) و فناوری تداخل RNA (RNAi) در کاهش سطح mRNA ژن‌های درگیر در مسیر بیوسنتز لیگنین و همی‌سلولز (Hinchee et al., 2009; Hu et al., 1999; Lee et al., 2009)، مشکلات تولید سلولز و بهره برداری از این محصول ارزشمند حل نشده و همچنان باقی است.

مطالعه مسیر بیوسنتز سلولز در آرابیدوپسیس و صنوبر نشان می‌دهد که درصد شاخص تبلور و DP سلولز و تعدد میکروفیبریل‌ها در ساختار دیواره سلولی به نحوه اتصال و آرایش زیرواحدهای آنزیم سلولز سنتاز A (CESA) در تشکیل ساختار کمپلکس سلولز سنتاز (CSC) که اصطلاحاً ساختار رزت نامیده می‌شود، بستگی دارد (Luan et al., 2011; Scanlon and Timmermans, 2013; Speicher et al., 2018). مطالعات نشان می‌دهد که 18 یا 36 زنجیره‌ D-گلوکان سلولز از یک ساختار شش وجهی حاوی شش کمپلکس پروتئینی CSC متصل به غشای پلاسمایی، سنتز شده و در دیواره سلول تجمع می‌یابند. هر ساختار CSC متشکل از 3 یا 6 زیرواحد پروتئینی آنزیم سلولز سنتاز (CESA) به خانواده گلیکوزیل ترانسفراز 2 تعلق دارد که به شکل یک ساختار شش وجهی به نام رزت (rosette) به یکدیگر متصل هستند (Burn et al., 2002; Hill et al., 2014; Nixon et al., 2016). در P. trichocarpa 18 ژن cesA رمزکننده ایزوفرم‌های سلولز سنتاز در دیواره سلولی اولیه (PCW) شامل CESA1A/B، CESA3C/D،CESA6 و در دیواره سلولی ثانویه (SCW) شامل CESA4، CESA7A/B و CESA8A/B، شناسایی شده است (Abbas et al., 2020; Djerbi et al., 2005; Song et al., 2010; Suzuki et al., 2006; Xi et al., 2017). بررسی ساختار رزت CSC نشان می‌دهد که دمین P-CR در اتصال اختصاصی زیرواحدهای سلولز سنتاز و تشکیل ساختار کمپلکس نقش دارد (Kurek et al., 2002; Purushotham et al., 2016; Sethaphong et al., 2013). Purushotham و همکارانش (2020) با میکروسکوپ الکترونی cryo-EM نشان دادند که دمین P-CR در تشکیل همودایمر بین زیرواحدهای CESA8 دخالت دارد. در مطالعه پیشین، ما یک جایگاه اتصال با 4 اسید آمینه مستعد Pro435, Trp436 Pro437, Gly438 در ناحیه turn دمین P-CR زیرواحد CESA4 صنوبر شناسایی کردیم که در تشکیل هترودیمر CESA4 و CESA8 دخیل هستند. نتایج این پژوهش نشان داد که ایجاد جهش با ‌روش سیستم ویرایش ژن تناوب‌های کوتاه پالیندروم فاصله‌دار منظم خوشه‌ای/پروتئین مرتبط با کریسپر 9 (CRISPR/Cas9) در دو اسید آمینه تریپتوفان 436 و پرولین 437 می‌تواند به تغییر در نرخ رشد و سرعت فتوسنتز گیاه، تغییر در ضخامت دیواره سلولی، قطر سلول‌های آوندهای چوبی و آبکش، محتوای ترکیبات لیگنوسلولزی و میزان تبلور الیاف سلولز در صنوبر منجر شود (Nayeri et al., 2022).

در این پژوهش، دو اسید آمینه پرولین 435 و تریپتوفان 436 در دمین P-CR زیرواحد CESA4 صنوبر سفید (P. alba L.) توسط سیستم ویرایش ژن CRISPR/Cas9 برای ایجاد جهش نوکلئوتیدی و اسیدآمینه‌ای مورد هدف قرار داده شد. تأثیر فنوتیپی حاصل از این جهش اسیدآمینه‌ای شامل ویژگی‌های مورفوفیزیولوژیک گیاه، ساختار دیواره سلولی، محتوای لیگنوسلولزی، سطح تبلور سلولز و درجه پلیمریزه شدن سلولز در گیاهان T0 ویراسته ژنی سالم و قابلیت زنده مانی مطالعه شد. یافته‌های این پژوهش می‌تواند در تولید گیاهان ویراسته ژنی با ‌روش سیستم CRISPR/Cas9 با صفات مطلوب مانند تبلور پایین سلولز استفاده شود. کاهش سطح تبلور سلولز در درخت صنوبر با ارزش اقتصادی بالا می‌تواند به کاهش هزینه های تولید سلولز و فرآورده‌های سلولزی کمک نموده و راهگشای تولید انبوه محصولات مبتنی بر سلولز، افزایش صادرات محصولات سلولزی و توسعه فناوری‌های نوین و دوستدار محیط زیست در کشور شود.

مواد و روش‌ها

طراحی sgRNA اختصاصی

sgRNA اختصاصی برای دو اسیدآمینه پرولین 435 و تریپتوفان 436 مفروض با ابزارهای تحت وب شامل CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp/) (Naito et al., 2015)، CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/) (Labun et al., 2019) و CRISPOR-Tefor (http://crispor.tefor.net) (Concordet and Haeussler, 2018) طراحی شد. توالی ژن PalCESA4 با شماره دسترسی XM_035060298.1 متناظر با توالی اسیدآمینه‌ای آن به شماره دسترسی XP_034916189 در پایگاه GenBank در NCBI برای طراحی sgRNA استفاده شد. جایگاه اتصال شناسایی شده در دمین P-CR در موقعیت نوکلئوتیدی 2227-2246 به‌طول 20 نوکلئوتید در توالی ژن PalCESA4 قرار دارد. اطلاعات داده‌های توالی ژنوم P. trichocarpa v 4.1 (Phytozome genome ID: 533; NCBI taxonomy ID: 3694) (Tuskan et al., 2006) به‌عنوان ژنوم منبع در تعیین جایگاه اختصاصی sgRNA و جایگاه‌های غیرهدف استفاده شد. نوع پروتئین Cas و توالی PAM به‌ترتیب اندونوکلئاز Cas9 متعلق به باکتری Streptococcus pyogenes و موتیف '-NGG-3'5 استفاده شد. توالی sgRNA با تنها یک توالی هدف شناسایی کننده به طول 20 نوکلئوتید+PAM، 12 نوکلئوتید+PAM و 8 نوکلئوتید+PAM به عنوان sgRNA با اختصاصیت بالا مشخص شد. توالی sgRNA + PAM شامل 5′- CAGGATGGTACCCCATGGCCTGG -3′ است.

شناسایی جایگاه‌‌های غیرهدف

جایگاه‌های غیرهدف مستعد sgRNA اختصاصی بر مبنای شناسایی توالی PAM در اطلاعات داده‌های ژنوم P. trichocarpa ver. 4.1 (Phytozome genome ID: 533) در پایگاه sPta717 Variant DB (http://aspendb.uga.edu/s717) انجام شد (Tuskan et al., 2006). جایگاه‌های شناسایی شده بدون توالی PAM با توالی NGG و NAG که بیش از 4 نوکلئوتید غیر مشابه دارند و یا حداقل 2 نوکلئوتید از 3-4 نوکلئوتید غیرمشابه در ناحیه هدفگیری هستند، به‌عنوان توالی غیرهدف استفاده نشد (Hsu et al., 2013). بر اساس نتایج، جایگاه‌های غیر هدف برای sgRNA مورد نظر شناسایی نشد.

سویه باکتری و پلاسمیدهای استفاده شده

طی مراحل همسانه‌سازی و ساخت ناقل بیانی دوتایی نوترکیب CRISRPR/Cas9 حاوی کاست بیانی sgRNA اختصاصی از باکتری E. coli سویه DH5α استفاده شد. به‌منظور انتقال ژن به گیاه P. alba، از باکتری A. tumefaciens سویه LBA4404 (اکتوپین) با قدرت بیماری‌زایی پایین حاوی پلاسمید کمکی pTiAch5 در پیش‌زمینه کروموزومی Ach5، ژن مقاومت به آنتی‌بیوتیک ریفامپیسین (rif) و ژن مقاومت به آنتی بیوتیک استرپتومایسین (strB) استفاده شد (Hoekema et al., 1983; Ooms et al., 1982). ناقل همسانه‌سازی pUC19 (2686bp) (Cat No. SD0061، شرکت Thermo Scientific™، USA) و ناقل بیانی pFGC-pcoCas9 (13330bp) به‌ترتیب به‌عنوان ناقل همسانه‌سازی و بیانی گیاهی استفاده شده است (Li et al., 2013; Li et al., 2015b; Yoo et al., 2007).

ساخت ناقل بیانی نوترکیب CRISPR/Cas9

توالی crRNA در داخل کاست بیانی sgRNA (به طول 417 جفت باز) مابین پیشبر AtU6-1 (به طول 305 جفت باز)، ناحیه tracrRNA (اسکافولد RNA به طول 76 جفت باز) و یک توالی خاتمه دهنده الیگو-dT (به طول 8 جفت باز) با ‌روش SOEing-PCR درج شد. برنامه دمایی و واکنش PCR در هر مرحله از Soeing-PCR مطابق روش اتخاذ شده در مطالعه پیشین انجام شده است (Nayeri et al., 2022). مشخصات آغازگرهای مستقیم و معکوس واکنش SOEing-PCR در جدول (1) ارائه شده است. پیش ساخت ناقل بیانی نوترکیب، کاست بیانی sgRNA اختصاصی ژن CESA4 در ناقل pUC19 همسانه سازی و توالی نوکلئوتیدی DNA پلاسمیدی به‌صورت دوبار خوانش و با آغازگرهای مستقیم و معکوس M13pUC با ‌روش سنگر (شرکت BGI Group، چین) توالی‌یابی شد. پس تأیید نتایج توالی‌یابی، کاست بیانی با ‌روش برش آنزیمی مضاعف EcoRI و XbaI از ناقل همسانه سازی جدا شده و در ناقل بیانی pFGC-pcoCas9 درج شد. همسانه سازی ناقل بیانی CRISPR/Cas9 نوترکیب در باکتری E. coli strain DH5α با دستگاه الکتروپوریشن Micropluser، Hercules، (Bio-Rad، کالیفورنیا، USA) به پالس الکتریکی با ظرفیت خازنی 25 میکروفاراد، ولتاژ 5/2 کیلو ولت و مقاومت 200 اهم انجام شد (Green and Sambrook, 2020; Sambrook et al., 1989; Sambrook and Russell, 2006). همسانه‌های نوترکیب از طریق گزینش با آنتی‌بیوتیک کانامایسین (Kan) و با روش کلنی PCR با آغازگرهای مستقیم و معکوس قطعه 127 جفت باز (جدول 1) تأیید شد. نمای شماتیک از ناقل بیانی دوتایی نوترکیب CRISPR/Cas9 حاوی کاست بیانی sgRNA اختصاصی در شکل (1) نشان داده شده است. به‌منظور دستیابی به کلنی نوترکیب آگروباکتریوم حاوی ناقل بیانی نوترکیب pFGC-pcoCas9، DNA پلاسمیدی pFGC-pcoCas9 نوترکیب حاوی کاست بیانی gRNA اختصاصی ژن PalCESA با ‌روش الکتروپوریشن در باکتری A. tumefaciens سویه LBA4404 همسانه سازی شد (Lin, 1995; Lurquin, 1997). دستگاه الکتروپوریشن (Micropluser، Hercules، Bio-Rad، کالیفورنیا، USA) به پالس الکتریکی با ظرفیت خازنی 25 میکروفاراد، ولتاژ 7/16 کیلوولت و مقاومت 200 اهم تنظیم و همسانه‌های نوترکیب در محیط YM/Agar/Rif/Strep/Kan گزینش و با روش کلنی PCR با آغازگرهای مستقیم و معکوس قطعه 127 جفت باز (جدول 1) تأیید شدند.

