نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل، ایران.
2 گروه فارماکوگنوزی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی، واحد اردبیل، اردبیل، ایران.
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
The fennel plant (Foeniculum vulgare L.) is a member of the Apiaceae umbrella family. In this research, the effect of different plant growth regulators on the production of callus tissue from fennel explants was investigated and then the effect of selected plant growth regulators on the biochemical compounds and secondary metabolites of the resulting callus tissue was evaluated. The desired explants after transfer to the laboratory and surface disinfection on the MS base culture medium containing Kin and BAP in concentrations (zero, 0.1, and 0.5 mg/L) and 2,4-D, NAA, and IBA (at concentrations of zero, 0.5, 1, 2 and 4 mg/L) were cultivated. According to the results, the use of Kin instead of BAP (in lower concentrations) and NAA (in higher concentrations) increased the percentage of callus production. According to the results, the highest percentage of callus production (100%) is related to the culture medium containing Kin (in concentrations of 0.1 or 0.5 mg/L) along with NAA (in concentrations of 1, 2, or 4 mg/L). In this research, it was found that the use of auxin and cytokinin (in combination with each other) increased the induction and production of callus tissue. Also, in terms of the activity level of peroxidase and catalase enzymes, and accumulation of amino acid proline, flavonoid, and anthocyanin, a significant difference was observed between different plant growth regulators. So the highest peroxidase and catalase enzyme activities and proline amino acid accumulation are related to MS+1(mg/L)IBA +0.5(mg/L)BAP culture medium. Also, the highest amount of flavonoid was related to MS+2(mg/L)NAA+0.5(mg/L)BAP culture medium. The highest amount of anthocyanin was related to MS+2 (mg/L)2,4-D+0.5(mg/L)BAP culture medium.
Introduction
Fennel (Foeniculum vulgare L.) is a member of the Apiaceae family, which is known for having significant contents of phytochemicals, including flavonoids, coumarins, quinones, phenolic and alkaloid compounds. Plant tissue culture is the in vitro culture of cells, tissues, organs, or the whole plant under sterile conditions on a nutrient culture medium of known composition, which is often used to produce plant clones. The resulting clones are genetically uniform and very similar to the mother plant. Callus culture is the most common type of culture in plant tissue culture. Callus is a growing mass of undifferentiated and unorganized cells, which are formed because of a wound on the surface of the plant. Callus tissue can be obtained from all the organs of a whole plant such as meristem, stem tip, lateral buds, leaf, leaf, etc. Several factors including genetic structure, type of culture medium, environmental factors (light, pH, and temperature), and plant growth regulators are effective on tissue culture and micropropagation of plants. Plant growth regulators, which are used in very low concentrations, are effective in the distribution of substances inside the plant, cell division, and cell growth. Plant growth regulators, especially auxins and cytokinins, play a very important role in controlling the growth and development of cells both in the whole plant and in explants cultured in vitro.
Material and Methods
In this research, first, the optimal conditions to produce callus from explants obtained from fennel shoots were investigated, and then the biochemical compositions of the resulting callus were measured. To produce callus tissue, explants from F. vulgare shoots were prepared from the medicinal plant research center of Ardabil University of Medical Sciences. The samples were first examined phenotypically and after selecting fresh samples without obvious contamination, they were washed with a dishwashing solution for 30 minutes and then rinsed under running water for one hour. The explants were then immersed in H2O2 solution (5%) for 10 minutes and after rinsing twice with sterile water (autoclaved twice) for 10 minutes, they were disinfected in 2.5% sodium hypochlorite. At the end, sterilized explants on MS culture medium containing different plant growth regulators Kin or BAP (zero, 0.1 and 0.5 mg/L) alone or in combination with 2,4-D or NAA or IBA (each in concentrations of zero, 0.5, 1, 2 and 4 mg/L) were cultivated and the percentage of callus production, root and shoot and the biochemical composition of the resulting callus samples (peroxidase and catalase activity levels), the amount of amino acid accumulation of proline, total flavonoid and anthocyanin) were recorded after 3-4 weeks. This research was conducted as a completely randomized design experiment with three replications, and the data analysis was done using SPSS ver. 26.
Results and Discussion
According to the results obtained in this research, it was found that the percentage of callus production from explants obtained from fennel plant shoots, roots, and aerial parts obtained from callus, as well as the weight of the collected callus, had a significant difference between most of the plant growth regulators treatments and the control treatment. According to the results obtained in this research, it was found that the highest percentage of callus production (100%) was related to the culture medium containing Kin (concentrations of 0.1 or 0.5 mg/L) along with NAA (concentrations of 1, 2, or 4 mg/L). According to the results of the study, the use of auxin and cytokinin (in combination with each other) increased the induction and production of callus. In terms of the percentage of root production from callus samples, the best (100%) was related to MS+ 2,4-D (2 mg/L) + BAP (0.1 mg/L) culture medium. Also, MS culture medium containing 1mg/L of 2,4-D along with 0.5 mg/liter of BAP had the highest percentage of shoot production from callus samples of the fennel plant (55.53%). On the other hand, a significant difference was observed in the activities of peroxidase and catalase enzymes, amino acid proline, flavonoid, and anthocyanin accumulation between different plant growth regulators. The highest level of peroxidase, catalase, and amino acid proline was related to MS + IBA (1mg/L) + BAP (0.5mg/L) culture medium.
Conclusion
According to the results, the use of plant growth regulators had a positive and significant effect on the amount of callus production, root, and shoot production, as well as the biochemical characteristics of the fennel plant. In this research, it was found that the use of Kin and NAA causes the maximum increase in callus production from fennel explants. To increase the antioxidant and anticancer properties of callus samples, it is very important to increase the amount of flavonoids and anthocyanins in the callus, and in the current study, the highest amount of biochemical compounds, especially the amount of flavonoids and anthocyanins in the in vitro culture of the fennel plant, was associated with an increase in the concentration of auxin and cytokinin.
کلیدواژه‌ها [English]
گیاه رازیانه با نام علمی ( L. Foeniculum vulgare) متعلق به خانواده چتریان Apiaceae است. این گیاه با خواص دارویی و درمانی با ارزش در حالت وحشی، بهصورت گیاهی چند ساله بوده ولی نوع اهلی آن، گیاهی دو ساله است (Noshad & Falah, 2020). از نظر پلوئیدی این گیاه دیپلوئید (2n=2x=22) و علفی است و از دیرباز در طب سنتی ایرانی و بینالملل جهت درمان بیماریهای گوارشی، بیماریهای مربوط به زنان، بیماریهای تنفسی، آب مروارید، برونشیت، استفراغ، دفع سنگ کلیه، اسهال و سرفههای مزمن و نیز جلوگیری از اختلالات سوء هاضمه در نوزادان شیرخوار مورد توجه بوده است (Khan et al., 2022). خاستگاه اصلی این گیاه مدیترانه و اروپای مرکزی است. امروزه کشت این گیاه در تمامی نقاط مورد توجه قرار گرفته است، امّا بیشترین سطح زیر کشت مربوط به کشورهای حاشیه دریای مدیترانه است که جهت کشت تجاری از اهمیّت بسیار بالایی برخوردار است (Mehra et al., 2021). مواد معدنی و ویتامینهای موجود در اندامهای مختلف رازیانه شامل کلسیم، پتاسیم، سدیم، آهن، فسفر، تیامین، ریبوفلاوین، نیاسین و ویتامین C هستند (Khan et al., 2022). ریشه، برگ، ساقه و دانه گیاه رازیانه دارای ترکیبات موثره مفید و دارویی هستند که متناسب با نیاز و درمان هدف مورد استفاده قرار میگیرد، امّا به طور کلی دانه و ساقه این گیاه از ارزش دارویی بالایی برخوردار است (Saremirad et al., 2021).et al (2021) Mehra, در پژوهشی، با بررسیهای خود بر روی دانه گیاه رازیانه بیان کردند دانه این گیاه دارای ترکیبات بیوشیمیایی نظیر تانن، فنچون، فلاندرن، لیمونن، دیپنتن، استراگول، متیل اورانژ، کامفن، مواد پروتئینی- قندی و روغنی هستند. همچنین بیان کردند روغنهای استخراج شده از دانه این گیاه از اسیدهای چربی مانند اسید پالمتیک، اسید اولئیک، اسید لینولئیک و اسید پتروسلینیک تشکیل شده است. فنل کل موجود در این گیاه جزء ترکیبات متابولیتی با ارزش آن محسوب میشود. از جمله ترکیبات فنلی استخراج شده از دانه این گیاه میتوان به اسید نئوکلروژنیک، اسیدکلروژنیک، اسیدگالیک، اسیدکافئیک، اسیدکوماریک، اسید فلوریک، اسید سینامیک، کوئرستین، هسپریدین، اسید رزمارنیک، آنتول و آپیژینین اشاره نمود (Mehra et al., 2021). همچنین برگها و ساقههای این گیاه حاوی ترکیباتی ضد میکروبی و ضد سرطانی نظیر روتین، کمپفرول، کوئرستین، فلاونوئید فینکولارین، آرابینوزید و نلومبوزید است (Nikolova et al., 2011). از سوی دیگر، طبق بررسیهای انجام شده ریشه، این گیاه حاوی خانواده بزرگی از کومارینها و آپیول است (Rasheed et al., 2021). کشت بافت گیاهی، کشت در شرایط in vitro سلولها، بافت‌ها، اندام‌ها یا کل گیاه تحت شرایط کنترل‌شده تغذیه‌ای و محیطی است که اغلب برای تولید کلونهای گیاهی استفاده میشود. کلونهای حاصل از نظر ژنتیکی کاملاً یکنواخت بوده و بسیار شبیه به پایه مادری است. امروزه از روش کشت بافت و اندام گیاهی جهت تکثیر، افزایش تولید ترکیبات موثره گیاهی، حفاظت از ژرمپلاسم گیاهی، انتقال سریع گونهای و غیره استفاده میشود (Noruzpuor et al., 2022). تکنیک کشت بافت گیاهی بر اساس مفهوم Totipotency سلولها (قابلیت و ظرفیت تبدیل‌شدن هر سلول به یک موجود کامل) شکل گرفته است (Magyar-Tábori et al., 2010). کشت کالوس معمول‌ترین نوع کشت در کشت بافت گیاهی محسوب میشود. کالوس بافتی متشکل از سلولهای تمایز نیافته و غیرسازمان‌یافته است که در اثر بروز زخم در سطح گیاه حاصل میشود. بافت کالوس را میتوان در محیط کشت از تمام اندامهای یک گیاه کامل مانند مریستم، نوک ساقه، جوانه‌های جانبی، برگ، دم برگ، بساک، تخمدان، تخمک، جنین و غیره به دست آورد (Han et al., 2011). از تکنیک تولید کالوس برای ایجاد تنوع ژنتیکی در بین جمعیت، افزایش تولید متابولیتهای گیاه پایه، تولید متابولیتهای جدید، باززایی و تولید گیاهان عاری از بیماری و غیره استفاده میشود (Noruzpour et al., 2019). در سالهای اخیر استفاده از روشهای کشت سلول و بافت گیاهی به روشی مؤثر جهت تکثیر گونههای گیاهی در خطر انقراض تبدیل شده است. کشت بافت و سلول گیاهی روشی آسان و به نسبت ارزان قیمت محسوب میشود.
