نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
گروه تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ملایر، ملایر، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Heavy metal stress is one of the most important factors limiting the growth and yield of plants in many parts of the world. As a mycorrhizal endophytic fungus, Serendipita indica stimulates the growth of many plant species and increases resistance to biotic and abiotic stresses. In this research, the combined effect of S. indica endophytic fungus and nickel nitrate (control, 50, 100, and 200 mg/L) on chicory germination has been investigated according to a factorial experiment based on completely randomized design (CRD) with 3 replications. The results showed that the interaction effect of nickel nitrate and fungus was significant for the percentage and rate of germination, root length, shoot length, fresh and dry weight of seedlings, and chlorophyll. Also, the results showed that the main effect of nickel nitrate was significant for phenol, proline, and antioxidant enzymes, whereas the amounts of phenol, proline, catalase, and peroxidase increased by 40, 35, 33 and 42%, respectively, at the level of 50 mg/L of nickel nitrate compared to the control. Based on the results, treatment with the endophytic fungus increased traits such as germination percentage and rate, root and shoot length, seedling fresh and dry weight, and chlorophyll and reduced the negative effects of nickel nitrate in these traits. On the other hand, nickel nitrate treatment increased the content of total phenol, proline, and antioxidant enzymes. Therefore, it seems that the use of symbiotic endophyte fungus can be considered a suitable solution to reduce the negative effects of heavy metals.
Introduction
Heavy metals are frequently encountered contaminants in diverse soils and their presence can have adverse impacts on crop yields and agricultural production, thereby jeopardizing the sustainability of farming practices. The unprincipled disposal of sewage sludge and industrial effluents in farming fields has also given rise to nickel (Ni) accumulation in soils used for vegetable production and irrigated with untreated wastewater. Ni can thus harm some tissues; it is further suspected of being responsible for some types of cancer. Several reclamation techniques are available to address the life-threatening issues arising from potentially Ni-contaminated soils. One promising and environmentally friendly alternative is harnessing beneficial root-colonizing microbes. As a mycorrhizal endophytic fungus, Serendipita indica stimulates the growth of many plant species and increases resistance to biotic and abiotic stresses. This approach holds potential for the sustainable development of agriculture systems, offering a cost-effective way to enhance plant growth and increase the tolerance of crops to Ni stress. The present study was conducted to examine the possible protective role of S. indica inoculation under Ni toxicity in chicory germination.
Material and Methods
In this research, the combined effect of S. indica endophytic fungus and nickel nitrate (control, 50, 100, and 200 mg/L) on chicory germination has been investigated according to a factorial experiment based on completely randomized design (CRD) with 3 replications. The first chicory seeds were treated with 5.0% sodium hypochlorite for 5 min and then with 70.0% ethanol for 30 s for surface sterilization. Then, they were washed three times with distilled water. Spore extract was added to the Petri dishes for inoculation, except for the control treatments without S. indica. In total, 30 seeds of chicory were used for each Ni nitrate [Ni(NO3)2] stress treatment (50, 100, and 200 mg/L) and were placed in Petri dishes containing two layers of Whatman No 2.0 filter paper moistened with 10 mL of solutions or distilled water as the control. The stock solutions of Ni nitrate were further prepared in distilled water at the desired concentrations and diluted with distilled water to obtain suitable concentrations. Double-distilled water was applied as the control treatment. The Petri dishes were then located in a germinator with a temperature of 25 ℃ and a 16/8 h light/dark cycle. The measured traits also included percentage and rate of germination, seedling's fresh and dry weights, shoot length, root length, proline, phenol content, catalase, and peroxidase. The obtained data were analyzed using SPSS statistical software. Mean comparisons were conducted using Duncan's multiple range test at a significant level of 1%.
Results and Discussion
The results showed that the interaction effect of nickel nitrate and fungus was significant for the percentage and rate of germination, root length and shoot length, dry weight of seedlings, and chlorophyll a and -b. The impact of Ni and S. indica on seed germination and early stage of plant growth was measured. It was observed that Ni treatment decreases the percentage and rate of germination. In treatments of Ni without fungal spore at 50, 100, and 200 mg/L a reduced seed germination rate. While inoculation of fungal spores (Si+Ni) increased seed germination compared with the control ones. As shown, S. indica inoculation augmented the seedlings' fresh and dry weight compared to non-inoculated plants. Exposure of chicory plants to 200 mg/L Ni resulted in a marked decrease in seedling's fresh and dry weight compared to control plants. The toxic effect of Ni on biomass was significantly mitigated by S. indica. The root length and shoot height were significantly decreased by the supply of Ni. Under Ni stress, root length, and shoot height were significantly enhanced due to the presence of S. indica. Also, the results showed that the main effect of nickel nitrate was significant for phenol, proline, and antioxidant enzymes, whereas the amounts of phenol, proline, catalase, and peroxidase increased by 40, 35, 33 and 42%, respectively, at the level of 50 mg/L of nickel nitrate compared to the control. Based on the results, treatment with the endophytic fungus increased traits such as germination percentage and rate, root and shoot length, seedling fresh and dry weight, and chlorophyll and reduced the negative effects of nickel nitrate in these traits. On the other hand, nickel nitrate treatment increased the content of total phenol, proline, and antioxidant enzymes.
Conclusion
This study revealed that S. indica treatment significantly and positively enhanced most measured traits and improved the growth performance of chicory seedlings under Ni toxicity stress. The results of this study confirm that the use of symbiotic endophyte fungus can be considered a suitable solution to reduce the negative effects of heavy metals.
