نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
گروه زیست‌شناسی، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
In this study, the effect of salicylic acid and sodium nitroprusside on the toxicity of zinc oxide nanoparticles (ZnONPs) and zinc sulfate (ZnSO4) in Phlomis tuberosa was investigated. The purpose of this research was to investigate new methods of increasing the tolerance threshold of Phlomis plants under the influence of zinc oxide and zinc sulfate nanoparticles toxicity. This experiment was conducted in the form of a completely randomized design with three replications in the form of pot cultivation in a perlite bed, and the plants were harvested after 21 days of treatment. The measured factors included total chlorophyll, carotenoid, total phenol, flavonoid, the activity of phenylalanine ammonia lyase, catalase, superoxide dismutase, and ascorbate peroxidase. The results of the analysis of the variance of the data in the laboratory showed that the application of 1000 mgL-1 of zinc oxide nanoparticles or zinc sulfate caused more toxicity. The interaction effect of salicylic acid and sodium nitroprusside pretreatments on zinc oxide nanoparticles in Phlomis seedlings was significant and salicylic acid pretreatment increased the amount of proline in the treatment of zinc oxide nanoparticles. Phenol antioxidants increased significantly under the effect of zinc oxide and zinc sulfate nanoparticles, which was associated with an increase in the activity of the phenylalanine ammonia lyase enzyme. Salicylic acid pretreatment showed the greatest effect in the Phlomis plant compared to the combination of salicylic acid and nitric oxide.
Introduction
Engineered zinc oxide nanoparticles (ZnONPs), due to their unique physicochemical properties, have many applications in industrial, optical, electrical, cosmetic, biomedical, pharmaceutical, and agricultural fields (Pullagurala et al., 2018; Mosquera-Sánchez et al., 2020). Despite the application of Zn nanoparticles in agriculture, some reports show that Timarin nanoparticles can lead to Zn accumulation and toxic effects in plants (Molnár et al., 2020; Zoufan et al., 2020). The toxicity mechanism of zinc oxide nanoparticles is better understood by using compounds that increase the tolerance and performance of plants during the treatment of nanoparticles. Salicylic acid, as a phenolic compound, plays a role in controlling plant growth, seed germination, photosynthesis and flowering (Arif et al., 2020). Under heavy metal stress, treatment with salicylic acid reduces the toxic effects of these metals and increases plant tolerance through changes in the antioxidant system (Zengin, 2014; Kotapati et al., 2017; Lu et al., 2018). When stresses cause the accumulation of excess reactive oxygen species, nitric oxide reacts with superoxide anions, thereby reducing the formation of other oxygen radicals (Domingos et al., 2015). There are few studies on the effects of nitric oxide on the tolerance of nanoparticle toxicity in plants, which confirms this hypothesis (Siddiqui et al., 2015). Tripathi et al. (2017) showed that sodium nitroprusside reduces the accumulation of zinc, reactive oxygen species and malondialdehyde and increases the amount of chlorophyll and the efficiency of photosynthesis in wheat shoots under the stress of zinc oxide nanoparticles. In this research, in order to better understand the effects of zinc oxide nanoparticles, the physiological and molecular reactions of the plant when exposed to zinc were compared to zinc sulfate. The importance of the role of salicylic acid and nitric oxide in reducing the tension of zinc oxide nanoparticles in plants was mentioned. These results showed that salicylic acid pretreatment alone is effective for Phlomis tuberosa plants under the stress of zinc oxide nanoparticles.
Materials and Methods
The seeds of Phlomis tuberos (Jerusalem sage) were collected from Madagh near Marand city, 65 km south of Tabriz (45°38'E and 38°22'N) at an altitude of 1800 meters in East Azarbaijan province (Northwest of Iran). The seeds were planted in cylindrical plastic pots containing perlite and then watered with 500 ml of Hoagland solution. For pre-treatment, the seeds of gerbera and phlomis were soaked in solutions of sodium nitroprusside (SNP, as NO donor) and salicylic acid (SA) at a concentration of 0.1 mM for 12 hours). Sixteen weeks after sowing, when the plants were about 10 cm (30 inches) tall, the pots were irrigated with 1000 ppm ZnONPs or ZnSO4 solution dissolved in tap water for 21 days (Zn treatment). Plants in the greenhouse with day and night temperatures of 25-30 degrees Celsius and 19-21 degrees Celsius respectively, day and night light periods of 16 and 8 hours respectively, relative humidity of 60-65% and daily light flux density of about 350-400 micromoles per square meter per second were tested during the maintenance period. After 21 days of Zn treatment, plants were harvested for morphological and physiological analysis. After the determination of fresh weight (FW), leaves were dried for 48 h at 70 °C for the determination of dry weight (DW). For the latter physiological analysis, samples were stored immediately in liquid N2 until assay. For the determination of leaf concentration of chlorophyll and carotenoids, samples were homogenized in the methanol according to Lichtenthaler and Wellburn (1983). Proline was calculated as described by Bates et al., 1973. Soluble sugar concentrations were determined according to the method of Quentin et al. (2015). The resulting precipitate was used for starch analysis following the method of Magne et al. (2006). The activity of phenylalanine ammonialyase was determined by measuring the absorbance of cinnamic acid with spectrophotometry at a wavelength of 290 nm based on the modified method of Zucker (1965). Superoxide dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) activity was estimated according to the method of Giannopolitis and Ries (1977). Nitric oxide concentration was measured using the modified method described by Wu et al. (2016). The digested plant solution was diluted in distilled water, and zinc content was estimated by Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy (ICP-AES, INTEGRA XL2, GBC, Australia). HPLC analysis was performed using an Agilent 1290 Santa Clara, CA, USA HPLC high-performance liquid chromatography system with a diode array detector (DAD) according to Sinrod et al. (2019). Experiments were done in a complete randomized block design with 3 replications. Statistical analysis was carried out using Sigma Stat (3.5) with the Tukey test (P<0.05).