عوامل متعددی از جمله ساختار ژنتیکی، نوع محیط کشت، عوامل محیطی (نور، pH، دما و غیره) و تنظیمکنندههای رشد گیاهی بر کشت بافت و ریز ازدیادی گیاهان مؤثر است (Noruzpuor et al., 2022). تنظیمکنندههای رشد گیاهی که در غلظتهای بسیار کم به کار گرفته میشوند، روی توزیع مواد داخل گیاه، تقسیم سلولی، رشد سلولی و غیره موثرند. تنظیمکنندههای رشد گیاهی، به ویژه اکسینها و سیتوکینینها، در کنترل رشد و نمو سلولها هم در گیاه کامل و هم در ریزنمونههای کشت شده در شرایط درونشیشهای نقش بسیار مهمی دارند. از جمله تنظیمکنندههای رشد گیاهی متداول جهت تولید کالوس در شرایط درونشیشهای میتوان به NAA، 2,4-D، IAA، IBA (به عنوان اکسین) و BAP، زآتین، Kin، TDZ و BA (به عنوان سیتوکینین) اشاره نمود. نوع و مقدار اکسین یا سیتوکینین و یا نسبت اکسین به سیتوکینین و بالعکس در شرایط درون شیشهای بر تشکیل اندامهای گیاهی، بافت کالوس، تولید متابولیتهای ثانویه و غیره موثر است. به طور کلی افزودن اکسینها به درون محیط کشت به عنوان تنظیم کننده رشد گیاهی برخلاف سیتوکینینها امکان تشکیل ریشه و بافت کالوس را افزایش داده و از ایجاد ساقه ممانعت به عمل میآورد (Zare et al., 2021). (2020) Sharma & Mandal، با بررسی انواع محیط کشت و تنظیم کننده های رشد گیاهی بیان کردند استفاده از محیط کشت MS به همراه 1/0 میلیگرم برمیلیلیتر BA و 2 میلیگرم بر میلی لیتر NAA بهترین شرایط را برای تولید بافت کالوس از ریزنمونههای گیاه رازیانه (F. vulgare) را فراهم میکند (Sharma & Mandal, 2020). استفاده از NAA در غلظت 5/1 میلیگرم بر لیتر به همراه 5/0 میلیگرم بر لیتر BA در محیط کشت پایه MS درصد تولید کالوس نمونههای گیاه رازیانه (F. vulgare) را تا 100 درصد افزایش میدهد (Asree & Khirallah, 2020). همچنین Asree & Khirallah (2020) گزارش کردند محیط کشت پایه MS به همراه 2 میلیگرم بر لیتر NAA و یک میلیگرم بر لیتر Kin سبب تولید 100 درصدی کالوس از ریزنمونههای گیاه رازیانه (L. Foeniculum vulgare) میشود (Asree & Khirallah, 2020). در پژوهش Yang, et al (2015) بر روی کشت بافت گیاه رازیانه و تولید متابولیتهای ثانویه توسط محرک های رشد گیاهی بیان کردند نمونه کالوسهای تیمار شده درون محیط کشت MS حاوی NAA و Kin به عنوان تنظیمکنندههای رشد گیاهی و سالیسیلیکاسید و متیلجاسمونات در غلظتهای 100 و 200 میلیگرم در لیتر به عنوان محرکهای رشد گیاهی بیشترین میزان تولید آنتول را داشتهاند (Yang et al., 2015). با توجه به اهمیت دارویی گیاه رازیانه و محدود بودن یافتههای ارائه شده در مورد تولید کالوس از ریزنمونههای حاصل از شاخساره این گیاه با ارزش، در پژوهش حاضر، میزان تولید کالوس، تولید اندام ریشه و اندام هوایی از کالوس حاصل به کمک انواع تنظیمکنندههای رشد گیاهی مختلف (اکسین و سیتوکینین) ارزیابی شد.
مواد و روشها
تهیه و کشت ریزنمونه
اندام هوایی (ساقههای جدید و تازه رشد کرده) گیاه رازیانه به عنوان ریزنمونه گیاهی جهت تولید کالوس در شرایط درون شیشهای، از مرکز (مزرعه) تحقیقات گیاهان دارویی دانشگاه علوم پزشکی اردبیل تهیه شد. نمونههای جمعآوری شده در جعبههای مخصوص و استریل به آزمایشگاه منتقل شدند. نمونهها در ابتدا از نظر فنوتیپی بررسی شدند و پس از انتخاب نمونههای تازه و فاقد آلودگی و پژمردگی واضح به مدّت 30 دقیقه توسط محلول ظرفشویی شستشو داده و سپس به مدّت یک ساعت زیر آب جاری آبکشی شدند. سپس نمونهها جهت حذف آلودگی قارچی در مرحله استقرار ریزنمونه درون بنومیل 3 درصد بنومیل (3 گرم بنومیل در یک لیتر آب) به مدّت 2 ساعت قرار گرفتند (Noruzpuor et al., 2022). ریز نمونهها سپس درون محلول H2O2 (5 درصد) به مدّت 10 دقیقه غوطهور شده و پس از دو بار آبکشی با آب استریل (دو بار اتوکلاو شده) به مدّت 10 دقیقه درون هیپوکلریتسدیم 5/2 درصد ضدعفونی شدند. در انتها و قبل از استقرار بر روی محیط کشت MS حاوی تنظیمکنندههای رشد مختلف (جدول 1)، ریز نمونهها سه مرتبه و هر بار به مدّت 10 دقیقه توسط آب استریل (دو بار اتوکلاو شده) آبکشی شدند.
مرحله استقرار و نگهداری ریزنمونه
پس از انتقال ریز نمونههای حاصل از شاخساره بر روی محیط کشت، جهت تولید کالوس محیط کشتهای حاوی ریزنمونه به اتاقک رشد فاقد روشنایی و با دمای °C 25 منتقل شدند. درصد تولید کالوس از ریزنمونههای کشت شده، درصد تولید ریشه و اندام هوایی از کالوس حاصل و وزن تر کالوس، رنگ و نوع کالوس پس از گذشت 3 الی 4 هفته ثبت شد.
