بررسی تنوع گونه ای گیاه آبزی Ceratophyllum L. در ایران با صفات ریخت‌شناسی و نشانگرهای مولکولی ISSR و SRAP

بهادری, حانیه; افشارزاده, سعید; عباسی, شبنم

doi:10.22108/ijpb.2023.139564.1339

بررسی تنوع گونه ای گیاه آبزی Ceratophyllum L. در ایران با صفات ریخت‌شناسی و نشانگرهای مولکولی ISSR و SRAP

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

¹ گروه زیست‌شناسی گیاهی و جانوری، دانشکدۀعلوم و فناوری‌های زیستی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران

² گروه آموزش زیست‌شناسی، دانشگاه فرهنگیان، صندوق پستی 889-14665، تهران، ایران

10.22108/ijpb.2023.139564.1339

چکیده

جنس Ceratophyllum L. یک گیاه آبزی غوطه‌ور از خانواده Ceratophyllaceae است که شش گونه آن در سراسر جهان شناخته شده است. تاکنون دو گونه C. demersum و C. submersum برای فلور ایران گزارش شده‌اند. باتوجه به اهمیت این گیاه از نظر زیست‌محیطی و اکولوژیکی، پژوهش های تاکسونومی و مولکولی آن برای آشنایی با تنوع گونه ای این جنس انجام شد. پس از شناسایی گونه ها با ارزیابی ویژگی‌های ریخت‌شناسی در افرادی از جمعیت‌های مختلف، از 7 آغازگرISSR و 3 جفت آغازگر SRAP برای تأیید هویت‌ها و بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت‌های متمایز استفاده شد. بررسی‌های مولکولی تعداد 5 گروه ژنتیکی را نشان داد که تنوع درون جمعیتی آنها (52%) از تنوع بین جمعیتی (48%) با P<0.05 زیادتر بود. علاوه بر این، داده‌ها نشان داده‌اند که جمعیت‌های این گیاه در ایران دارای خزانه ژنتیکی نسبتاً مشابهی است. بر این اساس می‌توان نتیجه گرفت که عوامل متعددی از جمله پیوستگی اکوسیستم‌های آبی به‌ویژه در شمال کشور و همچنین سازگاری بالای این گیاه غوطهور با زیستگاه‌های آبی می‌توانند در ایجاد چنین شرایطی مؤثر باشد. خشکسالی‌های اخیر در کشور سبب افزایش تولید مثل جنسی این گیاه شده و در نتیجه تنوع گونه ای درون جمعیت‌ها افزایش یافته است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

سیستماتیک گیاهی

عنوان مقاله [English]

Investigating Specific Diversity of Aquatic Plant Ceratophyllum L. in Iran Using Morphological Characters and ISSR and SRAP Molecular Markers

نویسندگان [English]

Hanieh Bahadori ¹
Saeed Afsharzadeh ¹
Shabnam Abbasi ²

¹ Department of Plant and Animal Biology, Faculty of Biological Scienceand Technology, University of Isfahan, Isfahan, Iran

² Department of Biology Education, Farhangian University, P.O. Box 14665-889, Tehran, Iran

چکیده [English]

The genus Ceratophyllum L. is a submerged aquatic plant of the Ceratophyllaceae family, with six species recognized worldwide. So far, two species, C. demersum and C. submersum, have been reported for the flora of Iran. Considering the importance of this plant from an environmental and ecological point of view, its taxonomic and molecular studies have been carried out in this study to investigate the species diversity of this genus. Following the identification of species by assessing morphological features in individuals from different populations, 7 ISSR primers and 3 pairs of SRAP primers were used to confirm the identifications and study the genetic diversity of distinct populations. Molecular investigations showed the number of 5 genetic groups, whose intra-population diversity (52%) was higher than inter-population diversity (48%) with P<0.05. Furthermore, the data revealed that the populations of this plant in Iran have relatively the same genetic pool. Based on this, it can be concluded that several elements, including the connectedness of aquatic ecosystems, particularly in the north of the country, as well as the high adaptability of this submerged plant with aquatic habitats, can be effective in producing such conditions. Recent droughts have increased the sexual reproduction of this plant, and as a result, the species diversity within the populations has increased.

Introduction
Aquatic plants (macrophytes) are important components of freshwater ecosystems that affect the functioning and diverse services of the ecosystem. Aquatic plants grow along the edge of the lake and are both a protective and nourishing component of the ecosystem for healthy lakes. Ceratophyllum has about 2 to 30 species that have global distribution. The determination of genetic relationships of plant materials is important in terms of choosing the right parental combination for producing suitable populations, designing effective breeding programs, responding to long-term selection and reducing genetic vulnerability. The study of genetic relationships is a prerequisite for the improvement of agricultural plants and also a prerequisite for the preservation of genetic resources. Considering that in the Ceratophyllum, the separation of species is done by intermediate morphological characteristics, the study of the genetic diversity of different populations of this species in Iran using molecular markers seems necessary. In addition, considering the recent droughts in the country and the destruction of many aquatic habitats, the study of this aquatic plant can provide useful knowledge for the protection of the country's environment. Therefore, in this study, some of the important morphological traits of the samples, the relationships of the species of this genus, as well as their genetic diversity were investigated using molecular markers.

Materials and Methods
In this study, 50 individuals and 29 populations of two species, C. submersum and C. demersum, were examined. The modified CTAB method was used to extract DNA from 50 individuals from 29 studied aquatic plant populations. Seven ISSR primers and three SRAP primer pairs were selected. For data analysis and statistical analysis of populations, individuals were scored based on the presence of band (1) and the absence of band (0). Using NTSYSpc software and the Jaccard and Nei similarity coefficient, cluster analysis was performed and two dendrograms were obtained. GenAlex software was used for principal component analysis and STRUCTURE software was used to examine the genetic structure of populations.