برداشت شد و تیمار سوم پساب صنعتی که از محل خروجی پساب کارخانه چوب و کاغذ برداشت شد. پساب‌ها به‌صورت ماهانه جمع‌آوری و در دبه‌های مخصوص نگهداری شدند.

جدول 1- لیست آغازگرهای استفاده شده

Table 1. The list of primer sets used in the experiments

اندازه محصول PCR (جفت باز)	توالی (5’ 3’)	نام آغازگر	ژن	شماره
آغازگرهای SOEing-PCR
345	ACCGGAATTCGAGCTCAGAAATCTCA	PU6_F	محصول PCR (ناحیه پیشبر AtU6-1 کاست بیانی sgRNA)	1
	CCAGGCCATGGGGTACCATCCTGAATCACTACTTCGTCTCTAACCA	gRNA_R
127	CAGGATGGTACCCCATGGCCTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG	gRNA_F	محصول PCR (ناحیه اسکافولد کاست بیانی sgRNA)	2
	ACGGTCTAGAAGCTTCTGCAGAAA	Scaff_R
449	ACCGGAATTCGAGCTCAGAAATCTCA	PU6_F	کاست بیانی sgRNA اختصاصی CESA4	3
	ACGGTCTAGAAGCTTCTGCAGAAA	Scaff_R
آغازگرهای واکنش PCR برای گزینش گیاهان تراریخته
184	ATCAACCTTAGCCATCTCGTT	Cas9-F	Cas9	1
	AAGGTTCTTGGAAACACCGAT	Cas9-R
552	ATGAGCCCAGAACGACGCCCGG	Bar-F	bar	2
	TCAAATCTCGGTGACGGGCAGG	Bar-R
850	ATGATTGTACATCCTTCACG	Vir-F	Vir G	3
	TGCTGTTTTTATGAGTTGAG	Vir-R
آغازگرهای آنالیز ژنوتایپینگ MSBSP-PCR
557	AGTAAGCAGAACCAACTTCCA	CESA4_F	PalCESA4 gene	1
	GTTTTACTCACCAGAGCATTCA	CESA4_R
196	CAGGATGGTACCCCATGGCC	Target_F	PalCESA4 gene	2
	GTTTTACTCACCAGAGCATTCA	CESA4_R
آغازگرهای آنالیز هترودوپلکس ژنوتایپینگ
160	ATTCAAAGTAAGGATCAACGC	P3_F	PalCESA4 gene	1
	ATACGGATGATGTTGTTAAACC	P3_R

شکل 1. نمای شماتیک از نقشه ژنتیکی ناقل بیانی pFGC-pcoCas9 نوترکیب (13733 جفت باز). مابین توالی‌های تکراری مرز راست (RB) و چپ (LB) T-DNA ناقل بیانی دوتایی به ترتیب: 1) ژن Cas9 مستخرج از باکتری Streptococcus pyogenes که بر اساس تمایل کدونی گیاه بهینه شده است (فلش ارغوانی) که این ژن تحت پیشبر 35SPPDK و خاتمه دهنده NOS قرار دارد؛ 2) کاست بیانی sgRNA (فلش آبی) تحت کنترل پیشبر AtU6-1 (فلش نارنجی) و خاتمه دهنده الیگو-dT و 3) ژن bar به عنوان گزینشگر گیاهی (فلش سبز) قرار دارد. جهت فلش‌ها نشان‌دهنده جهت بیان ژن‌های مورد نظر است.

Figure 1. Schematic representation of the CRISPR/Cas9 binary vector of pFGC-pcoCas9 with PalCESA4-specific sgRNA cassette (449 bp long). The genes between right (RB) and left borders (RB) include1- plant codon-optimized Cas9 gene from Streptoccocus pyogenes (purpule arrow), 2- specific sgRNA expression cassette under AtU6-1 promoter (Orange arrow) and Oligo dT terminator at the end of the cassette and 3- bar gene as the plant-spechfic screening marker (green arrow). The orientation of the arrows represents the orientation of coding region.

مواد گیاهی و ضدعفونی سطحی

درخت صنوبر کبودهP. alba L. واقع در باغ تحقیقاتی گیاه‌شناسی دانشگاه تبریز (BRGUT) (عرض جغرافیایی 38°03'30.4"N شمالی و طول جغرافیایی 46°20'07.8"E شرقی، با میانگین بارندگی 330 میلی‌متر، تبریز، ایران) به‌عنوان گیاه دهندهاستفاده شد. 8-10 عدد ساقه‌ جوان و درحال رشد (به‌طول 50-45 سانتی‌متر و قطر تقریبی 5/0-2/0 سانتی‌متر) حاوی جوانه‌انتهایی، جوانه‌های جانبی، دمبرگ و برگ توسط قیچی باغبانی از درخت جدا و در ظرف حاوی آب دیونیزه اتوکلاو شده به آزمایشگاه منتقل شدند. ضدعفونی بافت گیاهی مطابق دستورالعمل ارائه شده در مطالعه پیشین انجام شد (Nayeri et al., 2022).

شیوه‌نامه انتقال ژن غیرمستقیم A. tumefaciens

ریزنمونه برش عرضی لایه‌های سلولی نازک (tTCL) پولوینوس در گره 4 نزدیک به ساقه به عنوان ریزنمونه اصلی برای انتقال ژن با ‌روش آگروباکتریوم و باززایی گیاهان تراریخت استفاده شده است. کاست T-DNA نوترکیب طبق دستورالعمل انتقال ژن با ‌روش آگروباکتریوم ارائه شده توسط (Nayeri et al., 2022) به ریزنمونه‌های tTCL پولوینوس انتقال یافت. ریزنمونه‌ها در محیط گزینش (SM) (محیط MS پایه، BAP 75/0 میلی‌گرم بر لیتر، IBA 5/0 میلی‌گرم بر لیتر، سفوتاکسیم 250 میلی‌گرم بر لیتر و علفکش Basta® 5/0 میکرومولار) گزینش شدند. گیاهچه‌های مستقل باززایی شده و مقاوم به علفکش Basta®، به‌عنوان گیاهچه تراریخته T0 جدا و برای القای افزایش طول ساقه به محیط کشت گزینش SEM حاوی محیط MS پایه، BAP 15/0 میلی‌گرم بر لیتر، IBA 1/0 میلی‌گرم بر لیتر، سفوتاکسیم 250 میلی‌گرم بر لیتر و علفکش Basta® 5/0 میکرومولار برای طویل شدن ساقه به مدت 2 هفته انتقال داده شدند. ریزساقه‌ها (به طول 1-2 سانتی‌متر) به محیط ریشه‌زایی (RIM) حاوی محیط‌ کشت پایه MS، IBA 2/0 میلی‌گرم بر لیتر، NAA 1/0 میلی‌گرم بر لیتر، سفوتاکسیم250 میلی‌گرم بر لیتر و علفکش Basta® 5/0 میلی‌گرم بر لیتر انتقال داده شدند. کشت‌های مورد نظر در اتاق فیتوترونبا دوره فتوتروپیسم 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و شدت نور 4500 لوکس حاصل از لامپ فلورسنت سفید و زرد نگهداری شدند. این گیاهچه‌های ریشه‌دار (به طول 6 تا 8 سانتی‌متر) به گلدان‌های حاوی مخلوط ماسه، پیت ماس و پرلیت با نسبت 3:2:1 انتقال داده شدند. پس از سازگاری، گیاهان به خاک منتقل و در فضای گلخانه قرار داده شدند.

استخراج DNA کل ژنومی (gDNA) و تأیید اولیه تراریختی گیاهچه‌های T0

DNA کل ژنومی گیاهچه‌های باززایی شده‌ی منتخب با روش CTAB استخراج شد (Doyle and Doyle, 1987). تراریختی گیاهچه‌های T0 طی واکنش PCR با آغازگرهای مستقیم و معکوس اختصاصی ژن‌های bar و Cas9 تأیید اولیه شد. عدم آلودگی نمونه‌ها با سویه‌های آگروباکتریوم طی واکنش PCR با آغازگرهای اختصاصی ژن vir G مشخص شد. توالی آغازگرهای اختصاصی هر ژن در جدول (1) ارائه شده است. برنامه دمایی و واکنش PCR مطابق روش اتخاذ شده در مطالعه پیشین انجام شده است (Nayeri et al., 2022).

ژنوتایپینگو شناسایی گیاهان T0 ویراسته ژنی

شناسایی گیاهان T0 ویراسته ژنی و نوع جهش‌ها اعم از عدم وجود جهش ژنتیکی، جهش هموزیگوس، جهش هتروزیگوس، جهش دوبل اللو جهش نقطه‌ای در ژن PalCESA4 از سه روش ژنوتایپینگ هترودوپلکس PCR (Guo et al., 2018)، تکثیر قطعات PCR با آغازگرهای اختصاصی جایگاه جهش (MSBSP-PCR) (Bhattacharya and Van Meir, 2019) و توالی‌یابی سنگر استفاده شد. برنامه دمایی و واکنش PCR با روش‌های ژنوتایپینگ هترودوپلکس PCR و MSBSP-PCR مربوط و باتوجه‌به برنامه دمایی واکنش ارائه شده در مطالعه پیشین انجام شده است (Nayeri et al., 2022). توالی آغازگرهای اختصاصی استفاده شده در مرحله ژنوتایپینگ در جدول (1) ارائه شده است. محصول CESA-PCR1 هر گیاه T0 ویراسته ژنی به‌صورت دوبار خوانش و با آغازگرهای مستقیم و معکوس اختصاصی ژن CESA4 (جدول 1) با روش سنگر (شرکت BGI Group، چین) توالی‌یابی شد.