اندازه گیری ویژگیهای بیوشیمیایی
ابتدا 1/0 گرم از نمونه کالوس حاصل از محیط کشت حاوی تنظیمکنندههای رشد گیاهی منتخب درون هاون چینی و ازت مایع سائیده شد. سپس 5/1 میلیلیتر بافر فسفات سدیم (7=pH) حاوی 1 درصد پلی‌وینیل پیرولیدون (PVP) و 1 میلیمولار EDTA اضافه شد. سپس نمونهها در دمای°C 4 و 13000 دور در دقیقه به مدّت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. سپس فاز رویی به عنوان عصاره پروتئینی برای اندازهگیری میزان پروتئین و فعالیت‌های آنزیمی جمعآوری شد. برای اندازهگیری مقدار پروتئین کل نمونهها از روش Bradford استفاده شد (Bradford, 1976). جهت پژوهش از 50 میکرولیتر عصاره پروتئینی و50 میکرولیتر معرف برادفورد و 900 میکرولیتر بافر فسفات به عنوان محلول واکنش استفاده شد. میزان جذب نوری عصاره پروتئینی در طول موج 595 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (BIORAD, SmartspecTM plus، آمریکا) استفاده شد. کمی‌سازی غلظت پروتئین با آلبومین سرم گاوی (BSA) در غلظتهای مختلف انجام شد.
|
غلظت سیتوکنین (میلیگرم/ لیتر) Cytokinin concentration (mg/L) |
نوع سیتوکنین Cytokinin type |
غلظت اکسین (میلیگرم/ لیتر) Auxin concentration (mg/L) |
نوع اکسین Auxin type |
محیط کشت Culture media |
|
- |
- |
- |
- |
MS |
|
0.1 |
BAP |
- |
- |
MS |
|
0.5 |
BAP |
- |
- |
MS |
|
0.1 |
Kin |
- |
- |
MS |
|
0.5 |
Kin |
- |
- |
MS |
|
- |
- |
0.5 |
2,4-D |
MS |
|
- |
- |
1 |
2,4-D |
MS |
|
- |
- |
2 |
2,4-D |
MS |
|
- |
- |
4 |
2,4-D |
MS |
|
0.1 |
BAP |
0.5 |
2,4-D |
MS |
|
0.1 |
BAP |
1 |
2,4-D |
MS |
|
0.1 |
BAP |
2 |
2,4-D |
MS |
|
0.1 |
BAP |
4 |
2,4-D |
MS |
|
0.5 |
BAP |
0.5 |
2,4-D |
MS |
|
0.5 |
BAP |
1 |
2,4-D |
MS |
|
0.5 |
BAP |
2 |
2,4-D |
MS |
|
0.5 |
BAP |
4 |
2,4-D |
MS |
|
0.1 |
Kin |
0.5 |
2,4-D |
MS |
|
0.1 |
Kin |
1 |
2,4-D |
MS |
|
0.1 |
Kin |
2 |
2,4-D |
MS |
|
0.1 |
Kin |
4 |
2,4-D |
MS |
|
0.5 |
Kin |
0.5 |
2,4-D |
MS |
|
0.5 |
Kin |
1 |
2,4-D |
MS |
|
0.5 |
Kin |
2 |
2,4-D |
MS |
|
0.5 |
Kin |
4 |
2,4-D |
MS |
|
- |
- |
0.5 |
NAA |
MS |
|
- |
- |
1 |
NAA |
MS |
|
- |
- |
2 |
NAA |
MS |
|
- |
- |
4 |
NAA |
MS |
|
0.1 |
BAP |
0.5 |
NAA |
MS |
|
0.1 |
BAP |
1 |
NAA |
MS |
|
0.1 |
BAP |
2 |
NAA |
MS |
|
0.1 |
BAP |
4 |
NAA |
MS |
|
0.5 |
BAP |
0.5 |
NAA |
MS |
|
0.5 |
BAP |
1 |
NAA |
MS |
|
0.5 |
BAP |
2 |
NAA |
MS |
|
0.5 |
BAP |
4 |
NAA |
MS |
|
0.1 |
Kin |
0.5 |
NAA |
MS |
|
0.1 |
Kin |
1 |
NAA |
MS |
|
0.1 |
Kin |
2 |
NAA |
MS |
|
0.1 |
Kin |
4 |
NAA |
MS |
|
0.5 |
Kin |
0.5 |
NAA |
MS |
|
0.5 |
Kin |
1 |
NAA |
MS |
|
0.5 |
Kin |
2 |
NAA |
MS |
|
0.5 |
Kin |
4 |
NAA |
MS |
|
- |
- |
0.5 |
IBA |
MS |
|
- |
- |
1 |
IBA |
MS |
|
- |
- |
2 |
IBA |
MS |
|
- |
- |
4 |
IBA |
MS |
|
0.1 |
BAP |
0.5 |
IBA |
MS |
|
0.1 |
BAP |
1 |
IBA |
MS |
|
0.1 |
BAP |
2 |
IBA |
MS |
|
0.1 |
BAP |
4 |
IBA |
MS |
|
0.5 |
BAP |
0.5 |
IBA |
MS |
|
0.5 |
BAP |
1 |
IBA |
MS |
|
0.5 |
BAP |
2 |
IBA |
MS |
|
0.5 |
BAP |
4 |
IBA |
MS |
|
0.1 |
Kin |
0.5 |
IBA |
MS |
|
0.1 |
Kin |
1 |
IBA |
MS |
|
0.1 |
Kin |
2 |
IBA |
MS |
|
0.1 |
Kin |
4 |
IBA |
MS |
|
0.5 |
Kin |
0.5 |
IBA |
MS |
|
0.5 |
Kin |
1 |
IBA |
MS |
|
0.5 |
Kin |
2 |
IBA |
MS |
|
0.5 |
Kin |
4 |
IBA |
MS |
اندازهگیری فعالیت آنزیمهای پراکسیداز و کاتالاز
اندازهگیری فعالیت آنزیم پراکسیداز طبق روشMacAdam, et al (1992) با کمی تغییر انجام شد (MacAdam et al., 1992). مخلوط واکنش شامل 81/0 میلیلیتر بافر فسفات پتاسیم 100 میلیمولار (7pH= )، 20 میکرولیتر عصاره پروتئینی، 90 میکرولیتر گایاکول (10 میلیمولار) ، 90 میکرولیتر آب اکسیژنه (5 میلیمولار) بود. تغییرات جذب مخلوط واکنش در طول موج 425 نانومتر به مدّت 60 ثانیه و در دمای °C 25 با اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. فعالیت آنزیم پراکسیداز بر حسب تغییرات جذب در دقیقه به ازای هر میلیگرم پروتئین بیان شد و میزان فعالیت آن از رابطه (× (V/Vt) / (0.1×T) / Cp 425A∆) محاسبه شد، که در این فرمول 425A∆: تغییرات جذب نوری؛ V: حجم کل؛ Vt: حجم عصاره مورد استفاده در واکنش؛ T: زمان واکنش (دقیقه)؛ Cp: غلظت پروتئین بود.
برای اندازهگیری فعالیت آنزیم کاتالاز از روش(1996) & Mahely Chanesبا کمی تغییر استفاده شد (Chanes & Mahely, 1996). بافر فسفات سدیم 20 میلیمولار با 7 pH= و20 میکرولیتر پراکسید هیدروژن (H2O2) 5 میلیمولار به عنوان پذیرنده الکترون استفاده شد و سپس 60 میکرولیتر عصاره پروتئینی در حمام یخ به آن اضافه و تغییرات جذب نوری در طول موج 240 نانومتر خوانده شد. برای نمونه بلانک به جای عصاره پروتئینی از بافر فسفات (7pH=) استفاده شد. فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس میزان تغییرات جذب در میکروگرم پروتئین در دقیقه از فرمول
∆) A 240 ×(V/Vt) (0.1×T)/Cp (× (V/Vt) / (0.1×T)
محاسبه شد. در این فرمول: 240A∆: تغییرات جذب نوری؛ V: حجم کل؛ Vt: حجم عصاره مورد استفاده در واکنش؛ T: زمان واکنش (برحسب دقیقه) و Cp: غلظت پروتئین بود.
اندازه گیری اسیدآمینه پرولین
پرولین آزاد نمونههای مورد نظر طبق روش Bates اندازهگیری شد (Bates et al., 1973). برای این کار 1/0 گرم نمونه کالوس در اسید سولفوسالیسیلیک 3/3 درصد و در یک هاون چینی کوچک به مدّت 3 دقیقه سائیده شد. همگنای حاصل در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و با 4000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شده و محلول رویی به یک میکروتیوب جداگانه منتقل شد. سپس یک میلیلیتر از معرف نینهیدرین و یک میلیلیتر استیکاسید خالص به آن اضافه شد. سپس، مخلوط حاصل به حمام آب با دمای °C90 منتقل شده و به مدّت یک ساعت در این شرایط نگهداری شد. پس از سرد شدن نمونه دو میلیلیتر تولوئن به آن اضافه و سپس به مدّت دو دقیقه همزده شد. سپس، جذب نوری محلول رویی در طول موج 520 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. پرولین آزاد نمونه با یک منحنی استاندارد پرولین خالص تعیین شد.
