تأثیر نانو هیدروکسی آپاتیت بر شاخص‌های فیزیولوژیکی و سیستم‌های آنتی اکسیدانی آنزیمی و غیر آنزیمی دو رقم انگور تحت تنش کادمیم در خاک

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه علوم محیطی، پژوهشکده انگور و کشمش، دانشگاه ملایر، ملایر، ایران

2 دانشیار گروه علوم خاک، دانشکدة کشاورزی، دانشگاه ملایر، ملایر، ایران

3 گروه محیط زیست، دانشکده محیط زیست و منابع طبیعی، دانشگاه ملایر، ملایر، ایران

4 گروه مهندسی باغبانی و فضای سبز، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ملایر، ملایر، ایران

چکیده

آلودگی فلزات سنگین به علّت کاربرد بی‌رویه کودها وسموم شیمیایی در محصولات کشاورزی رو به افزایش است. کاربرد نانوذرات می تواند تاحد مطلوبی سبب کاهش آلودگی فلزات سنگین در خاک شود. پژوهش حاضر در بهار 1401 با هدف بررسی تأثیر نانوذره هیدروکسی آپاتیت بر شاخص‌های فیزیولوژیکی و کاهش تنش اکسایشی ناشی از تنش کادمیم (100 میلی‌گرم بر کیلوگرم خاک) در دو رقم انگور (بیدانه‌سفید و پرلت) به صورت آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح کامل تصادفی در گلخانه تحقیقاتی دانشگاه ملایر انجام شد. پس از 60 روز از اعمال تنش کادمیم و کاربرد نانوهیدروکسی آپاتیت (یک درصد وزنی) در گلدان‌ها، نمونه‌های برگ جمع‌آوری و شاخص‌های فیزیولوژیکی و فعالیت آنتی اکسیدانی برگ اندازه‌گیری شدند. نتایج نشان دادند کاربرد نانو هیدروکسی آپاتیت در هر دو رقم سبب افزایش محتوای نسبی آب، کلروفیل، فسفر و افزایش فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، گایاکول‌پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز برگ شد، ولی به کاهش میزان نشت یونی منجر شد. در گیاهان تحت تنش کادمیم بیشترین محتوای کلروفیل مربوط به رقم بیدانه سفید تیمار شده با ترکیب نانو هیدروکسی آپاتیت مشاهده شد که در مقایسه با تاک‌های شاهد تحت تنش کادمیم تا 88/10 درصد بیشتر بود. بیشترین محتوای آب در تاک‌های تحت تنش کادمیم مربوط به تیمار نانو هیدروکسی آپاتیت در رقم بیدانه سفید بود که در مقایسه با تاک‌های شاهد تحت تنش کادمیم 09/4 درصد بیشتر بود. افزایش مقدار آنزیم آسکوربات پراکسیداز در رقم بیدانه سفید در نمونه‌های تحت تنش کادمیم 71/15 درصد و در رقم پرلت 04/13 درصد مشاهده شد. بر اساس نتایج این پژوهش، کاربرد نانو هیدروکسی آپاتیت در خاک تا حدی می‌تواند به‌عنوان یک راهکار مفید، برای کنترل کادمیم در خاک_های مناطق آلوده به این فلز سنگین در نظر گرفته شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

The effect of nano hydroxyapatite on physiological indices and enzymatic and non-enzymatic antioxidant systems of two grape cultivars under cadmium stress in soil

نویسندگان [English]

  • Hoda Karimi 1
  • Shahriar Mahdavi 2
  • Nasrin Hasanzadeh 3
  • Rouholah Karimi 4
1 Department of Environmental Science, Research Institute of Grapes and Raisins, Malayer University, Malayer, Iran
2 Department of Soil Science, Faculty of Agriculture, Malayer University, Malayer, Iran
3 Department of Environment, Faculty of Environment and Natural Resources, Malayer University, Malayer, Iran
4 Departments of Horticulture and Landscape Engineering, Faculty of Agriculture, Malayer University, Malayer, Iran
چکیده [English]

Heavy metals pollution is increasing due to the excessive use of fertilizers and chemical pesticides in agricultural products. The application of nanoparticles can significantly reduce heavy metal pollution in soil. This research was conducted in the spring of 2022 to investigate the effect of nano-hydroxyapatite (n-HAP) on physiological indices and reduce oxidative stress caused by cadmium (Cd) stress (100 mg/kg of soil) in two grape cultivars (Bidaneh-Sefid and Perlette). The study was conducted factorially based on a completely randomized design in the research greenhouse of Malayer University. After 60 days of Cd stress and the application of n-HAP (1% by weight) in the pots, leaf samples were collected, and physiological indices and antioxidant activity were measured. The results showed that the application of n-HAP in both grape cultivars increased relative water content, chlorophyll, phosphorus contents, and the activity of catalase, guaiacol peroxidase, and ascorbate peroxidase enzymes in the leaves, while it reduced ion leakage. In plants under Cd stress, the highest chlorophyll content was observed in the Bidaneh-Sefid cultivar treated with n-HAP, which was 10.88% higher compared to the Cd-treated control vines. Under Cd stress, the highest relative water content was observed in the Bidaneh-Sefid cultivar treated with n-HAP, which was 4.09% higher compared to the control vines under Cd stress. The increase in ascorbate peroxidase enzyme activity was 15.71% in the Bidaneh-Sefid and 13.04% in the Perlette under Cd stress. Also, under Cd stress, the application of n-HAP led to an increase in leaf total phenol and total flavonoid content of the leaf in two grape cultivars. There was no difference in the content of these two secondary metabolites among the grape cultivars grown under Cd stress conditions. In the plants under Cd stress, the highest proline content was related to Perlette cultivar treated with n-HAP compound, which was 18.78% higher compared to control vines under Cd stress. According to the results of this research, the application of n-HAP in soil can be considered a useful strategy for controlling Cd in soils contaminated with this heavy metal.
Introduction
Cadmium, a heavy metal with a wide range of contamination and strong toxicity, has increasingly become a serious challenge for vineyard soil and grapes in recent years. Previous studies have reported that compared to other heavy metals, cadmium can be absorbed by crops and transferred to edible parts. Heavy metal stress can negatively affect the structure of proteins and enzyme activities and disrupt the replacement reactions of essential metal ions with biomolecules. Therefore, there is an urgent need to reduce cadmium accumulation in crops. One of these methods is reducing the bioavailability of heavy metals (such as Cd) in the soil and also reducing their absorption from the soil. Among the strategies for reducing the bioavailability of Cd in the soil, stabilization is one of the most effective. In this method, using amendments and mechanisms such as adsorption, complexation, or precipitation, Cd is removed from the soil solution and made unavailable to humans, plants, or groundwater. Nano-hydroxyapatite (n-HAP), due to reasons such as environmental compatibility, ability to adsorb heavy metals, low solubility in water, high stability under oxidative and reductive conditions, high specific surface area, and availability, can be an ideal material with high capability for Cd stabilization. Since Malayer is recognized as a global city of grapes and has many diverse grape varieties, and due to the increasing use of chemical fertilizers containing Cd impurities, this plant and the Cd metal were chosen for study. Furthermore, to date, the effect of nano-hydroxyapatite on reducing the negative impacts of Cd on woody plants, including grapes, has not been examined. Therefore, this research aims to investigate the effect of nano-hydroxyapatite in soil and its impact on the physiological indices and enzymatic and non-enzymatic antioxidant systems of grape leaves under two conditions: without stress and with 100 mg/kg Cd stress in the soil, in two grape varieties, Perlette and White Seedless, in the research greenhouse of the Faculty of Agriculture, Malayer University.
Materials and Methods
 This research was conducted in 2022 to investigate the effect of n-HAP on physiological indices and reducing oxidative stress caused by Cd stress (100 mg/kg) in two grape varieties (White Soltana and Perlette). The study was designed as a factorial experiment based on a completely randomized design in the research greenhouse of Malayer University. After 60 days of Cd stress and application of n-HAP (1% by weight) in pots, mature leaves were
detached from each vine per treatments and following physiological and phytochemical parameters, including ion leakage, chlorophyll, phosphorus, relative water content (RWC), ascorbate peroxidase (APX), guaiacol peroxidase (GPX), catalase (CAT), proline, total phenol, total flavonoid, malondialdehyde (MDA), and soluble sugar contents were measured using a spectrophotometer (Spekol, Germany). Data analysis of variance (ANOVA) were performed by GLM procedures of SAS (SAS Institute Inc., USA), and Duncan’s multiple range test at a confidence level of 5% was used for mean comparisons (three replications).
Results and Discussion
The results showed that Cd stress decreased chlorophyll content (based on SPAD index) and RWC while increasing ion leakage. The application of n-HAP in both grape varieties increased the RWC, chlorophyll, and phosphorus contents and reduced ion leakage to some extent. Under Cd stress conditions, the use of n-HAP in soil significantly influenced plant indicators such as RWC, ion leakage, chlorophyll, and phosphorus. The application of n-HAP significantly reduced ion leakage in both grape cultivars compared to untreated soil. Under cadmium stress, the highest chlorophyll content was found in the White Soltana variety treated with n-HAP, which was 10.88% higher than the control vines under cadmium stress. The highest proline content under Cd stress was in the Perlette variety treated with nano-hydroxyapatite, which was 18.78% higher than the control variety under Cd stress. This value increased by 3.99% in the White Soltana variety. The highest water content under Cd stress was in the Bidaneh-Sefid cultivar treated with n-HAP, 4.09% higher than the control under Cd stress. The application of n-HAP treatment positively affected the biosynthesis and accumulation of phenolic compounds in the vines of both cultivars, especially under Cd stress conditions. Total flavonoid content in the White Soltana variety under cadmium stress with nano-hydroxyapatite increased by 69.51% compared to plants grown under Cd stress without n-HAP, and this value increased by 56.17% in the Perlette variety. The activity of the catalase enzyme in the White Soltana variety treated with nano-hydroxyapatite was 19.94% higher than in the same variety under Cd stress without nano-hydroxyapatite. The activity of the CAT enzyme increased by 12.63% in Perlette cultivar. The increase in GPX enzyme activity in samples treated with this compound under Cd stress was 14.47% in the White Soltana cultivar and 12.39% in the Perlette cultivar compared to control samples under cadmium stress in both cultivars. The highest activity of the APX enzyme was in the Bidaneh-Sefid variety treated n-HAP under Cd stress. There was a 15.71% increase in the activity of this enzyme in the leaves of the White Soltana variety treated with n-HAP under Cd stress, and this increase was 13.04% in the Perlette cultivar.
Conclusion
The n-HAP is known as a solution for contaminated and degraded soils. According to the results of this research, the use of n-HAP with a concentration of 1% (w/w) in soil contaminated with Cd in two grape cultivars increased some physiological indices of leaves, including chlorophyll, phosphorus contents and the RWC. Also, the Bidaneh-Sefid cultivar reacted better to the effects of n-HAP than the Perlette cultivar. Totally, the soil-application of n-HAP in 1% (w/w) concentration can be considered as a useful method to decrease Cd contamination in vineyard soil.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Grapes
  • Catalase
  • Chlorophyll
  • Nano-hydroxyapatite
  • Ion LeakageBottom of Form