Results and Discussion
The morphological studies of this plant showed an herbaceous perennial state. The stem of this plant has multiple nodes and internodes, and the stem mostly branches in the upper 1/3. In the C. demersum species, they have 1 or 2 divisions and in the C. submersum species, they have 3 or 4 dichotomy divisions. The shape of the leaves is thin, long, pointed, and fork-like, which are stringy or linear. In both dendrograms, the samples from the north of the country and the central region of the country (Isfahan) are almost separated, but a kind of genetic connection can be seen between the samples from the north of the country and the center of the country. Through humans and also through water birds, they show a kind of genetic connection. Regarding the C. demersum and C. submersum species that exist in Iran, it seems that the C. demersum species has a wider genetic treasure in the aquatic habitats of the country and the species C. submersum has been found only in a region in the north of the country (Izbaran, Amirkalaye, and Bandar Anzali) in our sampling. Therefore, it seems that C. demersum is ecologically more compatible with various environmental factors and the C. submersum species exists only in limited ecological water niches in the country due to the lack of suitable living conditions. The results of the principal component analysis were in agreement with the cluster analysis and showed some kind of connection and continuity between populations. The results of AMOVA showed 52% genetic diversity within populations and 48% genetic diversity between populations. The results of the Mantel test indicated that there is no relationship between the genetic distance and the geographical distance (R= 0.019 and P = 0.320), which is due to the fact that in the principal component analysis, we saw the lack of separation of the populations. The molecular analysis of Cerarophyllum intraspecies relationships through STRUCTURE analysis showed 5 genetic groups and demonstrated the relationship between individuals of different populations, whose gene pool was relatively similar.

Conclusion
According to analyses done, it can be said that the gene pool of Ceratophyllum population in Iran is somewhat distorted and there is a relationship and genetic similarity between different populations and only some populations in the north of the country are more uniform. As was stated, various factors can be effective in creating such conditions. A high intra-population genetic diversity has been shown in the populations of this study.

کلیدواژه‌ها [English]

Ceratophyllum L
Specific Diversity
Morphology
Molecular Markers

اصل مقاله

مقدمه.

تاکسونومی گیاهی به عنوان علم شناسایی، نام‌گذاری و طبقه‌بندی گیاهان شناخته شده است. از آنجایی که شناسایی و نام‌گذاری شرط مهم در طبقه‌بندی است، تاکسونومی به عنوان علم طبقه بندی شامل پایه‌ها، اصول، قوانین و روش کار است (Wilkins, 2009). گیاهان آبزی (ماکروفیت‌ها) اجزای مهم اکوسیستم‌های آب شیرین هستند که بر عملکرد و خدمات متنوع اکوسیستم اثر می‌گذارند. گیاهان آبزی در امتداد لبه دریاچه رشد می‌کنند و به عنوان یک جزء محافظ و هم به عنوان جزء تغذیه کننده اکوسیستم برای دریاچه‌های سالم هستند. جامعه گیاهان آبزی یک زیستگاه و مهد حیاتی برای ماهیها، منبع اکسیژن برای همه موجودات، پناهگاهی برای طعمه‌ها و همچنین منطقه‌ای برای جستجوی شکارچیان، حائلی در برابر فرسایش و تعلیق رسوب از امواج و ورودیهای ساحلی است و می‌تواند به طور قابل توجهی به بهره وری اولیه دریاچه کمک کند (Carr et al., 1997). خانواده Ceratophyllaceae که به نام شاخ علفی یا چنگال آبی معروف است دارای یک جنس به نام Ceratophyllum است (APGIV, 2016) . این جنس دارای 2 تا 30 گونه است که پراکنش جهانی دارند. از این گیاه در ایران گونه‌های Ceratophyllum demersum L. و Ceratophyllum submersum L. در مرداب انزلی و برخی دیگر از آبگیرهای شمالی و جنوبی کشور به وفور یافت می‌شود (Ghasemi et al., 2016). گیاه آبزی چند ساله که به طور گسترده در زیستگاه‌های آب شیرین سراسر جهان توزیع شده‌اند. در پائیز این گیاهان در آب غوطه ور می شوند تا از خود در برابر دمای پائین محافظت کنند، حدود 3 متر و دارای ساقه تانن‌دار، دارای یک رشته آوندی منفرد با مجرای هوایی مرکزی که توسط سلول‌های کشیده حاوی نشاسته احاطه شده است؛ برگ‌ها چرخه‌ای، ساده، غالباً دوشاخه و منقسم و رشته ای، کامل تا دندانه اره‌ای فاقد روزنه و گوشواره هستند. گل‌آذین متشکل از گل‌های منفرد جانبی، گل‌ها تک جنس، شعاعی، با یک چرخه 7 تا تعداد زیادی برگه (احتمالاً تپال‌ها). پرچم‌ها ۱۰ عدد تا تعداد زیاد، جدا، میله‌ها به طور آشکار از بساک متمایز نیستند. دانه گرده فاقد شیار، با اگزین تحلیل رفته و لوله گرده منشعب و برچه 1 عدد و تخمدان فوقانی است، کلاله دراز و به یک سمت خامه پهن شده است. میوه فندقه و در بعضی گونه‌ها دارای خار است. گل‌های نر سفید رنگ و گلهای ماده به رنگ سبز است (Dinarvand et al., 2022). بر اساس پژوهش‌های صورت گرفته در ایران روی جنس Ceratophyllum به نظر می‌رسد خصوصیات ریخت‌شناسی به ویژه در ساقه با توجه به حالات حد واسطی که مشاهده شده، تحت تأثیر محیط می‌باشد و برای تفکیک دو گونه باید متکی به بررسی و مشاهده خصوصیات صفات مولکولی بود. تاکنون پژوهش‌های پراکنده‌ای بر روی این جنس انجام شده است. Ghasemi et al. (2016) با استفاده از نشانگر مولکولی SRAP نشان دادند تنوع بین جمعیت‌ها به دلیل جریان ژنی (بر اثر مهاجرت پرندگان یا تکثیر به روش غیر جنسی) کم است و تنوع درون جمعیتی بیشتر از بین جمعیتی است و این نشانگر توانسته گونه‌های این جنس را از هم تفکیک کند. در پژوهش دیگری مشخص شد Ceratophyllum demersum توانایی زیادی برای جذب و تخریب زیستی در حذف رنگ دارد (Eftekhari et al., 2020). همچنین نتایج به دست آمده از پژوهش دیگری بیانگر قابلیت بالای سراتوفیلوم اصلاح شده با ترکیبات دیگر، به عنوان یک جاذب زیستی مطلوب برای حذف کادمیوم از محیط آبی است (Szalontai et al., 2018). در بررسی دیگری که با عنوان بیوسنتز نانو ذرات نقره زیست فعال از گیاه آبزی انجام شده (Aghajani, 2016)، یک روش تولید نانو ذرات، استفاده از روشهای بیولوژیک است که به تازگی استفاده از عصاره گیاهان برای تهیه ذرات فلزی مطرح شده است. نتایج حاصل از تشکیل نانو ذرات نقره بیوسنتزی از عصاره آبی گیاه C. demdrsum حکایت دارد، با وجود این با تغییر رنگ واضح و انجام طیفگیریهای متعدد نتایج بر سنتز نانو ذرات نقره تأکید داشتند. تست سمیّت سلولی نشان داد که با افزایش زمان مجاورت نانو ذرات بیوسنتزی و نیز افزایش غلظت نانو ذرات شاهد افزایش میزان اثرگذاری بر سل‌لاین های مختلف بودند. در بررسی دیگری که بر روی قابلیت تصفیه Ceratophyllum demersum جمع آوری شده از رودخانه سیاه درویشان در سیستم مداربسته با فیلتر مصنوعی انجام شد (Asadi & Imanpour, 2014)، شاخص‌های رشد و بقا برای موجودات آن محیط، هنگام استفاده از فیلتر زیستی به همراه گیاه سراتوفیلوم عملکرد خوبی را نسبت به سایر تیمارها نشان داد و از این ترکیب می‌توان به‌عنوان تصفیه‌کننده زیستی استفاده کرد.