استخراج متابولیتهای ثانویه
برای استخراج متابولیتهای ثانویه نمونههای کالوس از روشet al (2022) Chang, استفاده شد (Chang et al., 2002). بدین منظور ابتدا 1/0 گرم نمونه کالوس یا سلول درون هاون چینی و با 5 میلیلیتر متانول اسیدی )متانول خالص و اسید کلریدریک به نسبت حجمی 99:1) کاملا سائیده شد. سپس مخلوط حاصل به مدّت 72 ساعت در دمایC ° 25 و در تاریکی نگهداری شد. سپس نمونهها به مدّت 10 دقیقه و 4000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. از محلول رویی حاصل برای اندازهگیری مقدار فلاونوئید و آنتوسیانین استفاده شد. برای اندازهگیری فلاونوئید کل از روشet al (2002) Chang, با کمی تغییر استفاده شد (Chang et al., 2002). ابتدا 250 میکرولیتر از محلول کلریدآلومینیوم 10 درصد (جرمی-حجمی)، 250 میکرولیتر پتاسیماستات یک مولار به یک میلیلیتر عصاره حاصل اضافه شد و مقادیر جذب نمونهها با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 498 نانومتر اندازهگیری شد. منحنی استاندارد کوئرستین با غلظتهای مختلف کوئرستین (صفر، 25، 50 و 100 میلیگرم در لیتر متانول) تهیه و برای کمی‌سازی میزان فلاونوئید کل در نمونهها استفاده شد. سپس از فرمول T=(C ×V)/M مقدار فلاونوئید بر حسب میلیگرم در یک گرم کالوس محاسبه شد. در این فرمول T، میزان فلاونوئید بر حسب میلیگرم در گرم کالوس؛C ، غلظت فلاونوئید بر حسب میلیگرم کوئرستین در میلیلیتر؛V ، حجم نهایی عصاره و M، وزن نمونه (کالوس برحسب گرم) است. برای اندازهگیری مقدار آنتوسیانین نمونههای کالوس از روش Wagnerاستفاده شد (Wagner, 1979). همچنین جذب نوری عصاره حاصل با دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج 550 نانومتر اندازهگیری شد. سپس میزان آنتوسیانین با فرمولA=εbc و ضریب خاموشیM-1cm-1 33000 محاسبه شد. در فرمول فوق A برابر مقدار عدد جذبی، b برابر عرض کووت، ε برابر ضریب خاموشی و c برابر غلظت آنتوسیانین است.
طرح آزمایشی و تجزیه آماری
این پژوهش به صورت آزمایش طرح کامل تصادفی با سه تکرار انجام شد. قبل از انجام تجزیه و تحلیل دادهها، تست نرمال بودن توزیع دادهها با آزمون تک نمونهای کولموگروف- اسمیرنوف انجام شد. تجزیه و تحلیل دادهها با نرمافزار SPSS ver. 26 و رسم نمودارها با نرمافزار EXCEL انجام شد.
نتایج
طبق نتایج به دست آمده از جدول تجزیه واریانس دادهها (جدول2)، درصد تولید کالوس، درصد تولید ریشه و اندام هوایی از کالوس حاصل و وزن تر کالوس جمع آوری شده از ریزنمونههای گیاه رازیانه کشت شده در شرایط درون شیشهای به طور معنیداری (در سطح احتمال یک درصد) تحت تأثیر نوع و غلظت اکسین و سیتوکینین قرار گرفتند (جدول2).
جدول2- تجزیه واریانس تأثیر نوع و غلظتهای مختلف تنظیمکنندههای رشد گیاهی بر درصد تولید کالوس، درصد تولید ریشه و اندام هوایی از کالوس حاصل و وزن تر کالوس ریزنمونههای گیاه رازیانه ( F. vulgare) در شرایط درون شیشهای
Table 2- Variance analysis of the effect of different types and concentrations of plant growth regulators on the percentage of callus production, the percentage of root and shoot production from the resulting callus tissue and callus fresh weight of (F. vulgare) in in vitro
|
منبع تغییرات Source of Variation |
df |
|
|
|
MSمیانگین مربعات |
|
|
|
|
تولید کالوس (%) Callus production (%) |
|
تولید ریشه (%) Root production (%) |
تولید اندام هوایی (%) Shoot production (%) |
وزن تر کالوس (گرم) Fresh weight of callus (gr) |
|
|
تیمار Treatment |
64 |
1739.81 ** |
|
2546.05 ** |
2003.50 ** |
1.35 ** |
|
|
خطا Error |
130 |
50.12 |
|
41.29 |
31.89 |
0.01 |
|
|
CV% |
- |
10.59 |
|
34.08 |
31.24 |
15.62 |
|
ns, ** and *: Non-significant and significant at 1 and 5 % level of probability, respectively.
طبق نتایج حاصل از جدول مقایسه میانگینها (جدول3)، اختلاف معنیداری بین انواع اکسین و غلظتهای مختلف آن درون محیط کشت پایه MS از نظر درصد تولید کالوس از ریزنمونههای گیاه رازیانه و وزن تر آن و درصد تولید ریشه و اندام هوایی از بافت کالوس حاصل مشاهده شد. با توجه به نتایج جدول 3، از نظر درصد تولید کالوس از ریزنمونههای گیاه رازیانه بین تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیم کنندههای رشد گیاهی) و سایر تیمارهای هورمونی در غلظتهای مختلف اختلاف معنیداری مشاهده شد. بیشترین درصد تولید کالوس (33/93 درصد) مربوط به محیط کشت MS حاوی NAA در غلظت 2 میلیگرم برلیتر است که به طور معنیداری بیشتر از تیمار شاهد و سایر تیمارهای هورمونی است. طبق نتایج به دست آمده از نظر انواع اکسین مورد استفاده جهت تولید کالوس نیز بین 2,4-D و NAA (در اکثر موارد) اختلاف معنیداری مشاهده نشد. همچنین استفاده از IBA نسبت به 2,4-D یا NAA به طور معنیداری درصد تولید کالوس از ریزنمونههای گیاه رازیانه را کاهش داد. علاوهبر این بین غلظتهای مختلف اکسین مورد استفاده نیز در همه موارد (2,4-D یا NAA یا IBA) استفاده از 2 میلیگرم بر لیتر نسبت به سایر غلظتهای استفاده شده بهترین عملکرد را از نظر درصد تولید کالوس داشته است (جدول3). از نظر درصد تولید ریشه از کالوس حاصل نیز بین تیمار شاهد و سایر تیمارهای مورد استفاده اختلاف معنیدار کاملاً مشخصی مشاهده شد (جدول3). به طوریکه کمترین میزان تولید ریشه از بافت کالوس ریز نمونه گیاه رازیانه (صفر درصد) مربوط به تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیم کنندههای رشد گیاهی) است. این درحالی است که بیشترین میزان تولید ریشه (37/31 درصد) نیز مربوط به محیط کشت دارای 2 میلیگرم بر لیتر 2,4-Dبود. طبق نتایج حاصل در بین انواع اکسین مورد استفاده، بیشترین درصد تولید ریشه از بافت کالوس حاصل مربوط به 2,4-D بود. کمترین درصد تولید کالوس نیز مربوط به NAA در غلظتهای مختلف است (جدول3). از نظر غلظتهای مختلف اکسین مورد استفاده نیز بالاترین درصد تولید ریشه از کالوس حاصل درون محیط کشتهای دارای 2,4-D یا NAA مربوط به غلظت 2 میلیگرم بر لیتر بود، این امر در مورد IBA مربوط به غلظت 4 میلیگرم بر لیتر مشاهده شد. همچنین از نظر درصد تولید اندام هوایی نیز بین نوع اکسین و انواع غلظتهای آن اختلاف معنیداری بین تیمار شاهد و تیمارهای هورمونی مشاهده شد. بیشترین درصد تولید اندام هوایی از بافت کالوس حاصل (96/25 درصد) مربوط به محیط کشت حاوی 1 میلیگرم بر لیتر 2,4-D است. به طور کلی استفاده از 2,4-D در غلظتهای مختلف در مقایسه با NAA یا IBA از نظر درصد تولید اندام هوایی از بافت کالوس حاصل عملکرد معنیدار و بهتری داشته است (جدول3). همچنین از نظر میانگین وزن تر نمونه کالوسهای جمعآوری شده بین محیط کشتهای دارای اکسین در غلظتهای مختلف و تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیمکنندههای رشد گیاهی) اختلاف معنیداری از نظر آماری مشاهده شد. بیشترین میزان وزن تر کالوس ثبت شده (07/1 گرم) مربوط به محیط کشت MS حاوی 2 میلیگرم بر لیتر NAA بود. از سوی دیگر، بر اساس نتایج به دست آمده (جدول3)، استفاده از NAA در غلظتهای مختلف در مقایسه با 2,4-D و IBA به طور معنیداری از نظر وزن تر بافت کالوس حاصل عملکرد بهتری داشته است.