Results and Discussion
This research showed that the effect of pretreatment of seeds with salicylic acid, nitric oxide and the combination of salicylic acid and nitric oxide at a concentration of 0.1 mM on the physiological and biochemical parameters of Phlomis under the influence of the application of zinc oxide nanoparticles and zinc sulfate at a concentration of 1000 mM Gram per liter was studied and the following general results were obtained: Zinc oxide and zinc sulfate nanoparticles at a concentration of 1000 ppm caused a significant decrease in plant growth due to the increase in zinc content, lipid peroxidation, hydrogen peroxide and oxidative stress. The amount of sinapyl alcohol, chlorogenic acid, ascorbic acid and cinnamic acid compounds of salicylic acid pretreated leaves showed a significant increase under the influence of zinc oxide nanoparticles. The greatest effect of priming seeds with salicylic acid under the influence of zinc stress with the accumulation of phenolic compounds (sinapil-alcohol, chlorogenic-acid, ascorbic-acid, cinnamic-acid) and the amount of flavonoid, activity of antioxidant enzymes (superoxide dismutase), increased proline Obtained. Salicylic acid may have an important function in increasing the integrity of membranes by controlling the function of the antioxidant system.
Conclusion
We showed that both ZnONPs and ZnSO4 adversely decreased growth, due to enhanced levels of Ag and significant lipid peroxidation. Strong amelioration of Zn-induced stress was achieved under SA priming. These findings provide valuable information for the development of sustainable strategies in order to reduce the negative impact of ZnONPs and ZnSO4 on crops.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
نانوذرات اکسیدروی مهندسی‌شده (ZnONPs) به دلیل ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی منحصر‌به‌فرد خود، کاربردهای فراوانی در زمینه‌های صنعتی، نوری، الکتریکی، آرایشی، زیست‌پزشکی، دارویی و کشاورزی دارند (Pullagurala et al., 2018; Mosquera-Sánchez et al., 2020). گیاهان، موجودات فتوسنتزکننده و مسیر اصلی ورود نانوذرات به زنجیرۀ غذایی هستند. باوجود کاربرد نانوذرات روی در کشاورزی، برخی گزارش‌ها نشان داده‌اند تیمار این نانوذرات به تجمع روی و آثار سمی آن در گیاهان منجر می‌شود (Molnár et al., 2020; Zoufan et al., 2020). سازوکار سمیت نانوذرات اکسیدروی با استفاده از ترکیباتی که تحمل و عملکرد گیاهان هنگام تیمار نانوذرات را افزایش می‌دهند، بهتر درک می‌شود.
سالیسیلیک‌اسید، ترکیبی فنولی است که در کنترل رشدونمو گیاه، جوانه‌زنی بذر، فتوسنتز و گل‌دهی نقش دارد (Arif et al., 2020). محلول‌پاشی سالیسیلیک‌اسید، آثار نامطلوب تنش خشکی بر وضعیت آب و رشد رویشی گیاه را کاهش و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی آن را افزایش می دهد (Estaji & Niknam, 2020). برخی مطالعه‌ها نشان داده‌اند تیمار سالیسیلیک‌اسید آسیب ناشی از تنش دما بر رشد و شاخص‌های بیوشیمیایی را کاهش می‌دهد (Wang et al., 2010; Ignatenko et al., 2019). در شرایط تنش فلزات سنگین، تیمار سالیسیلیک‌اسید آثار سمی فلزات را کاهش و تحمل گیاهان را از طریق تغییر عملکرد سیستم آنتی‌اکسیدانی افزایش می‌دهد (Zengin, 2014; Kotapati et al., 2017; Lu et al., 2018). با وجود نقش تأییدشدۀ سالیسیلیک‌اسید در کاهش سمیت فلزات سنگین، اطلاعات اندکی در زمینۀ واکنش گیاهان تحت‌تأثیر تیمار نانوذرات به سالیسیلیک‌اسید وجود دارد.