کلیدواژهها [English]
گیاه کاسنی (Cichorium intybus L.) متعلق به خانواده Asteracea یا خانواده کاسنی است که در دهههای جدید به علّت اهمیتی که گیاهان دارویی نسبت به داروهای با منشاء شیمیایی پیدا کردهاند، این گیاه مورد توجه خاصی قرار گرفته و از آن در جهت درمان مشکلات گوارشی، کبد و کیسه صفرا استفاده میشود. استفاده از این گیاه برای رفع قولنجهای کبدی، زردی، بیماریهای مزمن پوست، عفونت مجاری ادرار مفید بوده و تاثیرات مثبتی شامل تصفیهکنندگی خون، ملین بودن، تب بری و رفع کمخونی دارد (Ahvazi et al., 2010). مصرف کاسنی به علّت مقادیر زیاد اسید سیتریک، سبب بهبود سیستم ایمنی در برابر التهاب و عفونت باکتریایی میشود (Ahmad, 2009). تنشهای محیطی سبب کاهش عملکرد محصولات کشاورزی در سطح جهان میشوند (Upendra & Bandyopadhyay, 2006). آلودگی خاک با فلزات سنگین از تنشهای محیطی است که اثرات فیزیولوژیکی مضری بر موجودات زنده و از جمله انسان دارند و حتی در غلظتهای کم نیز سرطانزا است (Bafeel, 2010). آلوده شدن زمینهای کشاورزی با فلزات سنگین که عدد اتمی بالاتر از 20 و چگالی بالاتر از پنج گرم بر سانتیمتر مکعب دارند، یکی از مسائل مهم زیست محیطی است (Alloway, 2010). برخی فلزات سنگین مانند مس، روی، نیکل، مولیبدن، منگنز و آهن بهعنوان عناصر کم مصرف، در مقادیر کم سبب رشد و نمو گیاه میشوند، ولی مقدار اضافی آنها نیز منجر به اختلال در فرآیندهای فیزیولوژیکی و ریخت شناسی گیاهان میشود. همچنین فلزات سنگینی مانند سرب، کادمیوم، کروم و جیوه در غلظتهای بسیار کم برای گیاهان سمی هستند ( et al., 2004; Rubio et al., 2012 Sebastiani).
نیکل از عناصر ضروری کم مصرف است که فعالیت آنزیم اورهآز در گیاهان به آن وابسته است. این فلز به فرمهای مختلف در محیطهای آبی، خاکی و همچنین در پیکره گیاهان و جانوران وجود دارد. با افزایش آلودگیهای زیستمحیطی، نیکل وارد زنجیره غذایی موجودات زنده شده و میزان آن به طور معنیداری افزایش یافته است (Cempel & Nikel, 2006). مقادیر بالای نیکل، فرآیندهای فیزیولوژیکی گیاهان از قبیل فتوسنتز، انتقال مواد آلی، تغذیه معدنی و توازن آب بافتها را کاهش میدهد (Pegon, 1985). تأثیر سمی نیکل با بروز علائمی مانند کلروز و نکروز و پژمردگی برگها آشکار میشود (Parida et al., 2003). بخش دیگری از تأثیرات سمی نیکل، توسط تنش اکسیداتیو القا شونده بر گیاهان وارد میشود (Baccouch et al., 2001).
کاربرد روشهای زیست شناختی مانند قارچهای اندوفیت جهت افزایش تحمّل گیاهان به تنشهای محیطی مانند آلودگی خاک به فلزات سنگین، پژوهشگران را در رسیدن به اهداف کشاورزی پایدار امیدوار نموده است. یکی از این قارچهای اندوفیت مفید، قارچ Serendipita indica است که در سال 1998توسط پژوهشگری به نام وارما و همکارانش در کشور هندوستان از خاک مناطق بیابانی جداسازی شد (Varma et al., 1998). این قارچ دارای گیاهان میزبان فراوانی است که با همسانه سازی ریشه گیاه میزبان، سبب تحریک رشد میشود. S. indica با تعداد زیادی از گیاهان عالی (تک و دولپهای)، از جمله گیاهان خشکیپسند، بوتهای یکساله و چندساله و درختان چوبی رابطه همزیستی برقرار مینماید (Singh et al., 2000; Varma et al., 1998). قارچهای میکوریزی بهعنوان همزیست اجباری گیاهان میزبان مطرح هستند، ولی قارچ S. indica یک همزیست اختیاری بوده و در محیطهای کشت مصنوعی به راحتی رشد میکند (Qiang et al., 2011).
سمّیت ناشی از غلظتهای بالای نیکل و ضرورت وجود آن برای رشد، نشاندهنده اهمّیت شناخت علائم مسمومیت این عنصر در گیاهان را آشکار میکند. همچنین اطلاع از میزان جذب آن توسط گیاهان در خاکهای آلوده به نیکل اهمیت دارد. اگرچه نیکل یک ریز مغذی ضروری برای گیاهان است، امّا در غلظتهای زیاد در بیشتر گونههای گیاهی سمّی است (Eskandari et al., 2017). جوانهزنی بذر، اولین فرآیند فیزیولوژیکی است که به طور بالقوه تحت تأثیر غلظت بالای نیکل در خاک قرار میگیرد. بنابراین توانایی جوانه زدن بذر در محیط حاوی نیکل زیاد، ممکن است نشان دهنده سطح تحمّل آن به این عنصر سمّی باشد، اگرچه به نظر میرسد سمیت نیکل بر رشد گیاهچه نسبت به جوانهزنی تأثیر بیشتری دارد (Eskandari et al. 2017). پژوهش تأثیر نیکل بر صفات و ویژگیهای مورفوفیزیولوژیکی گیاهان و شناسایی آستانه تحمل نسبت به غلظتهای مختلف این فلز در شرایط کنترل شده، میتواند در بهبود کیفیت گیاهان و محصولات زراعی و افزایش بازده آنها مفید باشد. بنابراین هدف از انجام این تحقیق بررسی تأثیر تلفیقی نیترات نیکل و تلقیح با قارچ اندوفیت Serendipita indica بر جوانهزنی گیاه کاسنی است.
مواد و روشها.
این آزمایش بهصورت فاکتوریل و در قالب طرح کامل تصادفی و در سه تکرار انجام شد. قارچ S. indica (شاهد و اسپور تهیه شده از پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی ایران) بهعنوان فاکتور اول و سطوح مختلف نیترات نیکل (شاهد، ۵۰، ۱۰۰ و ۲۰۰ میلیگرم در لیتر) به عنوان فاکتور دوم در نظر گرفته شد. هر تکرار یک پتری دیش حاوی
30 عدد بذر بود.