جدول3- تأثیر نوع و غلظت اکسین بر درصد تولید کالوس، درصد تولید ریشه و اندام هوایی از کالوس و وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونههای گیاه رازیانه (F. vulgare) در شرایط درونشیشهای
Table 3- Effect of type and concentration of auxin on the percentage of callus production, the percentage of root and shoot production from the resulting callus tissue and callus fresh weight of (F. vulgare) in in vitro
|
تیمار Treatment |
تولید کالوس (%) Callus production (%) |
تولید ریشه (%) Root production (%) |
تولید اندام هوایی (%) Shoot production (%) |
وزن تر کالوس (گرم) Fresh weight of callus (gr) |
|
|||||
|
|
MS (control) |
7.33 g * |
0 h |
15.13 bc |
0.08 f |
|||||
|
|
MS+ 0/5 2,4-D |
61.33 ef |
19.16 cde |
15.83 bc |
0.51 de |
|||||
|
|
MS+1 2,4-D |
72 cd |
24.71 abc |
25.96 a |
0.63 cde |
|||||
|
|
MS+2 2,4-D |
81.33 bc |
31.37 a |
19.16 b |
0.73 bc |
|||||
|
|
MS+4 2,4-D |
80.66 bc |
30.26 ab |
11.80 cd |
0.73 bc |
|||||
|
|
MS + 0/5 NAA |
72 cd |
7.51 g |
12.08 cd |
0.68 cd |
|||||
|
|
MS +1 NAA |
84.4 b |
8.75 g |
6.25 def |
0.90 ab |
|||||
|
|
MS +2 NAA |
93.33 a |
12.91 efg |
4.16 ef |
1.07 a |
|||||
|
|
MS + 4 NAA |
83.33 b |
11.66 fg |
2.50 f |
0.96 a |
|||||
|
|
MS+ 0/5 IBA |
51.33 f |
15.97 def |
11.25 cde |
0.45 e |
|||||
|
|
MS+ 1 IBA |
56.66 ef |
20.69 cd |
9.58 c-f |
0.49 de |
|||||
|
|
MS+ 2 IBA |
64.44 de |
23.60 bc |
5 def |
0.60 cde |
|||||
|
|
MS+ 4 IBA |
58.66 ef |
25.82 abc |
2.5 f |
0.51 de |
|||||
*Different letters indicate a significant difference at the 5% probability level.
طبق نتایج حاصل از جدول مقایسه میانگین دادهها (جدول4)، از نظر اثر متقابل نوع اکسین- نوع سیتوکینین مورد استفاده درون محیط کشت گیاهی بین تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیمکنندههای رشد گیاهی) و تیمارهای هورمونی مورد استفاده از نظر درصد تولید کالوس از ریزنمونههای گیاه رازیانه و وزن تر آن و نیز درصد تولید ریشه و اندام هوایی از کالوس حاصل اختلاف معنیداری مشاهده شد. بیشترین درصد تولید کالوس و وزن تر آن (به ترتیب 95 درصد و 16/1 گرم) زمانی مشاهده شد که از ترکیب هورمونی NAA به همراه Kin استفاده شده بود. با توجه به جدول-4، استفاده از Kin به عنوان سیتوکینین در ترکیب با 2,4-D یا NAA و یا IBA در مقایسه یا BAP از نظر درصد تولید بافت کالوس و وزن تر آن عملکرد معنیدار و بهتری داشته است. از نظر درصد تولید ریشه و اندام هوایی از بافت کالوس حاصل نیز بیشترین مقدار به ترتیب (14/33 و 32/19 درصد) مربوط به محیط کشت MS+ 2,4-D + BAP بود. برخلاف نتایج حاصل از درصد تولید بافت کالوس و وزن تر آن، استفاده از Kin به عنوان سیتوکینین درصد تولید ریشه و اندام هوایی از بافت کالوس حاصل را در مقایسه با BAP به طور معنیداری کاهش میدهد.
جدول4- اثر متقابل نوع اکسین-نوع سیتوکینین بر درصد تولید کالوس، درصد تولید ریشه و اندام هوایی از کالوس و وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونههای گیاه رازیانه (F. vulgare) در شرایط درونشیشهای
Table 4- The interaction effect of auxin type-cytokinin type on the percentage of callus production, the percentage of root and shoot production from the resulting callus tissue and callus fresh weight of (F. vulgare) in in vitro
|
تیمار Treatment |
تولید کالوس (%) Callus production (%) |
تولید ریشه (%) Root production (%) |
تولید اندام هوایی (%) Shoot production (%) |
وزن تر کالوس (گرم) Fresh weight of callus (gr) |
|
|||||
|
|
MS (control) |
40.78 e * |
7.10 d |
7.51 cd |
0.25 d |
|||||
|
|
MS+ 2,4-D + BAP |
72.91 c |
33.14 a |
29.32 a |
0.59 c |
|||||
|
|
MS+ 2,4-D + Kin |
85.83 b |
25.51 b |
13.80 b |
0.87 b |
|||||
|
|
MS+ NAA + BAP |
83.83 b |
14.59 c |
9.63 bc |
0.92 b |
|||||
|
|
MS+ NAA + Kin |
95 a |
7.29 d |
4.16 d |
1.16 a |
|||||
|
|
MS+ IBA + BAP |
57.91 d |
22.91 b |
9.89 bc |
0.52 c |
|||||
|
|
MS+ IBA + Kin |
61.25 d |
26.72 b |
5.46 cd |
0.61 c |
|||||
* Different letters indicate a significant difference at the 5% probability level.
طبق نتایج به دست آمده از مقایسه میانگین دادهها (شکل1-A)، بین تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیمکنندههای رشد گیاهی) و اکثر تیمارهای هورمونی از نظر درصد تولید کالوس از ریزنمونههای گیاه رازیانه اختلاف معنیداری مشاهده شد. بین تیمار شاهد و محیط کشت فقط حاوی سیتوکینین (BAP و Kin در غلظتهای 1/0 و 5/0 میلیگرم بر لیتر) از نظر آماری اختلاف معنیداری مشاهده نشد. از سوی دیگر، استفاده از اکسینهای مختلف بدون حضور سیتوکینین (در غلظتهای مختلف) به طور معنیداری درصد تولید کالوس را نسبت به تیمار شاهد افزایش داد. همچنین استفاده از اکسین و سیتوکینین در غلظتهای مختلف (در ترکیب با همدیگر و در یک محیط کشت) به ویژه استفاده از BAP یا Kin به همراه 2,4-D و BAP یا Kin به همراه NAA درصد تولید کالوس از ریزنمونههای گیاه رازیانه را نسبت به تیمار شاهد، تیمار هورمونی فقط دارای سیتوکینین (BAP یا Kin) و تیمار هورمونی فقط دارای اکسین به طور معنیداری افزایش داد (شکل1-A). همچنین استفاده از BAP یا Kin به عنوان سیتوکینین در ترکیب با IBA در مقایسه با تیمار هورمونی فقط دارای اکسین، تأثیر معنیداری بر درصد تولید کالوس از ریزنمونههای گیاه رازیانه نداشته است. همچنین استفاده از Kin (به ویژه در غلظتهای پائینتر) به همراه NAA (در اکثر غلظتها) درصد تولید کالوس ریزنمونههای گیاه رازیانه را در مقایسه با اکثر تیمارهای هورمونی افزایش داد. بهطوری که بالاترین درصد تولید کالوس (100 درصد) از ریزنمونههای گیاه رازیانه بیشتر در این تیمار هورمونی مشاهده شد (شکل2- Bو C). طبق نتایج به دست آمده بین تیمارهای هورمونی فقط دارای اکسین (در غلظتهای مختلف) استفاده از NAA در غلظت 2 میلیگرم بر لیتر (به تنهایی و بدون ترکیب با سیتوکینین) به طور معنیداری درصد تولید کالوس را در مقایسه با سایر تیمارها تا 66/76 درصد افزایش داد. از سوی دیگر در بین محیط کشتهای دارای فقط اکسین کمترین درصد تولید کالوس (40 درصد) مربوط به محیط کشتهای MS+0/5 2,4-D و MS+0/5 IBA بود (شکل1-A). همچنین طبق نتایج حاصل از مقایسه میانگین دادهها (شکل1-B)، بین تیمار شاهد و اکثر تیمارهای هورمونی از نظر درصد تولید ریشه از بافت کالوس حاصل اختلاف معنیداری مشاهده شد. از سوی دیگر بین تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیم کنندههای رشد گیاهی) و محیط کشت فقط دارای سیتوکینین (BAP یا Kin) و محیط کشت MS دارای NAA (5/0 یا 1 یا 2 میلیگرم بر لیتر) به همراه 1/0 میلیگرم بر لیتر Kin اختلاف معنیداری مشاهده نشد. همچنین بین محیط کشتهای دارای فقط اکسین (در غلظتهای مختلف) نیز اختلاف معنیداری مشاهده نشد. همچنین بین محیط کشتهای دارای فقط 2,4-D یا IBA (در غلظتهای مختلف) و محیط کشتهای دارای 2,4-D یا IBA به همراه BAP یا Kin (در غلظتهای مختلف) اختلاف معنیداری از نظر آماری مشاهده شد (شکل1-B). امّا اختلاف معنیداری بین محیط کشت دارای فقط NAA و محیط کشت دارای NAA به همراه BAP یا Kin مشاهده نشد. بیشترین درصد تولید ریشه از بافت کالوس حاصل شده از ریز نمونه گیاه رازیانه (100 درصد) مربوط به محیط کشت MS+2 2,4-D+0/1BAP بود (شکل2-D و E). از نظر درصد تولید اندام هوایی از بافت کالوس حاصل نیز بین تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیمکنندههای رشد گیاهی) و اکثر تیمارهای هورمونی اختلاف معنیداری مشاهده نشد (شکل1-C). همانطوری که در شکل1-C مشاهده میشود از نظر درصد تولید ریشه از بافت کالوس حاصل از ریزنمونههای گیاه رازیانه بین تیمار شاهد و محیط کشتهای دارای فقط سیتوکینین (BAP یا Kin در غلظتهای مختلف) و همچنین محیط کشتهای دارای 2,4-D (در غلظتهای 5/0 یا 1 یا 2 یا 4 میلیگرم بر لیتر) به همراه BAP (در غلظتهای 1/0 یا 5/0 میلیگرم بر لیتر) اختلاف معنیداری مشاهده شد. همچنین بیشترین درصد تولید اندام هوایی از بافت کالوس حاصل (53/55 درصد) نیز مربوط به محیط کشت MS+1 2,4-D+0/5BAP بود (شکل1-C) (شکل2-F وG). همچنین از نظر وزن کالوس به دست آمده نیز بین تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیمکنندههای رشد گیاهی) و محیط کشتهای دارای فقط سیتوکینین اختلاف معنیداری مشاهده نشد. اما بین تیمار شاهد و محیط کشتهای دارای فقط اکسین و محیط کشتهای دارای اکسین به همراه سیتوکینین (در غلظتهای مختلف و در ترکیب با یکدیگر) اختلاف معنیداری مشاهده شد (شکل1-D). بیشترین میزان وزن کالوس جمعآوری شده از محیطهای کشت (43/1 گرم) مربوط به محیط کشت MS+2NAA+0.1BAP بود (شکل1-D) (شکل2-H). همانطوریکه از شکل 1-D استنباط میشود استفاده از 2,4-D در ترکیب با Kin و نیز استفاده از NAA در ترکیب با BAP یا Kin تأثیر بیشتری بر وزن تر کالوس حاصل از ریز نمونههای گیاه رازیانه دارد. نوع (زبر یا نرم بودن بافت کالوس حاصل) و رنگ آن در جدول7 و به صورت کیفی نشان داده شده است. طبق نتایج حاصل اکثر کالوسهای حاصل از ریز نمونههای گیاه رازیانه به رنگ قهوهای و از نوع نرم بودند (شکل2-K). امّا نمونه کالوسهای به دست آمده از محیط کشتهای حاوی غلظتهای مختلف NAA به همراه 1/0 میلیگرم بر لیتر Kin سبز رنگ و از نوع زبر بودند (شکل2-I و L).
شکل 1 - تأثیر تنظیمکنندههای رشد گیاهی: A) درصد تولید کالوس، B و C) درصد تولید ریشه و اندام هوایی از بافت کالوس حاصل (به ترتیب) و D) وزن تر بافت کالوس حاصل.
Figure 1- Effect of plant growth regulators: A) Callus production percentage,( B and C) The percentage of root and shoot production from the resulting callus tissue (respectively) and( D) Fresh weight of the resulting callus tissue
.jpg)
شکل 2- استقرار و تولید کالوس توسط ریزنمونههای گیاه رازیانه (F. vulgare) در شرایط درونشیشهای. A) تیمار کنترل محیط کشت MS فاقد تنظیم کنندههای رشد گیاهی، B وC ) تولید بافت کالوس از محیط کشت MS+1 NAA+0.1 Kin و MS+2 NAA+0.1 Kin (به ترتیب)، D وE) تولید ریشه از بافت کالوس و محیط کشت MS+4 2,4-D+0.1 BAP و MS+2 2,4-D +0.1 BAP(به ترتیب)، G و F) تولید شاخساره از بافت کالوس محیط کشت MS+0.5 BAP و MS+1 2,4-D +0.5 BAP (به ترتیب)، H) بیشترین وزن تازه ثبت شده بافت کالوس MS+2 NAA +0.1 BAP، I) تولید بافت کالوس با رنگ سبز محیط کشت MS+0.5 BAP و MS+2 NAA +0.1 Kin، J) تولید بافت کالوس با رنگ سفید محیط کشت MS+0.5 NAA +0.1 BAP، K) تولید بافت کالوس با رنگ قهوهای محیط کشت MS+2 IBA +0.1 BAP، L) تولید بافت کالوس زبر محیط کشت MS+2 2,4-D +0.5 BAP.
Figure 2- Establishment and production of callus tissue by fennel (F. vulgare) explants in in vitro. A) Control (MS without plant growth regulators), B and C) production of callus tissue (MS+1NAA+0/1Kin and MS+2NAA+0/1Kin (respectively)), D and E) root production from callus tissue (MS+4 2,4-D+0/1BAP and MS+2 2,4-D +0/1BAP(respectively)), F and G) shoot production from callus tissue (MS+0/5BAP and MS+1 2,4-D + 0/5BAP(respectively)), H) The highest fresh weight of callus recorded (MS+2 NAA + 0/1BAP), I) callus with green color (MS+2 NAA + 0/1Kin), J) callus with white color (MS+0.5 NAA + 0/1BAP), K) callus with brown color (MS+2 IBA + 0/1BAP), L) rough callus (MS+2 2,4-D+0/5BAP).
بررسی میزان ترکیبات بیوشیمیایی نمونه کالوسهای منتخب
نتایج حاصل از تجزیه دادهها نشان دادند انواع مختلف تنظیمکنندههای رشد گیاهی بهطور معنیداری و در سطح احتمال 1 درصد بر میزان فعالیت آنزیمهای پراکسیداز و کاتالاز، میزان تجمع اسید آمینه پرولین، فلاونوئیدکل و آنتوسیانین نمونه کالوسهای گیاه رازیانه (F. vulgare) در شرایط درونشیشهای موثر است (جدول6).
جدول6- تجزیه واریانس تأثیر تنظیمکنندههای رشد گیاهی بر ویژگیهای بیوشیمیایی و متابولیتهای ثانویه نمونه کالوسهای گیاه رازیانه (F. vulgare) در شرایط درونشیشهای
Table 6- Mean square effect of plant growth regulators on biochemical characteristics and secondary metabolites of callus samples of (F. vulgare) in in vitro conditions
|
میانگین مربعات MS |
درجه آزادی df |
منبع تغییرات Source of Variation |
|
|||||||
|
|
آنتوسیانین Anthocyanin |
فلاونوئید Flavonoid |
پرولین Perolin |
کاتالاز Catalase |
پراکسیداز Peroxidase |
|
|
|||
|
|
12.76 ** |
0.19 ** |
0.38 ** |
492908.51 ns |
14257.30 ** |
24 |
تیمار Treatment |
|||
|
|
1.18 |
0.003 |
0.006 |
50088.23 |
1443.85 |
50 |
خطا Error |
|||
|
|
17.16 |
27.38 |
8.24 |
29.97 |
32.14 |
- |
CV (%) ضریب تغییرات |
|||
ns, ** and *: Non-significant and significant at 1 and 5 % level of probability, respectively.
طبق نتایج حاصل از مقایسه میانگین دادهها (جدول7)، از نظر فعالیت آنزیم پراکسیداز و کاتالاز، تجمع اسیدآمینه پرولین، میزان فلاونوئیدکل و آنتوسیانین نمونه کالوسهای گیاه رازیانه (F. vulgare) جمعآوری شده بین اکثر تیمارها اختلاف معنیداری مشاهده نشد.
