نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
گروه زیست‌شناسی گیاهی و جانوری، دانشکده علوم و فناوری‌های زیستی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Dracocephalum polychaetum is a significant medicinal plant known for its antioxidant and anticancer properties. In this study, we assessed the impact of varying yeast extract (YE) doses on the levels of certain phenolic compounds in D. polychaetum cells. The experiments followed a completely randomized design with three replicates. The results indicated that all parameters considered in the treated cells showed a significant difference compared to the control. Our results indicated that the highest activities of the key enzymes PAL and TAL were observed in cells treated with 100 mg/L of YE, suggesting a response to oxidative stress induced by YE. Consequently, the highest contents of total phenol, flavonoid, quercetin, catechin, carvacrol, and thymol were found in cells treated with the same YE concentration. In addition, cells treated with 25 mg/L YE showed the highest levels of rosmarinic acid. The response to different YE concentrations was dose-dependent rather than linear. Therefore, we conclude that moderate YE concentrations (100 mg/L) effectively increase phenolic contents. Moreover, the variations in phenolic compound levels may represent a defense mechanism in D. polychaetum cells exposed to YE. Based on the correlation coefficient, the accumulation of phenolic compounds can be positively regulated by activating key enzymes, particularly the PAL enzyme, in the phenylpropanoid biosynthesis pathway in cells treated with YE.
Introduction
Dracocephalum polychaetum is a medicinal plant known for its potent antioxidant and anticancer properties. Extensive research has highlighted this species' applications in modern and traditional medicine, particularly its anti-inflammatory, antioxidant, antimicrobial, and anticancer properties. Phytochemical analyses have revealed a variety of phenolic compounds present in the plant. However, production of these valuable metabolites is often limited, usually making up less than 1% of the dry weight. This production is influenced by the plant's physiological and developmental stages and environmental conditions.
To overcome the limitations in producing secondary metabolites, tissue and cell suspension cultures have emerged as effective biotechnological strategies. The biosynthesis of these metabolites can be significantly enhanced by applying biotic and abiotic elicitors. One commonly used elicitor is yeast extract (YE), which has been demonstrated to substantially increase the production of secondary metabolites compared to untreated controls.
Despite the medicinal significance of D. polychaetum, there is a lack of experimental studies utilizing biotic elicitors to boost its metabolite production. Therefore, this study aims to investigate the effects of various concentrations of YE on the accumulation of specific phenolic compounds, as well as the activity of key enzymes involved in their biosynthetic pathways, namely phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and tyrosine ammonia-lyase (TAL), within D. polychaetum cell cultures.
Material and Method
polychaetum seeds were germinated in MS medium supplemented with GA₃ under dark conditions at 25°C. Hypocotyl explants were cultured in MS medium containing BAP, NAA, sucrose, and agar to induce callus formation, also in complete darkness at a temperature of 23±2°C. The resulting calli were then used to establish suspension cultures maintained at 25°C on an orbital shaker and subcultured every 12 days to promote uniform cell growth.
On the eighth day of cultivation, during the logarithmic growth phase, the cells were treated with varying concentrations of YE. The cells were harvested on the 13th day. The phenolic and flavonoid content and the activities of the PAL and TAL enzymes were quantified using UV-Vis spectrophotometry, while HPLC was utilized for phytochemical analysis. Statistical analyses were conducted, including Duncan's test (P ≤ 0.05) and principal component analysis (PCA), to identify significant differences and relationships among the physiological parameters.
Results and Discussion
The findings indicated that YE treatment significantly affected all measured parameters in D. polychaetum cells compared to the control group. The highest activities of PAL and TAL were found in cells treated with 100 mg/L YE. This suggests a strong response to the oxidative stress induced by YE. Additionally, this treatment led to the most significant accumulation of total phenols, flavonoids, quercetin, catechin, carvacrol, and thymol. Notably, the maximum content of rosmarinic acid was observed in cells treated with 25 mg/L YE.
The response to YE was dose-dependent yet non-linear, with moderate concentrations (100 mg/L) proving most effective in enhancing phenolic compound production. These variations imply a defensive mechanism in D. polychaetum cells, which upregulate phenolic biosynthesis as a protective response to YE treatment. Correlation analysis further confirmed a positive association between the accumulation of phenolic compounds and the activation of PAL, underscoring the enzyme's critical role in regulating secondary metabolite production.
YE is abundant in amino acids, vitamins, and minerals supporting plant growth and development. Additionally, it acts as an elicitor by triggering secondary signaling pathways by generating free radicals. These reactive molecules serve as secondary messengers, activating the phenylpropanoid pathway and stimulating the synthesis of phenolic compounds. The increased production of these potent antioxidants likely helps protect plant cells under YE-induced oxidative conditions, highlighting the potential of YE as an effective elicitor for enhancing secondary metabolite production in medicinal plants.
Conclusion
This study demonstrates that YE is an effective elicitor for enhancing the production of secondary metabolites in D. polychaetum. Moderate concentrations of YE (100 mg/L) significantly activated the phenylpropanoid pathway, leading to increased activity of PAL and TAL. As a result, there was an enhanced accumulation of phenolic compounds such as quercetin, catechin, and thymol. These findings highlight the potential of YE to optimize the biosynthesis of valuable medicinal metabolites, offering a sustainable strategy to address the limitations of natural metabolite production in medicinal plants.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
گیاه Dracocephalum polychaetum Bornm. با نام بادرنجبویهی کرمانی یا لالهزاری، مفرو یا زررو بومی ایران و یکی از اعضای خانوادهی Lamiaceae یا نعنائیان است. جنس Dracocephalum دارای 50 گونه در سراسر جهان است که تنها 8 گونه از این جنس در ایران یافت میشود. این گیاه علفی- نیمه چوبی حدود 15-20 سانتیمتر ارتفاع دارد. این گیاه چندساله، بومی ایران بوده و در کوههای هزار در بخش راین، واقع در جنوب استان کرمان، یافت میشود. این گیاه به واسطه داشتن محتوای ارزشمندی از متابولیتهای ثانویه از جمله ترکیبات فنلی همچون روتین، نارینژین، آپیژنین، کوئرستین، تیمول، رزمارینیک اسید، لیمونن و کاروکرول مورد توجه است (Khodaei et al., 2019; Taghizadeh et al., 2019). این گیاه دارای فعالیتهای زیستی مهمی از جمله خواص پاد التهابی، پاد اکسیدانی، پاد میکروبی و پاد سرطانی هستند (Taghizadeh et al., 2022). علاوهبراین، آنها به عنوان یک ماده افزودنی و تسکین دهنده درد معده و نیز با اثرات ثابت شده علیه Staphylococcus aureus شناخته شده‌اند (Yaghoobi et al., 2018).