مقدمه

کادمیم (Cd) به‌عنوان یک فلز سنگین با دامنه آلودگی زیاد و سمیّت قوی، در سال‌های اخیر به‌طور فزاینده‌ای به یک چالش جدی برای خاک تاکستان و انگور تبدیل شده است (Mamut et al., 2023). کادمیم یک عنصر غیر ضروری و سمی برای گیاهان است که خطرات قابل‌توجهی برای سلامت انسان و محیط زیست ایجاد کرده است (Ke, 2023, Zeng et al., 2022). استفاده از کودها و قارچ کش ها سبب تجمع عناصر کمیاب از قبیل کادمیم در خاک تاکستان می­شود که ممکن است فراهمی زیستی آنها را برای گیاهان افزایش دهد (Jafarhaddadian et al., 2021). غلظت معمولی کادمیوم در خاک تاکستان­های انگور mg/kg 5/0-3/0، حد مسمومیت آن در خاک mg/kg 5-5/1 و حد بحرانی آن در گیاه mg/kg 53-8/8 است (Mamut et al., 2023). راه­هایی که کادمیم می تواند توسط آن وارد خاک‌های کشاورزی شود، شامل رسوب اتمسفر، آبیاری با آب آلوده یا استفاده از کود آلوده است. غلظت بیش از حد کادمیم در خاک ممکن است به‌طور قابل‌توجهی فرآیندهای بیوشیمیایی را تغییر دهد و عملکرد محصولات کشاورزی را کاهش دهد (Juang et al., 2012). پژوهش­های قبلی گزارش کردند در مقایسه با سایر فلزات سنگین، کادمیم می‌تواند توسط محصولات جذب شده و به قسمت‌های خوراکی منتقل شود (Ran et al., 2015; Song et al., 2015;). در گیاهان، کادمیم نقش فیزیولوژیکی شناخته شده ای ندارد، امّا به راحتی به بافت_های اندام هوایی گیاه منتقل که سمیت کادمیم منجر به پیامدهای نامطلوبی مانند زردی برگ‌ها، کاهش سرعت رشد، مهار تنفس و فتوسنتز، آسیب اکسیداتیو و کاهش جذب مواد مغذی می‌شود (He et al., 2017; Baliardini et al., 2015). همچنین کادمیم در خاک یک چرخه تجزیه طولانی، تحرک و سمیّت بالا را نشان می‌دهد که منجر به کاهش جوانه زنی بذر، مهار رشد گیاه و کاهش عملکرد می‌شود (Kaya et al., 2019; Kaya et al., 2020). بنابراین، نیاز به استراتژی‌های نوآورانه و پایدار جهت کنترل جذب و انتقال کادمیم از خاک به اندام هوایی محصولات خوراکی از قبیل انگور وجود دارد.

تنش فلزات سنگین می‌تواند بر ساختار پروتئین‌ها و فعالیت آنزیم‌ها تأثیر منفی بگذارد و در واکنش‌های جایگزینی یون‌های فلزی ضروری با مولکول‌های زیستی اختلال ایجاد کند. چنین واکنشی می‌تواند یکپارچگی غشاءها را مختل کند و منجر به تغییر واکنش‌های متابولیکی اساسی، به‌عنوان مثال، هموستاز، تنفس و فتوسنتز شود (Seneviratne et al., 2019). علاوه بر این، تنش فلزات سنگین می‌تواند بهره‌وری گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) مانند پراکسید هیدروژن (H2O2)، رادیکال‌های هیدروکسیل(OH) و رادیکال‌های سوپراکسید (O-2 ) را افزایش دهد. گونه‌های فعال اکسیژن می‌تواند به تنش اکسایشی و پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء منجر شود (Tripathi et al., 2021; Metcalfe et al., 2022). کادمیم اضافی در گیاهان با تولید گونه‌های فعال اکسیژن، نشت الکترولیت، پراکسید هیدروژن و غلظت مالون دی‌آلدئید رشد گیاه را کاهش می­دهد ( Ali et al., 2015; Rizwan et al., 2016). با این حال، گیاهان دارای سازوکارهای سم‌زدایی فلزات سنگین برای غلبه بر گونه‌های فعال اکسیژن با تحریک مجموعه‌ای از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی مانند سوپر اکسید دیسموتاز، کاتالاز، پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز هستند ( Manikandan et al., 2016)  پژوهش­های متعددی اثرات سمی کادمیم را در گیاهان زراعی در سطوح مختلف گزارش کرده اند (Abbas et al., 2017; Ur Rehman et al., 2018; Rizwan et al., 2019). بنابراین، نیاز مبرم به کاهش تجمع کادمیم در محصولات وجود دارد.

در دهه‌های اخیر، توجه به توسعه راهکار‌های مختلف برای کاهش سمّیت فلزات سنگین در کشت محصولات جهت پاسخگویی به نیازهای جهانی برای غذا، و علوفه معطوف شده است. یکی از این روش‌ها، کاهش فراهمی زیستی فلزات سنگین (مثل کادمیم) در خاک و کاهش جذب آن از خاک است. از میان راهکارهای کاهش فراهمی زیستی کادمیم در خاک، روش تثبیت یکی از موثرترین آنها است. در این روش توسط اصلاح کنندها و با سازوکار‌هایی مانند جذب سطحی، کمپلکس شدن و یا رسوب کادمیم از محلول خاک حذف می‌شود و برای انسان، گیاه و یا آب زیرزمینی غیر فراهم می‌شود.

همچنین با گسترش نانوفناوری پژوهشگران در پالایش خاک به استفاده از نانو مواد به عنوان مواد اصلاحی توجه کردند. زیرا نانو مواد واکنش پذیری و سطح ویژه بیشتری نسبت به همان مواد در اندازه غیر نانو دارند (Adrees et al., 2015; Abbas et al., 2017). نانومواد می­توانند برای کنترل آلودگی­های محیطی استفاده شوند تا به آرامی سبب کاهش فراهمی زیستی و یا حذف ترکیبات بسیار سمی از جمله فلزات سنگین در خاک­های آلوده شوند .(Mahdavi et al., 2015)، نانو هیدروکسی آپاتیت (n-HAP) به علّت سازگاری با محیط زیست، توانایی جذب فلزات سنگین، حلالیت کم در آب، پایداری زیاد در شرایط اکسید و احیایی، سطح ویژه بالا و در دسترس بودن می­تواند یک ماده ایده ال با توانایی بالا در تثبیت کادمیم باشد (Wu et al., 2024; Shaheen & Rinklebe, 2015; Feng et al., 2021).

از سوی دیگر، نانو موادی مانند نانوذرات (NPs)، می‌توانند نقش حیاتی در کاهش تأثیر منفی جذب و جابه‌جایی فلزات سنگین به علّت مساحت سطح بزرگ‌شان داشته باشند. نانوذرات می­توانند برای کاهش سمّیت فلزات سنگین در گیاهان استفاده شوند و در نتیجه می توانند جوانه زنی بذر و سیستم‌های فتوسنتزی را بهبود بخشند (Alhammad et al., 2016).

همچنین نانو هیدروکسی آپاتیت به طور گسترده به‌عنوان یک ماده کارآمد و سازگار با محیط زیست برای تصفیه آلاینده های آب و خاک استفاده می‌شود (Feng et al., 2021; Wan et al., 2021). پژوهش­های قبلی نشان داده‌اند استفاده از n-HAP در خاک‌های کشاورزی می‌تواند منجر به بهبود عملکرد محصول و نیز کاهش دسترسی کادمیم در خاک شده و در نهایت سبب کاهش تجمع کادمیوم در محصولات شود (Kottegoda et al., 2017). همچنین یافته­ها نشان دادند نانوهیدروکسی آپاتیت در ریشه برنج می‌تواند به ‌عنوان مانعی برای به دام انداختن سرب عمل کند، بنابراین انتقال سرب در برنج (Oryza sativa L.) را محدود می‌کند (Ye et al., 2018). استفاده از n-HAP می‌تواند با تبادل یونی، کمپلکس‌سازی سطحی و انتشار بین ذره‌ای با Cd متصل شود و بنابراین کارایی بالایی در تثبیت کادمیم دارد (Zhou et al., 2023). پیش تیمار نانو هیدروکسی آپاتیت رشد و جذب کادمیم در نشاء های برنج را تنظیم کرده است (Wu et al., 2024).