جدول 7- تأثیر تنظیمکنندههای رشد گیاهی مختلف بر میزان فعالیت آنزیمهای پراکسیداز و کاتالاز، میزان تجمع اسید آمینه پرولین، فلاونوئیدکل و آنتوسیانین نمونه کالوسهای گیاه رازیانه (F. vulgare) در شرایط درونشیشهای
Table 7- The effect of different plant growth regulators on the activity level of peroxidase and catalase enzymes, the amount of amino acid accumulation of proline, flavonoids, and anthocyanin in callus samples of fennel plant (F. vulgare) in in vitro conditions
|
Anthocyanin (µmol.g-1 ) |
Flavonoid (mg Quercetin.g-1) |
Prolin (µg.mg-1) |
Catalase protein) (µmol H2O2 min-1 mg-1 |
Peroxidase protein) (µmol H2O2 min-1 mg-1 |
Cell media (MS) |
||||||
|
5.55 efg |
0.10 fg |
0.62 ij |
708.80 bc |
89.54 def * |
MS (free) |
|
|||||
|
9.50 a |
0.29 abc |
0.62 ij |
608.62 c |
100.23 def |
1 2,4-D+0.1 BAP |
|
|||||
|
7.17 b-e |
0.20 c-f |
0.60 j |
689.33 bc |
95.13 def |
2 2,4-D+0.1 BAP |
|
|||||
|
8.48 ab |
0.38 a |
0.83 fg |
575.38 c |
87.81 def |
1 2,4-D+0.5 BAP |
|
|||||
|
9.80 a |
0.34 ab |
0.73 g-j |
515.43 c |
80.02 ef |
2 2,4-D+0.5 BAP |
|
|||||
|
5.85 d-g |
0.15 def |
0.60 j |
480.19 c |
70.40 e |
1 2,4-D+0.1 Kin |
|
|||||
|
7.77 a-d |
0.20 c-f |
0.73 g-j |
498.11 c |
80.13 ef |
2 2,4-D+0.1 Kin |
|
|||||
|
7.77 a-d |
0.24 cd |
0.68 hij |
444.16 c |
67.73 e |
1 2,4-D+0.5 Kin |
|
|||||
|
8.68 ab |
0.21cde |
0.75 ghi |
424.44 c |
86.36 ef |
2 2,4-D+0.5 Kin |
|
|||||
|
6.16 c-g |
0.17 def |
0.70 g-j |
465.13 c |
75.30 ef |
1 NAA+0.1 BAP |
|
|||||
|
7.97 abc |
0.20 c-f |
0.75 ghi |
443.63 c |
68.67 e |
2 NAA+0.1 BAP |
|
|||||
|
8.98 ab |
0.22 cde |
0.75 ghi |
389.44 c |
80.88 ef |
1 NAA+0.5 BAP |
|
|||||
|
8.88 ab |
0.38 a |
0.75 ghi |
487.85 c |
87.80 def |
2 NAA+0.5 BAP |
|
|||||
|
5.15 e-h |
0.04 g |
0.79 fgh |
743.40 bc |
96.84 def |
1 0.5 NAA+0.1 Kin |
|
|||||
|
5.75 d-g |
0.11efg |
0.99 e |
627.40 c |
100.89 def |
2 NAA+0.1 Kin |
|
|||||
|
6.06 c-g |
0.15 def |
0.78 fgh |
459.22 c |
73.68 ef |
1 NAA+0.5 Kin |
|
|||||
|
6.46 c-f |
0.21 cde |
0.9 ef |
383.65 c |
66.53 e |
2 NAA+0.5 Kin |
|
|||||
|
4.44 f-i |
0.15 def |
1.01 e |
691.42 bc |
101.15 def |
1 IBA+0.1 BAP |
|
|||||
|
4.44 f-i |
0.17 def |
1.23 cd |
1064.85 b |
161.36 cd |
2 IBA+0.1 BAP |
|
|||||
|
3.03 i |
0.25 bcd |
1.79 a |
1813.89 a |
273.45 a |
1 IBA+0.5 BAP |
|
|||||
|
4.44 f-i |
0.18 def |
1.29 c |
1081.99 b |
149.78cde |
2 IBA+0.5 BAP |
|
|||||
|
5.55 e-h |
0.15 def |
1.20 cd |
794.58 bc |
104.09 def |
1 IBA+0.1 Kin |
|
|||||
|
3.43 hi |
0.19 def |
1.46 b |
1105.03 b |
203.93 bc |
2 IBA+0.1 Kin |
|
|||||
|
4.24 ghi |
0.18 def |
1.16 d |
1516.20 a |
227.37 b |
1 IBA+0.5 Kin |
|
|||||
|
3.13 hi |
0.21cde |
1.53b |
1610.75 a |
265.64 b |
2 IBA+0.5 Kin |
|
|||||
* Different letters in each column indicate statistically significant differences at the 5% probability level of Duncan's Multiple Range Test (DMRT).
بیشترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز و کاتالاز (به ترتیب 45/273 و 89/1813 µmol H2O2 min-1 mg-1) و تجمع اسیدآمینه پرولین (79/1 میکروگرم در میلیگرم) مربوط به محیط کشت MS+1 IBA+0.5 BAP بود. همچنین بیشترین مقدار فلاونوئید (38/0mg.Quercetin.g-1 ) مربوط به محیط کشت MS+2 NAA+0.5 BAP و بیشترین مقدار آنتوسیانین (80/9 µmol.g-1) نیز مربوط به محیط کشت MS+2 2,4-D+0.5 BAP مشاهده شدند.
بحث
تنظیمکنندههای رشد گیاهی بهویژه اکسینها و سیتوکینینها در شرایط طبیعی و آزمایشگاهی (in vitro) رشد و نمو سلولهای گیاهی را کنترل میکنند. اکسینها و سیتوکینینها در تقسیم سلولی، رشد سلولی و اندامزایی گیاهان نقش بسیار مهمی دارند. اکسینها با اسیدی نمودن دیواره سلولی و افزایش قدرت توسعه‌پذیری آن منجر به رشد سلولی میشوند. سیتوکینینها با تنظیم سنتز پروتئین‌های درگیر در شکل‌گیری دوک‌های میتوزی بهطور مستقیم چرخه سلولی را تحت تأثیر قرار می‌دهند (Noruzpour et al., 2022). در پژوهش حاضر، از 2,4-D، NAA و IBA به عنوان اکسین و BAP و Kin به عنوان سیتوکینین (در غلظتهای مختلف) جهت بررسی تأثیر این نوع از تنظیمکنندههای رشد گیاهی (به تنهایی و در ترکیب با یکدیگر) بر درصد تولید کالوس، درصد تولید ریشه و اندام هوایی از بافت کالوس حاصل و وزن تر کالوس تولید شده از ریزنمونههای گیاه رازیانه درون محیط کشت پایه MS استفاده شد. طبق نتایج حاصل در این پژوهش افزودن NAA در غلظت 2 میلیگرم بر لیتر به درون محیط کشت در مقایسه با سایر اکسینها در غلظتهای مختلف درصد تولید کالوس از ریزنمونههای گیاه رازیانه (F. vulgare) و وزن تر آن را به طور معنیداری افزایش میدهد (جدول3). استفاده از NAA به جای 2,4-D و IAA میزان القا و تولید کالوس در ریزنمونههای گیاه مارچوبه (Asparagus densiflorus) را تا 100 درصد افزایش میدهد (Toma & Rsheed, 2012). طبق یافتهها بیشترین درصد تولید کالوس و وزن تر آن زمانی به دست آمد که از غلظتهای بالاتر اکسینهای مختلف (2 و 4 میلیگرم بر میلی لیتر) درون محیط کشت استفاده شده است (جدول3). همچنین طبق نتایج این پژوهش، از نظر نوع و غلظتهای مختلف اکسین مورد استفاده درون محیط کشت، بالاترین درصد تولید ریشه از بافت کالوس حاصل زمانی به دست آمد که از 2,4-D (به تنهایی و یا در ترکیب با سیتوکینینهای مختلف) و در غلظت 2 میلیگرم بر لیتر استفاده شده باشد (جدول3). از نظر درصد تولید اندام هوایی از بافت کالوس به دست آمده نیز استفاده از 2,4-D و در غلظت 1 میلیگرم بر لیتر (به تنهایی و یا در ترکیب با سیتوکینینهای مختلف) به طور معنیداری عملکرد بهتری نسبت به سایر اکسینهای مورد استفاده درون محیط کشت داشته است (جدول3). از سوی دیگر، طبق یافتهها (جدول-4)، استفاده از Kin (به تنهایی و یا در ترکیب با اکسینهای مختلف) در ترکیب با اکسین های مختلف به جای BAP تأثیر معنیداری بر درصد تولید کالوس و وزن تر کالوس حاصل داشته است. مطابق با نتایج پژوهش حاضر، Zare et al., (2021) بیان کردند استفاده از Kin در مقایسه با BA تولید کالوس از ریزنمونههای گیاه Stevia rebaudiana را به طور معنیداری افزایش میدهد (Zare et al., 2021). همچنین مشخص شد بیشترین درصد تولید ریشه و اندام هوایی از بافت کالوس ریزنمونههای گیاه رازیانه مربوط به محیط کشت دارای BAP به عنوان سیتوکینین و 2,4-D به عنوان اکسین بوده است (جدول-4). نتایج نشان دادند از نظر درصد تولید ریشه و اندام هوایی استفاده از BAP به