رویش گیاه در ارتفاعات بالا (ارتفاع 4000 متر)، آب وهوای سرد رویشگاه و خواب پیچیده بذر از جمله عوامل محدودیت رویش این گونه است، خواب پیچیده بذر، تغییرات آب و هوایی، کاهش بارندگی و استفاده بیرویه انسان از این گیاه سبب شده که هر ساله جمعیت آن کاهش یابد. بنابراین، تلاش برای اهلی کردن این گونه به عنوان اقدام حفاظتی بسیار مورد توجه قرار گرفته است (Rajaei & Mohamadi, 2012). رویکردهای بیوتکنولوژیکی، از جمله کشت سلولها و بافت‌های گیاهی، به عنوان یکی از راههای امیدوارکننده و موثر در تکثیر گیاهان دارویی در معرض خطر انقراض شناخته شده است. در این تکنیک با بهکارگیری روشهای مختلفی مانند انتخاب لاین سلولی با توانایی تولید محصول بیشتر، اصلاح محیط کشت و استفاده از محرکها (Elicitation)، کشت ریشه موئین، کشت سلول در مقیاس بزرگ در راکتورهای زیستی، بیوترانسفورماسیون (Biotransformation) وplant cell immobilization (تثبیت سلولهای گیاهی) میتوان تولید متابولیتهای ثانویه را بدون تخریب زیستگاه و با حفظ تنوع زیستی افزایش داد (Cardoso et al., 2019; Hassanpouraghdam et al., 2022).
یکی از روشهای مؤثر در افزایش تولید و تجمع متابولیتهای ثانویه در گیاهان استفاده از محرکها است. محرکها مولکولهای سیگنال با منبع زیستی و غیر زیستی هستند که سبب فعال شدن سیستم دفاعی در سلول شده و منجر به افزایش سنتز و تجمع متابولیتهای ثانویه در سلول میشوند (Jamiołkowska, 2020). یکی از محرکهای زیستی، عصاره مخمر (YE) است که میتواند با تحریک سیستم دفاعی گیاه، در جهت افزایش تولید و تجمع متابولیتهای ثانویه نقش داشته باشد. ﻋﺼـﺎره ﻣﺨﻤﺮ ﯾﮏ ﻧﺎم راﯾﺞ ﺑﺮای اﻧﻮاع ﻣﺨﺘﻠﻒ ﻣﺤﺼـﻮﻻت ﻓﺮاوری ﺷـﺪه از ﻣﺨﻤﺮ Saccharomyces cerevisiae اﺳـﺖ ﮐﻪ ﺑﻪ ﻋﻨﻮان اﻓﺰودﻧﯽﻫﺎی ﻣﻮاد ﻏﺬاﯾﯽ و ﯾﺎ ﻃﻌﻢ دﻫﻨﺪه اﺳـﺘﻔﺎده ﻣﯽﺷـﻮﻧﺪ. اﮐﺜﺮ ﺗﺮﮐﯿﺒﺎت تأثیرﮔﺬاری ﮐﻪ در ﻋﺼــﺎره ﻣﺨﻤﺮ وﺟﻮد دارد، ﺷــﺎﻣﻞ وﯾﺘﺎﻣﯿﻦﻫﺎی ﮔﺮوه ب، ﮐﯿﺘﯿﻦ، ﺑﺘﺎ ﮔﻠﻮﮐﺎن، اﻟﯿﮕﻮﻣﺮﻫﺎی ان-اﺳــﺘﯿﻞ ﮔﻠﻮﮐﺰ آﻣﯿﻦ، ﮔﻠﯿﮑﻮﭘﭙﺘﯿﺪﻫﺎ، آﻣﯿﻨﻮ اﺳــﯿﺪﻫﺎ، ارﮔﻮﺳــﺘﺮول، ﻣﻮاد ﻣﻌﺪﻧﯽ از ﻗﺒﯿﻞ ﮐﺒﺎﻟﺖ، ﮐﻠﺴــﯿﻢ و روی هستند ﮐﻪ ﻣﯽﺗﻮاﻧﺪ ﭘﺎﺳـﺦ ﺳـﯿﺴـﺘﻢ دفاعی ﮔﯿﺎه را با تولید رادیکالهای آزاد اکسیژنی (ROS) ﻓﻌﺎل ﮐﻨﺪ (El-Beltagi et al., 2022). حضور غلظت بالایی از رادیکالهای آزاد در سلول، سلول را دچار آسیب میکند. برای جلوگیری از آسیب به سلول، سیستم آنتیاکسیدانی آنزیمی و غیر آنزیمی سلول از جمله متابولیتهای ثانویه از جمله فنلها وارد عمل میشود که به پاک‌سازی و مقابله با رادیکال های آزاد میپردازد (Ho et al., 2018). بررسی پژوهش‌های پیشین نشان میدهد که عصاره مخمر در غلظتهای مناسب میتواند منجر به افزایش رشد و تولید متابولیتهای ثانویه از جمله ترکیبات فنلی در ریشه موئین Polygonum multiflorum (Ho et al., 2018)، کشت سلول Linum grandiflorum Desf. (Goncharuk et al., 2022) و ریشه موئین Orthosiphon aristatus (Smetanska et al., 2021) شود.
ترکیبات فنلی، آنتی‌اکسیدان‌های با وزن مولکولی کم هستند که از نظر ساختار و خواص شیمیایی متنوع هستند (Wagay et al., 2020). بر همکنش آنها با ROS از فرآیندهای اکسیداسیون رادیکال‌ها آزاد جلوگیری میکند، بنابراین سلولهای گیاهی را از آثار سمّی و مضر آنها محافظت میکند (Kumar & Pandey, 2013). همچنین، خواص آنتیاکسیدانی ترکیبات فنلی گیاهی با ورود به بدن انسان حفظ میشود. به همین واسطه این ترکیبات برای درمان بیماری‌های مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرند (Tungmunnithum et al., 2018).