کشت قارچ و آماده سازی اسپور: جدایه قارچ S. indica بر اساس روش پیشنهادی قبولی و همکاران (Ghabooli et al., 2013) در تعداد 12 پتریدیش حاوی محیط کشت پیچیده (حاوی عناصر میکرو، ماکرو، نمکها، پیتون و عصاره مخمر)، کشت شده و در درون شیکر انکوباتور با دمای °C 24 به مدت ۴ هفته نگهداری شد. پس از گذشت مدّت زمان لازم جهت تولید اسپور، مقدار ۳۰-۲۰ میلیلیتر محلول آب توئین ۲۰ درصد به هر پتری دیش افزوده، اسپورهای قارچ جمعآوری شده و تعداد آنها با لام نئوبار شمارش شدند.
آماده سازی و تلقیح بذر: بذر گیاه دارویی کاسنی از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد. ضدعفونی سطحی بذرها با هیپوکلرید سدیم
۵ درصد به مدّت ۵ دقیقه، سه بار شستشو با آب مقطر و سپس با الکل (اتانول ۷۰ درصد) به مدّت۳۰ ثانیه و سه بار شستشو با آب مقطر انجام شد. پس از ضدعفونی، بذرها به مدت 24 ساعت در سوسپانسیون اسپور قرار داده شدند و سپس اعمال تیمار نیترات نیکل (شاهد، ۵۰، ۱۰۰ و ۲۰۰ میلیگرم در لیتر) روی گیاهان تلقیح شده انجام شد. انتخاب این مقادیر بر اساس بررسی منابع و آزمایشهای اولیه بود. تمامی تیمارها به علاوه شاهد در دمای 25 درجه سانتیگراد ژرمیناتور (16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی) و رطوبت نسبی 45 درصد قرار داده شدند. برای اثبات کلنیزاسیون، بین 7 تا 10 روز پس از تلقیح، از ریشههای گیاهان تلقیحشده و شاهد نمونهبرداری و با روشهای میکروسکوپی و با رنگ تریفان بلو، وجود کلامیدوسپورهای قارچ بررسی شد.
بررسی صفات ریخت شناسی و فیزیولوژیک.
24 ساعت پس از شروع آزمایش، تعداد بذرهای جوانه زده شمارش شده و تا پایان آزمایش (21 روز بعد) ادامه یافت. همچنین صفات مرتبط با جوانهزنی از جمله درصد جوانه زنی کل، سرعت جوانه زنی، طول ریشهچه، طول ساقهچه، وزن تر و خشک گیاهچه یادداشت شد. آزمایش جوانهزنی در داخل ژرمیناتور و در دمای 25 درجه سانتیگراد انجام شد. برای سنجش وزن خشک، گیاهچهها به مدّت 48 ساعت در آونی با دمای 70 درجه سانتیگراد قرار داده شده و سپس با ترازوی دیجیتالی با دقت یک هزارم گرم توزین شدند. درصد جوانهزنی نهایی از رابطهی شماره 1 (Ranal & De Santana, 2006) محاسبه شد.
|
رابطه ی (1): |
|
در رابطه فوق، GP درصد جوانهزنی کل،
Ng تعداد کل بذرهای جوانه زده در پایان آزمایش و Nt برابر با تعداد کل بذرهای مورد استفاده در آزمایش است. برای محاسبه سرعت جوانه زنی از رابطه ی شماره 2 استفاده شد که در این رابطه،
GR سرعت جوانه زنی، Ni تعداد بذور جوانه زده در روز مورد نظر و Di تعداد روزهای سپری شده از شروع آزمایش است (Abdolrahmani, 2010).
|
رابطه ی (2): |
|
سنجش محتوای کلروفیل با روش Arnon (1949) و با استون 80 درصد صورت گرفت و میزان کلروفیل در طولموجهای ۶۶۳ و ۶۴۵ نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. برای اندازهگیری پرولین از روش Bates و همکاران (1973) استفاده و غلظت آن در طولموج ۵۲۰ نانومتر اندازهگیری شد. استخراج و اندازهگیری فنول کل به روش Zhu & Yao (2004) انجام شد. جهت انجام این آزمایشها به 5/0 میلیلیتر از هر عصاره (۱۰ میلیگرم بر میلیلیتر) 5/2 میلیلیتر واکنشگر فولین - سیو کالتیو 2/0 نرمال افزوده شد. پس از ۵ دقیقه ۲ میلیلیتر از محلول ۷۵ گرم بر لیتر کربنات سدیم به آن اضافه شد. پس از ۲ ساعت، جذب مخلوط در طول موج 760 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Jenway 6035, UK) در مقابل بلانک خوانده شد. در نهایت با منحنی استاندارد غلظتهای مختلف اسید گالیک برحسب میلیگرم بر گرم وزن تر تعیین شد. فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز با روش Nakano & Asada (1981) اندازهگیری شد. مخلوط واکنشی
(یک میلیلیتر) شامل 250 میکرولیتر از محلول بافر فسفات 100 میلیمولار با pH خنثی، 250 میکرولیتر از آسکوربات یک میلیمولار، 250 میکرولیتر ازEDTA 4/0 میلیمولار، 190 میکرولیتر آب دو بار تقطیر، 10 میکرولیتر از پراکسید هیدروژن
10 میلیمولار و 50 میکرولیتر از محلول آنزیمی استخراج شده بود. سرعت واکنش آنزیمی بهصورت تغییرات جذب بر زمان در طول موج 290 نانومتر برای یک دقیقه ثبت شده و فعالیت آنزیم کاتالاز به روش Bergmeyer (1970) و بر اساس میزان ناپدیدشدن آباکسیژنه در طولموج 240 نانومتر اندازهگیری شد.در نهایت تجزیه آماری بر اساس آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی، با نرم افزار آماری SPSS انجام شده و برای بیان تفاوتهای آماری بین میانگینها از آزمون چند دامنهای دانکن استفاده شد.
نتایج و بحث.