بررسی میکروسکوپی تغییرات آناتومی چوب گیاه T0 ویراسته ژنی در مقایسه با گیاه شاهد

تغییرات فنوتیپی ناشی از جهش در آناتومی چوب گیاه T0 ویراسته ژنی با ‌روش هیستوشیمیایی با میکروسکوپ نوری (LM) و میکروسکوپ الکترونی روبشی نشر میدانی (FE-SEM) بررسی شد. بافت میانگره ساقه در گره 15 نزدیک طوقه برای مطالعات میکروسکوپی استفاده شد. نمونه‌های ساقه با محلول FAA و سری‌ غلظت‌های مختلف اتانول شامل اتانول50، 60، 70، 85، 96 و 100 درصد (دو مرتبه) تثبیت شدند (Weigel and Glazebrook, 2008). سپس، با نسبت‎های مختلف اتانول و گزیلول شامل اتانول 75 درصد: گزیلول 25 درصد (Cas. No. 2650-17-1، Sigma-Aldrich، USA)، اتانول 50 درصد: گزیلول 50 درصد، اتانول 25 درصد: گزیلول 75 درصد و گزیلول 100درصد (دو مرتبه)، اتانول حذف شد. هر مرحله تیمار نمونه‌ها با محلول اتانول-گزیلول به‌مدت 30 دقیقه و در دمای اتاق انجام شد. به‌منظور پارافینه کردن نمونه‌ها از دستگاه اتوماتیک آماده سازی بافت (DS-2080/H، شرکت دیدسبز، تهران، ایران) حاوی پارافین (ASTM D87، Cas. No. 8002-74-2، Sigma-Aldrich، USA) در دمای 60 درجه سانتیگراد استفاده شد. نمونه‌های تثبیت شده طی دو مرتبه و هر مرتبه به مدت 8 ساعت با پارافین (ASTM D87، Cas. No. 8002-74-2، Sigma-Aldrich، USA) تیمار شدند و سپس با دستگاه توزیع کننده پارافین (مدل Paraffin Dispenser plus، DS 4LM، شرکت دیدسبز، ایران) حاوی پارافین ذوب شده در دمای 65 درجه سانتیگراد قالب‌گیری شدند.

به‌منظور مطالعه میکروسکوپی LM و FE-SEM از نمونه‌های پارافینه به‌ترتیب به ضخامت 20 میکرون و 8 میکرون با دستگاه میکروتوم چرخشی دستی (DS 8402، شرکت دیدسبز، ایران) برش عرضی تهیه شد. به‌منظور مطالعه میکروسکوپ LM، نمونه‌ها با ماده رنگ‌آمیزی سافرانین O 5/0 درصد رنگ‌آمیزی شدند. برای مطالعه ویژگی‌های آناتومی برش عرضی ساقه از میکروسکوپ نوری (LM) (BX41، Olympus، توکیو، ژاپن) مجهز به دوربین دیجیتالی (مدل DP72، شرکت Olympus، ژاپن) استفاده شد. از هر اسلاید میکروسکوپ، 5 تصویر دیجیتالی به صورت تصادفی با بزرگنمایی 400× برای بررسی تعداد آوندهای چوبی در میلی‌متر مربع (V_d) (Tigunova et al., 2020)، تعداد سلول‌های فیبر، تعداد سلول‌های شعاعی، درصد مساحت آوندهای چوبی، درصد مساحت لومن سلول‌های فیبر، درصد مساحت دیواره سلولی و درصد سلول‌های شعاعی استفاده شد. اندازه‌گیری‌ها با نرم‌افزار تجزیه و تحلیل تصویر Image-Pro Plus 7.0 (Media Cybernetic، Silver Spring، USA) انجام شد.

به‌منظور مطالعه میکروسکوپی FE-SEM، نمونه‌ها با دستگاه خشک‌کن انجمادی (Freezer dryer FD-5005-BT، شرکت صنعت پرداز دنا، ایران) در دمای منفی 45 درجه سانتیگراد به‌مدت 45 دقیقه آبگیری شدند. برای پوشش‌دهی نمونه‌ها با فیلم طلا به ضخامت 200 آنگسترم با دستگاه اسپاترینگ فیلم طلا (مدل Emitech K550 Gold Sputter Coater، شرکت Groupe Emitech، فرانسه) انجام شد. برای اندازه‌گیری قطر لومن آوندهای چوبی، قطر لومن سلول‌های فیبر، مساحت لومن آوندهای چوبی، مساحت لومن سلول‌های فیبر، ضخامت دیواره سلولی مابین دو سلول در برش عرضی ساقه گیاه شاهد و گیاه‌ T0 ویراسته ژنی، از میکروسکوپ الکترونی FE-SEM (مدل TESCAN MIRA3 FEG-SEM، شرکت Kohoutovice، جمهوری چک) استفاده شد. تصویربرداری از نمونه‌ها با ولتاژ 20-30 کیلوولت و شدت جریان تقریبا 2 نانوآمپر با بزرگنمایی 1400× تا 3000×، انجام شد. 4 ناحیه از هر نمونه آزمایش به صورت تصادفی انتخاب و حداقل 100 سلول با نرم‌افزار تجزیه و تحلیل تصویر Image-Pro Plus 7.0 (Media Cybernetic، Silver Spring، USA) اندازه گیری شد.

محتوای ترکیبات مختلف بیوماس لیگنوسلولزی در گیاه T0 ویراسته ژنی

محتوای ترکیبات لیگنوسلولز شامل مواد استخراجی، لیگنین کل، همی‌سلولز و سلولز در گیاه شاهد و T0 ویراسته ژنی، طبق دستورالعمل استاندارد بین المللی TAPPI هر یک از ترکیبات لیگنوسلولز از بافت ساقه گیاهان مورد نظر استخراج و تعیین مقدار شد. 500 میلی‌گرم از بافت میانگره ساقه (میانگره 15 تا طوقه) هر یک گیاهان شاهد و T0 ویراسته ژنی به‌عنوان نمونه برای استخراج مواد لیگنوسلولزی استفاده شد. تعیین مقدار مواد استخراجی بر اساس دستورالعمل استاندارد بین المللی TAPPI T204 cm-27 با محلول اتانول تولوئن به نسبت 2 به 1 توسط دستگاه سوکسله انجام و حذف لیگنین و همی‌سلولز بر اساس دستورالعمل گزارش شده توسط Abe وYano (2009) انجام شد (Abe and Yano, 2009). به‌منظور تعیین محتوای لیگنین بر اساس اختلاف وزن قبل و پس از حذف لیگنین با دستورالعمل استاندارد بین المللی TAPPI T222 om-02 انجام شد. برای تعیین محتوای همی‌سلولز بر اساس اختلاف وزن قبل و پس از حذف همی‌سلولز از محتوای هولوسلولز طبق دستورالعمل استاندارد بین المللی ASTM D 1104-56 انجام شد. همچنین محتوای آلفا سلولز پس از حذف همی سلولز اندازه‌گیری شد. اختلاف وزن خشک نمونه‌ها با ترازوی دیجیتالی با دقت 0001/0 گرم (مدل digital balance AND® model HR، شرکت AND، ژاپن) اندازه‌گیری شد. آزمایش در سه تکرار زیستی و تکنیکی به ازای هر گیاه انجام شد.

تعیین CrI الیاف سلولز گیاه T0 ویراسته ژنی با روش XRD

الگوی‌ XRD نمونه‌های α-سلولز استخراج شده از گیاه شاهد و T0 ویراسته ژنی با دستگاه اندازه‌گیری پراش XRD (مدل D8-Adnance، شرکت Brucker Co.، آلمان) اندازه‌گیری شد. سیستم دستگاه اندازه‌گیری XRD مجهز به پرتو CuKα در طول موج 54056/1 آنگستروم و امواج مونوکروماتور نیکل بوده و در ولتاژ 40 کیلوولت و شدت جریان 30 میلی‌آمپر تنظیم شد. زاویه پراش اشعه X در بازه 2θ=5-40º با سرعت 5 درجه در دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد تنظیم شد. داده‌های XRD با نرم‌افزار X'Pert HighScore Plus ver. 2.2.2 بررسی شد. شاخص تبلور سلولز (CrI) از رابطه (1) بدست آمد (Park et al., 2010) .

رابطه (1):

%CrI = (1-I_am/I₂₀₀) × 100

در این معادله I₂₀₀ (2θ=22.6º) شدت plane 200 حاوی میزان نواحی متبلور و آمورف سلولز را نشان می‌دهد. I_am (2θ=18.7º) نشان دهنده حداقل شدت تراکم مابین plane 110 و plane 200 و میزان نواحی آمورف سلولز است (Oun and Rhim, 2016).

تعیین میزان DP سلولز با روش کروماتوگرافی نفوذی ژل (GPC)

فرایند تریکاربانیلاسیون برای هر نمونه سلولز طبق دستورالعمل ارائه شده توسط Hubbell و Ragausskas (2010) انجام شد. 10 میلی‌گرم از نمونه‌های تریکاربانیله شده CMF در 1 میلی‌لیتر حلال تترا هیدروفوران (THF) (Cas. No. 109-99-9، Sigma-Aldrich، USA) حل شده و با فیلتر نایلونی 45/0 میکرون فیلتر شد. توزیع وزن مولکولی نمونه‌های مورد نظر با نرم‌افزارPSS-Polymer Standards Service (Warwick, RI, USA) Waters Breeze 2 HPLC system تجزیه و تحلیل شد. این سیستم مشابه سیستم Agilent HPLC 1200 مجهز به یک ستون خطی 5UJORDI GPC، ردیاب شاخص انکسار Agilent و ردیاب اشعه UV (270نانومتر)Agilent است. در این کروماتوگرافی فاز متحرک محلول THF (با سرعت 1 میلی‌لیتر در دقیقه) به حجم 50 میکرولیتر است. منحنی کالیبراسیون مبتنی بر استانداردهای پلی استیرن در بازه وزن مولکولی 10³×5/1 تا 10⁶×6/3 گرم بر مول در 8 موقعیت استاندارد تعیین شد. میانگین درجه پلیمریزه شدن برحسب واحد‌های گلوکزی (DP_N) و میانگین درجه پلیمریزه شدن در واحد وزن (DP_W) به‌ترتیب از نسبت وزن مولکولی کل واحدهای گلوکزی (M_N) و وزن مولکولی کل نمونه (M_W) بر 519 گرم بر مول (وزن مولکولی گلوکز تری کاربانیله شده) به‌دست آمد. شاخص پراکنش وزنی (PDI) نمونه‌ها از نسبت M_W به M_N در هر نمونه محاسبه شد. آزمایش GPC در 3 تکرار تکنیکی برای هر گیاه انجام شد.

تجزیه و تحلیل آماری

تجزیه و تحلیل نمونه‌های آماری بر اساس آنالیز تجزیه واریانس ANOVA یک طرفه و مقایسه میانگین بر مبنای حداقل اختلاف معنی‌دار LSD posthoc’ با نرم‌افزار SPSS IBM v. 22.0 (SPSS Inc، شیکاگو، USA) و حداقل سطح معنی‌داری 05/0 انجام شد.