بررسی مقالات منتشر شده نشان دادند تاکنون پژوهشی در رابطه با تأثیرYE بر روی محتوای ترکیبات فنلی در کشت بافت و سوسپانسیون سلولی D. polychaetum انجام نشده است، اما از سایر الیسیتورها جهت افزایش محتوای متابولیتهای دارویی این گیاه استفاده شده است که از آن جمله میتوان به پژوهش‌های صورت گرفته توسط (Taghizadeh et al., 2019) اشاره کرد. آنها در این پژوهش نشان دادند تیمار سلولهای D. polychaetum توسط نانوذرات مغناطیسی و میدان مغناطیسی ساکن، موجب افزایش محتوای ترکیبات فنلی و فلاونوئیدها و همچنین منجر به افزایش فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی شد. بنابراین، با توجه به اهمیت این گیاه از نظر دارویی، و پژوهش‌های اندک انجام شده بر روی این گیاه، هدف از انجام این پژوهش، بررسی تأثیر غلظتهای مختلف عصاره مخمر به عنوان یک محرک زیستی بر تولید ترکیبات فنلی به عنوان بخشی از سیستم دفاع آنتیاکسیدانی غیر آنزیمی و اثر بر فعالیت آنزیم PAL و TAL در مسیر بیوسنتز این ترکیبات در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه D. polychaetum Bornm. است.
استقرار کشت سوسپانسیون سلولی و تیمار با عصاره مخمر
بذرهای گیاه D. poltchaetum پس از استریل شدن جهت رشد هیپوکوتیل، به مدّت 30 روز در محیط MS+10 mg/l GA3 کشت و سپس در تاریکی و دمای 2±23 سانتیگراد قرار داده شدند. هیپوکوتیل به دست آمده به عنوان ریز نمونه در اندازههای 1/5-2 سانتیمتر جهت القاء کالوس در محیط کشت MS+4mg/L BAP+1.5mg/L NAA به همراه 30 گرم ساکاروز و6 گرم آگار کشت شدند و در شرایط تاریکی مطلق با دمای ℃ 2±23 قرار گرفتند. کالوسهای تشکیل شده هر 21 روز یکبار واکشت و به محیط جدید منتقل شدند (Taghizadeh et al., 2019). پس از چند مرحله واکشت کالوسها، 5/2 گرم از کالوسهای کاملاً یکدست و نرم به ارلن مایر 100 میلیلیتری حاوی 20 میلیلیتر محیط MS مایع غنی شده دارای 2 میلیگرم در لیتر هورمون بنزیلآمینوپورین (BAP) و 1 میلیگرم هورمون نفتالیناستیکاسید (NAA) به همراه 20 گرم ساکارز، منتقل شد. ارلن حاوی سلولها روی شیکر با دور rpm 100 و در تاریکی مطلق، در اتاق کشت با دمای ℃ 2±23 قرارداده شدند. پس از نگهداری سلولها در محیط کشت مایع و چندین مرحله واکشت کردن، کشت سوسپانسیون سلولی یکدست و مناسب بهدست آمد. بر اساس منحنی رشد سلولهای این گیاه، در روز هشتم پس از واکشت سلولها، زمانیکه سلولها در مرحله رشد لگاریتمی قرار داشتند (Taghizadeh et al., 2019)، غلظتهای ppm 0، 25، 50 ،100، 150 و 200 عصاره مخمر به هر ارلن اضافه شد. روز 13 ام از منحنی رشد سلولها، زمانیکه سلولها وارد فاز ثابت رشد شدند، سلولها برداشت و برای اندازهگیری شاخص‌های فیزیولوژیکی در فریزر 70- نگهداری شد.
سنجش محتوای فنل کل
جهت اندازهگیری محتوای کل ترکیبات فنلی، 500 میلیگرم از سلولهای منجمد شده با 2 میلیلیتر متانول 80% همگن شد. سپس هموژنات حاصل به مدت 15 دقیقه با دور rpm 10000 در دمای محیط سانتریفیوژ شد و محلول رویی آن به لوله جدیدی منتقل شد. همچنین جهت اندازهگیری محتوای کل ترکیبات فنلی از روش استفاده شد. به 250 میکرولیتر از عصاره، 750 میکرولیتر معرف Folin-ciocalteu (10%) و پس از ورتکس شدید 500 میکرولیتر سدیم کربنات 5/7% اضافه شد و پس از 75 دقیقه انکوباسیون در دمای محیط و تاریکی شدت جذب نمونهها در طول موج 765 نانومتر با اسپکتروفتومتر در مقابل بلانک اندازهگیری شد. از گالیک اسید با غلظتهای 0، 25، 50، 100، 200 ، 400 و 800 میکروگرم در میلی لیتر برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد و نتایج بر حسب میلیگرم گالیک اسید بر حسب گرم وزن تر سلول گزارش شد (Singleton et al., 1999).
سنجش محتوای فلاونوئید
برای سنجش محتوای کل فلاونوئیدها، 500 میلیگرم وزن تر سلول با 2 میلیلیتر متانول80% سائیده شد و مخلوط حاصل به مدّت 15 دقیقه با دورrpm 10000 سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی جداسازی شد و برای سنجش فلاونوئید کل مورد استفاده قرار گرفت. سپس به 100 میکرولیتر عصاره، 200 میکرولیتر متانول 80% ،200 میکرولیتر آلومینیوم کلراید (10%) و 200 میکرولیتر محلول سدیم استات یک مولار اضافه شد و به مدّت 30 دقیقه در تاریکی و دمای اتاق نگهداری شد. شدت جذب نمونهها در طول موج 415 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. از کوئرستین با غلظتهای 0، 50، 100، 150، 200، 250 و 300 میکروگرم در میلیلیتر برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد و نتایج بر حسب میکروگرم کوئرستین بر گرم وزن تر سلولها گزارش شد (Chang et al., 2002).
سنجش فعالیت آنزیمهای فنیل‌آلانین آمونیالیاز PAL و تیروزین آمونیالیاز TAL
برای استخراج و سنجش میزان فعالیت آنزیمهای PAL و TAL، 300 میلیگرم از سلولهای تازه با 1.5 میلیلیتر بافر تریس- هیدروکلریک اسید 50 میلی مولار (5/8 = pH) حاوی 2- مرکاپتواتانول 4/14 میلی مولار و PVP (Polyvinylpyrrolidone) 5% در دمای ℃ 4 هموژن شد. سپس مخلوط بهدستآمده به مدّت 20 دقیقه و با دور rpm 10000 در دمای ℃ 4 سانتریفیوژ و محلول رویی جداسازی و به لولههای جدید منتقل شدند.