درصد و سرعت جوانه زنی
نتایج تجزیه واریانس (جدول 1) نشان دادند تأثیر متقابل سطوح مختلف نیترات نیکل در قارچ اندوفیت S. indica برای صفات درصد و سرعت جوانهزنی در سطح احتمال یک درصد معنیدار بود. نتایج مقایسه میانگین نشان دادند بیشترین درصد جوانهزنی (۳/۹۸ درصد) در تیمار تلقیح با قارچ و در عدم حضور نیترات نیکل و کمترین درصد جوانهزنی (۰۹/۵۲ درصد) مربوط به ترکیب تیمار 200 میلیگرم در لیتر نیترات نیکل و عدم تلقیح با قارچ S. indica بود (جدول 2). به عبارت دیگر با افزایش غلظت نیترات نیکل به 50، 100 و 200 میلیگرم در لیتر 13، 41 و 75 درصد از جوانهزنی بذور نسبت به شاهد کاسته شد. این تأثیر مضر نیترات نیکل با تلقیح قارچ S. indica بهصورت 12، 34 و 59 درصد بود که به ترتیب نشانگر تأثیر مثبت 1، 7 و 16 درصدی کاربرد این قارچ است. بر اساس نتایج مقایسه میانگین بیشترین سرعت جوانهزنی (۰۶۵/۰ بذر در ساعت) به تیمار تلقیح با قارچ و عدمحضور نیترات نیکل و کمترین آن به تیمار تلقیح نشده و 200 میلیگرم در لیتر نیترات نیکل (۰۳۸/۰ بذر در ساعت) مربوط بود (شکل 1).
با افزایش غلظت نیترات نیکل به 200 میلیگرم در لیتر، 75 درصد از سرعت جوانهزنی بذور نسبت به شاهد کاسته شد. این تأثیر مضر نیترات نیکل با تلقیح قارچ S. indica به مقدار 18 درصد افزایش یافت. پاسخهای گوناگون به سمیت ایجاد شده توسط فلزات سنگین به گونه گیاهی، مرحله رشد، شرایط کشت، غلظت و مدتزمان تیماردهی بستگی دارد (Chen et al., 2009) . تأثیر مهارکنندگی فلزات سنگین بر جوانهزنی از روش مهار هیدرولیز نشاسته آندوسپرم اعمال میشود که سرعت جوانهزنی را کاهش داده و از رشد اولیهی بذور جلوگیری میکند، از سوی دیگر، این تأثیر مهارکنندگی با آسیب رساندن به رویان مانع جوانهزنی میشود (Mishra & Choudhuri, 1997). یکی دیگر از عوامل کاهش درصد جوانهزنی، سرعت پائین تجزیه اندوخته بذر و از بینرفتن غشاء است (Shafiq & Iqbal, 2008). کاهش جوانهزنی و قدرت بذر در اثر استفاده فلزات سنگین در سایر گیاهان از جمله تربچه در تنش نیکل، کادمیوم و سرب (Moridian Pirdosti
et al., 2022) و افسنطین در تنش فلزات سنگین مس، کادمیوم و سرب (Lashkari Sanami et al., 2022) گزارش شده است. پژوهش حاضر نشان داد که کاربرد قارچ S. indica، دارای تأثیر مثبت بر جوانهزنی کاسنی بوده و تأثیر منفی نیترات نیکل را کاهش داد. نتایج Sakhai و همکاران (Sakhai et al., 2021) نشان دادند تلقیح گیاه شنبلیله با قارچ
S. indica میتواند تأثیرات مثبتی بر جوانهزنی و کاهش تأثیر فلز سنگین داشته باشد. در شرایط عدمکاربرد قارچ، سرعت جوانهزنی با افزایش درصد جوانهزنی کاهش یافته ولی با تلقیح قارچ، سرعت جوانهزنی با افزایش درصد جوانهزنی افزایش یافت، بنابراین در شرایط تنش، گیاه سعی میکند تا سریعتر جوانه بزند، اگرچه درصد جوانهزنی کم میشود. در مقابل، با ورود یک عامل محرک تحمل به تنش مثل قارچ S. indica، درصد جوانهزنی بهبود یافته و سرعت نیز وضعیت بهتری داشت. قارچ اندوفیت S. indica سرعت جوانهزنی را در گونههای مختلف گیاهی بهبود داده و حتی در شرایط تنش نیز سبب بهبود جوانهزنی بذر میشود (Saleem et al., 2022).
جدول 1- تجزیه واریانس سطوح مختلف نیترات نیکل و تلقیح با قارچ S. indica بر درصد و سرعت جوانهزنی و طول ریشهچه و ساقهچه
Table 1- Variance analysis for effect of nickel nitrate and S. indica inoculation on germination percentage and rate, root and shoot length
|
Sources of variation |
DF |
Germination percentage |
Germination rate |
Shoot length
|
Root length
|
|
Fungus S. indica (F) |
1 |
7.2** |
3.21** |
1.5** |
2.2** |
|
Nickel nitrate (N) |
3 |
25.6** |
4.8** |
16.6** |
5.64** |
|
F × N |
3 |
5.6** |
15.3** |
7.3** |
3.15** |
|
Error |
16 |
0.023 |
3.6 |
0.051 |
0.011 |
|
Coefficient of variation |
- |
5.98 |
10.46 |
6.98 |
8.07 |
** و n.s به ترتیب معنیداری در سطح احتمال 1 درصد و عدم تفاوت معنیداری است.
** and ns: significance at 1% probability level and non-significance, respectively.
شکل 1- مقایسه میانگین تأثیرات نیترات نیکل و قارچ S. indica بر (A) درصد جوانهزنی، (B) سرعت جوانهزنی، (C) طول ریشهچه و (D) طول ساقهچه
Figure 1- Mean comparison for effect of nickel nitrate and S. indica inoculation on (A) germination percentage,
(B) germination rate, (C) shoot length, and (D) root length
طول ریشهچه و ساقهچه، وزن تر و خشک گیاهچه.
نتایج تجزیه واریانس (جداول 1 و 3) نشان دادند تأثیر متقابل نیترات نیکل و قارچ اندوفیت
S. indica برای صفات طول ریشهچه و ساقهچه، وزن تر و خشک گیاهچه در سطح احتمال یک درصد معنیدار بود. نتایج مقایسه میانگین نشان داد بیشترین طول ریشهچه (2/13 سانتیمتر) و ساقهچه
(3/6 سانتیمتر)، وزن تر (75/1 گرم) و خشک (05/1 گرم) گیاهچه مربوط به بذرهای تیمار شده با اسپور قارچ S. indica و در عدم حضور نیترات نیکل بودند (جداول 2 و 4). با افزایش غلظت نیترات نیکل به 200 میلیگرم در لیتر، طول ساقهچه 4 برابر نسبت به شاهد کاهش یافت ولی با کاربرد قارچ، این کاهش به یک برابر کاهش یافت. همچنین با افزایش غلظت نیترات نیکل به 200 میلیگرم در لیتر، طول ریشهچه 2 برابر نسبت به شاهد کاهش یافت، ولی با کاربرد قارچ، این کاهش به یک برابر کاهش یافت (شکل 1). همچنین نتایج نشان دادند کمترین طول ریشهچه (2/4 سانتیمتر) و ساقهچه (19/1 سانتیمتر)، وزن تر (76/0 گرم) و خشک (34/0 گرم) مربوط به ترکیب تیمار 200 میلیگرم در لیتر نیترات نیکل و عدم تلقیح قارچ S. indica بود (شکل 2).