وجود تنوع ژنتیکی و تعیین روابط ژنتیکی مواد گیاهی از نظر انتخاب ترکیب والدینی مناسب برای تولید جمعیت های مناسب، طراحی برنامه های اصلاحی موثر، پاسخ به گزینش طولانی مدت و کاهش آسیبپذیری ژنتیکی حائز اهمیت می‌باشد (Troyer et al., 1998). بررسی روابط ژنتیکی، پیش نیازی برای اصلاح گیاهان زراعی و همچنین پیش نیازی برای حفظ و نگهداری منابع ژنتیکی است. تفاوت بین افراد ناشی از تفاوت در توالی DNAکروموزوم های آنها است. از این تفاوتها میتوان به عنوان یک نشانه یا نشانگر ژنتیکی استفاده کرد (Moshtaghi et al., 2013).

در میان تکنیک‌های انگشت نگاری DNA، نشانگر ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) به وسیله واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در حضور یک آغازگر مکمل با توالی موتیف ریز ماهوارهها در ژنوم تکثیر می‌شود. این نشانگر قابلیت تکثیر بین جایگاه‌های ریز ماهواره را داشته و به اطلاعات قبلی از ژنوم مورد نظر نیاز ندارد. این یک روش سریع، کم هزینه و مطمئن برای ارزیابی تنوع ژنتیکی و نشان دادن روابط خویشاوندی می‌باشد (Wang et al., 2008).

نشانگرSRAP قابلیت تشخیص میزان بالایی از پلی مورفیسم را بین گونه‌ها دارد (Robarts & Wolfe, 2014). در تکنیک استفاده از این نشانگر توالی کددهنده ژنوم توسط دو آغازگر توسعه دهنده با توالی دلخواه که طول آنها 17 تا 21 نوکلئوتید باشد، مورد هدف قرار می‌گیرند که به خصوص برای تقویت و توسعه ORFها (Open Reading Frame) به کار می‌رود. در مولکول‌های ژنتیکی، ORF ها بخشی از قالب خوانش هستند که قابلیت ترجمه شدن را دارند. برای 5 چرخه اول PCR دمای اتصال 35 درجه و برای 35 چرخه بعدی دما روی 50 درجه تنظیم می‌شود (Agarwal et al., 2008).

در ایران پژوهش‌های مختلفی در ارتباط با بررسی تنوع گونه ای گیاهان با نشانگرهای ریخت‌شناسی و نشانگر مولکولی انجام شده است.et Mofid Bojnoordi et al. (2022) در بررسی تنوعات ریخت‌شناسی و مولکولی Lactuca undulata Ledeb. با استفاده از صفات ریخت شناسی و نشانگر مولکولی ISSR، تنوع ریخت شناسی بالایی را گزارش نمودند و در مطالعه آنها تنوع ژنتیکی درون جمعیتی بیشتر از تنوع ژنتیکی بین جمعیتی بود. Atapour et al. (2022) در بررسی تنوع ژنتیکی Prunus avium L. بر اساس صفات ریخت شناسی جمعیت های این گونه را به دو گروه تقسیم کردند، ولی با استفاده از آنالیزهای حاصل از نشانگر مولکولی SCoT، جمعیت های این گونه را به 8 گروه تفکیک کردند. Khodadoost et al. (2017) در بررسی تنوع ژنتیکی Malus Orientalis Uglitz. تنوع ژنتیکی درون جمعیتی قابل ملاحظه ای را گزارش نمودند. Zare Rashnoodi et al. (2017) خویشاوندی ژنتیکی زیادی را در بین ژنوتیپ های گردو در غرب ایران با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD، گزارش کردند. Latifi et al. (2018) در بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت‌های Cordia myxa L. تنوع ژنتیکی درون جمعیتی بالاتری را نشان دادند.

با توجه به اینکه در گیاه Ceratophyllum، تفکیک گونه‌‌ها و تشخیص آنها توسط ویژگی‌های ظاهری حد واسط و نزدیک به هم صورت می‌گیرد، مطالعه تنوع ژنتیکی جمعیت‌های مختلف این گونه در ایران با استفاده از نشانگرهای مولکولی ضروری به نظر می‌رسد. همچنین با توجه به خشکسالی‌های اخیر در کشور و تخریب بسیاری از زیستگاه‌های آبی، مطالعه این گیاه آبزی می‌تواند در این زمینه دانش مفیدی را برای حفاظت محیط زیست کشور ارائه نماید. بنابراین در این مطالعه بعضی از صفات مهم ریخت‌شناسی نمونه‌ها، روابط گونه‌های این جنس و همچنین تنوع ژنتیکی آنها با استفاده از نشانگرهای مولکولی بررسی شده است.

مواد و روش‌ها

در پژوهش حاضر، تعداد50 پایه و 29 جمعیت از دو گونه C. submersum و C. demersum از نمونه‌های موجود در هرباریوم دانشگاه اصفهان (HUI) و نمونه های گیاهی که از تالاب‌ها و رودخانه‌های مختلف جمع‌آوری شد (جدول 1)، مورد بررسی قرار گرفت. صفات ظاهری نمونهها با استفاده از دستگاه استریومیکروسکوپ و کاغذ میلی‌متری مورد بررسی قرار گرفت. سپس استخراج DNA ژنومی از 50 پایه از 29 جمعیت گیاه آبزی مورد مطالعه، از روش تغییریافته CTAB (Cetyltrimethylamonium bromide) استفاده شد (Abbasi & Afsharzadeh, 2016).