نتایج و بحث

تأیید اولیه حضور کاست T-DNA نوترکیب در ژنوم صنوبر سفید

نتایج گزینش ریزنمونه‌های انتقال یافته با ‌روش آگروباکتریوم در محیط کشت گزینش حاوی علف‌کش Basta® نشان داد که از 50 ریزنمونه تلقیح شده در حدود 47 ریزنمونه زنده و باززایی شدند. در مجموع 15 ریزنمونه باززایی شده حاوی تنها یک ریزساقه باززایی شده برای تأیید اولیه انتقال ژن با ‌روش PCR انتخاب شد. بر اساس نتایج واکنش PCR، 14 نمونه از مجموع 15 گیاهچه باززایی شده مستعد T0 حاوی نوار DNA به ژن‌های bar و pcoCas9 مربوط بودند که میزان کارایی انتقال ژنتیکی ریزنمونه‌های tTCL درحدود 33/93 درصد بود. در این DNA ژنومی گیاه شاهد به‌عنوان کنترل منفی و DNA پلاسمیدی ناقل بیانی pFGC-pcoCas9 نوترکیب به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد. در شکل (2) نتایج واکنش PCR ژن‌های bar (552 جفت باز) و pcoCas9 (184 جفت باز) نشان داده شده است. اندازه قطعات DNA هر ژن در مقایسه با نشانگر وزنی مولکولی DNA 100 جفت باز (Cat. No. 1153، Thermo Scientific^TM، USA) تعیین شد. میزان کارایی انتقال ژنتیکی با نتایج مطالعه پیشین کاملاً مطابقت دارد (Nayeri et al., 2022) و نشان دهنده کارایی بالای شیوه نامه انتقال ژنتیکی است.

شکل 2- گزینش گیاهچه‌های T0 با ‌روش PCR ژن bar (552 جفت باز) و ژن pcoCas9 (184 جفت باز) با DNA ژنومی گیاهچه‌های باززایی شده در محیط کشت گزینش SM حاوی علف‌کش Basta®. (L1-L15 نوار DNA محصول PCR از ژن bar (552 جفت باز) و ژن pcoCas9 (184 جفت باز) در 15 گیاه‌ T0 گیاه P. alba L. var Kabudeh Bumi، (P نوار DNA ژن bar (552 جفت باز) و ژن pcoCas9 (184 جفت باز) در ناقل بیانی نوترکیب pFGC-pcoCas9 نوترکیب به‌عنوان نمونه کنترل مثبت، (WT واکنش PCR از DNA ژنومی گیاه شاهد به‌عنوان نمونه کنترل منفی، (N واکنش PCR فاقد DNA و (M نوار DNA نشانگر وزنی مولکولی DNA 100 جفت باز (Cat. No. 1153، Thermo ScientificTM، USA).

Figure 2. PCR analysis of the independently regenerated Basta®-resistant plantlets using bar gene (550 bp), and Cas9 gene (184 bp) specific primers to screen a total of 15 T0 white poplars. L1-L15: DNA bands of PCR products from bar gene (550 bp), and Cas9 gene (184 bp) of 15 T0 P. alba L. var. Kabudeh Bumi plants. Lane P: The plasmid DNA of pFGC-pcoCas9:CESA4-gRNA cassette binary vector as a positive control; Lane WT: wild type (non-transformed plants), Lane N: non-template control, Lane M: 100 bp DNA ladder (Thermo Scientific™, USA, CAT. SM1153).

شناسایی جهش‌های هموزیگوس/دوبل‌الل در گیاهان T0 ویراسته ژنی با ‌روش MSBSP-PCR

بر اساس روش MSBSP-PCR، DNA ژنومی 14 گیاه T0 تأیید شده برای جداسازی و تکثیر محصول PCR1 به طول bp557 از ژن PalCESA4 استفاده شد. بر اساس نتایج ژل الکتروفورز، از DNA ژنومی 14 گیاهان T0 و یک گیاه شاهد نوار DNA به طول 557 جفت باز ژن PalCESA4 جداسازی و تکثیر شد (شکل 3A). سپس، طی یک واکنش PCR از 14 نمونه DNA محصول CESA-PCR1 گیاهان T0 و گیاه شاهد، قطعه CESA-PCR2 به طول 196 جفت باز جداسازی و تکثیر شد. باتوجه‌به اینکه، آغازگر معکوس قطعه CESA-PCR2 دقیقاً هم‌ردیف با توالی crRNA اختصاصی هدف بدون ناحیه موتیف PAM است، تکثیر موفقیت‌آمیز محصول CESA-PCR2 منوط به عدم وجود جهش و هر نوع تغییرات نوکلئوتیدی در انتهای '3 آغازگر و نزدیک ناحیه PAM است. بدین‌ترتیب، جهش‌های هموزیگوس یا دوبل‌آلل از گیاهان T0 بدون جهش یا دارای جهش هتروزیگوس قابل شناسایی خواهد بود (Guo et al., 2018). بر اساس نتایج ژل الکتروفورز، 11 گیاه T0 ویراسته ژنی از مجموع 14 گیاه T0 فاقد نوار DNA محصول PCR2 (bp196) بودند (شکل 3B). بنابراین، می‌توان به‌این نتیجه رسید که این 11 گیاه ویراسته ژنی دارای جهش هموزیگوس یا دوبل‌آلل هستند. علاوه‌براین، در 3 گیاه T0 احتمال وجود عدم جهش یا جهش از نوع هتروزیگوس وجود دارد. بنابراین، برای تفکیک جهش‌ها در کل گیاهان T0 از روش ژنوتایپینگ هترودوپلکس PCR استفاده شد.

شناسایی جهش‌های هتروزیگوس و دوبل‌آلل در گیاهان T0 ویراسته ژنی با ‌روش ژنوتایپینگ هترودوپلکس

طبق دستورالعمل ارائه شده توسط Bhattacharya و Van Meir (2019)، محصول CESA-PCR3"" (160 جفت باز) از روی قطعه CESA-PCR1 (bp557) نمونه‌های گیاهان T0 و شاهد جداسازی و تکثیر شد. به‌منظور شناسایی جهش‌های هتروزیگوس و دوبل‌آلل در گیاهان T0 از روش هیبریداسیون DNA بین قطعات CESA-PCR3 گیاه شاهد و تراریخته T0 استفاده شد. بررسی نتایج هیبریداسیون DNA در 3 گیاه T0 با احتمال وقوع عدم جهش یا جهش هتروزیگوس نشان می‌دهد که 1 گیاه T0 ویراسته ژنی دارای دو نوار DNA در ژل آگارز 5 درصد هستند که نشان‌دهنده وجود جهش هتروزیگوس در گیاه T0 ویراسته ژنی است (شکل 3C). لیکن، در نتایج هیبریداسیون DNA قطعات CES-PCR3 (160 جفت باز) بین گیاه T0 حاوی جهش هموزیگوس/دوبل‌آلل با گیاه شاهد، همه 11 گیاه T0 ویراسته ژنی تنها یک نوار DNA (تقریباً 160 جفت باز) در ژل آگارز 5 درصد نشان دادند (شکل 3D) که نشان‌دهنده جهش هموزیگوس در گیاهان ویراسته ژنی است.

شکل 3- ژنوتایپینگ گیاهان T0 صنوبر سفید توسط سه روش MSBSP-PCR، ژنوتایپینگ هترودوپلکس PCR و توالی یابی سانگر. A) جداسازی و تکثیر محصول CESA-PCR1 ژن PalCESA4 (557 جفت باز) با DNA ژنومی گیاهان T0. L1-L15: نوار DNA محصول CESA-PCR1 ژن PalCESA4 (557 جفت باز) در 15 گیاه‌ T0 P. alba L. var Kabudeh Bumi؛ B) جداسازی و تکثیر محصول CESA-PCR2 ژن PalCESA4 (196 جفت باز) با CESA-PCR1 ژنومی گیاهان T0. C) شناسایی گیاهان T0 ویراسته ژنی دوبل‌آلل از گیاهان T0 ویراسته ژنی هموزیگوس با ‌روش ژنوتایپینگ هترودوپلکس DNA محصول PCR (تقریباً 160 جفت باز). D) شناسایی گیاهان T0 ویراسته ژنی هتروزیگوس از گیاهان T0 بدون جهش با ‌روش ژنوتایپینگ هترودوپلکس DNA محصول PCR (تقریباً 160 جفت باز).L1-L15: نوار DNA محصول PCR DNA هیبرید ژن PalCESA4 در 15 گیاه‌ T0 گیاه P. alba L. var Kabudeh Bumi؛ WT: نوار DNA محصول PCR DNA هیبرید ژن PalCESA4 گیاه شاهد به‌عنوان کنترل مثبت؛ N: واکنش PCR فاقد DNA نمونه؛ M: نوار DNA نشانگر وزنی مولکولی DNA 100 جفت باز (Cat. No. 1153، Thermo ScientificTM، USA)؛ E) نمای شماتیک از هم‌ردیفی و تغییرات اسیدآمینه‌ای ناحیه gRNA اختصاصی ژن PalCESA4 بین گیاه شاهد (WT) و گیاهان T0 ویراسته ژنی هموزیگوس و هتروزیگوس. حروف قرمز نشان‌دهنده تغییرات نوکلئوتیدی از نوع اضافه شدن و جایگزینی است. علامت خط تیره (-) قرمز نشان‌دهنده تغییرات نوکلئوتیدی از نوع حذف است. موتیف PAM ('3-GGG-'5) به‌رنگ سبز و با خط زیر مشخص شده است. تعداد تغییرات نوکلئوتیدی در داخل پرانتز نشان داده شده است. حروف با رنگ روشن نشان‌دهنده توالی‌های نوکلئوتیدی و اسیدآمینه‌ای اطراف ناحیه gRNA اختصاصی ژن PalCESA4 است. توالی اسیدآمینه‌ای در ناحیه crRNA هدف کدون پایان به‌ترتیب با حروف سیاه و قرمز نشان داده شده‌اند.

Figure 3. Genotyping analysis of CRISPR/Cas9-mediated PalCESA4 T0 mutants of P. alba. using MSBSP-PCR, heteroduplex genotyping and Sanger sequencing methods. A) Isolation and amplification of CESA-PCR1 product (552 bp) in a total of 15 T0 P. alba L. var Kabudeh Bumi plants. B) Isolation and amplification of CESA-PCR2 product (196 bp) from CESA-PCR1 product of a total of 15 T0 P. alba L. var Kabudeh Bumi plants. C) Identification of bialleic T0 mutants from homozygous T0 mutants using heteroduplex genotyping analysis of CESA-PCR3 products (~ 160 bp) from CESA-PCR1 products of 11 potent homozygous/biallelic T0 mutants. D) Identification of heterozygous T0 mutants from none mutation T0 plants using heteroduplex genotyping analysis of CESA-PCR3 products (~ 160 bp) from CESA-PCR1 products of three potent heterozygous/none mutation T0 mutants. M: 100bp DNA ladder (Thermo Scientific™, USA, CAT. SM1153); WT: non-transformed white poplar (wild type) as a positive control; N: non-template control as the negative control. E) Illustration of multiple sequence alignments between wild type (WT) and the CRISPR/Cas9-mediated T0 mutants (L1-L15) and their sequence variation in the PalCESA4-specific gRNA target region at the amino acid and nucleotide levels. The red characters indicate nucleotide insertions and substitutions; red-colored dash (-) characters represent deletions; the PAM motif (GGG) is underlined and shown in green color; “STOP” indicates stop codons of TGA and TAA (dark red characters). “DEL” indicates amino acid deletions. The number of indels is shown in the parenthesis. the black and gray letters show the crRNA sequence and flanking region of PalCESA4-sgRNA at nucleotide and amino acids levels, respectively.