در سال‌های اخیر، سیستم تولید انگور ملایر به عنوان میراث مهم کشاورزی جهانی در سازمان خوار و بار جهانی تائید و به ثبت رسیده است (FAO, 2018) و دارای تعداد فراوانی از ارقام متنوع انگور است و به علّت مصرف روز افزون کودهای شیمیایی دارای ناخالصی کادمیم، بنابراین این گیاه و فلز کادمیم انتخاب و بررسی شد. همچنین، تاکنون اثر نانو هیدروکسی آپاتیت بر کاهش اثرات منفی کادمیم بر گیاهان چوبی از جمله انگور بررسی نشده است. بنابراین پژوهش حاضر برای بررسی اثر نانو هیدروکسی آپاتیت درخاک و تأثیرآن روی شاخص‌های فیزیولوژیکی و سیستم‌های آنتی اکسیدانی آنزیمی و غیر آنزیمی برگ انگور در دو سطح بدون تنش و تنش 100 میلی‌گرم برکیلوگرم کادمیم در خاک در دو رقم انگور پرلت و بیدانه سفید در گلخانه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه ملایر مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش‌ها

نمونه‌برداری و آماده سازی نمونه‌ها

در پژوهش حاضر، تأثیر تنش کادمیم بر شاخص‌های فیزیولوژیکی و سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی آنزیمی و غیر ‌آنزیمی برگ دو رقم انگور (Vitis vinifera L.) به صورت آزمایش فاکتوریل(2×2) در قالب طرح کامل تصادفی در گلخانه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه ملایر در بهار و تابستان 1401 انجام شد. فاکتور اول شامل کاربرد خاکی کادمیم در دو سطح بدون کاربرد (شاهد) و غلظت 100 میلی­گرم بر کیلوگرم (تنش) و فاکتور دوم شامل دو رقم انگور بیدانه­سفید و پرلت بود. ابتدا قلمه های ریشه دار درگلدان‌های 7 لیتری پلاستیکی با ارتفاع، قطر دهانه و قطر ته به ترتیب 20، 19 و 25 سانتی­متر حاوی خاک کاشته شدند. برای هر تیمار سه تکرار (دو گلدان در هر تکرار) انتخاب شد و در مجموع برای هر دو رقم انگور تعداد 24 گلدان بر اساس طرح کامل تصادفی به کارگرفته شد. گلدان­ها هر سه روز یکبار آبیاری و هر هفته با کود NPK 20-20-20 (NutriPad، مرسین­کشت، کرج، ایران) با غلظت 5/0 گرم در لیتر قبل از شروع تیمار Cd کود داده شدند. پس از اینکه نهال‌ها به 10 الی 15 برگی رسیدند، نانو هیدروکسی آپاتیت (1 درصد) به خاک گلدان‌ها اضافه شد و پس از حدود دو هفته گلدان‌ها با محلولی از نمک کادمیم (CdSO4.8H2O ) و محلول در آب و به صورت آب آبیاری، آلوده شدند. غلظت اعمال شده تجمعی کادمیم در 4 مرحله، 100 میلی‌گرم در کیلوگرم و گلدان‌های شاهد بدون تنش بود. برای جلوگیری از شوک، مقدار وزنی کادمیم با احتساب وزن 5 کیلویی خاک هر گلدان و غلظت مبنا محاسبه (100 میلی­گرم در کیلوگرم) و به صورت هفتگی تا هفته نهم به صورت کودآبیاری به محیط کشت گلدان اضافه شد. در طول دوره تنش، رطوبت ریزوسفر در هر گلدان با یک تانسیومتر (مدل PMS-714، Lutron، تایوان) بررسی و در حد 65-70% ظرفیت زراعی کنترل شد. پس از گذشت حدود 60 روز (انتهای هفته نهم) از شروع تنش، برگ بالغ از گره­های میانی شاخه های فرعی در هر گلدان به طور جداگانه برداشت و برای ارزیابی های بعدی به آزمایشگاه_های تحقیقات فیزیولوژی گیاهان باغی و خاک_شناسی دانشکده کشاورزی دانشگاه منتقل شد. همچنین شاخص­هایی از جمله نشت­یونی، پراکسیداسیون­لیپیدهای غشاء، پراکسید هیدروژن، محتوای نسبی آب و قند محلول از برگ­های تازه اندازه­گیری شد. برای اندازه­گیری سایر شاخص­ها، برگ ها تا لحظه شروع آزمایش در فریزر 70- درجه سانتی­گراد نگهداری شدند.

نشت یونی

جهت اندازه‌گیری پایدار غشای سلولی 10 قطعه از برگ رفرنس به مساحت یک سانتی متر مربع از برگ هر تیمار در زمان رسیدن به سطح تنش مورد نظر بریده شد. قطعات برگ را داخل فالکون‌های 50 میلی لیتری قرار داده و سپس مقدار 15 میلی لیتر آب مقطر دو بار تقطیر شده به آن ها اضافه شد. سپس فالکون‌ها را به مدت 24 ساعت در دمای اتاق روی شیکر قرار داده و بعد از این مدّت با دستگاه هدایت سنج الکتریکی، هدایت الکتریکی (EC1) آن ها اندازه گیری شد. فالکون های حاوی نمونه‌ها به مدّت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی گراد و فشار 1 اتمسفر اتوکلاو شدند. سپس بعد از سرد شدن فالکون‌های حاوی نمونه‌ها تا دمای اتاق، مجدداً هدایت الکتریکی (EC2) آن ها اندازه‌گیری و میزان نشت یونی نسبی(REL) از رابطه زیر محاسبه شد ( (Sairam et al., 2002.

رابطه 1:

%REL=[EC1 / EC2]*100                            

 محتوای نسبی آب برگ گیاه

نمونه­ برداری توسط قیچی از برگ رفرنس (آخرین برگ توسعه یافته) انجام شد و نمونه­ها بلافاصله درون یخ قرار گرفته و در آزمایشگاه، وزن تر آن­ها با ترازوی دقیق اندازه­گیری شد. سپس تمامی نمونه­‏ها در آب مقطر قرار داده شدند و به مدّت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی­‎گراد قرار گرفتند. بعد از 24 ساعت وزن اشباع برگ­ها اندازه­گیری و برگ‌ها به مدّت 24 ساعت دیگر در دمای 70 درجه سانتی­‎گراد در آون قرار گرفتند و وزن خشک هر کدام اندازه­‎گیری شد (Ritchie et al., 1990).

Fw: وزن تر برگ بلافاصله بعد از نمونه­‎برداری، Dw: وزن خشک برگ بعد از قرار گرفتن در آون و Sw: وزن اشباع برگ بعد از قرار گرفتن در آب مقطر است.

رابطه 2:

RWC= (Fw- Dw// Sw- Dw)*100                       

 پراکسید هیدروژن

اندازه‌گیری پراکسید هیدروژن (H2O2) به روش (2001) Loreto & Velikova انجام شد. 3/0 گرم از نمونه برگ توزین و در 3 میلی لیتر تری­کلرواستیک (TCA) یک درصد هموژن شد. سپس نمونه‌ها به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد با 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. پس از آن به 75/0 میلی لیتر محلول شناور، 75/0 میلی لیتر محلول بافر فسفات پتاسیم 10 میلی مولار با pH معادل 7 و 5/1 میلی یدید پتاسیم 1 مولار اضافه شد. غلظت پراکسید هیدروژن نمونه‌ها توسط مقایسه جذب آن‌ها در طول موج 390 نانومتر و منحنی استاندارد آن در طیفی از 100 تا 1000 میکرومول بر لیتر محاسبه شد ( Loreto & Velikova, 2001).

 پرولین

با توجه به این که تجمع پرولین یک پاسخ فیزیولوژیکی به شرایط تنش است، سنجش این اسید آمینه نیز انجام شد. جهت سنجش پرولین روش Bates et al. (1973)، انتخاب شد. 5/0 گرم از نمونه در هاون چینی ریخته و با ازت مایع کوبیده شد. سپس 10 میلی لیتر سولفو سالسیلیک اسید سه درصد افزوده شد. محلول در سانتریفیوژ 10 هزار دور در دقیقه قرار داده شد. از مایع رویی محلول سانتریفیوژ شده دو میلی لیتر برداشته و در زیر هود به آن دو میلی لیتر اسید استیک و دو میلی لیتر معرف نین هیدرین (25/1 گرم نین هیدرین+30 میلی لیتر استیک اسید گلایشیال+20میلی لیتر اسید فسفریک اسید شش مولار) اضافه شد و 15 دقیقه در حرارت 40 سانتی گراد زیر هود توسط همزن مغناطیسی هم زده شد. محلول حاصل به مدّت یک ساعت در بن ماری با دمای 100 درجه سانتی گراد قرار داده شد. بعد از سرد شدن محلول، مقدار 4 میلی لیتر تولوئن به آن­ها افزوده شد. سپس لوله­ها را ورتکس کرده تا دو فاز ایجاد شود. برای سنجش میزان پرولین میزان جذب فاز فوقانی در طول موج 520 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد (Bates et al ., 1973).

مالون دی آلدئید

مقدار یک گرم نمونه را با 10 میلی­لیتر تری­کلرو استیک­اسید 20 درصد حاوی نیم درصد وزنی- حجمی تیو باربیتوریک ­اسید آسیاب و عصاره حاصله به مدّت 15 دقیقه سانتریفیوژ شده، محلول رویی به مدّت 25 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 80 درجه سانتی­گراد قرار گرفت، سپس فوری با یخ سرد شد و در 12000 دور به مدّت پنج دقیقه سانتریفیوژشد. سپس فاز بالایی را جدا و جذب آن در طول موج­های 600 و 532 نانومتر خوانده شد.غلظت نهایی مالون ­دی­آلدهید از معادله زیر بدست آمد ( Heath & Packer, 1986).

رابطه 3:

1000                  ×  MDA

 قندهای محلول

از هرگیاه 5/0 گرم از بافت تازه آن به همراه 5 میلی لیتر اتانول 95 درصد در داخل هاون چینی کوبیده و قسمت بالایی محلول جدا شدند. عمل استخراج دو بار دیگر و هر بار با 5 میلی لیتر اتانول 70 درصد تکرار شد. سپس محلول به دست آمده به مدّت 15 دقیقه با سرعت 6000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. برای اندازه­گیری با توجه به روش  Irigoyen et al. (1992) 1/0 میلی لیتر از عصاره الکلی برداشته و در لوله آزمایش ریخته شد و سپس سه میلی لیتر آنترون تازه تهیه شده (150 میلی گرم آنترون + 100 میلی لیتر اسید سولفوریک 72 درصد W/W) به آن اضافه شد. لوله های آزمایش را به مدت 10 دقیقه در حمام آب جوش قرارداده تا مادةرنگی تشکیل شود. پس ازخنک شدن نمونه‌ها میزان جذب آن‌ها در طول موج 625 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‎گیری شد. غلظت قند محلول به صورت میلی گرم در گرم وزن تر از رابطه زیر محاسبه شد (Irigoyen et al., 1992).