برای سنجش فعالیت آنزیم PAL به 8/1 میلیلیتر بافر واکنش تریس- هیدروکلریک اسید 500 میکرومولار (8= pH) حاوی 6 میکرومولار فنیل‌آلانین به عنوان سوبسترای آنزیمPAL و جهت انجام واکنش بین آنزیم و سوبسترا، نمونهها به مدت 60 دقیقه در بن ماری با دمایºC 37 قرار گرفت و در انتها با افزودن 50 میکرولیتر محلول هیدروکلریک اسید 5 نرمال به مخلوط واکنش، واکنش آنزیمی متوقف شده و مقدار ترانس- سینامیک اسید تشکیل شده، محصول آنزیم PAL، با خواندن شدت جذب در طول موج 290 نانومتر توسط دستگاه طیف سنج نوری انجام شد. فعالیت ویژه آنزیم PAL با در نظر گرفتن ضریب خاموشی آن محاسبه و برحسب نانومول تولید محصول در میلیگرم پروتئین کل بر گرم وزن تردر ساعت سلول بیان شد (Beaudoin -Eagan & Thorpe, 1985).
جهت سنجش میزان فعالیت آنزیم TAL، به 8 /1 میلی لیتر بافر تریس- هیدروکلریک 500 میکرومولار (8=pH) ) حاوی 5.5 میکرومولار تیروزین به عنوان سوبسترا، 200 میکرولیتر عصاره ی آنزیمی اضافه شد و جهت انجام واکنش بین آنزیم و سوبسترا، نمونهها به مدت 60 دقیقه در بن ماری با دمای ℃ 37 قرار گرفت و در انتها با افزودن 50 میکرولیتر محلول هیدروکلریک اسید 5 نرمال به مخلوط واکنش، واکنش آنزیمی متوقف شده و مقدار p-کوماریک اسید تشکیل شده، حاصل فعالیت آنزیم TAL، با اندازهگیری شدت جذب در طول موج 333 نانومتر توسط دستگاه طیف سنج نوری انجام شد و فعالیت ویژهی آنزیم بر حسب نانومول p -کوماریک اسید تولید شده در میلیگرم پروتئین کل بر گرم وزن تر سلول در ساعت (nmol p-CA. mg pr-1. g FW-1.h) بیان شد (Beaudoin-Eagan & Thorpe, 1985).
سنجش ترکیبات فیتوشیمیایی با دستگاه HPLC-DAD
برای شناسایی و اندازهگیری محتوای ترکیبات فنلی به کمک HPLC (High-Performance liquid chromatography)، 2.5 گرم از وزن تر سلولها با 7 میلی لیتر متانول اسیدی هموژن و به مدّت 24 ساعت در دمای محیط و در تاریکی انکوبه شد. پس از 24 ساعت هموژنات حاصل به مدت 30 دقیقه و با دور rpm 10000 سانتریفیوژ و محلول رویی جمعآوری و در دمای محیط تبخیر شد. باقیماندهی عصاره در mL 1 متانول حل شده و محلول حاصل توسط فیلتر میلی پور µm 22/0 فیلتر و به ویال تمیزی منتقل شده و به دستگاه HPLC تزریق شد(Taghizadeh et al., 2019) . برای بررسی کمی و کیفی ترکیبات فنلی از دستگاه HPLC (Agilent Technologies 1200 series, Germany, UV vis detector) و ستون Zorbax eclipse (XDB) C18, 5µm (ID), 4.6 × 150 mm (FT) استفاده شد. طول زمان انجام HPLC 40 دقیقه،Flow rate: 1 و طول موج مورد استفاده 280 و 320 نانومتر بود (Lin & Harnly, 2010). برنامه HPLC شامل دو محلول:A 1 درصد فورمیک اسید و متانول بود که تحت شرایط گرادیان 10 تا 25 درصد محلول B (v/v) از دقیقه 0 تا دقیقه 10، 25 تا 60 درصد B از دقیقه 10 تا دقیقه 20 و سرانجام 60 تا 70 درصد محلول B از دقیقه 20 تا 40 انجام شد. برای شناسایی ترکیبات فنلی موجود در هر نمونه از مقایسهی Retention time (RT) پیک هر نمونه و پیک استانداردها (کوئرستین، کاتچین، تیمول و کاروکرول، p- کوماریک اسید و رزمارینیک اسید) در طول موج حداکثر جذب استفاده شد و محاسبهی مقدار ترکیبات فنلی با استفاده از منحنی استاندارد هر نمونه انجام شد.
آنالیز آماری
تمامی آزمایشها به صورت طرح کامل تصادفی با 3 تکرار انجام شد. معنیدار بودن آماری داده‌ها بر اساس آزمون تجزیه واریانس یک طرفه (ANOVA) و در سطح احتمال 05/0≥ P مشخص شد. آزمون چند دامنه‌ای دانکن برای مقایسه میانگین‌ها مورد استفاده قرار گرفت. به منظور رسم نقشه حرارتی ارتباط بین همه شاخص های مورد بررسی در این پژوهش، ضریب همبستگی پیرسون با نرم افزار MetaboAnalyst 6.0 (https://www.metaboanalyst.ca/) محاسبه شد. علاوه بر این، از تجزیه و تحلیل مؤلفه های اصلی (PCA)، به عنوان روش ترسیمی، برای نشان دادن الگوی ارتباطی میان تیمارهای اعمال شده با فاکتورهای بیوشیمیایی مورد بررسی، از نرم‌افزار PAST ver. 4.17 (Hammer & Harper, 2024) استفاده شد.
نتایج و بحث
نتایج حاصل از تجزیه واریانس فاکتورهای مورد بررسی در این پژوهش در جدول 1 نشان داد که تیمار عصاره مخمر سبب ایجاد تغییرات معنیدار در تمامی صفات اندازهگیری در سطح 1 درصد شد.
جدول 1- تجزیه واریانس اثر غلظت های مختلف عصاره مخمر بر فاکتورهای مختلف مورد بررسی D. polychaetum.