نیتریک‌اکسید، مولکول سیگنالی است که واکنش‌های متعددی نسبت به تنش‌های زیستی و غیرزیستی نشان می‌دهد. هنگامی که تنش‌ها سبب تجمع گونه‌های فعال اکسیژن اضافی می‌شوند، نیتریک‌اکسید با آنیون‌های سوپراکسید واکنش و تشکیل سایر رادیکال‌های اکسیژن را کاهش می‌دهد (Domingos et al., 2015). نیتریک‌اکسید ممکن است به‌طور مستقیم و به‌شکل مولکول آنتی‌اکسیدانی عمل کند یا به‌طور غیرمستقیم و با فعال‌کردن سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی سلول‌ها، آثار تنش اکسیداتیو را کاهش دهد. مطالعه‌های اندکی در زمینۀ آثار نیتریک‌اکسید بر تحمل سمیت نانوذرات در گیاهان وجود دارند که فرضیۀ یادشده را تأیید می‌کنند (Siddiqui et al., 2015). Tripathi et al. (2017) نشان دادند نیتروپروسایدسدیم تجمع روی، گونه‌های فعال اکسیژن و مالون‌دی‌آلدهید را کاهش و مقدار کلروفیل و کارایی فتوسنتز در نشای گندم در معرض تنش نانوذرات اکسیدروی را افزایش می‌دهد (Tripathi et al., 2017). Chen et al. (2015) بیان کردند نیتروپروسایدسدیم گونه‌های فعال اکسیژن و پراکسیداسیون لیپیدی در گیاهان را کاهش و رونوشت‌ها و فعالیت‌های پراکسیداز، کاتالاز و آسکوربات‌پراکسیداز را در برنج در معرض تنش نانوذرات اکسیدروی افزایش می‌دهد (Chen et al., 2015). Habibi & Rostampoor (2020) گزارش کردند گیاه فلومیس توبروزا به‌واسطۀ انباشت نیتریک‌اکسید، مقاومت زیادی به تنش مس نشان می‌دهد. Ghasemifar et al. (2022) نشان دادند پیشتیمار سالیسیلیک‌اسید و نیتریک‌اکسید، آثار سمیت نانوذرات نقره و نیترات‌نقره در گیاه فلومیس توبروزا را کاهش می‌دهد (Ghasemifar et al., 2022). گیاه فلومیس توبروزا به خانوادۀ لامیاسه تعلق دارد و در خاک‌های سبک (ماسه)، لومی و سنگین به‌خوبی رشد می‌کند (Javzan & Selenge, 2013). چنانچه گیاه یادشده بتواند مقادیر زیاد سمیت روی را تحمل کند، نتایج پژوهش حاضر قابلیت استفاده در پژوهش‌های مربوط به جستجوی نامزد مناسب برای گیاه‌پالایی را دارند. در پژوهش حاضر، تأثیر غلظت زیاد نانوذرات روی و نمک آن بر رشد، میزان انباشت نانوذرات و فلز آن، رنگیزه‌های فتوسنتزی، مقدار محلول‌های سازگار، ظرفیت آنتی‌اکسیدانی و متابولیت‌های ثانویۀ گیاه فلومیس توبروزا بررسی شد و هدف مطالعه، بررسی آستانۀ تحمل گیاه فلومیس توبروزا در معرض سمیت نانوذرات اکسیدروی (ZnONPs) و سولفات‌روی (ZnSO4) با استفاده از پیشتیمار نیتریک‌اکسید و سالیسیلیک‌اسید بود.
مواد و روش‌ها
آزمایش‌های مقدماتی: در مطالعۀ مقدماتی، به‌منظور تعیین غلظت‌های مؤثر نیتریک‌اکسید و سالیسیلیک‌اسید، غلظت‌های مختلف نیتریک‌اکسید (05/0، 1/0، 5/0، 1، 5 و 10 میلی‌مولار) و سالیسیلیک‌اسید (05/0، 1/0، 5/0، 1، 5 و 10 میلی‌مولار) روی جوانه‌زنی بذر و رشد گیاهچه‌ها آزمایش شدند. غلظت مؤثر نانوذرات (1000 میلی‌گرم‌بر‌لیتر) با‌توجه‌به تأثیر غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسیدروی و نقره (5، 50، 100، 1000 و 2000میلی‌گرم‌بر‌لیتر) بر جوانه‌زنی بذر و رشد گیاهچه انتخاب شد. بذرها به‌مدت 48 ساعت در غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسیدروی و نقره خیسانده شدند.
مواد گیاهی و تیمار: بذر Phlomis tuberos (مریم‌گلی اورشلیم) از میشوداغ، در نزدیکی شهر مرند، 65 کیلومتری جنوب تبریز (45 درجه و 38 دقیقۀ شرقی و 38 درجه و 22 دقیقۀ شمالی)، در ارتفاع 1800 متری استان آذربایجان شرقی (شمال‌غربی ایران) جمع‌آوری شد. بذرها در گلدان‌های پلاستیکی استوانه‌ای‌شکل حاوی پرلیت کاشته و سپس با 500 میلی‌لیتر محلول هوگلند آبیاری شدند؛ قطر گلدان‌ها 14 سانتی‌متر و عمق آنها 45 سانتی‌متر بود. به‌منظور پیشتیمار، بذرهای گل راعی و فلومیس به‌مدت 12 ساعت در محلول‌های نیتروپروسایدسدیم ((SNP به‌عنوان اهداکنندۀ NO)) و سالیسیلیک‌اسید (SA) در غلظت 1/0 میلی‌مولار خیسانده شدند. شانزده هفته پس‌از کاشت، زمانی که بوته‌ها حدود 10 سانتی‌متر ارتفاع داشتند، گلدان‌ها به‌مدت 21 روز با 1000 میلی‌گرم‌در‌لیتر نانوذرات نقره و اکسیدروی یا نیترات‌نقره و سولفات‌روی محلول در آب دیونایزر (تیمار روی) آبیاری شدند. محصول نانوذرات اکسیدروی از شرکت معتبر پیشگامان نانومواد ایران (مشهد، ایران) تهیه شد؛ ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی نانومحصول یادشده به شرح زیر بود: خلوص: 99 درصد، APS: 10 تا 30 نانومتر، SSA: 20 تا 60 مترمربع‌بر‌گرم، رنگ: سفید، مورفولوژی: کروی، چگالی واقعی: 606/5 گرم‌برسانتی‌مترمکعب. نمک سولفات‌روی (ZnSO4) از شرکت سیگما خریداری و به‌منظور کنترل حجم استفاده شد. گیاهان شاهد با محلول غذایی بدون روی، نیتریک‌اکسید و سالیسیلیک‌اسید آبیاری شدند. گیاهان در گلخانه‌ای با دمای روز و شب به‌ترتیب 25 تا 30 و تا 21 درجۀ سانتی‌گراد، دورۀ نوری روز و شب به‌ترتیب 16 و 8 ساعت، رطوبت نسبی 60 تا 65 درصد و تراکم جریان نوری روزانه حدود 350 تا 400 میکرومول‌بر‌مترمربع‌بر‌ثانیه در طول دورۀ آزمایش نگهداری شدند.