رابطه 4:

فلاونوئید کل

برای سنجش میزان فلاونوئید کل از روش رنگ سنجی کلرید آلومینیوم استفاده شد (Chang et al., 2002). در این روش ابتدا 1/0 میلی لیتر کلرید آلومینیوم 10 درصد در لوله آزمایش ریخته شد. سپس 1/0 میلی لیتر استات­پتاسیم یک مولار به لوله‌ها افزوده و با آن مخلوط و سپس 8/2 میلی لیتر آب مقطر به لوله ها اضافه شد. در مرحله آخر 5/0 میلی لیتر از محلول عصاره به مخلوط اضافه شد. نمونه‌ها به مدّت 30 دقیقه در محیط تاریک قرار گرفتند و در نهایت جذب نمونه‌ها در طول موج 415 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر تعیین شد. مقدار فلاونوئید کل برای هر کدام از عصاره‌ها در سه تکرار به صورت معادل میلی گرم کوئرستین بر گرم وزن تر محاسبه شد.

 فنول کل

محتوای فنول کل با معرف فولین- سیوکالتیو اندازه‌گیری شد. ابتدا 5/0 گرم از بافت منجمد شده برگ در 5 میلی‌لیتر متانول 85% حل و به مدّت ده دقیقه با دور g 6000 سانتریفیوژ شد. به 5/0 میلی‌لیتر از هر عصاره متانولی (10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) 5/2 میلی‌لیتر واکنش­گر فولین-سیوکالتیو 2/0 نرمال افزوده شد، پس از 5 دقیقه 2 میلی‌لیتر از محلول 7% کربنات سدیم به آن اضافه شد. پس از 20 دقیقه جذب مخلوط در طول موج 760 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل JENWAY 6305، شرکت JENWAY، انگلستان) خوانده شد. میزان فنول کل بر اساس میزان معادل میلی‌گرم اسید گالیک در گرم وزن تر بیان شد (Jalili & Karimi, 2021, Slinkard & Singleton, 1977).

 پروتئین محلول

نیم گرم بافت برگ با 5 میلی لیتر بافر استخراج (تریس با غلظت یک میلی مولار و 7pH=)، در حضور ازت مایع در هاون چینی کاملاً له شده و این مخلوط به مدّت 20 دقیقه با دور g6000 سانتریفیوژ شد. سپس 100 میکرولیتر از محلول روشناور با 5 میلی‌لیتر معرف بیورد [(10% گلایشیال استیک اسید + 25% اتانول + 65% آب مقطر+ 1/0 % (حجم/وزن) محلول کوماسی بریلیانت بلوجی 250)] مخلوط و جذب آن با اسپکتروفتومتر در طول موج 595 نانومتر خوانده شد (Bradford, 1976). با منحنی استاندارد تهیه شده از غلظت­های مختلف آلبومین گاوی (100-500 میلی‌گرم در میلی­لیتر)، غلظت پروتئین­های محلول به صورت میلی‌گرم در گرم وزن تر محاسبه شد.

 آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX)

فعالیت این آنزیم به روش (1981 ) Nakano & Asada اندازه‌گیری شد. اساس این روش کاهش جذب نور در طول موج 290 نانومتر است که ناشی از اکسیده شدن آسکوربات است. جهت استخراج آنزیم، 1/0 گرم بافت پودر شده برگ در 1 میلی‌لیتر «بافر استخراج» ریخته و بهم زده شد. عصاره حاصل به مدّت 20 دقیقه در دمای ºC 4 و با سرعت 14000 دور در دقیقه سانتریفیوژ و محلول شفاف بالائی که عصاره آنزیم تلقی می‌شود، به آرامی جدا شد. در هر دو کووت شاهد و کووت نمونه مقدار 3 میلی لیتر بافر استخراج ریخته و به آن مقدار 51/4 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 30 درصد اضافه شد. ثبت تغییرات جذب نوری نمونه­ها در طول موج 290 نانومتر که بیانگر میزان اکسیداسیون و کاهش غلظت آسکوربات است، هر 10 ثانیه و به مدت 120 ثانیه انجام شد (Nakano & Asada, 1981; Zokaee Khosroshahi et al., 2023).

رابطه 5:

APX activity *      

 آنزیم کاتالاز (CAT)

فعالیت آنزیم کاتالاز به روش (1970) Bergmeyer و بر اساس میزان ناپدید شدن آب اکسیژنه (H2O2) در طول موج 240 نانومتر اندازه­گیری شد. جهت استخراج آنزیم، 1/0 گرم بافت پودر شده برگ در 1 میلی­لیتر «بافر استخراج» ریخته و به­هم زده شد. عصاره حاصل به مدّت 20 دقیقه در دمای ºC 4 و با سرعت 14000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. در هر دو کووت شاهد و کووت نمونه مقدار 3 میلی لیتر بافر استخراج ریخته و به آن­ها مقدار 5/4 میکرولیتر H2O230 درصد اضافه شد. ثبت تغییرات جذب نور نمونه‌ها در طول موج 240 نانومتر که بیانگر میزان کاهش غلظت H2O2 است، هر 10 ثانیه و به مدّت 120 ثانیه انجام شد. میزان فعالیت آنزیم (بر حسب واحد در میلی‌گرم پروتئین برگ) از رابطه زیر محاسبه شد:

          رابطه 5:   CAT activity =                      رابطه 6:  

 آنزیم پراکسیداز (POD)

 برای سنجش فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز سه میلی­لیتر مخلوط واکنش شامل 855/0 میکرولیتر از 25 میلی­مولار گایاکول و 355/1 میکرولیتر از 30% حجمی-حجمی آب اکسیژنه در سه میلی­لیتر بافر فسفات به یک میلی­لیتر عصاره آنزیمی استخراجی اضافه شدند و تغییرات جذب آن­ها در طول موج 465 نانومتر به مدّت سه دقیقه خوانده شد. فعالیت آنزیمی بر حسب تغییرات جذب نور بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین (ΔOD /Min/mg protein) بیان شد (Herzog & Fahimi, 1973).

رابطه 6:                 رابطه 7:POD activity= *   

 تجزیه آماری

تجزیه آماری داده­ها با نرم افزار آماری SAS 9.3 انجام شد. بعد از نرمال سازی داده ها تجزیه واریانس دوطرفه با دستورالعمل GLM و مقایسه میانگین ها با آزمون چند دامنه ای دانکن در سطح 05/0 انجام شد. نمودارها با نرم افزار Excel 2013 رسم شد.

نتایج و بحث

نشت یونی

در گیاهان بدون تنش کادمیم بین تیمارهای استفاده شده و شاهد اختلاف معنی‌داری از لحاظ درصد نشت یونی مشاهده نشد. با این حال اعمال تنش کادمیم سبب افزایش درصد نشت یونی برگ در هر دو رقم انگور شد و بین تاک‌های تحت تنش کادمیم، تیمار هیدروکسی آپاتیت و شاهد از لحاظ درصد نشت یونی برگ اختلاف معنی‌داری مشاهده شد (جدول 1). مقدار نشت یونی در رقم بیدانه سفید تحت تنش کادمیم تیمار شده با نانو هیدروکسی آپاتیت 1% در مقایسه با گیاهان رشد یافته در شرایط تنش کادمیم و بدون تیمار نانو هیدروکسی آپاتیت به میزان 53/13 درصد کاهش داشت و این شاخص در رقم پرلت به میزان 61/14 درصد نسبت به تاک­های بدون تیمار تحت تنش کاهش یافت (جدول 1). افزایش تجمع کادمیم در برگ منجر به ایجاد تنش اکسایشی و پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء می‌شود (Metcalfe et al., 2022). این تغییرات منجر به اختلال در ویژگی نفوذ پذیری غشاء و نشت یون­ها در فضای بین سلولی می‌شود. پیش تیمار نانو هیدروکسی آپاتیت با تأثیر بر فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان و کاهش تنش اکسایشی و به دنبال آن حفظ یکپارچگی غشاء سبب کاهش اثرات تنش کادمیوم در نشاء‌های برنج شده است (Wu et al., 2024). قابلیت هیدروکسی آپاتیت در کاهش فراهمی کادمیم و زدودن رادیکال‌های آزاد منجر به پایداری بیشتر غشاء و کاهش نشت یونی در برگ تاک‌های تیمار شده با این ترکیب شده است که هم­راستا با نتایج دیگر پژوهشگران است (Alhammad et al., 2023).

جدول 1- اثر نانو هیدروکسی آپاتیت بر نشت یونی، مالون دی آلدئید و پراکسید هیدروژن برگ دو رقم انگور تحت تنش کادمیم

Table 1- The effect of nano hydroxyapatite (HAP) on leaf electrolyte leakage, malondialdehyde and hydrogen peroxideof content of two grapevine cultivars under cadmium (Cd) stress.

Hydrogen peroxide

(µmol g-1 FW)

Malondialdehyde

(µmol g-1 FW)

Electrolyte leakage (%)*

Treatments

HAP

(%)

Cd (mg/kg)

Grape cultivars

1.52c

0.37d

14.94c

0

0

Perlette

1.45cd

0.36d

14.47c

1

3.76a

1.44a

56.04a

0

100

3.37a

1.34b

47.85b

1

1.27cd

0.35d

13.65c

0

0

Bidane-Sefid

1.17d

0.35d

12.84c

1

3.03b

1.33b

54.17a

0

100

2.48b

1.21c

46.84b

1

*میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون از لحاظ آماری (سطح 5 درصد) اختلاف معنی‌داری ندارند.

*Means with common letters in each column do not have a statistically significant difference (5% level).

مالون دی آلدئید

با اعمال تنش کادمیم 100 میلی­گرم در کیلوگرم در هر دو رقم انگور، محتوای مالون­دی­آلدهید برگ افزایش پیدا کرد که این افزایش تحت تأثیر رقم و تیمار هیدروکسی آپاتیت قرار گرفت. به عبارت دیگر محتوای مالون­دی­آلدهید تاک­های تیمار شده با هیدروکسی آپاتیت کمتر از تاک­های بدون تیماربا این ترکیب تحت تنش کادمیم بود. همچنین محتوای مالون­دی­آلدهید برگ تاک­های رقم بیدانه سفید تیمار شده با هیدروکسی­آپاتیت تحت تنش کادمیم کمتر از دیگر تیمارها بود (جدول 1). محتوای مالون­دی­آلدئید برگ در رقم بیدانه سفید و پرلیت تیمار شده با نانو هیدروکسی آپاتیت تحت تنش کادمیم در مقایسه با تاک­های هر رقم بدون تیمار نانو هیدروکسی آپاتیت تحت تنش کادمیم به ترتیب 02/9 و 94/6 درصد کاهش نشان داد (جدول1). مطابق نتایج Hussain et al. (2018)، نانوذرات اکسید روی نشت با افزایش فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز به کاهش تولید و تجمع پراکسیدهیدروژن در برگ گندم (Triticum aestivum L.) منجر شد. به عبارت دیگر، نانوذرات­های هیدروکسی­آپاتیت می‌توانند به طور موثری سمیت و غلظت کادمیم را در برگ کاهش داده و از تنش اکسایشی و تولید پراکسید هیدروژن جلوگیری کند (Alhammad et al., 2023).