Table 1- The analysis of variance for different studied traits in D. polychaetum cells subjected to yeast extract treatment.
|
|
|
Mean squares of traits |
|
|
|||||||||
|
Source of variation |
DF |
TPC |
TFC |
PAL |
TAL |
CAT |
QUR |
p-CA |
RA |
TYML |
CVC |
||
|
Treatments |
5 |
1.79** |
445.64** |
2493.85** |
91.38** |
5.15** |
3980.83** |
.011** |
135.08** |
.28** |
2.54** |
||
|
Residual |
12 |
.010 |
19.78 |
49.26 |
3.19 |
.29 |
.017 |
0.001 |
.053 |
.002 |
.025 |
||
** : معنی دار بودن در سطح 1%
درجه آزادی، TFC: محتوای فلاونوئید کل، TPC: محتوای فنل کل، PAL: فنیل آلانین آمونیالیاز، TAL: تیروزین آمونیالیاز، CAT: کاتچین، QUR: کوئرستین، pCA: p-کوماریک اسید، RA؛ رزمارینیک اسید، TYML؛ تیمول، CVC؛ کارواکرول.
** Significant at P<0.01.
D.F: Degree of freedom, TPC: Total phenolics content; TFC: Total flavonoids content; PAL: phenylalanine ammonia-lyase, TAL: tyrosine ammonia lyase, OUR: Quercetin, p-CA: p-coumaric acid, RA: Rosmarinic acid, TYML: Thymol, CVC: Carvacrol.
اثر غلظتهای مختلف عصاره مخمر بر فعالیت آنزیمهای PAL و TAL
شکل 1، الگوی تغییرات میزان فعالیت دو آنزیم کلیدی مسیر بیوسنتز ترکیبات فنلی در سوسپانسیون سلولی D. polychaetum تیمار شده با YE را نشان میدهد. براساس نتایج نشان بدست آمده، فعالیت آنزیمهای PAL و TAL تحت تأثیر غلظتهای مختلف YE میتواند تغییر کند. آنزیم PAL به طور قابل توجهی در مقادیر 25 تا 150 میلیگرم بر لیتر YE فعال شده است. بیشترین فعالیت این آنزیم در سلولهای تیمار شده با 100 میلیگرم بر لیتر YE گزارش شد که نزدیک به دو برابر بیش از سلولهای شاهد (nmol CA/mg protein 96/66) بود. همچنین داده‌های حاصل نشان دادند کمترین فعالیت آنزیم PAL مربوط به نمونه‌های سلولی تیمار شده با بیشترین غلظت به کاربرده شده از YE (200 میلیگرم بر لیتر) بود که تفاوت معنیداری با نمونه‌های شاهد نداشت (شکل 1-الف).
تیمار سوسپانسیون سلولی D. polychaetum با غلظتهای مختلف YE منجر به افزایش قابل ملاحظه و معنیدار در فعالیت آنزیم TAL شد. بیشترین میزان فعالیت این آنزیم در نمونه‌های تیمار شده با 100 میلی گرم بر لیتر YE (nmol p-CA/mg protein 97/31) یافت شد که 176% بیش از فعالیت گزارش شده برای نمونه‌های شاهد بود. لازم به ذکر است این نمونهها تفاوت معنیداری با نمونه‌های تحت تیمار با غلظت 25 و 50 میلیگرم بر لیتر YE نشان ندادند. با وجود این، میزان فعالیت TAL در سلولهای تیمار شده با بیشینه غلظت YE، در مقایسه با سطوح دیگر YE کاهش یافت (شکل 1- ب).
افزایش فعالیت آنزیمهای PAL و TAL ممکن است به علّت انباشت گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) ناشی از غلظتهای متوسط YE در سلولهای D. polychaetum باشد. به طور مشابه، افزایش میزان فعالیت آنزیمهای PAL و TAL در کشت سوسپانسیون سلولی Zataria multiflora و Bletilla striata تحت تیمار YE گزارش شده است (Bavi et al., 2022; Chen et al., 2021). با هدف افزایش مقاومت گیاه به شرایط تنش اکسیداتیو، این آنزیم‌ها عملکرد سلولها را از متابولیسم اولیه به متابولیسم ثانویه تغییر می‌دهند (Ahmad et al., 2019).
شکل 1- اثر غلظتهای مختلف عصاره مخمر (YE) بر فعالیت آنزیمهای (a) فنیل‌آلانین آمونیالیاز (PAL) و (b) تیروزین آمونیالیاز (TAL) در سلول D. polychaetum. مقادیر براساس میانگین سه تکرار SE نشان داده شده و حروف نامشابه معرف معنیدار بودن براساس آزمون دانکن (P ) است.
Figure 1- Mean comparison the yeast extract (YE) concentrations (0, 25, 50, 100, 150 and 200 mg/L) on the (a) PAL activity and (b) TAL activity in D. polychaetum cells. Data are mean values of three replicates ± SE. Dissimilar letters indicate significant differences based on Duncan’s test (P≤0.05).
اثر غلظتهای مختلف عصاره مخمر بر محتوای فنل و فلاونوئید کل
نتایج بدست آمده از اثر غلظتهای مختلف YE بر محتوای TPC در سلولهای D. polychaetum نشان داد غلظت 100 میلیگرم بر لیتر (mg GA/g FW 21/3) از این محرک منجر به افزایش بیش از دو برابری محتوای این ترکیبات در مقایسه با سلولهای شاهد (mg GA/g FW 54/1) شد. همچنین، تفاوت معنیداری (05/0 ≥ P) در TPC، بین کمترین (25 میلیگرم بر لیتر) و بیشترین (200 میلیگرم بر لیتر) غلظت به کار برده شده از YE با سلولهای شاهد مشاهده نشد. همچنین، TPC در سلولهای تحت تیمار با غلظتهای 50 و 150 میلیگرم بر لیتر YE افزایشی حدود 72/1 و97/1 برابر نسبت به نمونه‌های شاهد نشان دادند (جدول 2). بررسی اثر وابسته به غلظت YE بر محتوای فلاونوئید کل (TFC) نشان داد که سلولهای تیمار شده با غلظتهای 50 و 150 میلیگرم بر لیتر از YE حاوی بیشترین (بیش ازµg Qu/g FW 119) مقدار از TFC بودند که تفاوت معنیداری (05/0≥P) با سایر سلولهای مورد بررسی داشتند (جدول 2). با توجه به جدول 2، سلولهای تیمار شده با 200 میلیگرم بر لیتر از YE تفاوت معنیداری (05/0≥P) با نمونه‌های شاهد (µg Qu/g FW 89) نشان ندادند.