شکل 2- مقایسه میانگین تاثیرات نیترات نیکل و قارچ S. indica بر(A) وزن تر گیاهچه، (B) وزن خشک گیاهچه، (C) کلروفیل a و (D) کلروفیل b
Figure 2- Mean comparison for effect of nickel nitrate and S. indica inoculation on (A) seedling dry weight, (B) seedling fresh weight, (C) chlorophyll a and (D) chlorophyll b
جدول 2- مقایسه میانگین تأثیرات نیترات نیکل و قارچ S. indica بر درصد و سرعت جوانهزنی و طول ریشهچه و ساقهچه
Table 2- Mean comparison for effect of nickel nitrate and S. indica inoculation on germination percentage, germination rate, root and shoot length
|
S. indica |
Nickel nitrate(mg/L) |
Germination percentage (%) |
Germination rate (Seeds/hour) |
Shoot length (cm) |
Root length (cm) |
|
Non-inoculated |
0 |
91.2±0.91b |
0.061±0.0007ab |
5.64±0.0564b |
11.65±0.117b |
|
50 |
80.4±1.61d |
0.052±0.0010b |
3.41±0.0682d |
8.70±0.174c |
|
|
100 |
64.5±1.94f |
0.041±0.0014cd |
2.54±0.0762e |
5.50±0.165cd |
|
|
200 |
52.1±0.52g |
0.038±0.0005de |
1.19±0.0119f |
4.20±0.042e |
|
|
Inoculated |
0 |
98.3±1.97a |
0.065±0.0014a |
6.30±0.1260a |
13.20±0.264a |
|
50 |
87.5±2.63c |
0.056±0.0017b |
4.50±0.1350c |
11.90±0.357b |
|
|
100 |
73.2±1.46e |
0.048±0.0011c |
3.70±0.0740d |
9.70±0.194c |
|
|
200 |
61.5±0.61f |
0.043±0.0005d |
3.10±0.0310de |
6.37±0.064d |
میانگینهایی که در یک ستون حروف مشابهی دارند از لحاظ آماری در سطح احتمال 1% تفاوت معنیداری ندارند
Means that have the same letters in a column are not statistically significant at the 1% probability level.
پژوهشهای قبلی نشان دادند گیاهان در معرض تنش فلزات سنگین از قبیل نیکل، کاهش معنیداری در وزن تر و خشک گیاه و طول اندام هوایی و ریشه دارند (Moridian Pirdosti et al., 2022). کاهش طول گیاهچه در اثر بروز تنش فلز سنگین، توسط سایر پژوهشگران در گیاهانی از جمله شنبلیله (Sakhai et al., 2021) و خرفه، سیاهدانه، شنبلیله، شوید، زنیان و ریحان (Spanany & Fallah, 2016) گزارش شده است. یکی از دلایل کاهش طول گیاهچه در رویارویی با فلزات سنگین، مرگ سلولهای مریستمی بهواسطه فعالیت برخی آنزیمهای مرتبط با مرگ برنامهریزی شده در لپهها و آندوسپرم است، که تعداد سلولهای مریستمی را کاهش میدهد، بنابراین وقتی فعالیت آنزیمهای هیدرولیتیک بهواسطه عناصر سنگین تحتتأثیر قرار میگیرد، غذا به ریشههای اولیه و اندام هوایی نمیرسد و در نتیجه طول گیاهچهها را تحتتأثیر قرار میدهد (Kabir et al., 2008). برخی منابع، این کاهش طول گیاهچه در اثر تنش فلزات سنگین را به دخالت این عوامل در فرآیند تقسیم سلولی، انحراف کروموزومی و میتوز غیرطبیعی نسبت میدهند (Radha et al., 2010)، بهطوریکه فلزات سنگین با مهار تقسیم میتوزی و جلوگیری از طویل شدن سلولها سبب کاهش رشد ریشه و ساقه میشوند (Shulan et al., 2010). علاوه بر این، فلزات سنگین در غلظتهای زیاد مانع ساختRNA های ریبوزومی در سلولهای مریستمی شده و سبب کاهش رشد میشوند (Serida et al., 2008).
از مهمترین دلایل کاهش عملکرد و ماده خشک گیاه در شرایط تنش میتوان به کاهش فعالیت کینازهای وابسته به سیکلین، کاهش تقسیم سلولی، بستهشدن روزنهها و کاهش فتوسنتز اشاره کرد که مانع از رشد میشود (Farooq et al., 2009). همچنین کاهش وزن تر اندام هوایی و ریشه میتواند به علّت تأثیر فلز سنگین روی میزان آب در بافتهای گیاه (کاهش پتانسیل آب گیاه)، باشد (John et al., 2009). کاهش رشد گیاه در طول تنش به علّت کاهش پتانسیل آب، اختلال در جذب عناصر غذایی و تنش ثانویه مانند تنش اکسیداتیو است. علاوه بر این، نیکل میتواند سازمان میکروتوبول را در سلولهای مریستمی مختل کند (Yemets et al., 2021). همچنین کاهش رشد میتواند به علّت سرکوب سرعت رشد ازدیاد طول سلولها و مهار غیرقابل برگشت نیکل روی پمپ پروتون باشد (Zambelli & Ciurli, 2013). فلزات سنگین ریخت شناسی ریشه را تغییر داده و سبب کاهش جذب مواد غذایی شده و از این روش بر وزن تر و خشک ریشه و اندام هوایی تاثیر منفی دارند (Fuentes et al., 2006). نتایج این پژوهش، نشان داد تلقیح با قارچ S. indica تأثیرات منفی نیترات نیکل را کاهش داد. تأثیر مثبت قارچ
S. indica بر کاهش تأثیرات منفی فلزات سنگین در گیاهان مختلف از جمله تربچه (Izadi et al., 2021)، توتون (Hui et al., 2015) و گوجهفرنگی (Golestani kian et al., 2021) گزارش شده است. نتایج این پژوهش نشان داد طول ریشهچه، ساقهچه و وزن تر و خشک گیاهچه در گیاهان تلقیح شده با S. indica در مقایسه با گیاهان شاهد افزایش یافت. این نتایج با گزارش Mehri و همکاران (Mehri et al., 2023) و Mahmoodi و همکاران (Mahmoodi et al., 2023) در زمینه تأثیر معنیدار قارچ S. indica بر طول ریشه و ساقه و نیز وزن خشک گیاه مطابقت داشت. این تأثیرات مثبت میتواند به علّت این باشد که تلقیح گیاهان با قارچ S. indica سبب افزایش تولید هورمونهای اکسین و سیتوکینین شده که به دنبال آن منجر به افزایش تقسیم سلولی و رشد سلولها و نیز افزایش قدرت جذب در گیاهان میشود (Sirrenberg, 2007; Hartley & Gange, 2009).