پراکسید هیدروژن

در تاک­های هر دو رقم انگور بیدانه­سفید و پرلت رشد داده شده در شرایط بدون تنش کادمیم بین تاک­های تیمارشده با نانو هیدروکسی آپاتیت و تاک­های شاهد اختلاف معنی­داری از لحاظ محتوای پراکسید هیدروژن مشاهده نشد (جدول 1). با این حال، اعمال تنش کادمیم به افزایش محتوای پراکسید هیدروژن برگ در هر دو رقم انگور منجر شد. محتوای پراکسید هیدروژن برگ انگور رقم بیدانه­سفید و پرلت رشد یافته تحت شرایط تنش کادمیم + تیمار نانو هیدروکسی آپاتیت به ترتیب 15/18 و 37/10 درصد کمتر از تاک های تحت تتنش بدون تیمار نانو هیدروکسی آپاتیت بود (جدول 1).

در پژوهش Khan et al. ، نتایج نشان دادند نانوذرات Fe3O4 با کاهش تجمع آرسنیک که از دانه­رست­های برنج در برابر تنش آرسنیک محافظت می کند، به‌عنوان یک جاذب نانو عمل کرده و جذب آرسنیک را در گیاهان برنج محدود می‌کند. در واقع کاربرد نانوذرات به کاهش محتوای H2O2 و مالون­دی­آلدئید منجر شد (Khan et al., 2022). همچنین Gohari et al. دریافتند کاربرد نانوذرات TiO2 به طور قابل توجهی غلظت هیدروژن پراکسید را کاهش داد (Gohari et al., 2020). کاربرد تنش سرب در دانه­رست­های ذرت محتوای مالون­دی­آلدئید برگ را به میزان 143 درصد نسبت به شاهد افزایش داد. از سوی دیگر، استفاده از نانوهیدروکسی­آپاتیت به طور قابل توجهی (تا 53%) محتوای مالون­دی­آلدئید را کاهش داد که تأئیدی بر یافته­های پژوهش حاضر است.

تنش کادمیم با القای تنش اکسیداتیو موجب تخریب غشای سلولی، افزایش مقدار مالون­دی­آلدهید و کاهش مقدار کلروفیل می_شود که این موضوع با افزایش سنتز پرولین در شرایط تنش ارتباط دارد. در بررسی اثر نانوهیدروکسی آپاتیت بر کاهش جذب کادمیم و اثرات آن بر سطح کلروفیل، مالون دی آلدئید و فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدانی از جمله سوپراکسیداز دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیدازدر خاک آلوده به کادمیم، مشخص شد نانو هیدروکسی آپاتیت می‌تواند سطح کلروفیل را افزایش داده و سطح مالون­دی­آلدئید را در اندام هوایی (برگ) گیاهان کاهش دهد. علاوه بر این، فعالیت‌های افزایشی سوپراکسیداز دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز را می‌توان پس از افزودن نانو هیدروکسی آپاتیت در خاک آلوده به کادمیم مشاهده کرد (Li & Huang, 2014).

کلروفیل (SPAD)

با افزایش سطح تنش کادمیم از صفر به 100 میلی‌گرم بر کیلوگرم میزان SPAD به‌عنوان شاخص سنجش کلروفیل در تمامی تیمارها کاهش یافت. از سوی دیگر، در گیاهان تحت تنش کادمیم و نیز گیاهان رشد یافته در شرایط بدون تنش محتوای کلروفیل در تاک­های تیمار شده با نانو هیدروکسی آپاتیت بیشتر از گیاهان شاهد بود. در گیاهان تحت تنش کادمیم بیشترین محتوای کلروفیل مربوط به رقم بیدانه سفید تیمار شده با ترکیب نانو هیدروکسی آپاتیت بود که در مقایسه با تاک­های شاهد تحت تنش کادمیم تا 88/10 درصد بیشتر بود (جدول 2).

نتایج پژوهش  Akandi et al. بر روی گیاه خرفه (Portulaca oleracea L.) تحت تنش کادمیم که از نانو ذرات آهن در جهت کاهش میزان اثرات کادمیم در گیاه استفاده کردند نشان داد برخی از فاکتورهای رشد و غلظت کلروفیل به طور قابل‌توجهی در گیاه خرفه افزایش یافت (Akandi et al., 2020). همچنین Alhammad et al.، اثر نانو هیدروکسی آپاتیت را بر کاهش تنش سرب در گیاه ذرت بررسی کردند و نشان دادند که تیمار نانوهیدروکسی‌آپاتیت به افزایش 47 درصدی کلروفیل کل (SPAD) در مقایسه با نمونه‌های شاهد تحت تنش سرب شد (Alhammad et al., 2023)، که تأئیدی بر یافته­های پژوهش حاضر است. غلظت بالای فلزات سنگین در برگ‌های گیاه می‌تواند فتوسنتز را با ایجاد آسیب ساختاری، اختلال در سنتز کلروفیل، مسدود کردن انتقال الکترون و بستن روزنه‌ها برای کاهش جذب خالص CO2 مختل کند (Alhammad et al., 2023). قابل درک است که نانو هیدروکسی آپاتیت­ها می‌توانند حرکت و فراهمی زیستی کادمیم را در خاک کاهش دهند و در نتیجه می‌توانند منجر به کاهش جذب کادمیم توسط ریشه های گیاه شوند. علاوه بر این، نانو هیدروکسی آپاتیت­ها پاک کننده های موثر فلزات سنگین از خاک نیز هستند، زیرا می‌توانند محتوای کلروفیل و سیستم آنتی اکسیدانی را در گیاهان افزایش دهند (He et al., 2017).

 

 

جدول 2- اثر نانو هیدروکسی آپاتیت بر محتوای نسبی آب، شاخص کلروفیل (SPAD) و پرولین برگ دو رقم انگور تحت تنش کادمیم

Table 2- The effect of nano hydroxyapatite (HAP) on leaf relative water content (RWC), chlorophyll (SPAD) and proline content of two grapevine cultivars under cadmium (Cd) stress.

RWC

(%)

Proline

(µmol g-1 FW)

SPAD

Treatments

HAP

(%)

Cd

(mg/kg)

Grape cultivars

80.60c

4.32d

9.62a

0

0

Perlette

81.84bc

4.32d

7.68bc

1

64.94f

8.17c

5.98d

0

100

68.04e

10.06a

6.42cd

1

82.48ab

4.36d

10.32a

0

0

Bidane-Sefid

83.45a

4.45d

8.08b

1

68.53e

8.66bc

6.09d

0

100

71.45d

9.02b

6.71bcd

1

 *میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون از لحاظ آماری (سطح 5 درصد) اختلاف معنی‌داری ندارند.

*Means with common letters in each column do not have a statistically significant difference (5% level).

اعمال تنش کادمیم ( 100میلی‌گرم بر کیلوگرم) سبب افزایش محتوای پرولین در تمامی تاک­ها شد و بیشترین محتوای پرولین مربوط به تاک­های تیمار شده با باکتری به تنهایی بود (جدول 2).

 پرولین

با افزایش سطح تنش کادمیم از صفر به 100 میلی گرم بر کیلوگرم محتوای پرولین در تمامی تیمارها افزایش یافت. با این حال در گیاهان تحت تنش کادمیم و نیز گیاهان رشد یافته در شرایط بدون تنش محتوای پرولین در تاک­های تیمار شده با نانو هیدروکسی آپاتیت بیشتر از گیاهان شاهد بود. در گیاهان تحت تنش کادمیم بیشترین محتوای پرولین مربوط به رقم پرلت تیمار شده با ترکیب نانو هیدروکسی آپاتیت بود که در مقایسه با تاک­های شاهد تحت تنش کادمیم تا 78/18 درصد بیشتر بود (جدول 2). این مقدار در رقم بیدانه سفید 99/3 درصد افزایش نشان داد. نتایج پژوهش‌های مختلف نشان داده اند فلزات سنگین در گیاهان سبب افزایش تولید  ROSو تنش اکسیداتیو می‌شوند که به ماکرومولکول‌هایی مانند لیپیدها، پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک آسیب می‌رسانند ( Wani et al., 2018). در گیاه گندم افزایش غلظت کادمیم منجر به  افزایش سطح پرولین، مالون­دی­آلدئید، پراکسیدهیدروژن و افزایش فعالیت کاتالاز شد (Ur Rahman et al., 2021). Alhammad et al.، در بررسی اثر نانو هیدروکسی آپاتیت بر کاهش تنش سرب در گیاه ذرت نشان دادند سبب افزایش محتوای پرولین در مقایسه با نمونه‌های شاهد تحت تنش سرب شد (Alhammad et al., 2023).

 محتوای نسبی آب

با افزایش تنش کادمیم محتوای نسبی آب در برگ تمامی تیمارها روند کاهشی نشان داد. با این تفاوت که در تاک‌های تیمار شده با نانو هیدروکسی آپاتیت میزان کاهش محتوای آب کمتر از تاک­های شاهد بود. بیشترین محتوای آب در تاک­های تحت تنش کادمیم مربوط به تیمار نانو هیدروکسی آپاتیت در رقم بیدانه سفید بود که در مقایسه با محتوای آب نسبی برگ تاک­های شاهد تحت تنش کادمیم 09/4 درصد بیشتر بود (جدول 2). اثر نانوذرات مس، روی بر تعادل پرواکسیداتیو/آنتی اکسیداتیو و محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی و سطح برگ گیاهان گندم در شرایط تنش خشکی نشان داد این نانو ذرات با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدان سبب کاهش سطح تجمع مواد واکنش‌دهنده تیوباربیتوریک اسید (TBARS) و تثبیت محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی و افزایش محتوای نسبی آب در برگ‌ها شد (Taran et al., 2017). اثر مثبت هیدروکسی آپاتیت بر روابط آبی در ریشه گیاه و تنظیم اسمزی ایجاد شده در اثر تجمع بیشتر قندهای محلول و پرولین ضمن بهبود جذب آب منجر به افزایش محتوای نسبی آب در تاک‌های تیمار شده تحت تنش کادمیم شده است.