قرارگیری سلولها در معرض غلظتهای مختلف YE میتواند منجر به ایجاد تنش اکسیداتیو شود. افزایش تولید متابولیتهای ثانویه از جمله ترکیبات فنلی میتواند با فعال شدن سازوکارهای دفاعی در سلولهای تحریک شده مرتبط باشد. افزایش TPC و TFC در سلولهای D. polychaetum تیمار شده با YE نیز میتواند در نتیجه افزایش مقدار رادیکالهای آزاد باشد. به طور مشابه، YE منجر به افزایش قابل توجه TPC و TFC در کشت سوسپانسیون سلولی Linum usitatissimum شد (Nadeem et al., 2018). عصاره مخمر در غلظت 100 میلیگرم بر لیتر در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه Oryza sativa L. سبب افزایش وزن خشک و تر سلول، محتوای فنل کل، فلاونوئید، آنتوسیانین و تانن شد (El-Beltagi et al., 2022). مقدار فلاونولیگنان‌ها در کشت سلولی Silybum marianum (L.) تیمار شده با غلظت‌ها مختلف عصاره مخمر نشان داد عصاره مخمر سبب افزایش محتوای این ترکیبات (تا 5 برابر نمونه شاهد) در غلظت 120 میلیگرم بر لیتر شد (Rahimi Ashtiani et al., 2009).
اثر غلظتهای مختلف عصاره مخمر بر محتوای برخی متابولیتهای ثانویه
نتایج بدست آمده نشان دادند از بین ترکیبات شناسایی شده، فراوانترین ترکیب فنلی حاضر در سلولهای تیمار شده مربوط به کوئرستین بود که میانگین محتوای این ترکیب در بین همه سلولهای مورد بررسی بیش از µg/g FW 42 بود. همانطور که در جدول 2 نشان داده شده است، بیشترین مقدار کوئرستین در نمونه‌های تیمار شده با 100 میلیگرم بر لیتر از YE (µg/g FW 22/108) مشاهده شد که نزدیک به 580% بیش از نمونه‌های شاهد بود. علاوهبراین، نمونه‌هایی که در معرض 100 میلیگرم بر لیتر از YE قرار داده شدند، حاوی بیشترین مقدار کاتچین (µg/g FW 38/7) بودند. علاوه بر غلظت 100 میلیگرم بر لیتر YE، به کار بردن 25 میلیگرم بر لیتر از YE نیز منجر به افزایش تولید کاتچین در سلولهای تحت تیمار شد که با محتوای این ترکیب فنلی در سلولهای شاهد (µg/g FW 38/7) قابل مقایسه بود. نمونه‌های تیمار شده با سایر غلظتهای استفاده شده در محیط کشت سوسپانسیون سلولی D. polychaetum حاوی مقادیر پائین‌تری نسبت به سلولهای شاهد بودند. کمترین محتوای کاتچین در سلولهای تیمار شده با 50 میلیگرم بر لیتر YE با مقداری حدود µg/g FW 35/4 گزارش شد که حدود 59% نسبت به شاهد کاهش یافته است.
بیشترین مقدار رزمارینیک اسید (µg/g FW 29/24) در نمونه‌های تیمار شده با غلظت 25 میلیگرم بر لیتر از YE مشاهده شد که نزدیک به 3 برابر بیش از سلولهای شاهد (µg/g FW 28/8) بود. افزایش غلظت YE، منجر به تفاوت معنیدار در محتوای این اسید فنلی بین سلولهای تحت تیمار و نمونه‌های شاهد نشد. همچنین p-کوماریک اسید فقط در سلولهای تیمار شده با 150 میلیگرم بر لیتر YE قابل مشاهده بود. علاوه بر این، در پژوهش حاضر دو ترکیب تیمول و کاروکرول نیز در سلولهای تحت تیمار مورد شناسایی قرار گرفتند. داده‌های بدست آمده نشان داد غلظت 100 میلیگرم بر لیتر YE موجب تولید و انباشت بیشترین مقدار از دو ترکیب تیمول (µg/g FW 26/5) و کارواکرول (µg/g FW 67/7) شد که تفاوت معنیداری (05/0 ≥ P) با نمونه‌های شاهد و سایر سلولهای مورد تیمار تشان دادند.
احتمالاً یکی از مسیرهایی که سلولهای تحت تیمار برای مقابله با تنش اکسیداتیو ناشی از بکارگیری YE انتخاب کرده‌اند، افزایش بیوسنتز متابولیتهای ثانویه از جمله ترکیبات فنلی و تجمع آنها در سلولهای مورد بررسی بوده است. محصولات نهایی در مسیر فنیل پروپانوئید مانند رزمارینیک اسید، کوئرستین و کاتچین، پس از تیمار با غلظتهای مختلف YE القا شده‌اند. نتایج نشان میدهد که ارتباط معنیداری بین تجمع و بیوسنتز ترکیبات فنلی و فعالیت آنزیمهای کلیدی مسیر بیوسنتز آنها مشاهده شد (شکل 3). جالب توجه است که بیوسنتز برخی نظیر کاروکرول و تیمول نیز به طور قابل توجهی در سلولهای D. polychaetum تیمار شده با YE افزایش یافت (جدول 2). به طور مشابه، کیتوزان و YE منجر به القای بیوسنتز و تجمع برخی از ترکیبات فنلی در کشت سوسپانسیون سلولهای Z. multiflora شد (Bavi et al., 2022). همچنین، تیمار سلولهای L. Azadirachta indica با غلظت 50 میلی گرم در لیتر عصاره مخمر سبب افزایش تولید اسکوالن و موالونیک اسید شد (Babich et al., 2020).
جدول 2- مقایسه میانگین غلظتهای مختلف عصاره مخمر بر محتوای ترکیبات فنلی در سلولهایD. polychaetum .