محصول: پس از 21 روز از تیمار روی، گیاهان برای تجزیهوتحلیل مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی برداشت شدند. پس از تعیین وزن تر (FW) و به‌منظور تعیین وزن خشک (DW)، برگ‌ها به‌مدت 48 ساعت در دمای 70 درجۀ سانتی‌گراد خشک شدند. به‌منظور آزمایش‌های بعدی، نمونه‌ها بی‌درنگ در N2 مایع تا زمان سنجش ذخیره شدند.
سنجش کلروفیل‌ها و کاروتنوئیدها: به‌منظور تعیین غلظت کلروفیل و کاروتنوئیدها، نمونه‌ها در متانول همگن (Lichtenthaler & Wellburn, 1983) و سپس هموژنه و صاف شدند. پس از سانتریفیوژ با سرعت 1000 دوردردقیقه به‌مدت 1 دقیقه، مایع رویی برای تعیین رنگدانه‌ها استفاده شد. رنگدانه‌های فتوسنتزی به روش اسپکتروفتومتری در طول موج‌های 400 تا 700 نانومتر اندازه‌گیری شدند.
.تعیین قندهای محلول، نشاسته و پرولین: غلظت قندهای محلول بر اساس روش Quentin et al. (2015) تعیین شد. پس از استخراج عصاره، مواد رویی مورد تجزیهوتحلیل قندهای محلول به کمک معرف آنترون‌سولفوریک در 630 نانومتر قرار گرفتند. به‌منظور رسم منحنی استاندارد از گلوکز (سیگما) استفاده شد. رسوب حاصل برای تجزیهوتحلیل نشاسته به روش Magne et al. (2006) استفاده و جذب در طول موج 600 نانومتر خوانده شد؛ نشاسته (Merck) برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد. به‌منظور استخراج و سنجش پرولین آزاد نمونه‌ها از روش Bates et al. (1973) استفاده شد. پس‌از استخراج عصاره‌های گیاهی، جذب آنها در 520 نانومتر با اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری و مقدار پرولین نمونه‌ها برحسب نانومول‌بر‌میلی‌گرم پروتئین محاسبه شد.
.سنجش فعالیت فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز (PAL) و متابولیت‌های آن: فعالیت فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز به کمک اندازه‌گیری میزان جذب سینامیک‌اسید با اسپکتروفتومتری در طول موج 290 نانومتر بر اساس روش اصلاح‌شدۀ Zucker (1965) تعیین شد. یک واحد (U) از فعالیت فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز به‌عنوان مقدار آنزیمی که یک نانومول سینامیک‌اسید در ساعت تولید می‌کند، تعریف شده است. محتوای فنولی کل به روش Velioglu et al. (1998) اندازه‌گیری شد. گالیک‌اسید برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد و نتایج به‌شکل میلی‌گرم گالیک‌اسید (GA) به‌ازای هر گرم وزن تازه تعریف شدند. محتوای فلاونوئید کل با استفاده از منحنی استاندارد کورستین اندازه‌گیری و بر اساس میزان معادل میلی‌گرم کوئرسیتین در گرم عصاره بیان شد.
.سنجش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی و متابولیت‌های آن: فعالیت سوپراکسیددیسموتاز (SOD, EC 1.15.1.1) بر اساس روش Giannopolitis & Ries (1977) بررسی و جذب عصارۀ آنزیمی در طول موج 560 نانومتر اندازه‌گیری شد. یک واحد سوپراکسیددیسموتاز به‌عنوان مقدار آنزیمی که 50 درصد مهار کاهش نیتروکلریدتترازولیوم در شرایط سنجش را ایجاد می‌کند، تعریف شد. فعالیت آسکوربات‌پراکسیداز (APX, EC 1.11.1.11) با پیروی از کاهش جذب در طول موج 290 نانومتر بر اساس روش Boominathan & Doran (2002) تعیین شد. به‌منظور تعیین کاتالاز (CAT, EC 1.11.1.6)، عصارۀ آنزیمی با 50 میلی‌مولار بافر فسفات (pH=7) همگن و به روش اسپکتروفتومتری با دنبال‌کردن تجزیۀ پراکسیدهیدروژن در طول موج 240 نانومتر طبق روش Simon et al. (1974) سنجش شد.
تعیین محتوای روی: محلول هضم‌شدۀ گیاهی در آب مقطر رقیق و محتوای روی با طیف‌سنجی انتشار پلاسما- اتمی القایی جفت‌شده ICP-AES, INTEGRA XL2, GBC)، استرالیا( برآورد شد.
تجزیهوتحلیل HPLC: تجزیهوتحلیل HPLC با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (Agilent 1290 Santa Clara, CA, HPLC، آمریکا) با آشکارساز آرایه دایود (DAD) مطابق Sinrod et al. (2019) انجام شد.
تجزیهوتحلیل آماری: آزمایش‌ها در قالب طرح بلوک‌های کامل تصادفی با 3 تکرار انجام شدند. تجزیهوتحلیل آماری با استفاده از Sigma Stat 3.5 با آزمون Tukeyانجام شد (P<0.05).
نتایج و بحث.
.تعیین غلظت‌های مؤثر نیتریک‌اکسید، سالیسیلیک‌اسید و نانوذرات اکسیدروی: مطالعۀ حاضر نشان داد جوانه‌زنی بذر و رشد گیاهچه در پیشتیمار نیتریک‌اکسید و سالیسیلیک‌اسید با غلظت 1/0 میلی‌مولار، افزایش معناداری دارد (شکل 1). در غلظت 1000 میلی‌گرم‌در‌لیتر نانوذرات اکسیدروی، درصد جوانه‌زنی در مقایسه با شاهد به نصف کاهش یافت و به‌عنوان غلظت نیمه‌کشندۀ نانوذرات برای آزمایش‌های بیشتر انتخاب شد (شکل 2) (داده‌ها نشان داده نشده‌اند)(Zhang et al., 2008).