قند محلول

محتوای قند محلول برگ در هر دو رقم انگور تحت تنش کادمیم 100 میلی­گرم در کیلوگرم افزایش پیدا کرد. افزایش قند محلول تحت تأثیر آثار رقم، کادمیم و تیمار هیدروکسی آپاتیت قرار گرفت، امّا محتوای این محلول سازگار در تاک­های تیمار شده با هیدروکسی آپاتیت اختلاف معنی­داری با تاک­های بدون تیمار  با این ترکیب تحت تنش کادمیم نداشت (جدول 3). در هر حال، محتوای قند محلول برگ تاک­های رقم بیدانه سفید تیمار شده تحت تنش کادمیم بیشتر از رقم پرلت تحت تنش بود (جدول 3). محتوای قند محلول برگ در رقم بیدانه سفید و پرلیت تیمار شده تحت شرایط بدون تنش کادمیم و بدون تیمار در مقایسه با تاک­های هر رقم بدون تیمار نانو هیدروکسی آپاتیت تحت تنش کادمیم به ترتیب 5/72 و 7/70 درصد افزایش نشان داد (جدول3) که حاکی از نقش تنظیم کنندگی قندهای محلول در گیاهان تحت تنش‌های محیطی از قبیل تنش کادمیم است. تجمع بیشتر قندهای محلول نشان­دهنده کارکرد بهتر دستگاه فتوسنتزی در جهت تولید قند است که به علّت تاثیر مثبت نانوهیدروکسی آپاتیت بر کاهش فراهمی و جذب کادمیم، دستگاه فتوسنتزی را از آسیب تنش این فلز سنگین محافظت نموده و با تولید بیشتر قند محلول منجر به بهبود تنظیم اسمزی در گیاهان تحت تنش کادمیم شده است.

فنول کل

 بر اساس نتایج جدول 3، کاربرد غلظت 100 میلی­گرم در کیلوگرم کادمیم سبب افزایش محتوای فنول کل برگ در تاک­های هر دو رقم انگور بیدانه­سفید و پرلت شد. همچنین مشخص شد که تیمار نانوهیدروکسی آپاتیت تأثیر مثبتی بر بیوسنتز یا تجمع ترکیبات فنولی در تاک­های هر دو رقم به ویژه تحت شرایط تنش کادمیم دارد (جدول 3). مقدار فنول کل در رقم بیدانه­سفید تحت تنش کادمیم با حضور نانو هیدروکسی آپاتیت در مقایسه با تاک­های رشد یافته در شرایط تنش کادمیم و بدون حضور نانو هیدروکسی آپاتیت به میزان 45/17درصد افزایش داشت و در رقم پرلت این مقدار 55/29 درصد افزایش نشان داد (جدول 3).

جدول 3- اثر نانو هیدروکسی آپاتیت بر محتوای قند محلول، فنول کل و فلاونوئید کل برگ دو رقم انگور تحت تنش کادمیم

Table 3- The effect of nano hydroxyapatite (HAP) on leaf soluble sugar, total phenol and total flavonoids content of two grapevine cultivars under cadmium (Cd) stress.

Total flavenoeids

(mg g-1 FW)

Total phenol

(mg g-1 FW)

Soluble sugars

(mg g-1 FW)

Treatments

HAP

(%)

Cd (mg/kg)

Grape cultivars

1.17cd

3.08c

11.18d

0

0

Perlette

1.20cd

3.24bc

11.27d

1

1.03d

2.17e

40.62b

0

100

2.35a

3.08c

41.87b

1

1.26bc

3.53b

13.36c

0

0

Bidane-Sefid

1.40b

4.07a

13.66c

1

1.14cd

2.65d

45.29a

0

100

2.36a

3.21bc

45.66a

1

*میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون از لحاظ آماری (سطح 5 درصد) اختلاف معنی‌داری ندارند.

*Means with common letters in each column do not have a statistically significant difference (5% level).

فلاونوئید کل

محتوای فلاونوئیدکل برگ در هر دو رقم انگور تحت تنش کادمیم 100 میلی­گرم در کیلوگرم افزایش پیدا کرد. مقدار فلاونوئیدکل برگ در رقم بیدانه سفید تحت تنش کادمیم با حضور نانو هیدروکسی آپاتیت در مقایسه با گیاهان رشد یافته در شرایط تنش کادمیم و بدون حضور نانو هیدروکسی آپاتیت 69/51 درصد افزایش نشان داد که این مقدار در رقم پرلت 17/56 درصد افزیش داشت (جدول 3). Awan et al.، اثر نانو ذره اکسید روی را در گیاه کلم بروکلی (Brassica oleracea var italic) بررسی کردند و نشان دادند که سبب افزایش میزان کلروفیل، ترکیبات فنولی و قند محلول در گیاه در مقایسه با نمونه‌های شاهد شد (Awan et al., 2021). در واقع تجمع بیشتر فنول و فلاونوئید کل در تاک­های تیمار شده با هیدروکسی آپاتیت به‌عنوان بخشی از سیستم آنتی اکسیدانی غیر آنزیمی است که با خنثی‌سازی رادیکال های آزاد اکسیژن از قبیل پراکسید هیدروژن منجر به کاهش آسیب‌های اکسایشی ناشی از تنش کادمیم در گیاهان شده است.

پروتئین محلول

با اعمال تنش کادمیم 100 میلی­گرم در کیلوگرم در هر دو رقم انگور، محتوای پروتئین محلول افزایش پیدا کرد که این افزایش تحت تأثیر رقم و تیمار هیدروکسی آپاتیت قرار گرفت. به عبارت دیگر محتوای پروتئین محلول تاک‌های تیمار شده با هیدروکسی آپاتیت بیشتر از تاک‌های بدون تیمار با این ترکیب تحت تنش کادمیم بود. همچنین محتوای پروتئین محلول تاک­های رقم بیدانه سفید تیمار شده با هیدروکسی­آپاتیت تحت تنش کادمیم بیشتر از دیگر تیمارها بود (شکل 1). تجمع بیشتر پروتئین‌های محلول در تاک­های تیمار شده با هیدروکسی آپاتیت نشان دهنده کارکرد بهتر این گیاهان در جلوگیری از تجمع کادمیم و حفظ ساختار پروتئین­ها از آسیب ناشی از تنش اکسایشی است.

آنزیم­های آنتی اکسیدانی (کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات­پراکسیداز)

با افزایش سطح تنش کادمیم فعالیت آنزیم کاتالاز در تاک­های تیمار شده با نانو هیدروکسی آپاتیت در مقایسه با دیگر تیمارها افزایش چشمگیری نشان داد به طوری که فعالیت آنزیم کاتالاز در رقم بیدانه سفید تیمار شده با نانو هیدروکسی آپاتیت 94/19 درصد بیشتر از فعالیت این آنزیم در مقایسه با این رقم تحت تنش کادمیم ولی بدون نانو هیدروکسی آپاتیت بود. این افزایش آنزیم کاتالاز در رقم پرلت 63/12 درصد مشاهده شد (شکل 1). فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز برگ در هر دو رقم انگور بیدانه­سفید و پرلت تحت تنش کادمیم 100 میلی­گرم در کیلوگرم افزایش پیدا کرد. این افزایش در انگور رقم بیدانه­سفید بیشتر از رقم پرلت بود. تیمار نانو هیدروکسی آپاتیت فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز برگ را در تاک­های تحت تنش کادمیم در مقایسه با تاک­های رشد یافته در شرایط تنش کادمیم بدون تیمار نانو هیدروکسی آپاتیت افزایش داد. افزایش فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز برگ در تاک‌های تیمار شده با این ترکیب تحت تنش کادمیم در رقم بیدانه سفید 47/14 درصد و در رقم پرلت 39/12 درصد بیشتر از تاک‌های شاهد تحت تنش کادمیم در هر دو رقم بود (شکل 1). آنزیم آسکوربات پراکسیداز در گیاهان بدون تنش کادمیم بین تیمارهای استفاده شده و شاهد اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد. اعمال تنش کادمیم سبب افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز برگ در هر دو رقم انگور شد. در هر حال، در گیاهان تحت تنش کادمیم تیمارهای استفاده شده و شاهد از لحاظ فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز اختلاف معنی‌داری داشتند. به عبارت دیگر تیمار نانو هیدروکسی آپاتیت سبب تحریک فعالیت این آنزیم در برگ تاک­های تحت تنش کادمیم شد. بیشترین فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز مربوط به تاک­های رقم بیدانه­سفید تیمار شده با نانو هیدروکسی آپاتیت تحت تنش کادمیم بود (شکل 1). افزایش فعالیت این آنزیم در برگ تاک­های رقم بیدانه سفید تیمار شده با نانو هیدروکسی آپاتیت تحت تنش کادمیم 71/15 درصد و در رقم پرلت 04/13 درصد بود (شکل 1).

گیاهان در شرایط تنش، از سیستم‌های دفاع آنتی اکسیدانی متشکل از آنزیم‌هایی نظیر آسکوربات پراکسیداز و کاتالاز برای مهار تجمع بیش از حد رادیکال های آزاد استفاده می‌کنند (Bhat et al., 2019). فعالیت بیشتر آنزیم­های آنتی اکسیدان در برگ تاک­های تیمار شده با هیدروکسی آپاتیت از این جهت است که به‌عنوان آنزیم­های ضد رادیکال‌های آزاد اکسیژن، ضمن محافظت از درشت­مولکول‌ها و غشاهای سلول، آسیب‌های ناشی از رادیکال‌های آزاد اکسیژن به وجود آمده در اثر تنش کادمیم را خنثی کند. پژوهش­ها نشان دادند هیدروکسی آپاتیت می‌تواند به­ طور چشمگیری فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز را در گیاهان تحت تنش فلزات سنگین افزایش دهد. Alhammad et al. اثر نانو هیدروکسی آپاتیت را بر کاهش تنش سرب در گیاه ذرت بررسی کردند و نشان دادند که سبب افزایش میزان آنزیم‌های کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز در مقایسه با نمونه‌های شاهد تحت تنش سرب شد و سبب بهبود عملکرد آنزیم‌های آنتی اکسیدانی نسبت به نمونه‌های بدون حضور نانو هیدروکسی آپاتیت شد (Alhammad et al., 2023). طبق پژوهش Li & Huang فعالیت‌های افزایشی سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز، را می توان پس از افزودن نانوهیدروکسی آپاتیت در خاک آلوده به کادمیم مشاهده کرد (Li & Huang, 2014).