Table 2- Mean comparison of various concentrations of YE on phenolic content in D. polychaetum cells.
|
Concentration |
TPC |
TFD |
Catechin |
Quercetin |
p-Coumaric acid |
Carvacrol |
Rosmarinic acid |
Thymol |
|
(mg/L) |
mg GA/g FW |
µg Qu/g FW |
µg/g FW |
µg/g FW |
µg/g FW |
µg/g FW |
µg/g FW |
µg/g FW |
|
0 |
1.54±0.04 d |
97.15±2.36 c |
7.38±1.25 ab |
18.69±0.04 e |
ND b |
5.88±0.12 c |
8.28±0.02 b |
4.68±0.05 c |
|
25 |
1.66±0.11 d |
107.22±9.36 b |
7.69±0.27 a |
13.43±0.06 f |
ND b |
5.38±0.04 d |
24.29±0.08 a |
4.99±0.02 b |
|
50 |
2.65±0.11c |
119.08±2.97 a |
4.35±0.14 d |
32.66±0.07 c |
ND b |
6.99±0.016 b |
14.45±0.13 b |
4.54±0.02 d |
|
100 |
3.21±0.07 a |
119.46±2 a |
7.82±0.16 a |
108.22±0.28 a |
ND b |
7.67±0.23 a |
8.9±0.12 b |
5.26±0.05 a |
|
150 |
3.03±0.10 b |
112.93±3.12ab |
6.52±0.03 bc |
61.56±0.08 b |
0.15± 0.002 a |
6.84±0.11 b |
8.4±0.07 b |
4.7±0.06 c |
|
200 |
1.56±0.13 d |
89.36±2.54 c |
6.12±0.13 c |
21.43±0.06 d |
ND b |
5.51±0.2 d |
12.05±1.38 b |
4.43±0.05 e |
مقادیر براساس میانگین سه تکرار ± SEM نشان داده شده و حروف نامشابه معرف معنیدار بودن بر اساس آزمون دانکن (P≤0.05)است. ND (Not Detected) نشان دهنده عدم وجود ترکیبات فنلی در عصاره سلولی است. TPC: محتوای فنل کل، TFD: محتوای فلاونوئید کل.
Data are mean values of three replicates±SD. Dissimilar letters indicate significant differences based on the Duncan test (P≤0.05).
بررسی ضرایب همبستگی بین غلظتهای مختلف YE و فاکتورهای اندازهگیری شده
برای درک بهتر اثر غلظتهای مختلف YE بر پاسخ‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی سلولهای کشت شده، یک الگوی ساده از میزان همبستگی بین غلظتهای بکار برده شده و فاکتورهای مختلف اندازهگیری شده در سلولهای شاهد و تیمار شده بررسی شد (شکل 2). در این الگو ضریب همبستگی پیرسون (ρ) برای نمونه‌های مورد بررسی گزارش شده است. بر اساس این الگو میتوان اظهار داشت که منفی‌ترین همبستگی با غلظتهای مختلف YE مربوط به محتوای رزمارینیک اسید (57/0- = r0.01) و تیمول (29/0- = r0.01) بود و مثبت‌ترین همبستگی بین غلظتهای مختلف YE و p-کوماریک اسید (40/0+ = r0.01) و کوئرستین (27/+ = r0.01) گزارش شد. هر چند ضرایب بدست آمده نشان داد که همبستگی بین غلظتهای بکار برده شده از YE با فاکتورهای اندازهگیری شده غالباً ضعیف و بسیار ضعیف بود (شکل 2).
علاوه بر این، برای بررسی بیشتر مفاهیم عملکردی و همبستگی فاکتورهای اندازهگیری شده، نمودار نقشه حرارتی رسم شد (شکل 3). نتایج نشان دادند بین میزان فعالیت آنزیم PAL با TPC (83/0+ = r0.01)، TFC (89/0+ = r0.01) و محتوای کوئرستین (83/0+ = r0.01) یک همبستگی مثبت و تقریباً قوی وجود داشت. همچنین، بین میزان فعالیت آنزیم TAL با TPC (63/0+ = r0.01)، و TFC (73/0+ = r0.01) یک همبستگی مثبت و متوسط مشاهده شد. مقایسه این نتایج بیانگر این موضوع است که شاید آنزیم PAL در بیش‌تولیدی و بیش‌انباشتی برخی ترکیبات فنلی در سلولهای D. polychaetum موثرتر از آنزیم TAL عمل میکند.
شکل 2- الگوی ساده از میزان همبستگی بین غلظتهای بکار برده شده از YE (0، 25، 50، 100، 150 و 200 میلیگرم بر لیتر) و فاکتورهای مختلف اندازهگیری شده در سلولهای شاهد و تیمار شده. YE؛ عصاره مخمر، RA؛ رزمارینیک اسید، pCA؛ p-کوماریک اسید، TYML؛ تیمول، QUR؛ کوئرستین، TFC؛ محتوای فلاونوئید کل، TPC؛ محتوای فنل کل، CAT؛ کاتچین، PAL؛ فنیل آلانین آمونیالیاز، CVC؛ کارواکرول، TAL؛ تیروزین آمونیالیاز.
Figure 2- A simple correlation pattern between the different Yeast extract concentrations (0, 25, 50, 100, 150, and 200 mg/L) and various parameters of treated and untreated cells. YE: yeast extract, RA: Rosmarinic acid, p-CA: p-coumaric acid, TYML: Thymol, OUR; Quercetin, TPC: total phenolic compound, TFD: total flavonoid content, CAT: Catechin, PAL: phenylalanine ammonia-lyase, CVC: Carvacrol, TAL: tyrosine ammonia lyase.
شکل 3- تجزیه و تحلیل نقشه حرارتی و ضریب همبستگی پیرسون (ρ) برای نمونه‌های تیمار شده با YE و نمونه‌های شاهد محاسبه شد. نقشه حرارتی تغییرات در تمام صفات مورد بررسی را مقایسه می کند. روش عادی‌سازی شامل میانگین داده‌ها با مقیاس‌های رنگی بود. رنگ آبی نشان‌دهنده همبستگی منفی و رنگ قرمز نشان‌دهنده همبستگی مثبت بین فاکتورهای مورد بررسی بود، همچنین شدت رنگ نشان دهنده شدت همبستگی می باشد، هرچه شدت رنگ بیشتر همبستگی قوی تر و هر چه شدت رنگ کمتر همبستگی ضعیف تر می باشد. YE؛ عصاره مخمر، RA؛ رزمارینیک اسید، pCA؛ p-کوماریک اسید، TYML؛ تیمول، QUR؛ کوئرستین، TFC؛ محتوای فلاونوئید کل، TPC؛ محتوای فنل کل، CAT؛ کاتچین، PAL؛ فنیل آلانین آمونیالیاز، CVC؛ کاروکرول، TAL؛ تیروزین آمونیالیاز.