تأیید و شناسایی تغییرات نوکلئوتیدی در گیاهان T0 ویراسته ژنی با ‌روش سیستم CRISPR/Cas9 با ‌روش توالی‌یابی سنگر

بررسی کروماتوگرام نتایج توالی‌یابی نشان‌دهنده صحت نتایج ژنوتایپینگ MSBSP-PCR و هترودوپلکس DNA بود. در شکل (3E)، نوع جهش و انواع تغییرات نوکلئوتیدی و اسیدآمینه‌ای شامل حذف و اضافه و جایگزینی نوکلئوتیدی در هر گیاه T0 ویراسته ژنی طی هم‌ردیفی توالی‌های نوکلئوتیدی با توالی PalCESA4 گیاه شاهد نشان داده شده است. نتایج نشان‌دهنده 73/72 درصد جهش نوکلئوتیدی ناشی از مسیر ترمیم NHEJ در گیاهان T0 صنوبر سفید بود که در حدود 27/52 درصد این جهش‌ها از نوع جهش‌های هموزیگوس بودند (جدول 2). بر اساس توالی نوکلئوتیدی در گیاه شاهد و گیاهان T0 ویراسته ژنی، توالی اسیدآمینه‌ای ناحیه gRNA تعیین شد. در 11 مورد گیاهان T0 ویراسته ژنی با بیشینه فراوانی 66/91 درصد جهش‌های ناشی از ویرایش CRISPR/Cas9 در ژن PalCESA4 باعث ایجاد تغییر در چارچوب فرایند ترجمه پروتئین شده است. این تغییر در چارچوب به ایجاد کدون پایان نابجا (UGA یا UAA) نزدیک ناحیه gRNA هدف منجر شده است. انتظار می‌رود این نوع جهش‌ها باعث تولید موتانت‌های Palcesa4 فاقد دمین‌های CCD و TMHها در انتهای کربوکسیلی خود شوند. بنابراین، این زیرواحدهای ویراسته ژنی از نظر عملکردی غیرفعال بوده و به‌عنوان فنوتیپ غیرفعال یا خاموش استفاده شدند. در میان گیاهان T0 ویراسته ژنی، یک گیاه T0 ویراسته ژنی هموزیگوس (L7) حاوی جهش حذف اسید آمینه‌ای W436 و P435 مشاهده شد.

جدول 2- نوع و فراوانی ایجاد جهش در گیاهان T0 جهش یافته P. alba L.. با ‌روش سیستم CRISPR/Cas9

Table 2. The frequency and type of mutation by CRISPR/Cas9 gene editing system in T0 mutants of P. alba L.

نوع جهش	تعداد گیاهان T0 ویراسته ژنی	فراوانی جهش (%)
هموزیگوس	11	57/78
هتروزیگوس	1	14/7
دوبل‌آلل	0	0/0
بدون جهش	2	28/14
مجموع کل جهش‌ها	12	71/85
کل	14	100

مطالعه میکروسکوپی آناتومی چوب در گیاهان T0 ویراسته ژنی

باتوجه‌به اینکه فقط گیاه T0 ویراسته ژنی هموزیگوس PalCESA4^{P435del_W436del}(L7) از نظر رشد کاملاً سالم و دارای رشد طبیعی بود همراه گیاه شاهد در محیط اتاقک رشد سازگار شده و برای بررسی‌های فنوتیپی به گلخانه انتقال یافت (شکل 4A). تغییرات فنوتیپی ناشی از جهش در آناتومی چوب گیاه T0 ویراسته ژنی هموزیگوس PalCESA4^{P435del_W436del}(L7) و گیاه WT با ‌روش میکروسکوپی LM و FE-SEM بررسی شد. در جدول (3) مقایسه میانگین صفات آناتومی چوب گیاه T0 ویراسته ژنی در مقایسه با گیاه شاهد ارائه شده است. در شکل (4B) تصاویر میکروسکوپی LM از برش عرضی میانگره ساقه با ضخامت 20میکرون و بزرگنمایی ×40، ×100 و ×400 گیاه T0 ویراسته ژنی و گیاه WT نشان داده شده است. در مقایسه با گیاه شاهد، مقدار V_d گیاه T0 ویراسته ژنی هموزیگوس 85/74 درصد کاهش نشان داد. علاوه‌براین، درصد محتوای دیواره سلولی در گیاه T0 ویراسته ژنی 32 درصد کمتر از محتوای دیواره سلولی گیاه شاهد بود. سطح سلول‌های شعاعی در گیاه T0 ویراسته ژنی 21/3 برابر بیش از گیاه شاهد بود. مساحت فضای لومنی سلول‌های فیبر گیاه T0 ویراسته ژنی 87/3 درصد بیش از مساحت فضای لومنی سلول‌های فیبر گیاه شاهد است. همچنین، مساحت فضای لومنی آوندهای آبکشی با میانگین 81/4 برابر کمتر از گیاه شاهد است. تصویر میکروسکوپی FE-SEM از مقطع عرضی میانگره 15 ساقه نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار ضخامت دیواره سلولی و قطر فضای لومنی در سلول‌های فیبر گیاه T0 ویراسته ژنی در مقایسه با گیاه شاهد است (شکل 4C). ضخامت دیواره سلولی اطراف سلول‌های فیبر در گیاهان T0 ویراسته ژنی هموزیگوس (003/0 ± 52/1 میکرون) 31/7 درصد نسبت به گیاه شاهد کاهش داشت. این کاهش در ضخامت دیواره سلولی به افزایش قطر فضای لومن در سلول‌های فیبر و همچنین سلول‌های گزیلم منجر شده است. به‌طوری‌که قطر فضای لومن سلول‌های فیبر و گزیلم به طور متوسط در گیاهان T0 ویراسته ژنی هموزیگوس 26/19 و 02/15 درصد نسبت به نمونه گیاه شاهد افزایش نشان می‌دهند. پیش‌تر نیز Abbas و همکاران (2020) از طریق کاهش بیان ژن‌های PtriCESA4، PtriCESA7a/b و PtriCESA8a/b با ‌روش RNAi به این نتیجه دست یافتند که این ژن‌ها می‌توانند در تشکیل دیواره سلولی ثانویه در چوب درختان P. trichocarpa دخیل باشند. نتایج آنها نشان می‌دهد که کاهش بیان این ژن‌ها در کاهش ضخامت دیواره سلولی بافت گزیلم و افزایش قطر فضای لومن سلول‌های فیبر و گزیلم تأثیر زیادی دارد (Abbas et al., 2020). Xu و همکارانش (2021) با خاموشی ژن‌های PtriCESA4، PtriCESA7a/b و PtriCESA8a/b در P. trichocarpa با ‌روش سیستم ویرایش ژن CRISPR/Cas9 نشان دادند که خاموشی این ژن‌ها به تولید گیاهان ویراسته ژنی ناسالم و غیر نرمال منجر شده و میزان محتوای سلولز تا 90 درصد کاهش می‌یابد. صنوبرهای بالزام ویراسته ژنی در هر یک از این ژن‌ها رشدشان کاملاً متوقف شده، ساقه‌های پیچ‌خورده و فاقد غالبیت انتهایی تولید کردند. همچنین قطر ساقه، طول میانگره‌ها، اندازه برگ و ساختار ریشه کاهش یافته و ساختار سلول‌های فیبر و گزیلم چروکیده به سمت داخل است. مشابه نتایج پیشین (Nayeri et al., 2022)، این نتایج نیز نشان می‌دهد که تغییر در جایگاه اتصال زیرواحد PalCESA4 می‌تواند موجب تغییر در ضخامت دیواره سلولی و ساختار و آرایش سلول‌های فیبر، گزیلم و شعاعی شود. این نوع تغییرات در میزان جذب و انتقال آب و مواد غذایی و به دنبال آن در میزان رشد گیاه می‌تواند تأثیرگذار باشد.

شکل 4- تصویر گیاه T0 جهش یافته و مطالعه میکروسکوپی LM و FE-SEM بافت چوب گیاه T0 ویراسته ژنی PalCESA4^{P435del_W436del} در مقایسه با گیاه شاهد (WT) A) گیاهان T0 ویراسته ژنی هموزیگوس و شاهد (WT) سازگار شده پس از 2 ماه کشت در محیط سازگاری ماسه 3:پیت‌ماس 2: پرلیت 1. خط اندازه‌گیری نشان‌دهنده طول 1 سانتی‌متر است. B) تصاویر میکروسکوپ نوری از مقطع عرضی 15 امین میانگره ساقه در گیاه‌ T0 ویراسته ژنی در مقایسه با گیاه شاهد. میزان بزرگنمایی تصاویر به‌ترتیب از چپ به راست شامل بزرگنمایی ×40، ×100 و ×400 است. خط اندازه‌گیری در بزرگنمایی ×40 برابر با 10 میلیمتر، در بزرگنمایی ×100 برابر با 5/2 میلی‌متر و در بزرگنمایی ×400 برابر با تقریباً 500 میکرون است. C) تصاویر میکروسکوپ الکترونی FE-SEM از مقطع عرضی میانگره 15 ساقه گیاه‌ T0 ویراسته ژنی در مقایسه با گیاه شاهد. میزان بزرگنمایی تصاویر در محدوده ×2000 تا ×3500 است.

Figure 4. The shoot architecture and microscopy analysis of the hardened, PalCESA4^{P435del_W436del}T0 mutant compared with that of two-month-old untransformed wild type white poplar (WT). A) The shoot architecture of the T0 mutant and WT plants, which were hardened in soil mixture (sand, peat moss, and perlite in 3:2:1 ratio) after 2-month under greenhouse condition. Bars indicate 1cm. B) The light microscopy (LM) images of the cross-sectional fifth internodal stem from the two-month-old wild-type and T0 mutant. Bars (Lef to right) indicate magnifications of ×40 (10 mm), ×100 (2.5 mm) and ×400 (500 µm). C) The FE-SEM images of the cross-sectional fifth internodal stem from the two-month-old wild-type and T0 mutant. Bars indicate 10-20 µm.

جدول3- مقایسه میانگین صفات آناتومی چوب در گیاهان T0 ویراسته ژنی و شاهد P. alba L.