شکل 1- اثر نانو هیدروکسی آپاتیت بر محتوای پروتئین و فعالیت آنزیم‌های کاتالاز (CAT)، گایاکول پراکسیداز (GPX)، آسکوربات پراکسیداز (APX) برگ دو رقم انگور (بیدانه سفید و پرلت) تحت تنش کادمیم. میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون از لحاظ آماری (سطح 5 درصد) اختلاف معنی‌داری ندارند.

Figure 1- The effect of nano hydroxyapatite on the protein content and activity of catalase (CAT), guaiacol peroxidase (GPX) ans ascorbate peroxidase (APX) of the leaves of two grapevine cultivars (Bdaneh-Sefid and Perlette).) under cadmium (Cd) stress

نتیجه‌گیری کلی

استفاده از نانو هیدروکسی آپاتیت در خاک آلوده به فلزات سنگین به‌عنوان یک روش جدید برای کاهش اثرات آلودگی ناشی از فلزات سنگین می‌تواند مورد توجه قرار گیرد، البته باید مقدار آن را در نظر گرفت و همچنین می‌توان در ترکیب با مواد اصلاح‌کننده دیگر هم مورد استفاده قرار گیرد. علاوه بر این، نقش بالقوه نانو هیدروکسی آپاتیت در تثبیت فلزات سنگین خاک باید در شرایط مزرعه بلند‌مدت مورد پژوهش قرار گیرد. کاربرد کادمیم سبب افزایش تجمع کادمیم در ارقام انگور شد. نانو هیدروکسی آپاتیت به‌عنوان یک راه‌حل برای خاک‌های آلوده و تخریب شده شناخته شده است. استفاده از نانو هیدروکسی آپاتیت با غلظت یک درصد در خاک آلوده به کادمیم در دو رقم انگور سبب افزایش در برخی شاخص‌های فیزیولوژیکی برگ از جمله کلروفیل و محتوای نسبی آب و فسفر شد. در کل رقم بیدانه سفید نسبت به رقم پرلت به اثرات نانوهیدروکسی آپاتیت بهتر واکنش نشان داد. کاربرد درست و علمی نانو هیدروکسی آپاتیت می‌تواند یک فناوری اقتصادی و مفید برای کاهش آلودگی خاک و حفظ کیفیت خاک باشد. استفاده از نانو هیدروکسی آپاتیت نیاز به پژوهش­های بیشتری دارد. می‌توان استفاده از نانو هیدروکسی آپاتیت را همراه با مواد دیگر مورد آزمایش قرار داد تا بتوان به اثرات بهتری در زمینه کنترل آلودگی و افزایش بهره‌وری محصولات دست یافت.

سپاسگزاری

بخشی از هزینه­های این پژوهش از محل اعتبار پژوهشی بنیاد ملی علم ایران (4003143 کد طرح صندوق) تأمین شده است که به این وسیله از ایشان قدردانی می­شود. همچنین از همکاران و کارشناسان محترم در آزمایشگاه های پژوهشی شیمی خاک و فیزیولوژی گیاهان باغبانی دانشکده کشاورزی دانشگاه ملایر نیز کمال تشکر و قدردانی را داریم.