جدول 1- مشخصات نمونه‌های مورد مطالعه

Table 1- Characteristics of the studied samples

نام گونه	نام مخفف	محل	ارتفاع (m)	طول و عرض جغرافیایی	نوع اکوسیستم آبی	کدهرباریومی
C. demersum	cer38,cer39	اصفهان،اژیه	1480	N: 32º43'95.23'' E: 52º37'99.86''	رودخانه	25645
C. demersum	cer35, cer44	اصفهان، برسیان	1519	N: 32º52'66.40'' E: 52º03'77.58''	رودخانه	25649
C. demersum	cer50	اصفهان، چم حیدر	1780	N: 37º22'59.2'' E:50º59'36.7''	رودخانه	25655
C. demersum	cer6	اصفهان،حجت آباد	1902	N: 32º 30' 39.5'' E: 50º 50' 34.7''	رودخانه	25656
C. demersum	cer42	اصفهان، یزدآباد	1610	N: 32º66'33 E: 51º69'00	رودخانه	25667
C. demersum	cer37	اصفهان، زیار	1529	N: 32º50'85.23'' E: 51º93'85.17''	رودخانه	25668
C. demersum	cer32	اصفهان، باغ بهادران	1681	N: 32º 22' 54.8'' E: 51º 11' 31.2''	رودخانه	25647
C. demersum	cer36,cer40	اصفهان، چم آسمان	1750	N: 32º 22' 21.91'' E: 51º 13' 25.89''	سد	25643
C. demersum	cer12, cer13	آذربایجان غربی، کانی برازان	1000	N: 36º 58' 51.25'' E: 45º 47' 43.08''	تالاب	25657
C. demersum	cer41	تبریز، جاده اهر	1300	N: 38º81'33 E: 47º06'09	رودخانه	25664
C. demersum	cer4, cer25	جاده اصفهان شیراز	1958	N: 31º11'66.49'' E: 52º72'03.36''	رودخانه	25662
C. demersum	cer5	چهارمحال بختیاری، بروجن	2128	N: 31º 57' 35.8'' E: 51º 19' 37.7''	رودخانه	25650
C. demersum	cer2, cer4 3	چهارمحال بختیاری، چشمه برم	1635	N: 31º 34' 38.4'' E: 51º 12' 31.9''	رودخانه	25648
C. demersum	cer47,cer48,cer49	چهارمحال بختیاری، چغاخور	2320	N: 31º 55' 24.7'' E: 50º 55' 58.2''	تالاب	25651
C. demersum	cer1	چهارمحال بختیاری، گندمان	2254	N: 32º 22' 36.3'' E: 51º 31' 38.5''	تالاب	25653
C. demersum	cer3	خوزستان، آبادان به اهواز	500	N: 31º15'35.73'' E: 48º35'11.65''	رودخانه	25640
C. demersum	cer14	دلیجان	1674	N: 30º 06' 54.5'' E: 52º 55' 23.6''	رودخانه	25652
C. demersum	cer33,cer34	فارس، حسن آباد	1621	N: 29º 39' 23.1'' E: 53º 20' 12.4''	رودخانه	25654
C. demersum	cer16	کرمان، گلباف	1727	N: 29º 52' 42.1'' E: 57º 44' 12.5''	رودخانه	25658
C. submersum	cer23	گیلان، امیرکلایه	76	N: 37º 16' 38.8'' E: 50º 13' 19.9''	رودخانه	25641
C. submersum	cer17,cer18,cer20	گیلان،بندر انزلی	-26	N:37º28' E: 49º28'	رودخانه	25642
C. demersum	cer7,cer8,cer15,cer24	گیلان، سفیدرود	-2	N: 37º 22' 59.2'' E: 50º 10' 54.4''	رودخانه	25661
C. submersum	cer10,cer21	مازندران، ازباران	100	N: 36º 39' 03.5'' E: 52º 28' 37.1''	تالاب	25644
C. demersum	cer26,cer27	مازندران، بابل	-2	N: 36º34'10 E: 52º44'20	رودخانه	25646
C. demersum	cer19,cer22	مازندران، سیاه رود	62	N: 36º 18' 12.4'' E: 52º 53' 09.4''	رودخانه	25663
C. demersum	cer29,cer31	مازندران، تالاب نیلوفرآبی بابل	-2	N: 36º54'62.0 '' E: 52º72'6.	تالاب	25660
C. demersum	cer28, cer30,cer45,cer46	مازندران، تجن	1000	N: 36º 33' 52.9'' E: 53º 05' 12.2''	رودخانه	25665
C. demersum	cer9	مازندران، تنکابن	-20	N: 36º 47' 0.137'' E: 50º 54' 0.878''	رودخانه	25666
C. demersum	cer11	محمود آباد به سمت نور	-10	N: 36º 37.413' E: 52º 13.445'	رودخانه	25659

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای نشانگرهای ISSR و SRAP.

در ابتدا برای استفاده از نشانگر مولکولی ISSR (Blair et al., 1999)، در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، گرادیان دمایی برای 6 آغازگر انجام شد و پس از بررسی محصولات، تعداد 6 آغازگر به تنهایی و یک جفت آغازگر (808 ISSR و 811 ISSR) که در محصول PCR، باندهای واضح و قابل شمارشی را تولید کرده بودند، انتخاب شدند. برای استفاده از نشانگر SRAP، تعداد 3 آغازگر (Li et al., 2015) که باندهای واضحتری ایجاد کرده بودند، انتخاب شدند. توالی آغازگرهای استفاده شده به همراه دمای مناسب هرکدام و برنامه مورد استفاده برای PCR نشانگرها، در جدول 2 نشان داده شدند. برای هر دو نشانگر، هر میکروتیوب PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر تهیه شد و در جدول 3 مقدار مواد شرح داده شده است.