جای Kin عملکرد بهتری دارد.et al., (2018) Hu، با بررسی نوع سیتوکینین مورد استفاده جهت تولید اندام هوایی از بافت کالوس گیاه Papaver pseudo-orientale نشان دادند بیشترین درصد تولید اندام هوایی مربوط به محیط کشت حاوی 5/0 میلیگرم بر لیتر Kin (در ترکیب با اکسینهای مختلف) بود (Hu et al., 2018). از سوی دیگر، طبق نتایج این پژوهش (شکل1-A وD) از نظر درصد تولید کالوس و وزن تر حاصل از ریزنمونه های گیاه رازیانه، بین محیط کشت دارای فقط سیتوکینین (Kin یا BAP) و تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیمکنندههای رشد گیاهی) اختلاف معنیداری مشاهده نشد. امّا با افزودن اکسین به محیط کشت دارای سیتوکینین درصد تولید کالوس و وزن تر آن به طور معنیداری افزایش یافت (شکل1-A و D). استفاده از Kin در غلظتهای 5/0، 1 و 2 میلیگرم برلیتر (به تنهایی و بدون اکسین) امکان تولید کالوس از ریزنمونههای گیاه پریوش(Catharanthus roseus) را در مقایسه با ترکیب اکسین/سیتوکینین به طور معنیداری کاهش میدهد (Rahman et al., 2019).et al (2012) Arivalagan, با بررسی تأثیر انواع تنظیمکنندههای رشد گیاهی بر میزان تولید کالوس حاصل از ریزنمونههای گیاه endogynous Sauropus بیان کردند هیچ بافت کالوسی از محیط کشت حاوی Kin به تنهایی حاصل نمیشود و افزودن NAA به عنوان اکسین به محیط کشت دارای Kin تولید کالوس را القا میکند (Arivalagan et al., 2012). همچنینet al (2019) Rahman,، نشان دادند افزودن Kin (به ویژه در غلظتهای پائینتر) به عنوان سیتوکینین به محیط کشت حاوی اکسین القا و تولید کالوس را در ریزنمونههای پریوش در مقایسه با محیط کشت حاوی فقط اکسین را به طور معنیداری افزایش میدهد (Rahman et al., 2019)، که با نتایج این پژوهش مطابقت دارد. با توجه به شکل 1-A و D استفاده هم زمان از Kin یا BAP (به عنوان سیتوکینین) و 2,4-D یا NAA یا IBA (به عنوان اکسین) درون محیط کشت جهت القا و تولید کالوس از ریزنمونههای گیاه رازیانه، عملکرد معنیدار و بهتری را نسبت به محیط کشت دارای فقط اکسین یا فقط سیتوکینین نشان میدهد. طبق نتایج حاصل از مقایسه میانگین دادهها استفاده از Kin در ترکیب با NAA درصد تولید کالوس از ریزنمونه های گیاه رازیانه را افزایش می دهد (شکل1-A). همچنین بر اساس شکل1-A در اکثر موارد کاهش غلظت سیتوکینینها و افزایش غلظت اکسینها تولید کالوس را در ریزنمونههای گیاه رازیانه افزایش داد که نتایج این پژوهش با یافتههای سایر پژوهشگران بسیار مشابه است. افزایش غلظت NAA از 5/0 میلیگرم بر لیتر به 1 و 2 میلیگرم بر لیتر در کنار کاهش غلظت Kin درون محیط کشت MS میزان کالوسزایی ریزنمونههای گیاه رازیانه (F. vulgare) را افزایش میدهد (Hussian et al., 2021). این درحالی است که طبق نتایج پژوهش حاضر، بین تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیمکنندههای رشد گیاهی) و محیط کشت های دارای فقط اکسین و اکسین/سیتوکینین از نظر درصد تولید ریشه از بافت کالوس به دست آمده از ریزنمونههای گیاه رازیانه در شرایط درونشیشهای اختلاف معنیداری مشاهده شد (شکل1-B). بیشترین درصد تولید ریشه از بافت کالوس نیز (50 درصد) مربوط به محیط کشت MS+4 2,4-D+1.0 BAP بود.(2020) & Sharma Mandal، با بررسی تأثیر محیط کشتهای مختلف جهت باززایی گیاه رازیانه Foeniculum vulgare بیان کردند بهترین محیط کشت و تیمار هورمونی برای تولید ریشه از بافت کالوس این گیاه محیط کشت SH به همراه 1 میلیگرم بر لیتر NAA و 5/0 میلیگرم بر BAP است (Sharma & Mandal, 2020). از نظر درصد تولید اندام هوایی از بافت کالوس گیاه رازیانه نیز مشخص شد استفاده از BAP در مقایسه با Kin شاخسارههای بیشتری تولید میشود (شکل1-C). بیشترین درصد تولید اندام هوایی (53/55 درصد) مربوط به محیط کشت MS+1 2,4-D+5.0 BAP بود. بهترین محیط کشت به همراه تنظیمکنندههای رشد گیاهی جهت تولید شاخههای نابهجا از بافت کالوس گیاه رازیانه Foeniculum vulgare در فرایند باززایی گیاهی مربوط به محیط کشت SH حاوی 5/0 میلی گرم بر لیتر NAA به همراه 1 میلیگرم بر لیتر BA است (Sharma & Mandal, 2020). کشت سلولهای گیاهی یک منبع مناسب و مهم برای تولید متابولیتهای ثانویه با ارزش در اکثر گیاهان است (Espinosa-Leal et al., 2018). براساس فرضیه توتی‌پتانسی، هر سلول گیاهی تمام اطلاعات ژنتیکی گیاه والد را داراست و می‌تواند دامنه وسیعی از مواد بیوشیمیایی که در گیاه کامل یافت میشود را تولید کند (Fehér, 2019). نوع و مقدار اکسین یا سیتوکنین، یا نسبت اکسین به سیتوکنین، تشکیل و تجمع متابولیتهای ثانویه را در سلولهای گیاهی کشت شده تغییر میدهد (Hussain et al., 2021). استفاده از BAP، 2ip و زآتین تأثیر مناسبی بر سطح متابولیتهای ثانویه در بسیاری از آزمایشهای داشته است. همچنین مشخص شده است جیبرلیکاسید و آبسیزیکاسید، تولید آنتوسیانین را در برخی از کشتهای درونشیشه متوقف میسازند (Hu et al., 2018). در بسیاری از موارد مشاهده شد تنظیمکننده رشد گیاهی 2,4-D مانع تولید متابولیتهای ثانویه میشود. برای مثال، حذف 2,4-D و یا جایگزینی آن با NAA یا IAA سبب افزایش تولید آنتوسیانین در کشت تعلیقی carota Daucus، نیکوتین در کشت تعلیقی Nicotiana tabacum، شیکونین در کشت تعلیقی Portulaca grandiflora میشود (Srivastava, 2018). با وجود این، تحریک توسط 2,4-D در بیوسنتز کارتنوئید در کشت تعلیقی Daucus carota و تولید آنتوسیانین در کشت کالوس Oxolis linearis گزارش شده است ((Nartop, 2018; Ozsan et al., 2018. سیتوکنینها بسته به نوع متابولیت و گونه گیاهی اثرات متفاوتی دارند. برای مثال، Kin تولید آنتوسیانین را در کشت Salix tetrasperma Roxb تحریک کرده ولی مانع تولید آن در کشت سلول جنس Populus میشود (Shahid & Anis, 2018).
نتیجه گیری کلی
با توجه به یافتههای پژوهش حاضر، استفاده از سیتوکینین و اکسین در ترکیب با یکدیگر امکان القاء و تولید کالوس با وزن تر بالا در ریزنمونههای گیاه رازیانه (F. vulgare) را فراهم میکند. این در حالی است که استفاده از سیتوکینین و اکسین به تنهایی درون محیط کشت تأثیر مناسبی بر میزان تولید کالوس ندارد. همچنین نتایج حاصل نشان دادند استفاده از Kin به عنوان سیتوکینین در غلظت 1/0 میلیگرم بر لیتر و NAA به عنوان اکسین در غلظتهای 2 و 4 میلیگرم بر لیتر تأثیر مثبت و معنیداری بر درصد تولید کالوس و وزن کالوس حاصل از ریزنمونههای گیاه رازیانه (F. vulgare) داشته است. در این پژوهش بیشترین درصد تولید ریشه و اندام هوایی از بافت کالوس حاصل زمانی به دست آمد که از 2,4-D (به عنوان اکسین) و BAP (به عنوان سیتوکینین) استفاده شد. همچنین طبق یافتههای پژوهش حاضر، مشخص شد بین میزان فعالیت آنزیمهای پراکسیداز، کاتالاز، تجمع اسیدآمینه پرولین، فلاونوئید و آنتوسیانین و تنظیمکنندههای رشد گیاهی مختلف، اختلاف معنیداری وجود دارد.
)