Figure 3- Heatmap analysis and Pearson’s correlation coefficient (ρ) calculated for the YE-treated and untreated cells. Heatmap compares the changes in all studied traits. The normalization procedure consisted of mean row-centering with color scales. YE: yeast extract, RA: Rosmarinic acid, p-CA: p-coumaric acid, TYML: Thymol, OUR; Quercetin, TPC: total phenolic compound, TFD: total flavonoid content, CAT: Catechin, PAL: phenylalanine ammonia-lyase, CVC: Carvacrol, TAL: tyrosine ammonia lyase.
نکته قابل توجه این بود که این موضوع دررابطه با تولید رزمارینیک اسید بر عکس بود. بررسی ضرایب همبستگی پیرسون نشان داد ضریب همبستگی بین میزان فعالیت آنزیم TAL و محتوای رزمارینیک اسید (47/0+ = r0.01) در سلولهای مورد پژوهش بیش از ضریب همبستگی گزارش شده بین میزان فعالیت آنزیم PAL و مقدار این ترکیب (20/0+ = r0.01) بود. بنابراین، میتوان نتیجه گرفت که شاید اثر آنزیم TAL بر تولید رزمارینیک اسید بیشتر از آنزیم PAL بود. همچنین بین فعالیت دو آنزیم PAL و TAL یک همبستگی مثبت و قوی (85/0+ = r0.01) گزارش شد. بطور کلی میتوان نتیجه گرفت که تجمع ترکیبات فنلی میتواند به طور مثبت با فعال شدن آنزیمهای کلیدی در مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها در سلولهای تحت تیمار با YE تنظیم شود.
شکل 4- PCA biplot از پاسخ‌های بیوشیمیایی سلولهای شاهد و تیمار شده با غلظتهای مختلف YE (0، 25، 50، 100، 150 و 200 میلیگرم بر لیتر). YE؛ عصاره مخمر، RA؛ رزمارینیک اسید، pCA؛ p-کوماریک اسید، TYML؛ تیمول، QUR؛ کوئرستین، TFC؛ محتوای فلاونوئید کل، TPC؛ محتوای فنل کل، CAT؛ کاتچین، PAL؛ فنیل آلانین آمونیالیاز، CVC؛ کارواکرول، TAL؛ تیروزین آمونیالیاز.
Figure 4: PCA biplot of the analyzed biochemical responses of D. polychaetum cells to Yeast extract (0, 25, 50, 100, 150 and 200 mg/L) treatment. YE: yeast extract, RA: Rosmarinic acid, p-CA: p-coumaric acid, TYML: Thymol, OUR; Quercetin, TPC: total phenolic compound, TFD: total flavonoid content, CAT: Catechin, PAL: phenylalanine ammonia-lyase, CVC: Carvacrol, TAL: tyrosine ammonia lyase.
نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل اجزای اصلی (PCA)، اثر غلظتهای مختلف YE بر سلولهای مختلف و روابط بین فاکتورهای اندازهگیری شده را نشان داد (شکل 4). دو جزء اصلی (PC1 و PC2) به ترتیب 12/54% و 05/17% از کل واریانس را در سلولهای تیمار نشده و تیمار شده توضیح دادند. بر این اساس سلولهای مورد بررسی در چهار گروه دسته‌بندی شدند. گیاهان شاهد و تیمار شده با 200 میلیگرم بر لیتر YE (بالاترین غلظت به کار برده شده در این پژوهش) در یک دسته در کنار هم قرار گرفتند. همچنین، سلولهای تیمار شده با غلظت 25 میلیگرم بر لیتر YE در گروه دوم قرار گرفت. این غلظت منجر به افزایش تولید و انباشت رزمارینیک اسید و کاتچین در سلولهای تحت تیمار شد. دسته سوم، سلولهای تیمار شده با غلظتهای 50 و 150 میلیگرم بر لیتر YE بود که محتوای قابل توجهی از TPC، کاروکرول و کوئرستین را داشتند. علاوهبراین، سلولهای تیمار شده با 100 میلیگرم بر لیتر YE دسته چهارم را تشکیل دادند. فعالیت آنزیمهای PAL و TAL در این گروه از سلولها بیش از سایر سلولها بود. ممکن است این موضوع منجر به تجمع بیشتر TFC و تیمول در این سلولها شده باشد.
نتیجه‌گیری
با توجه به داده‌های حاصل از این پژوهش میتوان نتیجه گرفت که استفاده از YE به عنوان محرک زیستی منجر به تحریک فعالیت آنزیمهای مسیر بیوسنتز ترکیبات فنلی و بدنبال آن تجمع متابولیتهای ثانویه در کشت سوسپانسیون سلولی D. polychaetum شد. بسته به غلظت تیمارهای انجام شده، سلولها، پاسخ‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی متفاوتی را نشان دادند. به طور کلی، بیشترین محتوای TPC، TFC، کوئرستین، کاتچین، تیمول و کاروکرول در سلولهای تحت تیمار با غلظت متوسط YE (100 میلیگرم بر لیتر) و بیشترین محتوای رزمارینیک اسید در نمونه‌های تیمار شده با غلظتهای پائین YE (25 میلیگرم بر لیتر) گزارش شد. همچنین، بیشترین میزان فعالیت آنزیمهای PAL و TAL نیز در سلول‌هایی مشاهده شد که در معرض 100 میلیگرم بر لیتر YE قرار گرفته بودند. همچنین، بر اساس نتایج حاصل از بررسی ضریب همبستگی، تجمع ترکیبات فنلی میتواند به طور مثبت با فعال شدن آنزیمهای کلیدی به ویژه آنزیم PAL در مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها در سلولهای تحت تیمار با YE تنظیم شود. نتایج حاصل اطلاعات مفیدی در مورد آثار فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی YE بر روی سلولهای تیمار شده ارائه کرد. به همین ترتیب، YE در غلظتهای بهینه میتواند به عنوان محرک زیستی برای بیش‌تولیدی و بیش‌انباشتی متابولیتهای ثانویه ارزشمند در گیاهان دارویی نظیر رزمارینیک اسید، کوئرستین، کاتچین، تیمول و کاروکرول در نظر گرفته شوند.
قدردانی
نویسندگان این مقاله مراتب قدرانی خود را از دانشگاه اصفهان به منظور حمایت از انجام این پژوهش ابراز می‌کنند.
)