جدول 2- ویژگی‌های آغازگرهای ISSR و SRAP استفاده شده

Table 2- Characteristics of used ISSR and SRAP primers

طول قطعه تکثیر شده (جفت باز)	برنامه PCR	Tm	توالی آغازگر (‘3′ ® 5)	نام آغازگر
200-1500	4 min at 95°C, 40 cycles at (1 min at 95°C, 1 min at 59°C, 2 min at 72°C) and finally extension step 10 min at 72°C.	50°C	GAGAGAGAGAGAGAGAT	ISSR 810
180-1500		50°C	AGAGAGAGAGAGAGAGT	ISSR 807
200-1500		52°C	GAGAGAGAGAGAGAGAC	ISSR 811
200-3000		50°C	GAGAGAGAGAGAGAGAA	ISSR 812
400-1500		38°C	GATAGATAGATAGATA	ISSR 872
300-1500		52°C	AGAGAGAGAGAGAGAGC	ISSR 4
200-1500		52°C	AGAGAGAGAGAGAGAGC	ISSR 808
200-3000	5 min at 94°C, 5 cycles at (1 min at 94°C, 1 min at 35°C, 1 min at 72°C) and 35 cycles at (1 min at 94°C, 1 min at 50°C, 5 min at 72°C).	54°C 50°C	TGAGTCCAAACCGGATA GACTGCGTACGAATTTGA	Me 2 Em 4
100-1500		52°C 50°C	TGAGTCCAAACCGGAA GACTGCGTACGAATTTGA	Me 5 Em 4
100-1500		50°C 49.90°C	TGAGTCCAAACCGGACA GACTGCGTACGAATTTGC	Me 6 Em 2

جدول 3- مواد مورد نیاز برای انجام PCR

Table 3- Materials needed to perform PCR

غلظت	حجم	مواد
2 X	12.5 µl	Taq DNA Polymerase Master Mix red (Amplicon)
0.1 μM	0.5 µl	Primer forward
0.1 μM	0.5 µl	Primer reverse
50 ng/ml	1 µl	Template DNA
-	10.5 µl	آب مقطر دو بار تقطیر استریل

برای بررسی محصول PCR از ژل 2 درصد آگارز استفاده شد. برای مقایسه اندازه قطعات روی ژل از خط کش ژنی (Ladder) 100 جفت نوکلئوتیدی استفاده شد. برای انجام الکتروفورز، ولتاژ دستگاه 80 ولت و زمان 60 الی 90 دقیقه تعیین شد.

برای آنالیز داده‌ها وتحلیل آماری جمعیت‌ها، باند‌های ایجاد شده با نشانگر 100 جفت نوکلئوتیدی مقایسه و اندازه‌گیری شدند و افراد براساس حضور باند (1) و عدم حضور باند (0) نمره‌دهی شدند. با نرم‌افزار NTSYSpc (version 2.1; Rohlf, 1998) و ضریب تشابه Jaccard و Nei آنالیز خوشه‌ای انجام شد و دو دندروگرام به‌ دست آمد. از نرم‌افزار GenAlex (version 6.5, Peakall and Smouse, 2006) برای انجام آنالیز مؤلفه اصلی و به دست آوردن شاخصه‌های تنوع ژنتیکی و از نرم‌افزار STRUCTURE (Earl & VonHoldt, 2012) برای بررسی ساختار ژنتیکی جمعیت ها استفاده شد.

نتایج و بحثو

پژوهش‌های ریخت‌شناسی این گیاه به این شرح است که دارای وضعیت رویشی چند ساله علفی می‌باشد و ساقه این گیاهان دارای گره و میان‌گره متعدد می‌‌باشد و ساقه بیشتر در 3/1 فوقانی منشعب می‌شود. ارتفاع گیاه بین گونه‌ها متفاوت است که تحت تأثیر عواملی مانند سن گیاه و شرایط محیطی است و تقریباً 9 تا 50 سانتی‌متر است. در بررسی‌های انجام شده سطح ساقه صاف و بدون کرک است، سطح برگ هر دو گونه فاقد کرک و موم است. تقسیمات برگ بسته به نوع گونه دارای دو یا چند تقسیم دیکوتومی‌اند. در گونه C. demersum دارای 1 یا 2 بار تقسیم و در گونه submersum C. دارای 3 یا 4 بار تقسیم دیکوتومی‌اند. شکل برگ نازک، دراز، نوک تیز و چنگال مانند می‌باشد که به صورت رشته‌ای یا خطی هستند. در شکل های 1 و 2 تصویرهای این گیاه آورده شده است.

شکل 1- تصویر آرایش چرخه ای برگ ها و گره در ساقه

Figure 1- Picture of the cyclic arrangement of leaves and nodes in the stem

شکل 2- تصویر نمونه هرباریومی گیاه Ceratophyllum

Figure 2- Herbarium specimen image of Ceratophyllum

در پژوهش‌های انجام شده در این تحقیق در حوزه اکوسیستم‌های آبی ایران دو گونه برای جنسCeratophyllum یافت شد. گونه‌های این جنس شباهت‌های ریخت شناسی زیادی با برخی گونههای Myriophyllum L. دارند. همان طور که در کتاب فلور ایران آمده است دو گونه این گیاه شبیه به یکدیگر هستند با این تفاوت که گونه C. submersum دارای برگ‌های ظریف‌تر و اغلب با بیش از سه شاخه، در انتها اغلب با بیش از 4 بریدگی با دندانه‌های پراکنده و فندقه‌ها بدون زائده خاری است (Dinarvand et al., 2022). در این تحقیق از گیاهان موجود در هرباریوم و نیز تعدادی گیاه جمع آوری شده استفاده شد، اما همه نمونهها دارای میوه نبودند که بتوان از این صفت برای تشخیص گونهها استفاده کرد، البته در بررسی شکل و تعداد انشعاب برگ ها هم به دلیل ظریف بودن گیاه احتمال خطا وجود دارد. بنابراین تعداد انشعابات برگ صفتی با ارزش برای تفکیک گونه های Ceratophyllum می‌باشد.

برای پژوهش مولکولی و بررسی تنوع در گیاه Ceratophyllum از نشانگر مولکولی ISSR وSRAP برای 29 جمعیت مورد مطالعه که شامل 50 فرد هست، استفاده شد. درصد پلی مورفیسم برای تمامی آغازگرها، 100% بود.

جدول 8 اطلاعات مرتبط با شاخص‌های تنوع در جمعیت‌های مورد مطالعه را نشان می‌دهد. N بیانگر اندازه جمعیت، Na تعداد آلل‌های جمعیت، Ne تعداد آلل های موثر جمعیت، I شاخص تنوع شانون، He هتروزیگوسیتی مورد انتظار (شاخص نی) و P درصد پلی‌مورفیسم ژن‌های جمعیت‌های مورد مطالعه را نشان می دهد.