کلروفیل.
آثار اصلی تیمار نیترات نیکل و قارچ و نیز تأثیر متقابل نیترات نیکل و قارچ بر محتوای کلروفیل برگ کاسنی معنیدار بود (جدول 3). مقایسه میانگین ترکیبات تیماری نشان دادند بیشترین کلروفیل a و کلروفیل b مربوط به تلقیح با قارچ
S. indica و در عدم حضور نیترات نیکل و کمترین کلروفیل a و کلروفیل b مربوط به ترکیب تیمار 200 میلیگرم در لیتر نیترات نیکل و عدم تلقیح قارچ S. indica بوده است (جدول 4). درصد تأثیر مثبت کاربرد قارچ برای کاهش تأثیرات مضر نیترات نیکل در سطوح 50، 100 و 200 میلیگرم در لیتر، به ترتیب برابر 4، 11 و 8 % برای کلروفیل a و 3، 11 و 21 % برای کلروفیل b بوده است
(شکل 2). ایجاد اختلال در مراحل مختلف سنتز کلروفیل توسط فلزات سنگین از دلایل اصلی کاهش محتوای کلروفیل در گیاهان تحت تیمار عناصر سنگین است (Manio et al., 2003). تأثیرات منفی تنش فلزات سنگین بر میزان کلروفیل با تلقیح ریشه گیاهان با قارچهای اندوفیت کاهش مییابد (Hui et al., 2015; Shahabivand et al., 2017). تلقیح با قارچ اندوفیت سبب افزایش فعالیتهایی فتوسنتزی و تنظیم مقدار فیتوهورمونها شده و بهعنوان روشی مؤثر جهت کاهش تأثیر تنش فلز سنگین در گیاهان پیشنهاد میشود (He et al., 2017). کاهش کلروفیل در حضور نیکل میتواند به علّت افزایش فعالیت آنزیم کلروفیلاز، حساسیت سایرآنزیمهای ساخت پورفیرینها ازجمله بازدارندگی سنتز آنزیم دلتا آمینولوولینیک اسید دهیدراتاز، فعالیت آنزیمهای همدار مانند کاتالاز و پراکسیداز یا از کاهش دسترسی به آهن لازم برای سنتز کلروفیل باشد (Fatemeh et al., 2012). نیکل میتواند جایگزین یون منیزیم در بخش تتراپیرول مولکول کلروفیل شود و با کاهش میزان کلروفیل منجر به کاهش رشد شود (Azizollahi et al., 2019). همچنین ممکن است سازوکار عمل نیکل، بهصورت ایجاد اختلال در مراکز منیزیم فتوسیستم II باشد که از فراهمشدن الکترونها به فتوسیستم II جلوگیری کرده و مانع ورود پروتونها به داخل تیلاکوئیدها میشود (Chakarawet et al., 2020).
جدول 3- تجزیه واریانس وزن تر و خشک گیاهچه، کلروفیل a و b تحت سطوح مختلف نیترات نیکل با تیمار تلقیح با قارچ
S. indica
Table 3- Variance analysis for effect of nickel nitrate and S. indica inoculation on seedling dry and fresh weights and chlorophyll a and b.
|
Sources of variation |
DF |
seedlings fresh weight |
seedlings dry weight |
Chlorophyll a
|
Chlorophyll b
|
|
Fungus S. indica (F) |
1 |
3.52** |
1.5** |
4.36** |
3.95** |
|
Nickel nitrate (N) |
3 |
5.87** |
4.32** |
2.12** |
5.21** |
|
F × N |
3 |
7.66** |
2.51** |
5.3** |
7.22** |
|
Error |
16 |
0.091 |
0.001 |
0.031 |
0.049 |
|
Coefficient of variation |
- |
8.99 |
5.17 |
8.62 |
7.21 |
** و n.s به ترتیب معنیداری در سطح احتمال 1 درصد و عدم تفاوت معنیداری است.
ns, **: Significance is at the 1% probability level and non-significance , respectively
جدول 4-مقایسه میانگین تاثیرات نیترات نیکل و قارچ S. indica بر وزن تر و خشک گیاهچه و کلروفیل a و b
Table 4- Mean comparison for effect of nickel nitrate and S. indica inoculation on seedling dry and fresh weights and chlorophyll a and b.
|
S. indica |
Nickel nitrate (mg/L) |
seedlings fresh weight (g) |
seedlings dry weight (g) |
Chlorophyll a (mg/g FW) |
Chlorophyll b (mg/g FW) |
|
Non-inoculated |
0 |
1.32±0.0118b |
0.98±0.0097a |
1.78±0.0119b |
1.63±0.011b |
|
|
50 |
1.11±0.0112c |
0.87±0.0089b |
1.68±0.009c |
1.58±0.0014c |
|
|
100 |
0.93±0.0078d |
0.56±0.0054cd |
1.37±0.0012d |
1.24±0.0032e |
|
|
200 |
0.76±0.0065e |
0.34±0.0031e |
1.22±0.0089e |
0.98±0.0027g |
|
Inoculated |
0 |
1.75±0.0061a |
1.05±0.0091a |
1.98±0.0017a |
1.77±0.0031a |
|
|
50 |
1.38±0.0101b |
0.92±0.0088ab |
1.75±0.0019b |
1.62±0.0023c |
|
|
100 |
1.17±0.0091c |
0.62±0.0059c |
1.52±0.0027c |
1.38±0.0031d |
|
|
200 |
0.98±0.007d |
0.45±0.0029d |
1.32±0.0024d |
1.19±0.0094f |
میانگینهایی که در یک ستون حروف مشابهی دارند از لحاظ آماری در سطح احتمال 1% تفاوت معنیداری ندارند
Means that have the same letters in a column are not statistically significant at the 1% probability level.