.تجمع نانوذرات اکسیدروی و یون‌های روی و تأثیر آن بر شاخص‌های رشد: مقدار وزن تر و خشک اندام‌های هوایی تحت‌تأثیر نانوذرات اکسیدروی کاهش معناداری در مقایسه با شاهد نشان داد (شکل 3) که با یافته‌های Mahajan et al. (2011) مطابقت داشت؛ آنها نشان دادند رشد و تکامل در گیاهان Vigna radiate و Cicer arietinum (نخود) پس از تیمار با نانوذرات اکسیدروی کاهش می‌یابد. Zoufan et al. (2020) نشان دادند نانوذرات اکسیدروی رشد گیاه را کاهش می‌دهند. رشد اندام‌های هوایی تحت‌تأثیر نانوذرات اکسیدروی کاهش معناداری نشان داد که می‌تواند با افزایش تجمع روی در ریشه و اندام هوایی دانه‌رست‌های تیمارشده با نانوذرات اکسیدروی ارتباط داشته باشد؛ باوجوداین، پیشتیمار سالیسیلیک‌اسید با غلظت‌های مختلف اثر سمیت نانوذرات اکسیدروی کاهش داد (شکل 3).
شکل 1- تأثیر نیتریک‌اکسید و سالیسیلیک‌اسید بر جوانه‌زنی بذر گیاه فلومیس. بذرها به‌مدت 12 ساعت در غلظت‌های مختلف نیتریک‌اکسید (05/0، 1/0، 5/0، 1، 5 و 10 میلی‌مولار) و سالیسیلیک‌اسید (05/0، 1/0، 5/0، 1، 5 و 10 میلی‌مولار) خیسانده شدند.
Figure 1- Effect of NO and SA on the germination Phlomis tuberosa of seeds. Seeds were exposed to 0, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 and 10 mM SNP or SA for 12 h.
شکل 2- تأثیر نانوذرات اکسیدروی بر جوانه‌زنی بذر گیاه فلومیس. بذرها به‌مدت 48 ساعت در غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسیدروی (5، 50، 100، 1000 و 2000 میلی گرم‌بر‌لیتر) خیسانده شدند.
Figure 2- Effect of ZnONPs on the germination of Phlomis tuberosa seeds. Seeds were exposed to 0, 5, 50, 100, 1000 and 2000 ppm ZnONPs for 48 h.
|
|
|
|
|
|
شکل 3- تأثیر پیشتیمار سالیسیلیک‌اسید و نیتریک‌اکسید بر (A وزن تر اندام‌های هوایی، (B وزن خشک اندام‌های هوایی، (C وزن تر ریشه، (D وزن خشک ریشۀ گیاه فلومیس در معرض تنش نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) هستند. حروف یکسان، وجودنداشتن اختلاف معنادار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P< با استفاده از آزمون توکی را نشان می‌دهند.
Figure 3- Effect of SA and NO addition on the shoot and root fresh and dry weight of Phlomis tuberosa under ZnONPs or ZnSO4-stressed conditions. Bars indicated with the same letter are not significantly different (p<0.05, Tukey test). Values are the mean ± SD (n=3)
مقدار وزن خشک و تر ریشه تحت‌تأثیر سولفات‌روی در گیاهان پیشتیمارشده با سالیسیلیک‌اسید و نیتریک‌اکسید افزایش معناداری نشان داد. تیمار سالیسیلیک‌اسید در گیاهان، سیستم آنتی‌اکسیدانی را تنظیم می‌کند، رشد و عملکرد گیاه را بهبود می‌بخشد و سبب کاهش آسیب اکسیداتیو در شرایط تنش فلزات سنگین می‌شود (Hasanuzzaman et al., 2020). در تیمار نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی، مقدار روی در اندام هوایی و ریشه‌ها افزایش معناداری داشت و این افزایش در تیمار نانوذرات اکسیدروی بیشتر بود (جدول 1). مطالعه‌های Landa et al. (2015) نشان دادند نانوذرات اکسیدروی در گیاهان احتمالاً به‌جای باقی‌ماندن در شکل نانوذرات به یون روی تبدیل می‌شوند. مطالعۀ حاضر نشان داد کاربرد سالیسیلیک‌اسید در گیاهان فلومیس در معرض تنش نانوذرات اکسیدروی نسبت به ترکیب سالیسیلیک‌اسید و نیتریک‌اکسید مؤثرتر است. گیاهان پیشتیمارشده با سالیسیلیک‌اسید در رویارویی با تنش نانوذرات اکسیدروی، رشد بهتری را نشان دادند (جدول 1).
جدول 1- تأثیر پیشتیمار سالیسیلیک‌اسید و نیتریک‌اکسید بر مقدار روی (میکروگرم‌برگرم) در گیاه فلومیس در معرض تنش نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) هستند. حروف یکسان، وجودنداشتن اختلاف معنادار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P< با استفاده از آزمون توکی را نشان می‌دهند.