جدول 8- شاخص‌های تنوع ژنتیکی برای جمعیت‌های Ceratophyllum

Table 8- Genetic diversity indices for Ceratophyllum populations

%P	uHe	He	I	Ne	Na	N	نام مخفف	جمعیت
%28.42	0.157	0.118	0.172	1.201	0.705	2.000	cer10,cer21	ازباران
%30.53	0.169	0.126	0.185	1.216	0.695	2.000	cer38,cer39	اژیه
%0.00	0.000	0.000	0.000	1.000	0.305	1.000	cer6	اصفهان
%0.00	0.000	0.000	0.000	1.000	0.326	1.000	cer23	امیرکلایه
%0.00	0.000	0.000	0.000	1.000	0.284	1.000	cer3	آبادان
%17.89	0.099	0.074	0.108	1.127	0.547	2.000	cer26,cer27	بابل
%0.00	0.000	0.000	0.000	1.000	0.221	1.000	cer32	باغ بهادران
%36.84	0.203	0.153	0.223	1.261	0.821	2.000	cer35, cer44	برسیان
%0.00	0.000	0.000	0.000	1.000	0.232	1.000	cer5	بروجن
%38.95	0.169	0.141	0.211	1.233	0.895	3.000	cer17,cer18,cer20	بندر انزلی
%15.79	0.087	0.065	0.095	1.112	0.442	2.000	cer29,cer31	تالاب نیلوفرآبی
%0.00	0.000	0.000	0.000	1.000	0.326	1.000	cer41	تبریز
%46.32	0.183	0.160	0.242	1.271	1.000	4.000	cer28, cer30,cer45,cer46	تجن
%0.00	0.000	0.000	0.000	1.000	0.305	1.000	cer9	تنکابن
%30.53	0.169	0.126	0.185	1.216	0.705	2.000	cer2, cer4	چشمه برم
%42.11	0.206	0.172	0.250	1.307	0.947	3.000	cer47,cer48,cer49	چغاخور
%27.37	0.151	0.113	0.166	1.194	0.684	2.000	cer36,cer40	چم آسمان
%0.00	0.000	0.000	0.000	1.000	0.347	1.000	cer50	چم حیدر
%18.95	0.105	0.078	0.115	1.134	0.600	2.000	cer33,cer34	حسن آباد
%0.00	0.000	0.000	0.000	1.000	0.263	1.000	cer14	دلیجان
%0.00	0.000	0.000	0.000	1.000	0.000	1.000	cer37	زیار
%51.58	0.202	0.177	0.268	1.293	1.147	4.000	cer7,cer8,cer15,cer24	سفیدرود
%40.00	0.221	0.166	0.242	1.283	0.884	2.000	cer19,cer22	سیاه رود
%32.63	0.180	0.135	0.197	1.231	0.768	2.000	cer4, cer25	شیراز.اصفهان
%28.42	0.157	0.118	0.172	1.201	0.716	2.000	cer12, cer13	کانی برازان
%0.00	0.000	0.000	0.000	1.000	0.284	1.000	cer16	کرمان
%0.00	0.000	0.000	0.000	1.000	0.337	1.000	cer1	گندمان
%0.00	0.000	0.000	0.000	1.000	0.284	1.000	cer11	محمودآباد
%0.00	0.000	0.000	0.000	1.000	0.253	1.000	cer42	یزدآباد

تلفیق داده‌های نشانگرهای ISSR و SRAP

نتایج حاصل از آنالیز خوشه‌ای با استفاده از داده‌های نشانگر‌های ISSR و SRAP در شکل‌های 3 و 4 نشان داده شده است. دندروگرام به روش UPGMA و با ضریب تشابه Jaccard و Nei رسم شده است. در هر دو دندروگرام تقریباً نمونه‌های شمال کشور و منطقه مرکزی کشور (اصفهان) تفکیک شده است اما طبق این دندروگرام‌ها نوعی ارتباط و پیوستگی ژنتیکی بین نمونههای شمال کشور و مرکز کشور دیده می‌شود.

شکل 3- دندروگرام حاصل از تحلیل داده‌ها با استفاده از ضریب تشابه Jaccard

Figure 3- Dendrogram obtained from data analysis using Jaccard similarity coefficient

با توجه به دندروگرام‌های حاصل از آنالیز خوشه‌ای مشاهده می‌شود که جمعیت‌های مختلف کاملا تفکیک نشدند و در نمونه‌های مورد مطالعه براساس مکان‌های مختلف، تنوع ژنتیکی نشان می‌دهند که می‌توان آن را به دوری و مجاورت جمعیت‌ها تفسیر نمود. در بررسی تنوع ژنتیکی Prunus avium توسط Atapour et al., 2022، تفکیک بعضی از جمعیت ها بیشتر و بعضی نیز به علت تبادل ژنتیکی کمتر بود. ولی به نظر می‌رسد این خزانه‌های ژنی که عمدتاً در شمال کشور (مازندران)، مرکز کشور (اصفهان) و جنوب کشور نوعی جدایی را نشان می‌دهند، اما از سوی دیگر به دلیل ارتباط از طریق رفت و آمد و وسایل و تجهیزات از طریق انسان و نیز از طریق پرندگان آبی نوعی ارتباط و پیوستگی ژنتیکی را نشان می‌دهند. Khodadoost et al. (2017) در مطالعه تنوع ژنتیکی گیاه Malus Orientalis Uglitz. سطح بالایی از تبادل ژنتیکی بین جمعیتهای سیب جنگلی شمال ایران را گزارش کردند. در رابطه با گونه‌های C. demersum و C. submersum که در ایران وجود دارند به نظر می‌رسد گونه C. demersum دارای خزانه ژنتیکی وسیع تری در زیستگاههای آبی کشور است به طوری که در اکثر زیستگاهها وجود دارد و گونه C. submersum تنها در منطقهای در شمال کشور (ازباران، امیرکلایه و بندر انزلی) در نمونه برداری‌ها مشاهده شده اند. همان طور که در کتاب فلور ایران ذکر شده گونهی C. submersum متعلق به مناطق خزری و ایرانی تورانی است و در مناطق تالاب انزلی و تبریز به بستان آباد و دریاچه قوری گل دیده شده است (Dinarvand, 2017). بنابراین به نظر می‌رسد C. demersum از لحاظ اکولوژیکی گونه‌ای سازگارتر با عوامل مختلف محیطی مانند ارتفاع آب زیستگاه ها، میزان مواد محلول، وجود گونه‌های رقیب، شرایط دمایی آب و محیط باشد و گونه C. submersum به دلیل فراهم نبودن شرایط مناسب زیست تنها در نیچ های آبی اکولوژیکی محدودی در کشور وجود دارد.