فنول کل.
نتایج جدول تجزیه واریانس (جدول 5) نشان دادند تأثیر اصلی نیترات نیکل معنیدار بود، امّا تأثیر اثر ساده قارچ و اثر متقابل نیترات نیکل و قارچ معنیدار نشد. نتایج مقایسه میانگین برای اثر ساده نیترات نیکل نشان دادند کاربرد ۲۰۰ میلیگرم در لیتر نیترات نیکل سبب افزایش 3/89 درصدی میزان فنول نسبت به شاهد شد (جدول 6). درصد تأثیر مثبت کاربرد قارچ بر کاهش تأثیرات مضر نیترات نیکل در سطوح دیگر (50 و 100 میلیگرم در لیتر)، نسبت به شاهد به ترتیب برابر 40 و 76 % بود
(شکل 3). ترکیبات فنولیک در سازوکارهای دفاعی گیاهان نقش مهمی ایفا میکنند. این مواد عملکردهای متنوعی در گیاهان دارند که شامل دامنه وسیعی از فعالیتهای زیستی از جمله ویژگیهای آنتیاکسیدانی، ضد باکتریایی، ضدویروسی و ویژگیهای مختلف درمانی است (Eftekhari et al., 2012). یکی از سازوکارهای مؤثر در افزایش میزان تحمّل فلزات سنگین، تولید و انباشتگی ترکیبات فنولی است. در شرایط تنش فلزات سنگین، فنولهای متصل به دیواره بیشتر از فنولهای محلول تحتتأثیر قرار میگیرند
(Kreis & Reinhard, 1989). ترکیبات فنولی در شرایط طبیعی در سلول سنتز میشود، امّا تنشهای محیطی مقدار آنها را در سلول تغییر میدهد. تغییر در بیوسنتز آنزیمهای فتوسنتزکننده یا تجزیهکننده ترکیبات فنولی از قبیل فنول ﻫﯿﺪروﮐﺴﯿﻼز بر مقدار آنها در سلول تأثیر میگذارد. ترکیبات فنولی بهعنوان یکی از ترکیبات آنتیاکسیدان شناخته شدهاند که با سازوکارهای متعدد مثل ربایش رادیکالهای آزاد و قرارگرفتن بهعنوان سوبسترای آنزیمهای پراکسیداز، نقش آنتیاکسیدانی خود را ایفا میکنند (Chu et al., 2000). افزایش در میزان ترکیبات فنولی تحت تأثیر تنش فلزات سنگین در گیاهان مختلف گزارش شده است (Pandey & Tripathi, 2011;Schutzendubel et al., 2001).
جدول 5- تجزیه واریانس سطوح مختلف نیترات نیکل و تلقیح با قارچ S. indica بر پرولین، فنول و آنزیمهای آنتی اکسیدانی
Table 5- Variance analysis for effect of nickel nitrate and S. indica inoculation on antioxidant enzymes, proline and phenol content.
|
Sources of variation |
DF |
Total phenol |
Proline |
Catalase |
Peroxidase |
|
Fungus S. indica (F) |
1 |
0.0137ns |
0.001ns |
0.0079ns |
0.046ns |
|
Nickel nitrate (N) |
3 |
0.135** |
2.21** |
0.842** |
0.375** |
|
F × N |
3 |
0.002 ns |
0.005 ns |
0.048 ns |
0.0057 ns |
|
Error |
16 |
0.05 |
0.07 |
0.025 |
0.022 |
|
Coefficient of variation |
- |
11.46 |
8.72 |
6.41 |
8.60 |
** و n.s به ترتیب معنیداری در سطح احتمال 1 درصد و عدم تفاوت معنیداری است.
ns, **: Significance is at the 1% probability level and non-significance , respectively
جدول 6- مقایسه میانگین تأثیر نیترات نیکل بر پرولین، فنول و آنزیمهای آنتی اکسیدانی
Table 6- Mean comparison for effect of nickel nitrate on antioxidant enzymes, proline and phenol content.
|
Nickel nitrate (mg/L) |
Total phenol (mg/g FW) |
Proline (mg/g FW) |
Catalase (U/mg protein) |
Peroxidase (U/mg protein) |
|
0 |
0.94±0.018d |
0.54±0.005c |
0.272±0.0027d |
0.447±0.0045c |
|
50 |
1.32±0.049c |
0.73±0.015b |
0.363±0.0073c |
0.636±0.0127b |
|
100 |
1.65±0.071b |
0.81±0.024b |
0.512±0.0154b |
0.786±0.0236b |
|
200 |
1.78±0.026a |
1.17±0.012a |
0.867±0.0087a |
0.939±0.0094a |
میانگینهایی که در یک ستون حروف مشابهی دارند از لحاظ آماری در سطح احتمال 1% تفاوت معنیداری ندارند
Means that have the same letters in a column are not statistically significant at the 1% probability level.
شکل 3- مقایسه میانگین تأثیر نیترات نیکل بر (A) فنول، (B) پرولین، (C) کاتالاز و (D) پراکسیداز
Figure 3- Mean comparison for effect of nickel nitrate on (A) phenol content, (B) proline, (C) catalase and
(D) peroxidase
پرولین.