Table 3. Mean comparison of wood anatomy traits in CRISPR/Cas9-mediated T0 mutant and WT P. alba L. plants.

نوع صفات آناتومی چوب	میانگین ± انحراف معیار (SD)
نوع صفات آناتومی چوب	گیاه شاهد	گیاه T0 ویراسته ژنی
تعداد سلول‌های آوند چوبی در mm² (V_d)	^a13/1 ± 67/528	^b71/0 ± 97/135
مساحت لومن آوندچوبی (%)	^a13/0 ± 24/12	^b06/0 ± 54/2
مساحت لومن فیبر (%)	^b39/0 ± 98/37	^a04/0 ± 45/39
مساحت سلول‌های شعاعی (%)	^b29/0 ± 67/7	^a54/0 ± 68/24
مساحت دیواره سلولی (%)	^a79/0 ± 11/42	^b62/0 ± 89/32
ضخامت دیواره سلول‌ فیبر (µm)	^a007/0 ± 64/1	^b003/0 ± 52/1
قطر لومن سلول‌های فیبر (µm)	^b04/0 ± 89/7	^a02/0 ± 41/9
قطر لومن آوندچوبی (µm)	^b1/0 ± 17/17	^a03/0 ± 75/19
حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 05/0 >P است. Means with similar letters are not significantly different according to P< 0.05 value.

تعیین محتوای ترکیبات لیگنوسلولزی در گیاه T0 ویراسته ژنی

محتوای سلولز در گیاه T0 ویراسته ژنی 74/43 درصد کمتر از محتوای سلولز نمونه شاهد بود که به افزایش محتوای همی‌سلولز، مواد استخراجی منجر شده است. به‌طوری‌که محتوای همی‌سلولز در گیاه T0 ویراسته ژنی تقریباً دو برابر نسبت به نمونه شاهد افزایش نشان داد ولی در محتوای لیگنین اختلافی مشاهده نشد. همچنین، مشابه نتایج به‌دست آمده در این مطالعه، Li و همکارانش (2018) گزارش کردند که در برنج جهش یافته OsCESA9^W481C_P482Sمحتوای سلولز 18 درصد کاهش می‌یابد که این امر باعث افزایش 16 درصدی همی‌سلولز می‌شود. لیکن، آنها تغییری در محتوای لیگنین مشاهده نکردند (Li et al., 2017). بااینحال، Abbas و همکاران (2020) کاهش 45-50 درصدی محتوای سلولز همراه با افزایش محتوای لیگنین (9/38 درصد) و همی‌سلولز (83 درصد) در گیاهان P. trichocarpa T0 RNAi که بیان ژن‌های PtrCESA4/7/8 توسط فناوری RNAi کاهش یافته بود، را گزارش کردند (Abbas et al., 2020). همچنین، خاموشی ژن‌های PtrCESA4/7(a/b)/8(a/b) با روش سیستم ویرایش CRISPR/Cas9 به کاهش 90 درصدی محتوای سلولز و افزایش دوبرابری محتوای لیگنین منجر شد (Xu et al., 2021). همچنین، در مطالعه پیشین گزارش کردیم که تغییر و ایجاد جهش هدفمند در جایگاه اتصال دمین P-CR زیرواحد PalCESA4 می‌تواند در ترکیب لیگنوسلولز و محتوای این ترکیبات تأثیر مستقیم داشته باشد (Nayeri et al., 2022). مشابه نتایج این پژوهش، جایگزینی اسیدآمینه‌ای W436Q و P437S یا حذف این دو اسید آمینه به ترتیب باعث کاهش 67 درصدی و 35 درصدی در محتوای سلولز گیاهان T0 ویراسته ژنی شد. این امر به افزایش معنی‌دار محتوای همی‌سلولز، لیگنین و مواد استخراجی منجر شده است. به‌طوری‌که محتوای همی‌سلولز در گیاه T0 ویراسته ژنی PalCESA4^W436Q_P437S بیش از دو برابر نسبت به نمونه شاهد افزایش نشان داد. این درحالی است که حذف اسیدآمینه W436 از یک الل ژن PalCESA4 به افزایش 33 درصدی محتوای سلولز در بیوماس لیگنوسلولزی صنوبر منجر شد (Nayeri et al., 2022).

جدول 4. میانگین محتوای ترکیبات لیگنوسلولزی در گیاه T0 ویراسته ژنی در مقایسه با گیاه شاهد P. alba L..

Table 4. The lignocellulose composition of the CRISPR/Cas9-mediated T0 mutant and WT P. alba L. plants.

گیاه	میانگین ± SD
گیاه	مواد استخراجی (%)	لیگنین (%)	همی‌سلولز (%)	سلولز (%)
WT	^b05/0 ± 44/4	^a18/0 ± 31/22	^b52/0 ± 19/21	^a2/0 ± 73/51
T0 ویراسته ژنی	^a06/0 ± 97/5	^a09/0 ± 30/22	^a01/0 ± 59/42	^b06/0 ± 10/29

حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 05/0 >P است.

Means with similar letters are not significantly different according to P< 0.05 value.

تغییرات درصد شاخص CrI در نمونه‌های الیاف سلولز گیاه T0 ویراسته ژنی

میزان تبلور سلولز یکی از ویژگی‌های ساختاری فیزیکوشیمیایی سلولز است که ویژگی‌های مکانیکی و حرارتی آن را تعیین می‌کند (Chen et al., 2011). درصد شاخص تبلور سلولز (CrI) گیاه T0 ویراسته ژنی و گیاه شاهد با آزمون XRD مطالعه شد. نتایج نشان می‌دهد که جهش ایجاد شده در هر یک از گیاهان T0 ویراسته ژنی به تغییرات قابل ملاحظه‌ای در شاخص تبلور منجر شود. در شکل 5A، درصد شاخص تبلور گیاه T0 ویراسته ژنی در مقایسه با نمونه شاهد نشان داده شده است. بر اساس نتایج، در الگوی XRD پیک‌های اصلی در حدود 2θ برابر با 16 درجه و 6/22 درجه مشاهده شد. این پیک‌ها به نواحی آمورف (2θ=16º) و بلورین (2θ=22.6º) میکروفیبریل‌های سلولزی متعلق است که نشان‌دهنده الگوی XRD طبیعی متعلق به الیاف سلولز است (Nishiyama et al., 2002; Nishiyama et al., 2003). شاخص تبلور در گیاه T0 ویراسته ژنی 25/19 درصد کاهش نسبت به نمونه شاهد نشان داد. بررسی الگوی XRD نشان می‌دهد که افزایش نواحی آمورف در کاهش میزان شاخص تبلور میکروفیبریل‌های سلولزی تأثیر مثبتی دارد. Li و همکارانش (2017) یک گیاه ویراسته ژنی در برنج رقم Japponica حاصل از جهش‌زایی شیمیایی EMS یافتند که دارای جهش جایگزینی W481C و P482S در دمین P-CR زیرواحد OsCESA9 بود. بررسی این گیاه ویراسته ژنی نشان داد که ضخامت دیواره سلولی و شاخص تبلور در این گیاه کاهش یافته است که می‌تواند در تحمل ورس بسیار حائز اهمیت باشد (Li et al., 2017). در گزارش پیشین نیز جهش جایگزینی اسید آمینه‌ای و حذف اسیدآمینه‌های تریپتوفان 436 و پرولین 437 در جایگاه اتصال باعث کاهش 13-25 درصدی در شاخص تبلور سلولز حاصل از بیوماس صنوبر سفید T0 ویراسته ژنی شد (Nayeri et al., 2022) .

تغییرات میزان DP_N و DP_Wالیاف سلولز در صنوبر سفید T0 ویراسته ژنی

میزان DP سلولز از جمله عامل‌های تعیین کننده در میزان تولید سلولز به‌شمار می‌رود و همچنین، بین میزان DP و شاخص تبلور سلولز همبستگی معنی‌داری وجود دارد (Li et al., 2017; Yoo et al., 2017; Zhang et al., 2013). در این مطالعه برای تعیین میزان DP_Nو DP_Wنمونه‎‌‌های CMF گیاه T0 ویراسته ژنی و شاهد، روش GPC استفاده شد. میزان DP_Nو DP_Wدر گیاه شاهد (WT) به‌ترتیب 1011 و 4547 به‌دست آمد. بر اساس مطالعات انجام شده توسط Yoo و همکاران (2017)، میزان DP_Nو DP_Wدر انواع ارقام درخت صنوبر بالزام (P. trichocarpa) به‌ترتیب برابر با میانگین تقریبی 881-216 و 5400-4100 واحد گلوکزی است. همچنین میزان DP_Nو DP_Wدر کلون‌های هیبرید P. tremula × alba به‌ترتیب در حدود 300 و 600 گزارش شد (Foston et al., 2011). نتایج ما نیز تقریباً در این محدوده DP قرار دارد. با این‌حال اختلاف معنی‌داری از نظر میزان DP_N میکروفیبریل‌های سلولزی بین گیاه T0 ویراسته ژنی و نمونه شاهد وجود ندارد (شکل 5B). میزان DP_Wسلولز گیاه T0 ویراسته ژنی نسبت به گیاه شاهد افزایش معنی‌داری نشان داد (شکل 5C). شاخص پراکنش وزنی (PDI) نشان‌دهنده تنوع اندازه پلیمر است (Gilbert et al., 2009). بر اساس نتایج، سطح بالای شاخص PDI در گیاه T0 ویراسته ژنی در مقایسه با گیاه WT نشان‌دهنده پراکنش بالای DP و تنوع در اندازه میکروفیبریل‌های سلولز است (شکل 5D). در مقایسه با نتایج این پژوهش، جهش جایگزینی اسید آمینه‌ای و حذف اسیدآمینه‌های تریپتوفان 436 و پرولین 437 در جایگاه اتصال باعث افزایش میزان DP_Nو DP_W سلولز حاصل از بیوماس صنوبر سفید T0 ویراسته ژنی شد (Nayeri et al., 2022).