شکل 4- دندروگرام حاصل از تحلیل داده‌ها با استفاده از ضریب تشابه Nei

Figure 4- Dendrogram obtained from data analysis using Nei similarity coefficient

جنس Ceratophyllum با داشتن تولید مثل غیرجنسی و جوانههای زمختی به نام توریونکه در پائیز تولید شده و در ته آب غوطه ورند و در اثر سرمای زمستان از بین خواهند رفت، ولی در بهار به محض گرم شدن آب دوباره سبز شده، با تولید ساقه‌های تازه می‌تواند جمعیت‌ها و یا کلونی‌های توده‌ای زیادی را تولید کند (Lokker et al., 1994). در پژوهش بر اساس نشانگر SRAP، سطوح زیادی از تنوع کلونی و تنوع ژنتیکی را در درون جمعیت‌های این گونه نشان داد و همچنین بیشترین تنوع ژنی در نواحی شمال و مرکز ایران گزارش شد (Ghasemi et al., 2016).

نتایج حاصل از آنالیز مولفه اصلی در شکل 5 نشان داده شده است که این نتایج تقریباً در تطابق با آنالیز خوشهای است و نوعی ارتباط و پیوستگی بین افراد را نشان می‌دهد. محدوده سبز رنگ نشان دهنده جمعیت اصفهان، محدوده آبی رنگ نشان دهنده جمعیت‌های شمال کشور و محدوده صورتی، گونه‌های C. submersum شمال کشور را نشان می‌دهد.

شکل 5- دیاگرام حاصل از داده ها برای جمعیت‌های مختلف Ceratophyllum با روش آنالیز مؤلفه اصلی PCoA

Figure 5- Diagram of data for different populations of Ceratophyllum using PCoA principal component analysis method.

تحلیل واریانس مولکولی AMOVA بر اساس تلفیق نشانگر‌های ISSR و SRAP انجام شد. نتایج حاصل از این آنالیز نشان دهنده 52 درصد تنوع ژنتیکی درون جمعیت‌ها و 48 درصد تنوع ژنتیکی بین جمعیت‌ها می‌باشد. شکل 6 بیانگر این است که تنوع درون جمعیتی بیشتر است. در سایر پژوهش‌های مربوط به تنوع ژنتیکی (Khodadoost et al., 2017، Latifi et al., 2018 و Mofid Bojnoordi et al., 2022) نیز تنوع ژنتیکی درون جمعیتی بیشتری نشان داده شده است که این امر نشان‌دهنده تبادل ژنتیکی بالای میان جمعیت‌ها است.

نتایج حاصل از آزمون Mantel حاکی از عدم ارتباط بین فاصله ژنی و فاصله جغرافیایی است (R=0/019 و P=0/320) که با توجه به اینکه در درخت و تحلیل مولفه اصلی شاهد عدم تفکیک زیاد جمعیت‌ها بودیم، منطقی به نظر می‌رسد.

شکل 6- نتایج آنالیز AMOVA برای جمعیت های Ceratophyllum مورد مطالعه

Figure 6- AMOVA analysis results for studied Ceratophyllum populations

تحلیل مولکولی روابط درون گونهای Cerarophyllum از طریق آنالیز STRUCTURE در شکل 7 نشان داده شده است که 5 گروه ژنتیکی را نشان داده است و ارتباط بین افراد جمعیت‌های مختلف را بیان می‌کند که خزانه ژنی مشابهی دارند.

شکل 7- نتیجه حاصل از آنالیز STRUCTURE برای گونه‌های Ceratophyllum مورد مطالعه (نتیجه این تحلیل، نشان‌دهنده تعداد پنج گروه ژنتیکی شامل آبی: گروه 1، سبز: گروه 2، قرمز: گروه 3، زرد: گروه 4، صورتی: گروه 5 برای کل افراد 29 جمعیت است).

Figure 7- The result of the STRUCTURE analysis for the studied species of Ceratophyllum (The result of this analysis shows five genetic groups including blue: group 1, green: group 2, red: group 3, yellow: group 4, pink: group 5 for all individuals of 29 population).

با توجه به اینکه گونه‌های این جنس در شرایط مساعد محیطی بیشتر از طریق جوانه‌ها و قطعات گیاهتکثیر پیدا می‌کنند (Loveless & Hamrick, 1984). بنابراین بدیهی است، پلی‌مورفیسم قابل توجهی در جمعیت‌های گونه‌های این جنس مشاهده نشود. میانگین پلی‌مورفیسم در جمعیت‌های مورد مطالعه 77/16% است.

با توجه به اینکه، Ceratophyllum نسبت به گیاه آبزی Potamogeton L. پیشرفته‌تر است (Byng & Christenhusz, 2018)، سازگاری بیشتری نسبت به شرایط محیطی ایران از خود نشان می‌دهد که این امر تنوع درون جمعیت‌ها را بر خلاف جمعیت‌های Potamogeton (Abbasi et al., 2016) افزایش داده است. همین طور اثبات شده که در شرایط اکولوژیکی سخت و غیر پایدار مثل خشکسالی که به تازگی در ایران زیاد است، تولیدمثل جنسی زیادتر می شود و تنوع درون جمعیت‌ها افزایش نشان دادند. شرح فوق با نتیجه حاصل از آنالیز AMOVA در این مطالعه که نشان دهنده تنوع درون جمعیتی بیشتری نسبت تنوع بین جمعیتی است، تطابق دارد.

نتیجه‌گیری

با توجه به تحلیل‌های انجام شده می‌توان گفت که خزانه ژنی جمعیت Ceratophyllum در ایران تا حدودی مخدوش شده است و بین جمعیت‌های مختلف ارتباط و تشابه ژنی وجود دارد و تنها بعضی از جمعیت‌های شمال کشور یکنواخت‌تر هستند. همان طور که بیان شد عوامل مختلفی می‌تواند در ایجاد چنین شرایطی موثر باشد که تنوع ژنتیکی درون جمعیتی بالایی در جمعیت‌های این مطالعه نشان داده شده است.