بر اساس نتایج تجزیه واریانس (جدول 5) فقط تأثیر اصلی نیترات نیکل بر میزان پرولین گیاه کاسنی معنیدار بود. بررسی نتایج مقایسه میانگین نشان دادند بیشترین محتوای پرولین (۱۷/۱ میلیگرم بر گرم وزن تر) مربوط به ۲۰۰ میلیگرم در لیتر نیترات نیکل بوده است، همچنین کمترین میزان پرولین (۵۴/۰ میلیگرم بر گرم وزن تر) در تیمار شاهد مشاهده شد (جدول 6). مقدار افزایش پرولین در سطوح 50، 100 و 200 میلیگرم در لیتر نیترات نیکل، به ترتیب برابر 35، 50 و 116 % بوده است (شکل 3). یکی از ترکیبات مهمی که در شرایط تنش افزایش مییابد، پرولین است که مقدار آن در پاسخ به تنش در بسیاری از گیاهان، افزایشیافته و گیاه با تجمع پرولین، پلی آمین، تر هالوز، افزایش ذخیرهسازی کربوهیدراتها و پروتئینسازی میتواند مقاومت خود را در برابر تنش افزایش دهد (Hong, 2000). پرولین یکی از محافظتکنندههای غشاء است و افزایش آن در کاهش تأثیرات تنش نقش دارد. انباشتهشدن بیشتر پرولین در گیاهان تحت تیمار با غلظتهای زیاد نیکل میتواند بیانگر راهکارهای سازگاری گیاه برای مقابله با سمّیت نیکل توسط نقشهای چندگانه پرولین از قبیل عامل ایجادکنندهی اسمز، جاروب کنندهی رادیکالهای آزاد، محافظ آنزیمهای سیتوپلاسمی، منبع نیتروژن و کربن برای رشد پس از تنش، محافظ پروتئوم و مخزن انرژی برای تنظیم پتانسیل اکسایش - کاهش باشد Rodríguez et al., 2007)). گزارشهای متعددی نشان دادهاند که مقادیر زیاد فلزات سنگین از جمله کادمیوم و نیکل سبب تجمع پرولین در گیاهان میشود (Mir et al., 2019; Tagharobiyan et al., 2016). تنش نیکل با کاهش جذب آب در رشد اختلال ایجاد میکنند و برای کاهش آسیب حاصل از تنشهای غیر زیستی اسمولیتهایی مثل پرولین نقش دارند، زیرا سبب حفظ ماکروملکولها و کاهش پراکسیداسیون لیپید شده، سرعت و درصد جوانهزنی را افزایش میدهد (Thakur & Sharma, 2016). همچنین پرولین منجر به تغییر فرآیندهای فیزیولوژیکی شده که در نهایت جذب آب را افزایش میدهد. پرولین در تنش نیکل و شوری در گیاه نخود فرنگی سبب اصلاح وضعیت آبی و فعال شدن سامانه آنتی اکسیدانی شد (Shahid et al., 2014).
آنزیمهای آنتی اکسیدان.
نتایج تجزیه واریانس (جدول 5) برای آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز نشان داد فقط تأثیر ساده نیترات نیکل معنیدار شد. نتایج مقایسه میانگین اثر ساده نیترات نیکل (جدول 6) نشان دادند بیشترین فعالیت آنزیمهای کاتالاز (۸۶۶۹/۰ واحد در میلیگرم پروتئین) و پراکسیداز (939/ واحد در میلیگرم پروتئین) مربوط به تیمار ۲۰۰ میلیگرم در لیتر نیترات نیکل بوده است. همچنین کمترین میزان کاتالاز (2717/0 واحد در میلیگرم پروتئین) و پراکسیداز (447/0 واحد در میلیگرم پروتئین) را نیز تیمار شاهد دارا بوده است. مقدار فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی کاتالاز و پراکسیداز در سطوح 50، 100 و 200 میلیگرم در لیتر تنش نیترات نیکل، به ترتیب 33، 89 و 320 % برای کاتالاز و 42، 76 و 210 درصد برای پراکسیداز نسبت به گروه شاهد افزایش داشت (شکل 3). آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز در پژوهش حاضر، تحت تنش نیترات نیکل افزایش داشت. آنزیم کاتالاز، هیدروژن پراکسید را هم بهعنوان دهنده هیدروژن و هم بهعنوان سوبسترا در تجزیه کاتالیتیکی هیدروژن پراکسید به محصولات (اکسـیژن و آب) استفاده میکند (Xu et al., 2009). کاتالاز یک آنزیم آنتیاکسیدان مهم در سازوکار دفاعی گیاهان است که در کنترل گونههای فعال اکسیژن نقش مهمی دارد و سبب کاهش آسیب اکسیداتیو میشود. بروز تنش فلز سنگین موجب افزایش فعالیت کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، افزایش پراکسیداسیون لیپیدها، تجمع پراکسید هیدروژن و مرگ سلولی میشود. در گیاه شنبلیله تحت تنش فلزات سنگین، تولید و فعالیت آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز افزایش یافت (Garnczarska & Ratajczak, 2000). پراکسیداز و کاتالاز هر دو آنزیمهای مهمی هستند که H2O2 زیادی را از راه کاتالیز کردن به آب و مولکول اکسیژن تجزیه میکنند (Moller et al., 2007).
جمعبندی.
پژوهش حاضر نشان داد کاربرد S. indica سبب بهبود فاکتورهای جوانهزنی از جمله درصد و سرعت جوانهزنی تحت تنش نیترات نیکل (بهترتیب 8 و 18 درصد) شد که به نوبه خود میتواند استقرار گیاه و رشد گیاه را افزایش دهد. با کاربرد قارچ
S. indica، کاهش حدود 400 و 200 درصدی طول ساقهچه و ریشهچه در اثر تنش نیکل، به کاهش حدود 100 درصدی رسید. از طرف دیگر تلقیح با قارچ S. indica توانسته است تأثیرات منفی ناشی از نیترات نیکل را کاهش دهد. مقادیر تأثیر مثبت کاربرد قارچ برای کاهش تاثیرات مضر نیترات نیکل در سطوح شاهد، 50، 100 و 200 میلیگرم در لیتر، به ترتیب برابر 12، 32، 46 و 61 درصد برای کلروفیل a، 13، 37، 76 و 52 درصد برای کلروفیل b بود. در مجموع نتایج نشان دادند کاربرد میکروارگانیسمهای مفید مانند قارچهای مفید میتواند یک راهکار مناسب برای افزایش فاکتورهای جوانهزنی و کاهش تأثیرات منفی ناشی از فلزات سنگین در نظر گرفته شود.
)