جمع‌بندی

زیرواحد CESA4 به‌صورت اختصاصی از طریق دمین P-CR در ناحیه CCD می‌تواند با سایر زیرواحدها ازجمله CESA7 و CESA8 و همچنین، ایزوفرم‌های آنها برهمکنش پروتئین-پروتئین داشته باشد. قابلیت تشکیل همو/هترودیمر در زیرواحد CESA4 در آرایش زیرواحدهای CESA و نظام ساختاربندی رزت CSC‌ها نقش تعیین کننده‌ای ایفا می‌کند. بنابراین، ایجاد تغییرات هدفمند در دمین‌ P-CR زیرواحد CESA4 به‌عنوان یک زیرواحد منحصربفرد و منفرد در ساختار رزت CSC می‌تواند به تغییر در میزان برهمکنش زیرواحدها و به دنبال آن تغییر در ساختار دیواره سلولی، محتوای سلولز، تغییر در شاخص CrI و DP سلولز منجر شود. در این مطالعه، یک sgRNA اختصاصی برای هدفگیری اسید آمینه‌های پرولین 435 و تریپتوفان 436 در جایگاه اتصال دمین P-CR زیرواحد CESA4 صنوبر سفید طراحی شد. در طی جهش نوکلئوتیدی هدفمند با‌روش CRISPR/Cas9، یک گیاه T0 ویراسته ژنی دارای یک جفت جهش حذف هموزیگوس اسیدآمینه‌های پرولین 435 و تریپتوفان 436 به‌دست آمد که دارای رشد طبیعی، سالم بود. بررسی ویژگی‌های مورفولوژی چوب گیاه T0 ویراسته ژنی حاکی از کاهش تعداد سلول‌های آوند چوبی، درصد مساحت دیواره سلولی بود، به‌طوری‌که درصد مساحت فضای لومنی سلول‌های گزیلم و فیبر به‌صورت معنی‌‍‌‌داری افزایش داشت. مطالعه میکروسکوپ FE-SEM نشان داد که ضخامت دیواره سلولی اطراف سلول‌های فیبر درحدود 5/7 درصد کاهش و قطر فضای لومنی افزایش یافته است. همچنین، محتوای سلولز به میزان تقریبی 44 درصد کاهش یافته ولی میزان همی‌سلولز 2 برابر افزایش نشان می‌دهد.

شکل 5- میزان شاخص تبلور و DP سلولز حاصل از بیوماس چوب گیاه T0 ویراسته ژنی PalCESA4^{P435del_W436del} در مقایسه با گیاه شاهد (WT). A) الگوی پراش اشعه X حاصل از آنالیز XRD گیاه شاهد و T0 ویراسته ژنی (سمت چپ) و نمودار شاخص تبلور (CrI) سلولز نمونه های سلولز حاصل از بیوماس چوب گیاه شاهد (WT) و گیاه T0 ویراسته ژنی (T0). B-D) مقادیر میانگین DP_N(B)، DP_W (C) و DPI(D) ± انحراف معیار سلولز حاصل از بیوماس چوب گیاه شاهد (WT) و گیاه T0 ویراسته ژنی (T0). حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 05/0 >P است.

Figure 5. The crystallinity i8ndex and DP of cellulose fibers from wood biomass of the control (WT) and PalCESA4^{P435del_W436del}T0 mutant plants. A) The XRD patterns and CrI content of the cellulose fibrils from control (WT) and the T0 mutant plants. B-D) The mean of DP_N (B), DP_W (C), and PDI (D) of cellulose microfibrils from WT and T0 mutant plants.

علاوه‌براین، میزان تبلور سلولز تقریبا 5/19 درصد نسبت به شاهد کاهش یافته ولی میزان DP_Nو DP_Wبه‌ترتیب بدون تغییر و افزایش داشته است. بنابراین، می‌توان به این نتیجه رسید که ایجاد جهش‌های هدفمند با‌ روش CRISPR/Cas9 در دمین P-CR و بررسی تنوع ژنتیکی حاصل از جهش برای شناسایی گیاهان ویراسته ژنی (GE) امکان تولید میکروفیبریل‌های سلولزی با ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی مطلوب برای بهره‌برداری اقتصادی را فراهم می‌آورد.

تشکر و قدردانی

این مقاله مستخرج از گزارش نهایی طرح پژوهشی به شماره قرارداد 346/27/د (شماره طرح 947) است که از محل اعتبارات پژوهشی دانشگاه تبریز اجرا گردیده است. همچنین، از پژوهشگاه علوم و فناوری اطلاعات ایران (ایرانداک) با نام قبلی پژوهشگاه اطلاعات و مدارک علمی ایران به‌جهت حمایت‌های مادی و معنوی بی‌شائبه از آزمایشگاه مهندسی ژنتیک واقع در مرکز تحصیلات تکمیلی دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران تشکر و قدردانی می‌گردد.

مراجع

Abbas, M., Peszlen, I., Shi, R., Kim, H., Katahira, R., Kafle, K., Xiang, Z., Huang, X., Min, D. and Mohamadamin, M. (2020) Involvement of CesA4, CesA7-A/B and CesA8-A/B in secondary wall formation in Populus trichocarpa wood. Tree Physiology 40(1): 73-89.

Abe, K. and Yano, H. (2009) Comparison of the characteristics of cellulose microfibril aggregates of wood, rice straw and potato tuber. Cellulose 16(6): 1017-1023.

Abitbol, T., Rivkin, A., Cao, Y., Nevo, Y., Abraham, E., Ben-Shalom, T., Lapidot, S. and Shoseyov, O. (2016) Nanocellulose, a tiny fiber with huge applications. Current Opinion in Biotechnology 39: 76-88.

Balatinecz, J. J., Kretschmann, D. E. and Leclercq, A. (2001) Achievements in the utilization of poplar wood guideposts for the future. The Forestry Chronicle 77(2): 265-269.

Bali, G., Khunsupat, R., Akinosho, H., Payyavula, R. S., Samuel, R., Tuskan, G. A., Kalluri, U. C. and Ragauskas, A. J. (2016) Characterization of cellulose structure of Populus plants modified in candidate cellulose biosynthesis genes. Biomass and Bioenergy 94: 146-154.

Baucher, M., Chabbert, B., Pilate, G., Van Doorsselaere, J., Tollier, M. T., Petit-Conil, M., Cornu, D., Monties, B., Van Montagu, M. and Inze, D. (1996) Red xylem and higher lignin extractability by down-regulating a cinnamyl alcohol dehydrogenase in poplar. Plant Physiology 112(4): 1479-1490.

Bhattacharya, D. and Van Meir, E. G. (2019) A simple genotyping method to detect small CRISPR-Cas9 induced indels by agarose gel electrophoresis. Scientific Reports 9(1): 1-7.

Bjurhager, I., Olsson, A. M., Zhang, B., Gerber, L., Kumar, M., Berglund, L. A., Burgert, I., Sundberg, B. R. and Salmen, L. (2010) Ultrastructure and mechanical properties of Populus wood with reduced lignin content caused by transgenic down-regulation of cinnamate 4-hydroxylase. Biomacromolecules 11(9): 2359-2365.

Burn, J. E., Hocart, C. H., Birch, R. J., Cork, A. C. and Williamson, R. E. (2002) Functional analysis of the cellulose synthase genes CesA1, CesA2, and CesA3 in arabidopsis. Plant Physiology 129(2): 797-807.

Chang, V. S. and Holtzapple, M. T. (2000) Fundamental factors affecting biomass enzymatic reactivity. Twenty-first symposium on biotechnology for fuels and chemicals Held, in Fort Collins, Colorado, USA.

Chen, W., Yu, H. and Liu, Y. (2011) Preparation of millimeter-long cellulose I nanofibers with diameters of 30-80 nm from bamboo fibers. Carbohydrate Polymers 86(2): 453-461.

Concordet, J. P. and Haeussler, M. (2018) CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research 46(1): 242-245.

Djerbi, S., Lindskog, M., Arvestad, L., Sterky, F. and Teeri, T. T. (2005) The genome sequence of black cottonwood (Populus trichocarpa) reveals 18 conserved cellulose synthase (CesA) genes. Planta 221(5): 739-746.

Doyle, J. J. and Doyle, J. L. (1987) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19(1): 11-15.

Etemadi, E., Fayyaz, P. and Zolfaghari, R. (2016) Insights into some physiological and biochemical responses of Populus alba and Populus nigra to lead contamination. Iranian Journal of Plant Biology 8(30): 1-14 (in Persian).

Food and Agriculture Organization of USA, (2017) OECD-FAO Agricultural Outlook 2017-2026. https://doi.org/10.1787/agr-data-en

Foston, M., Hubbell, C. A., Samuel, R., Jung, S., Fan, H., Ding, S. Y., Zeng, Y., Jawdy, S., Davis, M. and Sykes, R. (2011) Chemical, ultrastructural and supramolecular analysis of tension wood in Populus tremula x alba as a model substrate for reduced recalcitrance. Energy and Environmental Science 4(12): 4962-4971.

Ghanbary, E., Tabari, M. and Sadati, E. (2012) Growth characteristics of populus deltoides seedlings under flood stress. Iranian Journal of Plant Biology 3(10): 47-58 (in Persian).

Gilbert, R., Hess, M., Jenkins, A., Jones, R., Kratochvil, P. and Stepto, R. (2009) Dispersity in polymer science. Pure and Applied Chemistry 81(2): 351-353.

Green, M. R. and Sambrook, J. (2020) Transformation of escherichia coli by electroporation. Cold Spring Harbor Protocols.

Guo, J., Li, K., Jin, L., Xu, R., Miao, K., Yang, F., Qi, C., Zhang, L., Botella, J. R. and Wang, R. (2018) A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants. Plant Methods 14(1): 1-10.

Hill, J. L., Hammudi, M. B. and Tien, M. (2014) The Arabidopsis cellulose synthase complex: a proposed hexamer of CESA trimers in an equimolar stoichiometry. The Plant Cell 26(12): 4834-4842.

Hinchee, M., Rottmann, W., Mullinax, L., Zhang, C., Chang, S., Cunningham, M., Pearson, L. and Nehra, N. (2009) Short-rotation woody crops for bioenergy and biofuels applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 45(6): 619-629.

Hoekema, A., Hirsch, P. R., Hooykaas, P. J. and Schilperoort, R. A. (1983) A binary plant vector strategy based on separation of vir-and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303(5913): 179-180.

Hsu, P. D., Scott, D. A., Weinstein, J. A., Ran, F. A., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E. J., Wu, X. and Shalem, O. (2013) DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology 31(9): 827-832.

Hu, W. J., Harding, S. A., Lung, J., Popko, J. L., Ralph, J., Stokke, D. D., Tsai, C. J. and Chiang, V. L. (1999) Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature Biotechnology 17(8): 808-812.

Hubbell, C. A. and Ragauskas, A. J. (2010) Effect of acid-chlorite delignification on cellulose degree of polymerization. Bioresource Technology 101(19): 7410-7415.

Klemm, D., Heublein, B., Fink, H. P. and Bohn, A. (2005) Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material. Angewandte Chemie International Edition 44(22): 3358-3393.

Kumar, R., Mago, G., Balan, V. and Wyman, C. E. (2009) Physical and chemical characterizations of corn stover and poplar solids resulting from leading pretreatment technologies. Bioresource Technology 100(17): 3948-3962.

Kurek, I., Kawagoe, Y., Jacob-Wilk, D., Doblin, M. and Delmer, D. (2002) Dimerization of cotton fiber cellulose synthase catalytic subunits occurs via oxidation of the zinc-binding domains. Proceedings of the National Academy of Sciences 99(17): 11109-11114.

Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H. and Valen, E. (2019) CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research 47(1): 171-174.

Lapierre, C., Pollet, B., Petit-Conil, M., Toval, G., Romero, J., Pilate, G., Leple, J. C., Boerjan, W., Ferret, V. and De Nadai, V. (1999) Structural alterations of lignins in transgenic poplars with depressed cinnamyl alcohol dehydrogenase or caffeic acid O-methyltransferase activity have an opposite impact on the efficiency of industrial kraft pulping. Plant Physiology, 119(1): 153-164.