سپاسگزاری

بدینوسیله نویسندگان از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه اصفهان برای انجام این پژوهش سپاسگزارند

مراجع

Abbasi, S., & Afsharzadeh, S. (2016). An efficient and simple CTAB based method for total genomic DNA isolation from low amounts of aquatic plants leaves with a high level of secondary metabolites. Progress in Biological Science, 95-106. https://doi.org/10.22059/pbs.2016.59012.

Abbasi, S., Afsharzadeh, S., Saeidi, H., & Triest, L. (2016). Strong genetic differentiation of submerged plant populations across mountain ranges: Evidence from Potamogeton pectinatus in Iran. PLoS One, 11(8), e0161889. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0161889.

Agarwal, M., Shrivastava, N., & Padh, H. (2008). Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Reports, 27, 617-631. https://doi.org/10.1007/s00299-008-0507-z.

Aghajani, J. (2016). Biosynthesis of bioactive silver nanoparticles from aquatic plant Ceratophyllum demersum. MA Thesis, Lahijan Islamic University [In Persian].

APG, IV. (2016). An update of the angiosperm phylogeny group classification for the orders and families of flowering plants: APGIV. Botanical Journal of the Linnean Society, 181, 1-20. https://doi.org/10.1111/boj.12385.

Asadi, Sh., & Imanpour, J. (2014). Comparison of the purification capability of the aquatic plant Ceratopyllum demersum with media in closed aquaculture systems. MA Thesis, Gilan University [In Persian].

Blair, M. W., Panaud O., & McCouch, S. R. (1999). Inter simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellite motif frequency and finger printing in rice (Oryza sativa L.). Theoretical and Applied Genetics, 98, 780-792. https://doi.org/10.1007/s001220051135.

Byng, J. W., & Christenhusz, M. M. (2018). Introducing The Global Flora, a global series of botany. The Global Flora: A practical flora to vascular plant species of the world, 1.

Carr, G. M., Duthie, H. C., & Taylor, W. D. (1997). Models of aquatic plant productivity: a review of the factors that influence growth. Aquatic Botany, 59(3-4), 195-215. https://doi.org/10.1016/S0304-3770(97)00071-5.

Dinarvand, M. (2017). Families of Aquatic Plants. In: Assadi, M., Massoumi, A. A. (eds), Flora of Iran. Tehran: Research Institute of Forest and Rangelands. No. 101–123: 3–130 [In Persian].

Dinarvand, M., Assadi, M., & Abbasi, S. (2022). A taxonomic revision on aquatic vascular plants in Iran. Rostaniha, 23(2), 1-50. https://doi.org/10.22092/bot.j.iran.2022.358319.1302.

Earl, D. A., & VonHoldt, B. M. (2012). Structures Harvester: a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method. Conservation Genetics Resources, 4, 359-361. https://doi.org/10.1007/s12686-011-9548-7.

Eftekhari, Z., Sharifi, N., Norastehnia, A., & Masoudian, Z. (2020). Assessing the risk of industrial dyes on life of aquatic plant Ceratophyllum demersum. Journal of Aquatic Ecology, 10(3), 52-60 [In Persian]. https://doi.org/20.1001.1.23222751.1399.10.3.6.6.

Ghasemi, M.., Abbasi, S., & Afsharzadeh, S. (2016). Investigation of the genus Ceratophyllum L. based on morphological, anatomical and molecular characteristics in Iran. 21st National Congress and 9th International Congress of Biology of Iran, Semnan [In Persian].

Li, P., Zhan, X., Que, Q., Qu, W., Liu, M., Ouyang, K., ... & Chen, X. (2015). Genetic diversity and population structure of Toona ciliata Roem. based on sequence-related amplified polymorphism (SRAP) markers. Forests, 6(4), 1094-1106. https://doi.org/10.3390/f6041094.

Lokker, C., Susko, D., Lovett‐Doust, L., & Lovett‐Doust, J. (1994). Population genetic structure of Vallisneria americana, a dioecious clonal macrophyte. American Journal of Botany, 81(8), 1004-1012. https://doi.org/10.1002/j.1537-2197.1994.tb15588.x.

Loveless, M. D., & Hamrick, J. L. (1984). Ecological determinants of genetic structure in plant populations. Annual Review of Ecology and Systematics, 15(1), 65-95. https://doi.org/10.1146/annurev.es.15.110184.000433.

Moshtaghi, N., Bagheri, A., & Sharifi, A. (2013). Plant biotechnology. Mashhad: University Jihad of Mashhad [In Persian].

Peakall, R., & Smouse P. E. (2006). GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes, 6(1), 288-295. https://doi.org/10.1111/j.1471-8286.2005.01155.x.

Robarts, D. W., & Wolfe, A. D. (2014). Sequence-related amplified polymorphisms (SRAP) markers: a potential resource for studies in plant molecular biology. Applications in Plant Sciences, 2(7), 1-13. https://doi.org/ 10.3732/apps.1400017.

Rohlf, F. J. (1998). NTSYS-pc numerical taxonomy and multivariate analysis system version 2.1. Setauket, NY, USA: Exeter Publishing.

Szalontai, B., Stranczinger, S., Mesterhazy, A., Scribailo, R. W., Les, D. H., Efremov, A. N., ... & Csiky, J. (2018). Molecular phylogenetic analysis of Ceratophyllum L. taxa: a new perspective. Botanical Journal of the Linnean Society, 188(2), 161-172. https://doi.org/10.1093/botlinnean/boy057.

Troyer, A., Openshaw, S., & Knittle, K. (1988). Measurement of genetic diversity among popular commercial corn hybrids. Crop Science, 28(3), 481-485. https://doi.org/10.2135/cropsci1988.0011183X002800030010x.

Wang, X., Zhao, F., Hu, Z., Critchley, A. T., Morrell, S. L., & Duan, D. (2008). Inter-simple sequence repeat (ISSR) analysis of genetic variation of Chondrus crispus populations from North Atlantic. Aquatic Botany, 88(2), 154-159. https://doi.org/10.1016/j.aquabot.2007.10.001.

Wilkins, J. S. (2009). Species: a history of the idea (Vol. 1). University of California Press.

Zare-rashnoodi, N., Erfani-Moghadam, J., & Fazeli, A. (2017). Evaluation of some walnut genotypes in the west of Iran using fruit characteristics and RAPD marker. Iranian Journal of Plant Biology, 9(3), 1-18 [In Persian]. https://doi.org/10.22108/ijpb.2017.100338.