Abbas, T., Rizwan, M., Ali, S., Zia-ur-Rehman, M., Qayyum, M. F., Abbas, F., Hannan, F., Rinklebe, J. & Ok, Y. S. (2017). Effect of biochar on cadmium bioavailability and uptake in wheat (Triticum aestivum L.) grown in a soil with aged contamination. Ecotoxicology and Environmental Safety, 140, 37-47. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2017.02.028
Adrees, M., Ali, S., Rizwan, M., Zia-ur-Rehman, M., Ibrahim, M., Abbas, F., Farid, M., Qayyum, M.F. & Irshad, M. K. (2015). Mechanisms of silicon-mediated alleviation of heavy metal toxicity in plants: a review. Ecotoxicology and Environmental Safety, 119, 186-197. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2015.05.011
Alhammad, B. A., Ahmad, A., & Seleiman, M. F. (2023). Nano-hydroxyapatite and ZnO-NPs mitigate Pb stress in maize. Agronomy, 13(4), 1174. https://doi.org/10.3390/agronomy13041174
Ali, B., Gill, R. A., Yang, S., Gill, M. B., Farooq, M. A., Liu, D., ... & Zhou, W. (2015). Regulation of cadmium-induced proteomic and metabolic changes by 5-aminolevulinic acid in leaves of Brassica napus L. PLoS One, 10(4), e0123328. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0123328
Awan, S., Shahzadi, K., Javad, S., Tariq, A., Ahmad, A., & Ilyas, S. (2021). A preliminary study of influence of zinc oxide nanoparticles on growth parameters of Brassica oleracea var italic. Journal of the Saudi Society of Agricultural Sciences, 20(1), 18-24. https://doi.org/10.1016/j.jssas.2020.10.003
Baliardini, C., Meyer, C.-L., Salis, P., Saumitou-Laprade, P., & Verbruggen, N. (2015). cation exchanger cosegregates with cadmium tolerance in the metal hyperaccumulator arabidopsis halleri and plays a role in limiting oxidative stress in Arabidopsis Spp. Plant Physiology, 169, 549–559. https://doi.org/10.1104/pp.15.01037
Bates, L. S., Waldren, R. A., & Teare, I. D. (1973). Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil, 39, 205-207. https://doi.org/10.1007/BF00018060
Bergmeyer, N. (1970). Methoden der Enzymatischen Analyse.  Akademie, Berlin, 1, 636–647.
Bhat, J. A., Shivaraj, S. M., Singh, P., Navadagi, D. B., Tripathi, D. K., Dash, P. K., Solanke, A. U., Sonah, H., & Deshmukh, R. (2019) Role of silicon in mitigation of heavy metal stresses in crop plants. Plants, 8, 71. https://doi.org/10.3390/plants8030071
Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry72(1-2), 248-254. https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3
Chang, C. C., Yang, M. H., Wen, H. M., & Chern, J. C. (2002). Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods. Journal of Food and Drug Analysis, 10(3). https:// doi.org/10.38212/2224-6614.2748
FAO (2018). FAO Statistical Yearbook: World Food and Agriculture. FAO.
Feng, Y., Yang, J., Liu, W., Yan, Y & Wang, Y. (2021). Hydroxyapatite as a passivator for safe wheat production and its impacts on soil microbial communities in a Cd-contaminated alkaline soil. Journal of Hazardous Materials 404, 124005. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2020.124005
Gohari, G., Mohammadi, A., Akbari, A., Panahirad, S., Dadpour, M. R., Fotopoulos, V., & Kimura, S. (2020). Titanium dioxide nanoparticles (TiO2 NPs) promote growth and ameliorate salinity stress effects on essential oil profile and biochemical attributes of Dracocephalum moldavica. Scientific Reports, 10(1), 912. https://doi.org/10.1038/s41598-020-57794-1
He, S., Yang, X., He, Z & Baligar, V.C. (2017). Morphological and physiological responses of plants to cadmium toxicity: a review. Pedosphere 27, 421–438. https://doi:10.1016/s1002-0160(17)60339-4
Heath, R. L., & Packer, L. (1968). Photoperoxidation in isolated chloroplasts: I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Archives of Biochemistry and Biophysics, 125(1), 189-198. https://doi.org/10.1016/0003-9861(68)90654-1
Herzog, V., & Fahimi, H. D. (1973). A new sensitive colorimetric assay for peroxidase using 3,3'-diaminobenzidine as hydrogen donor. Analytical Biochemistry, 55(2), 554-562. https://doi.org/10.1016/0003-2697(73)90144-9
Hussain, A., Ali, S., Rizwan, M., ur Rehman, M. Z., Javed, M. R., Imran, M., Chatha, S.A.S., & Nazir, R. (2018). Zinc oxide nanoparticles alter the wheat physiological response and reduce the cadmium uptake by plants. Environmental Pollution, 242, 1518-1526. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2018.08.036
Irigoyen, J. J., Einerich, D. W., & Sánchez‐Díaz, M. (1992). Water stress induced changes in concentrations of proline and total soluble sugars in nodulated alfalfa (Medicago sativa) plants. Physiologia Plantarum, 84(1), 55-60. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1992.tb08764.
Jafarhaddadian, E., Zoufan, P., & Shafiei, M. (2021) Effect of NaCl on Cd stress modulation, antioxidant system and Cd uptake and accumulation in Malva parviflora L. Iranian Journal of Plant Biology, 12(4), 59-76. https://doi.org/10.22108/IJPB.2021.122156.1204 [In Persian].
Jalili, M., & Karimi, R. (2021) The effect of combined application of nitrogen, zinc and manganese on yield and fruit qualitative characteristics of grape. Iranian Journal of Plant Biology, 13(4), 33-56. https://doi.org/10.22108/ijpb.2022.133403.1284 [In Persian].
Juang, K. W., Ho, P. C., & Yu, C. H. (2012). Short-term effects of compost amendment on the fractionation of cadmium in soil and cadmium accumulation in rice plants. Environmental Science and Pollution Research, 19, 1696-1708. https://doi.org/10.1007/s11356-011-0684-0
Kaya, C., Ashraf, M., Alyemeni, M. N., & Ahmad, P. (2020). The role of nitrate reductase in brassinosteroid-induced endogenous nitric oxide generation to improve cadmium stress tolerance of pepper plants by upregulating the ascorbate-glutathione cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety, 196, 110483. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2020.110483
Kaya, C., Okant, M., Ugurlar, F., Alyemeni, M. N., Ashraf, M., & Ahmad, P. (2019). Melatonin-mediated nitric oxide improves tolerance to cadmium toxicity by reducing oxidative stress in wheat plants. Chemosphere, 225, 627-638. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2019.03.026
Ke, W., Li, C., Zhu, F., Luo, X., Feng, J., Li, X., Jiang, Y., Wu, C., Hartley, W & Xue, S. (2023). Effect of potentially toxic elements on soil multifunctionality at a lead smelting site. Journal of Hazard Materials, 454, 131525. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2023.131525
Khan, S., Akhtar, N., Rehman, S. U., Shujah, S., Rha, E. S., & Jamil, M. (2022). Bacillus subtilis synthesized iron oxide nanoparticles (Fe3O4 NPs) induced metabolic and anti-oxidative response in rice (Oryza sativa L.) under arsenic stress. Toxics10(10), 618. https://doi.org/10.3390/toxics10100618
Kottegoda, N., Sandaruwan, C., Priyadarshana, G., Siriwardhana, A., Rathnayake, U.A., Berugoda Arachchige, D.M., Kumarasinghe, A.R., Dahanayake, D., Karunaratne, V & Amaratunga, G.A.J. (2017). Urea-hydroxyapatite nanohybrids for slow release of nitrogen. ACS Nano, 11, 1214–1221. https://doi.org/10.1021/acsnano.6b07781
Li, Z., & Huang, J. (2014). Effects of nanoparticle hydroxyapatite on growth and antioxidant system in pakchoi (Brassica chinensis L.) from cadmium-contaminated soil. Journal of Nanomaterials, (Special Issue). https://doi.org/10.1155/2014/470962
Loreto, F., & Velikova, V. (2001). Isoprene produced by leaves protects the photosynthetic apparatus against ozone damage, quenches ozone products, and reduces lipid peroxidation of cellular membranes. Journal of Plant Physiology, 127(4), 1781-1787. https://doi.org/10.1104/pp.010497
Mahdavi, S., Afkhami, A., & Jalali, M. (2015). Reducing leachability and bioavailability of soil heavy metals using modified and bare Al 2 O 3 and ZnO nanoparticles. Environmental Earth Sciences73, 4347-4371. https://doi.org/10.1007/s12665-014-3723-6
Mamut, A., Huang, J., Andom, O., Zhang, H., Zhang, N., Zhou, H., Lv, Y., & Li, Z. (2023). Stability of exogenous Cadmium in different vineyard soils and its effect on grape seedlings. Science of The Total Environment, 895, 165118. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2023.165118
Manikandan, R., Ezhili, N., & Venkatachalam, P. (2016). Phosphorus supplementation alleviation of the cadmium-induced toxicity by modulating oxidative stress mechanisms in vetiver grass [Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty]. Journal of Environmental Engineering, 142(9), C4016003. https://doi.org/10.1061/(ASCE)EE.1943-7870.0001112
Metcalfe, N.B., & Olsson, M. (2022). How telomere dynamics are influenced by the balance between mitochondrial efficiency, reactive oxygen species production and DNA damage. Molecular Ecology, 31, 6040–6052. https://doi.org/10.1111/mec.16150
Nakano, Y., & Asada, K. (1981). Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in Spinach chloroplasts. Plant Cell Physiology, 22(5), 867-880. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.pcp.a076232
Nouri Akandi, Z., Makarian, H., Pirdashti, H., Reza, M., Amerian, M.B.F. & Ghanbary, M.A.T. (2020). Effect of some symbiotic fungi and iron nanoparticles on morphological and physiological traits of purslane (Portulaca oleracea L.) under cadmium stress. Journal of Horticultural Plant Nutrition, 3(1), 1-22. https://doi.org/10.22070/hpn.2020.5242.1075 [In persian].
Ran, J., Wang, D., Wang, C., Zhang, G., & Zhang, H. (2015). Heavy metal contents, distribution, and prediction in a regional soil-wheat system. Science of The Total Environment, 544, 422–431. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2015.11.105
Ritchie, S. W., Nguyen, H. T., & Holaday, A. S. (1990). Leaf water content and gas‐exchange parameters of two wheat genotypes differing in drought resistance. Crop Science, 30(1), 105-111. https://doi.org/10.2135/cropsci1990.0011183X003000010025
Rizwan, M., Ali, S., Abbas, T., Zia-ur-Rehman, M., Hannan, F., Keller, C., Al-Wabel, M.I., & Ok, Y.S. (2016). Cadmium minimization in wheat: a critical review. Ecotoxicology and Environmental Safety, 130, 43-53. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2016.04.001
Rizwan, M., Ali, S., ur Rehman, M. Z., Adrees, M., Arshad, M., Qayyum, M. F., Ali, L., Hussain, A., Chatha, S.A.S., & Imran, M. (2019). Alleviation of cadmium accumulation in maize (Zea mays L.) by foliar spray of zinc oxide nanoparticles and biochar to contaminated soil. Environmental Pollution, 248, 358-367. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2019.02.031
Sairam, K., Dorababu, M., Goel, R., & Bhattacharya, S. (2002). Antidepressant activity of standardized extract of Bacopa monniera in experimental models of depression in rats. Phytomedicine, 9(3), 207-211. https://doi.org/10.1078/0944-7113-00116
Seneviratne, M., Rajakaruna, N., Rizwan, M., Madawala, H., Ok, Y.S., & Vithanage, M. (2019). Heavy metal-induced oxidative stress on seed germination and seedling development: A critical review. Environmental Geochemistry and Health, 41, 1813–1831. https://doi.org/10.1007/s10653-017-0005-8
Shaheen, S.M., & Rinklebe, J. (2015). Impact of emerging and low-cost alternative amendments on the (im)mobilization and phytoavailability of Cd and Pb in a contaminated floodplain soil. Ecological Engineering, 74, 319–326. https://doi.org/10.1016/j.ecoleng.2014.10.024
Slinkard, K., & Singleton, V. L. (1977). Total phenol analysis: automation and comparison with manual methods. American Journal of Enology and Viticulture, 28(1), 49-55. https://doi.org/10.5344/ajev.1977.28.1.49
Song, W.E., Chen, S.B., Liu, J.F., Chen, L., Song, N.N., Li, N & Liu, B. (2015). Variation of Cd concentration in various rice cultivars and derivation of cadmium toxicity thresholds for paddy soil by species-sensitivity distribution. Journal of Integrative Agriculture, 14, 1845–1854. https://doi.org/10.1016/S2095-3119(14)60926-6.
Taran, N., Storozhenko, V., Svietlova, N., Batsmanova, L., Shvartau, V., & Kovalenko, M. (2017). Effect of zinc and copper nanoparticles on drought resistance of wheat seedlings. Nanoscale Research Letters, 12, 1-6. https://doi.org/10.1186/s11671-017-1839-9
Tripathi, R., Gupta, R., Sahu, M., Srivastava, D., Das, A., Ambasta, R.K., Kumar, P. (2021). Free radical biology in neurological manifestations: Mechanisms to therapeutics interventions. Environmental Science and Pollution Research, 29, 62160–62207. https://doi.org/10.1007/s11356-021-16693-2
Ur Rahman, S., Xuebin, Q., Zhao, Z., Du, Z., Imtiaz, M., Mehmood, F., Hongfei, L., Hussain, B., & Ashraf, M. N. (2021). Alleviatory effects of silicon on the morphology, physiology, and antioxidative mechanisms of wheat (Triticum aestivum L.) roots under cadmium stress in acidic nutrient solutions. Scientific Reports, 11, 1-12. https://doi.org/10.1038/s41598-020-80808-x
Ur Rehman, M. Z., Rizwan, M., Khalid, H., Ali, S., Naeem, A., Yousaf, B., Liu, G., Sabir, M., & Farooq, M. (2018). Farmyard manure alone and combined with immobilizing amendments reduced cadmium accumulation in wheat and rice grains grown in field irrigated with raw effluents. Chemosphere, 199, 468-476. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2018.02.030
Wani, W., Masoodi, K. Z., Zaid, A., Wani, S. H., Shah, F., Meena, V. S., Wani, S. A., & Mosa, K. A. (2018) Engineering plants for heavy metal stress tolerance. Rendiconti Lincei Scienze Fisiche e Naturali, 29, 709-723. https://doi.org/10.1007/s12210-018-0702-y
Wu, H., Tong, J., Jiang, X., Wang, J., Zhang, H., Luo, Y., Pang, J., & Shi, J. (2024). More effective than direct contact: Nano hydroxyapatite pre-treatment regulates the growth and Cd uptake of rice (Oryza sativa L.) seedlings. Journal of Hazardous Materials, 463, 132889. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2023.132889
Ye, X.X., Wang, G.Z., Zhang, Y.X., & Zhao, H.J. (2018). Hydroxyapatite nanoparticles in root cells: reducing the mobility and toxicity of Pb in rice. Environmental Science: Nano, 5, 398–407. https://doi.org/10.1039/C7EN00953D
Zeng, J., Li, C., Wang, J., Tang, L., Wu, C., & Xue, S. (2022). Pollution simulation and remediation strategy of a zinc smelting site based on multi-source information. Journal of Hazard Materials, 433, 128774. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2022.128774
Zhang, Z., Li, M., Chen, W., Zhu, S., Liu, N., & Zhu, L. (2010). Immobilization of lead andcadmium from aqueous solution and contaminated sediment usingnano-hydroxyapatite. Environmental Pollution, 158(2), 514–519. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2009.08.024
Zhou, P., Zhang, P., He, M., Cao, Y., Adeel, M., Shakoor, N., Jiang, Y., Zhao, W., Li, Y., Li, M., Azeem, I., Jia, L., Rui, Y., Ma, X., & Lynch, I. (2023). Iron-based nanomaterials reduce cadmium toxicity in rice (Oryza sativa L.) by modulating phytohormones, phytochelatin, cadmium transport genes and iron plaque formation. Environmental Pollution, 320, 121063. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2023.121063
Zokaee Khosroshahi, M., Rouhollah Karimi, R., & Toranjian, A. (2023) Influence of soil application of natural zeolite and farmyard manure on physiological indices of Grapevine under drought stress. Journal of Plant Biological Sciences, 15(1), 65-84.  https://doi.org/10.22108/ijpb.2024.139739.1340