Laureano-Perez, L., Teymouri, F., Alizadeh, H. and Dale, B. E. (2005) Understanding factors that limit enzymatic hydrolysis of biomass. Applied Biochemistry and Biotechnology, 124(1): 1081-1099.

Lee, C., Teng, Q., Huang, W., Zhong, R. and Ye, Z. H. (2009) Down-regulation of PoGT47C expression in poplar results in a reduced glucuronoxylan content and an increased wood digestibility by cellulase. Plant and Cell Physiology 50(6): 1075-1089.

Leple, J. C., Dauwe, R., Morreel, K., Storme, V., Lapierre, C., Pollet, B., Naumann, A., Kang, K. Y., Kim, H. and Ruel, K. (2007) Downregulation of cinnamoyl-coenzyme A reductase in poplar: multiple-level phenotyping reveals effects on cell wall polymer metabolism and structure. The Plant Cell 19(11): 3669-3691.

Li, F., Xie, G., Huang, J., Zhang, R., Li, Y., Zhang, M., Wang, Y., Li, A., Li, X. and Xia, T. (2017) Os CESA9 conserved‐site mutation leads to largely enhanced plant lodging resistance and biomass enzymatic saccharification by reducing cellulose DP and crystallinity in rice. Plant Biotechnology Journal 15(9): 1093-1104.

Lin, J. J. (1995) Electrotransformation of Agrobacterium. In Electroporation Protocols for Microorganisms. Springer 47: 171-178.

Littlewood, J., Guo, M., Boerjan, W. and Murphy, R. J. (2014) Bioethanol from poplar: a commercially viable alternative to fossil fuel in the European Union. Biotechnology for Biofuels 7(1): 1-12.

Luan, W., Liu, Y., Zhang, F., Song, Y., Wang, Z., Peng, Y. and Sun, Z. (2011) OsCD1 encodes a putative member of the cellulose synthase‐like D sub‐family and is essential for rice plant architecture and growth. Plant Biotechnology Journal 9(4): 513-524.

Lurquin, P. F. (1997) Gene transfer by electroporation. Molecular Biotechnology 7(1): 5-35.

Naito, Y., Hino, K., Bono, H. and Ui-Tei, K. (2015) CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics 31(7): 1120-1123.

Nayeri, S., Baghban Kohnehrouz, B., Ahmadikhah, A. and Mahna, N. (2022) CRISPR/Cas9-mediated P-CR domain-specific engineering of CESA4 heterodimerization capacity alters cell wall architecture and improves saccharification efficiency in poplar. Plant Biotechnology Journal 20(6): 1197-1212.

Nishiyama, Y., Langan, P. and Chanzy, H. (2002) Crystal structure and hydrogen-bonding system in cellulose Iβ from synchrotron X-ray and neutron fiber diffraction. Journal of the American Chemical Society 124(31): 9074-9082.

Nishiyama, Y., Sugiyama, J., Chanzy, H. and Langan, P. (2003) Crystal structure and hydrogen bonding system in cellulose Iα from synchrotron X-ray and neutron fiber diffraction. Journal of the American Chemical Society 125(47): 14300-14306.

Nixon, B. T., Mansouri, K., Singh, A., Du, J., Davis, J. K., Lee, J. G., Slabaugh, E., Vandavasi, V. G., O-Neill, H. and Roberts, E. M. (2016) Comparative structural and computational analysis supports eighteen cellulose synthases in the plant cellulose synthesis complex. Scientific Reports 6(1): 1-14.

Ooms, G., Hooykaas, P. J., Van Veen, R. J., Van Beelen, P., Regensburg-Tuink, T. J. and Schilperoort, R. A. (1982) Octopine Ti-plasmid deletion mutants of Agrobacterium tumefaciens with emphasis on the right side of the T-region. Plasmid 7(1): 15-29.

Oun, A. A. and Rhim, J. W. (2016) Characterization of nanocelluloses isolated from Ushar (Calotropis procera) seed fiber: Effect of isolation method. Materials Letters 168: 146-150.

Park, S., Baker, J. O., Himmel, M. E., Parilla, P. A. and Johnson, D. K. (2010) Cellulose crystallinity index: measurement techniques and their impact on interpreting cellulase performance. Biotechnology for Biofuels 3(1): 1-10.

Petersen, P. D., Lau, J., Ebert, B., Yang, F., Verhertbruggen, Y., Kim, J. S., Varanasi, P., Suttangkakul, A., Auer, M. and Loque, D. (2012) Engineering of plants with improved properties as biofuels feedstocks by vessel-specific complementation of xylan biosynthesis mutants. Biotechnology for Biofuels 5(1): 1-19.

Pilate, G., Guiney, E., Holt, K., Petit-Conil, M., Lapierre, C., Leple, J. C., Pollet, B., Mila, I., Webster, E. A. and Marstorp, H. G. (2002) Field and pulping performances of transgenic trees with altered lignification. Nature Biotechnology 20(6): 607-612.

Porth, I. and El‐Kassaby, Y. A. (2015) Using Populus as a lignocellulosic feedstock for bioethanol. Biotechnology Journal 10(4): 510-524.

Purushotham, P., Cho, S. H., Diaz-Moreno, S. M., Kumar, M., Nixon, B. T., Bulone, V. and Zimmer, J. (2016) A single heterologously expressed plant cellulose synthase isoform is sufficient for cellulose microfibril formation in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences 113(40): 11360-11365.

Purushotham, P., Ho, R. and Zimmer, J. (2020) Architecture of a catalytically active homotrimeric plant cellulose synthase complex. Science 369(6507): 1089-1094.

Sakamoto, S., Somssich, M., Nakata, M. T., Unda, F., Atsuzawa, K., Kaneko, Y., Wang, T., Bagman, A. M., Gaudinier, A. and Yoshida, K. (2018) Complete substitution of a secondary cell wall with a primary cell wall in Arabidopsis. Nature Plants 4(10):777-783.

Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Second edition, cold spring harbor laboratory press, Cold Spring Harbor, NY, USA.

Sambrook, J. and Russell, D. W. (2006) Transformation of E. coli by electroporation. Cold Spring Harbor Protocols.

Scanlon, M. and Timmermans, M. (2013) Growth and development. Current Opinion in Plant Biology 16(1): 1-127.

Sethaphong, L., Haigler, C. H., Kubicki, J. D., Zimmer, J., Bonetta, D., DeBolt, S. and Yingling, Y. G. (2013) Tertiary model of a plant cellulose synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences 110(18): 7512-7517.

Simmons, B. A., Loque, D. and Ralph, J. (2010) Advances in modifying lignin for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology 13(3): 312-319.

Somerville, C. (2006) Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology 22: 53-78.

Song, D., Shen, J. and Li, L. (2010) Characterization of cellulose synthase complexes in Populus xylem differentiation. New Phytologist 187(3): 777-790.

Speicher, T. L., Li, P. Z. and Wallace, I. S. (2018) Phosphoregulation of the plant cellulose synthase complex and cellulose synthase-like proteins. Plants 7(3): 52.

Suzuki, S., Li, L., Sun, Y. H. and Chiang, V. L. (2006) The cellulose synthase gene superfamily and biochemical functions of xylem-specific cellulose synthase-like genes in Populus trichocarpa. Plant Physiology 142(3): 1233-1245.

Tigunova, O. O., Kamenskyh, D. S., Tkachenko, T. V., Yevdokymenko, V. A., Kashkovskiy, V. I., Rakhmetov, D. B., Blume, Y. B. andShulga, S. M. (2020) Biobutanol production from plant biomass. The Open Agriculture Journal 14(1):187-197.

Trache, D., Tarchoun, A. F., Derradji, M., Hamidon, T. S., Masruchin, N., Brosse, N. and Hussin, M. H. (2020) Nanocellulose: From fundamentals to advanced applications (Review). Frontiers in Chemistry 8(392) 1-33.

Tuskan, G. A., Difazio, S., Jansson, S., Bohlmann, J., Grigoriev, I., Hellsten, U., Putnam, N., Ralph, S., Rombauts, S. and Salamov, A. (2006) The genome of black cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. and Gray). Science 313(5793): 1596-1604.

Van Doorsselaere, J., Baucher, M., Chognot, E., Chabbert, B., Tollier, M. T., Petit‐Conil, M., Leple, J. C., Pilate, G., Cornu, D. and Monties, B. (1995) A novel lignin in poplar trees with a reduced caffeic acid/5‐hydroxyferulic acid O‐methyltransferase activity. The Plant Journal 8(6): 855-864.

Vermerris, W. and Abril, A. (2015) Enhancing cellulose utilization for fuels and chemicals by genetic modification of plant cell wall architecture. Current Opinion in Biotechnology 32: 104-112.

Wang, Y., Fan, C., Hu, H., Li, Y., Sun, D., Wang, Y. and Peng, L. (2016) Genetic modification of plant cell walls to enhance biomass yield and biofuel production in bioenergy crops. Biotechnology Advances 34(5): 997-1017.

Wang, Y., Ma, N., Qiu, S., Zou, H., Zang, G., Kang, Z., Wang, G. and Huang, J. (2014) Regulation of the α-expansin gene OsEXPA8 expression affects root system architecture in transgenic rice plants. Molecular Breeding 34(1): 47-57.

Weigel, D. and Glazebrook, J. (2008) Fixation, embedding, and sectioning of plant tissues. CSH protocols.

Xi, W., Song, D., Sun, J., Shen, J. and Li, L. (2017) Formation of wood secondary cell wall may involve two type cellulose synthase complexes in Populus. Plant Molecular Biology 93(4-5):419-429.

Xie, G. and Peng, L. (2011) Genetic engineering of energy crops: a strategy for biofuel production in china free access. Journal of Integrative Plant Biology 53(2): 143-150.

Xu, W., Cheng, H., Zhu, S., Cheng, J., Ji, H., Zhang, B., Cao, S., Wang, C., Tong, G. and Zhen, C. (2021) Functional understanding of secondary cell wall cellulose synthases in Populus trichocarpa via the Cas9/gRNA‐induced gene knockouts. The New Phytologist 231(4): 1478-1495.

Yoo, C. G., Yang, Y., Pu, Y., Meng, X., Muchero, W., Yee, K. L., Thompson, O. A., Rodriguez, M., Bali, G. and Engle, N. L. (2017) Insights of biomass recalcitrance in natural Populus trichocarpa variants for biomass conversion. Green Chemistry 19(22): 5467-5478.

Zhang, W., Yi, Z., Huang, J., Li, F., Hao, B., Li, M., Hong, S., Lv, Y., Sun, W. and Ragauskas, A. (2013) Three lignocellulose features that distinctively affect biomass enzymatic digestibility under NaOH and H₂SO₄ pretreatments in Miscanthus. Bioresource Technology 130: 30-37.