Table 1- Effect of SA and NO addition on the Ag concentration (µg g-1) within Phlomis tuberosa under ZnONPs or ZnSO4-stressed conditions. Data of each row within each parameter indicated by the same letter are not significantly different (P<0.05, Tukey test). Values are the mean ± SD (n=3).
|
Treatment |
Shoot Zn+2 concentration |
Root Zn+2 concentration |
|
Control |
0.2± 0.02d |
0.97± 0.08e |
|
ZnONPs |
5.4± 0.25a |
9.7± 0.5b |
|
ZnONPs+SA+NO |
3.83± 0.3b |
15.3± 1.4a |
|
ZnSO4 |
4.8± 0.5a |
4.5± 0.3d |
|
ZnSO4+SA+NO |
2. 2± 0.16c |
6.8± 0.63c |
تأثیر نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی بر رنگیزه‌های فتوسنتزی: مقدار کلروفیل به‌عنوان شاخص درخور توجه در زمینۀ آلودگی و سمیت فلزات سنگین در گیاهان طبقه‌بندی شده است (Mazaheri Tirani et al., 2018). بر اساس نتایج، نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی سبب کاهش معنادار مقدار کلروفیل a وb در فلومیس شدند (شکل 4). نتایج مشابه Ruiz-Torres et al. (2021) با نتایج حاضر نشان دادند با اِعمال سولفات‌روی، مقدار کلروفیل در Coriandrum sativum کاهش می‌یابد. مقدار کلروفیل برگ خردل (Brassica juncea L.) تحت‌تأثیر تنش نانوذرات اکسیدروی کاهش می‌یابد و این کاهش به‌طور مثبت با افزایش غلظت نانوذرات اکسیدروی مرتبط است (Bhat et al., 2021). در فلومیس توبروزا، افزودن روی سبب افزایش گونه‌های فعال اکسیژن و کاهش رنگدانه‌های فتوسنتزی شد و احتمالاً پدیدۀ یادشده به این دلیل رخ داده است که کلروپلاست‌ها محلی ترجیحی برای تشکیل گونه‌های فعال اکسیژن هستند و نانوذرات اکسیدروی می‌توانند سبب آسیب شدید به غشاهای تیلاکوئید گیاه فلومیس شوند (Du et al., 2017). پیشتیمار سالیسیلیک‌اسید و ترکیب سالیسیلیک‌اسید و نیتریک‌اکسید، مقدار کلروفیل a و b برگ‌ها تحت‌تأثیر نانوذرات اکسیدروی را بهبود بخشید (شکل 4). مطابق با نتایج یادشده، Arshad et al. (2017) نشان دادند کاربرد سالیسیلیک‌اسید با افزایش فعالیت آنتی‌اکسیدانی در گیاهان، مقدار کلروفیل a وb را در گیاه جو در معرض تنش سرب افزایش می‌دهد.
|
|
|
|
|
|
شکل 4- تأثیر پیشتیمار سالیسیلیک‌اسید و نیتریک‌اکسید بر مقدار (A کلروفیل a، (B کلروفیل b، (C نسبت کلروفیل b به a برگ‌های گیاه فلومیس در معرض تنش نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) هستند. حروف یکسان، وجودنداشتن اختلاف معنادار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P< با استفاده از آزمون توکی را نشان می‌دهند.
Figure 4- Effect of SA and NO addition on the chlorophyll a and b content Phlomis tuberosa leaves under ZnONPs or ZnSO4-stressed conditions. Bars indicated with the same letter are not significantly different (p<0.05, Tukey test). Values are the mean ± SD (n=3)
.تأثیر نانوذرات اکسیدروی و یون‌های روی بر مقدار مواد محلول سازگار: نتایج نشان دادند مقدار پرولین برگ‌ها تحت‌تأثیر نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی افزایش معناداری دارد (شکل 5).
|
|
|
|
|
|
شکل 5- تأثیر پیشتیمار سالیسیلیک‌اسید و نیتریک‌اکسید بر (A مقدار پرولین، (B قندهای محلول و (C نشاسته برگ‌های گیاه فلومیس در معرض تنش نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) هستند. حروف یکسان، وجودنداشتن اختلاف معنادار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P< با استفاده از آزمون توکی را نشان می‌دهند.
Figure5- Effect of SA and NO addition on the soluble sugars (mg g-1 FW), starch (mg g-1 FW) and proline (µgg-1 DW) content in Phlomis tuberosa leaves under ZnONPs or ZnSO4-stressed conditions. Bars indicated with the same letter are not significantly different (p<0.05, Tukey test). Values are the mean ± SD (n=3)
بسیاری از گیاهان، زمانی که در معرض تنش شوری قرار می‌گیرند، پرولین را به‌عنوان جاروکنندۀ گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و تنظیم‌کنندۀ اسمزی تجمیع می‌دهند (Chun et al., 2018). در مطالعۀ حاضر مشاهده شد پیشتیمار سالیسیلیک‌اسید سبب افزایش مقدار پرولین در تیمار سولفات‌روی می‌شود. Faraz et al. (2020) نتایجی مشابه با نتایج یادشده را گزارش کردند؛ آنها نشان دادند سالیسیلیک‌اسید در افزایش سطح پرولین طی تنش فلزات سنگین نقش دارد. قندها، کربوهیدرات‌های محلول در آبی هستند که در تحمل گیاهان نسبت به تنش نقش دارند (Keunen et al., 2013). در یافته‌های حاضر، تیمار سولفات‌روی سبب افزایش معنادار قندهای محلول در برگ‌های فلومیس شد (شکل 5). قندهای محلول به‌عنوان ترکیبات سازگار، تحمل گیاه در شرایط نامساعد محیطی را افزایش می‌دهند (Estaji & Niknam, 2020). در مطالعۀ حاضر، احتمالاً افزایش معنادار مقدار پرولین تحت‌تأثیر نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی می‌تواند به تحمل تنش در گیاه فلومیس کمک کند.
.تأثیر نانوذرات اکسیدروی و یون‌های روی در فعالیت آنتی‌اکسیدانی، مقدار فنول و فلاونوئید: در مطالعۀ حاضر، مقدار فلاونوئید برگ‌ها تحت‌تأثیر نانوذرات اکسیدروی و مقدار فنول برگ‌ها تحت‌تأثیر سولفات‌روی بیشترین افزایش معنادار را نشان دادند (شکل 6). در پژوهش حاضر، تیمار سولفات‌روی به‌تنهایی مقدار فنول را در گیاه فلومیس افزایش داد که با پژوهش Michalak (2010) مطابقت دارد و می‌توان نتیجه گرفت این ترکیبات، فلزات سنگین را کلات می‌کنند و آثار مخرب آنها در سلول را کاهش می‌دهند. در مطالعۀ حاضر، افزایش مقدار ترکیبات فنولی و فلاونوئیدها سبب کاهش تنش اکسیداتیو شد (Kaur et al., 2017; Kohli et al., 2018) افزایش فنول‌ها (سیناپیل‌الکل، کلروژنیک‌اسید،آسکوربیک‌اسید و سینامیک‌اسید) (جدول 2) و فلاونوئیدها و افزایش هم‌زمان ظرفیت آنتی‌اکسیدانی در گیاه فلومیس پیشتیمارشده با سالیسیلیک‌اسید تحت‌تأثیر نانوذرات اکسیدروی بر نقش ترکیبات فنولی به‌عنوان متابولیت‌های آنتی‌اکسیدانی تأکید می‌کند (Osama et al., 2019; Abbasi et al., 2020). افزودن نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی، تولید گونه‌های فعال اکسیژن در گیاه فلومیس را افزایش داد و فعالیت‌های آنزیمی تحت‌تأثیر روی قرار گرفتند؛ هرچند آثار بسته به آنزیم متفاوت بودند. فعالیت آنزیم کاتالاز برگ‌های تحت‌تأثیر سولفات‌روی کاهش معناداری نشان داد (شکل 7). نتایج یادشده با نتایج Panda et al. (2017) مطابقت دارند؛ آنها نشان دادند نانوذرات اکسیدروی فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی را کاهش می‌دهند و آنزیم کاتالاز را غیرفعال می‌کنند. فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز برگ‌ها تحت‌تأثیر نانوذرات اکسیدروی افزایش معناداری نشان داد (شکل 7). مطابق با یافته‌های یادشده، Mostofa et al. (2015) نشان دادند در برنج (Oryza sativa L.) تحت‌تأثیر نانوذرات اکسیدروی، فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز افزایش می‌یابد. فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی به دلیل واکنش مثبت گیاهان برای از‌بین‌بردن رادیکال‌های آزاد افزایش می‌یابد؛ هرچند هنگامی که رادیکال‌های آزاد ناشی از این سمیت مهارپذیر نباشند، سازوکار‌های دفاع آنتی‌اکسیدانی مختل می‌شوند (Bhaduri and Fulekar, 2012). حقایق یادشده توضیح می‌دهند چرا نانوذرات اکسیدروی سبب مهار فعالیت آنزیم کاتالاز و افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز در برگ فلومیس می‌شوند. در مطالعۀ حاضر، فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز برگ‌ها تحت‌تأثیر نانوذرات اکسیدروی افزایش معناداری نشان داد (شکل 7)؛ به‌طور مشابه، پراکسیداسیون لیپیدی پنبه همراه با افزایش فعالیت آنزیم آنتی‌اکسیدانی (فعالیت سوپراکسیددیسموتاز) کاهش یافت (Venkatachalam et al., 2017).
|
|
|
|
|
|
شکل 6- تأثیر پیشتیمار سالیسیلیک‌اسید و نیتریک‌اکسید بر مقدار (A فنول، (B فلاونوئیدها، (C فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز برگ‌های فلومیس در معرض تنش نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) هستند. حروف یکسان، وجودنداشتن اختلاف معنادار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P< با استفاده از آزمون توکی را نشان می‌دهند.
Figure 6- Effect of SA and NO addition on the total phenol and flavonoids content, and the activity of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) in Phlomis tuberosa leaves under ZnONPs or ZnSO4-stressed conditions. Bars indicated with the same letter are not significantly different (p<0.05, Tukey test). Values are the mean ± SD (n=3)
جدول 2- تأثیر پیشتیمار سالیسیلیک‌اسید و نیتریک‌اکسید بر مقدار فنول (میلی‌گرم‌بر میلی‌لیتر) برگ‌های فلومیس در معرض تنش نانوذرات اکسیدروی. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) هستند. حروف یکسان، وجودنداشتن اختلاف معنادار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P< با استفاده از آزمون توکی را نشان می‌دهند.
Table 2- Effect of SA and NO addition on the content of phenolics (mg ml-1) in leaves of Phlomis tuberosa under ZnONPs or ZnSO4-stressed conditions. Data of each row within each parameter indicated by the same letter are not significantly different (p<0.05, Tukey test). Values are the mean ± SD (n=3)
|
Treatment |
Sinapyl alcohol |
Chlorogenic acid |
Ascorbic acid |
Cinnamic acid |
|
Control |
0.17±0.02 c |
0.001±0.00 c |
1.64±0.06 d |
0.024±0.00 e |
|
SA |
0.38±0.06 a |
0.022±0.003 b |
2.62±0.16ab |
0.033±0.002 de |
|
NO |
0.16±0.01 c |
0.023±0.004 b |
1.75±0.09 d |
0.023±0.003 e |
|
SA+NO |
0.17±0.04 c |
0.014±0.003 bc |
2.26±0.04 bc |
0.042±0.005 bcd |
|
ZnONPs |
0.11± 0.01cd |
0.023±0.007 b |
2.07 ±0.17 cd |
0.039±0.005 cd |
|
ZnONPs+SA |
0.29± 0.03b |
0.082±0.01 a |
3.05±0.24 a |
0.072±0.005 a |
|
ZnONPs+NO |
0.04±0.008 d |
0 |
2.92±0.25 a |
0.052±0.005b |
|
ZnONPs+SA+NO |
0.18±0.02 c |
0 |
1.67±0.15 d |
0.048±0.005 bc |
فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز برگ‌ها تحت‌تأثیر نانوذرات اکسیدروی در گیاهان پیشتیمارشده با سالیسیلیک‌اسید، افزایش معناداری نشان داد. Lu et al. (2018) نتایجی مشابه با نتایج یادشده گزارش کردند؛ آنها نشان دادند سالیسیلیک‌اسید فعالیت سوپراکسیددیسموتاز را افزایش و فعالیت آسکوربات‌پراکسیداز را کاهش می‌دهد. سالیسیلیک‌اسید به‌عنوان مولکول سیگنال به‌طور مستقیم یا غیرمستقیم فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی را تحت‌تأثیر قرار می‌دهد (Ghassemi-Golezani et al., 2020). به‌منظور درک بهتر سمیت سلولی نانوذرات، مقدار پراکسیدهیدروژن در برگ‌های فلومیس اندازه‌گیری شد و مقدار پراکسیدهیدروژن تحت‌تأثیر سولفات‌روی، افزایش معناداری نشان داد (شکل 8). مطالعه‌های پیشین نشان دادند غلظت پراکسیدهیدروژن در بافت‌های گیاهی به دلیل جذب فلزات سنگین افزایش می‌یابد (Perveen et al., 2020). Ruiz-Torres et al. (2021) نشان دادند جذب بیشتر روی از طریق ریشه و انتقال آن به اندام‌های هوایی در تیمار سولفات‌روی با غلظت زیاد سبب ایجاد تنش در گیاهان و تجمع بیشتر پراکسیدهیدروژن و پراکسیداسیون لیپیدی می‌شود. مقدار پراکسیدهیدروژن برگ‌های پیشتیمارشده با نیتریک‌اکسید در شرایط تنش سولفات‌روی کاهش یافت؛ مطابق با این نتایج، Wang et al. (2013) نشان دادند سالیسیلیک‌اسید و نیتریک‌اکسید پراکسیداسیون لیپیدی و تجمع پراکسیدهیدروژن در تنش فلزات سنگین را کاهش می‌دهند. در گیاهانی که در معرض نانوذرات اکسیدروی یا سولفات‌روی قرار گرفتند، سالیسیلیک‌اسید سبب افزایش مقدار پرولین و به موازات آن، کاهش مقدار پراکسیدهیدروژن در گیاه فلومیس شد. نتایج نشان دادند سالیسیلیک‌اسید در کاهش تنش اکسیداتیو تحت‌تأثیر نانوذرات اکسیدروی یا سولفات‌روی نقش دارد.
|
|
|
|
|
|
شکل 7- تأثیر پیشتیمار سالیسیلیک‌اسید و نیتریک‌اکسید بر (A کاتالاز (CAT)، (B آسکوربات‌پراکسیداز (APX)، (C فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز (SOD) برگ‌های گیاه فلومیس در معرض تنش نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) هستند. حروف یکسان، وجودنداشتن اختلاف معنادار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P< با استفاده از آزمون توکی را نشان می‌دهند.
Figure 7- Effect of SA and NO addition on the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX) in Phlomis tuberosa leaves under ZnONPs or ZnSO4-stressed conditions. Bars indicated with the same letter are not significantly different (p<0.05, Tukey test). Values are the mean ± SD (n=3)
شکل 8- تأثیر پیشتیمار سالیسیلیک‌اسید و نیتریک‌اکسید بر مقدار پراکسیدهیدروژن (H2O2) برگ‌های گیاه فلومیس در معرض تنش نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) هستند. حروف یکسان، وجودنداشتن اختلاف معنادار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P< با استفاده از آزمون توکی را نشان می‌دهند.
Figure8- Effect of SA and NO addition on the concentration of nitric oxide (NO), hydrogen peroxide (H2O2) in in Phlomis tuberosa leaves under ZnONPs or ZnSO4-stressed conditions. Bars indicated with the same letter are not significantly different (p<0.05, Tukey test). Values are the mean ± SD (n=3)
جمع‌بندی
در پژوهش حاضر، تأثیر پیشتیمار بذرها با سالیسیلیک‌اسید، نیتریک‌اکسید و ترکیب سالیسیلیک‌اسید و نیتریک‌اکسید در غلظت 1/0 میلی‌مولار بر شاخص‌های فیزیولوژی و بیوشیمیایی فلومیس تحت‌تأثیر نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی در غلظت 1000 میلی‌گرم‌در‌لیتر مطالعه شد و نتایج کلی زیر به دست آمدند: نانوذرات اکسیدروی و سولفات‌روی در غلظت 1000 میلی‌گرم‌در‌لیتر به دلیل افزایش مقدار روی، پراکسیداسیون لیپیدی، پراکسیدهیدروژن و تنش اکسیداتیو سبب کاهش معنادار رشد گیاه شدند. مقدار ترکیبات سیناپیل‌الکل،کلروژنیک‌اسید، آسکوربیک‌اسید و سینامیک‌اسید برگ‌های پیشتیمارشده با سالیسیلیک‌اسید تحت‌تأثیر نانوذرات اکسیدروی افزایش معناداری نشان دادند. بیشترین اثر پیشتیمار بذرها با سالیسیلیک‌اسید تحت‌تأثیر تنش روی با تجمع ترکیبات فنولی (سیناپیل‌الکل، کلروژنیک‌اسید، آسکوربیک‌اسید، سینامیک‌اسید) و فلاونوئید، فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی (سوپراکسیددیسموتاز) و افزایش پرولین به دست آمد. سالیسیلیک‌اسید ممکن است عملکرد مهمی در افزایش یکپارچگی غشاها با کنترل عملکرد سیستم آنتی‌اکسیدانی داشته باشد.
)