نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
گروه تولید و ژنتیک گیاهی- دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
One of the technologies used to improve seed germination is the use of cold plasma. To investigate the effect of atmospheric cold plasma and cadmium stress on the germination and biochemical indices of different quinoa genotypes, a factorial experiment was conducted in a completely randomized design with three replications at the University of Mohaghegh Ardabili. The experimental treatments included cadmium concentrations at three levels (zero (control), 50, and 150 mg/L), cold plasma duration at three levels (0 (control), 10, and 30 seconds), and quinoa genotypes at three levels (Titicaca, Q26, and Giza). The results showed that as stress intensity increased, the average germination percentage and rate, as well as the dry weight and length of quinoa seedlings, decreased. Overall, it appears that among the studied cultivars, the Q26 cultivar yielded better results compared to the other cultivars. Additionally, 30 seconds of cold plasma treatment had the most positive effect on the germination and seedling growth of quinoa cultivars under different levels of cadmium stress, increasing seed and seedling vigor, and enhancing the activity of antioxidant enzymes.
Introduction
Heavy metal stress is one of the most critical abiotic factors that has garnered considerable attention over the last 30 years. Heavy metal is any element that exhibits a high density and exerts its lethal effects even when present in small amounts. Quinoa is a multipurpose plant that has recently been incorporated into the human diet as a substitute for animal products, serving as a source of protein. With the increasing world population, there is a need to provide more food. On the other hand, the role of new technologies in increasing health and production has a significant contribution. Plasma is often referred to as the fourth state of matter. The energy level rises from solid to liquid and gas, and finally to the ionized state of plasma. Cold atmospheric pressure plasma (CAP) has garnered increasing attention in recent years for its applications in biomedical, environmental, and agricultural fields. A wide range of effects of cold plasma treatment is observed in agricultural applications, including its impact on seed germination and seedling growth. Considering the importance of quinoa and the problems in the field of germination and seedling growth (due to the sensitivity and criticality of these stages), the use of the cold plasma technique in quinoa can be considered one of the solutions that can directly and indirectly improve germination and seedling establishment under heavy metal stress conditions. Therefore, this study aimed to investigate the effect of atmospheric cold plasma and cadmium stress on germination and biochemical indices of different quinoa genotypes.
Materials and Methods
The experimental treatments included cadmium concentrations at three levels (zero (control), 50, and 150 mg/L), cold plasma duration at three levels (zero (control), 10, and 30 seconds), and quinoa genotypes at three levels (Titicaca, Q26, and Giza). The quinoa seeds used in this study were the varieties T-T Kaka, Q26, and Giza (with a seed purity of 99%, a germination rate of 95%, and a thousand-seed weight of 2.6 g), purchased from Pakan Seed Company, Isfahan. Before applying the treatments, the seeds were disinfected with 2% sodium hypochlorite for one minute and then washed with distilled water. For the atmospheric cold plasma treatment, the seeds were exposed to cold argon (Ar) plasma for 10 and 30 seconds. Cold plasma device (DBD): The distance between the dielectrics was 3 mm. Argon was used as a functional gas between the dielectrics. After cold plasma treatment, the seeds were transferred to Petri dishes for germination testing. To perform the germination test, 50 quinoa seeds were randomly placed in three replicates in the Petri dishes using the top of paper method, and based on the desired treatments, cadmium solutions at concentrations of 50 and 150 mg/L were added to the Petri dishes (distilled water was used for the control treatment). The samples were then transferred to a germination chamber at 20°C and kept in this condition for 10 days.
The method of Chang & Koa (1988) was used to prepare the enzyme extract. The activity of the catalase enzyme was measured according to the method of Aebi (1984), and the peroxidase enzyme was measured according to the method of Chanec Maehly & (1955), based on the formation of tetraguaiacol from guaiacol in the presence of hydrogen peroxide and guaiacol enzyme. The activity of the polyphenol oxidase enzyme was measured by the method of Kar & Mishra (1955). Statistical analysis of data was done using SAS 9.4 statistical software. The normality of data distribution was evaluated using the Kolmogorov-Smirnov test. The comparison of means was done using Duncan's multiple range test at the 5% probability level. Excel software was used to draw graphs.
Results and Discussion
The results showed that as stress intensity increased, the average germination percentage and rate, as well as the dry weight and length of quinoa seedlings, decreased. In non-stressed conditions, the germination percentage and rate, and dry weight of seedlings obtained from seeds pretreated with cold plasma in the Q26 cultivar were significantly higher than those of the control seeds. Additionally, the duration of cold plasma treatment increased the traits of germination percentage, germination rate, average germination percentage, seedling length, and dry weight, as well as catalase, peroxidase, and polyphenol oxidase enzyme activities, saponin, and proline content. However, it decreased the average germination duration and time to 90% germination. Treatment of seeds with cold plasma for 30 seconds increased the seedling length by 53.79% compared to the control treatment. In all the traits studied, the Q26 cultivar was superior to the Titicaca and Giza cultivars.
Conclusion
Overall, it appears that among the studied cultivars, the Q26 cultivar yielded better results compared to the other cultivars. Additionally, 30 seconds of cold plasma treatment had the most positive effect on the germination and seedling growth of quinoa cultivars under different levels of cadmium stress, increasing seed and seedling vigor, and enhancing the activity of antioxidant enzymes.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
کینوا (Chenopodium quinoa Willd.) گیاهی علفی، یکساله و از تیره اسفناج و چغندرقند است. کینوا میتواند به خوبی با محیطهای مختلف سازگار شود که در آن امکان زیست سایر محصولات زراعی بسیار دشوار است. به همین دلایل، فائو سال 2013 را به عنوان سال بین المللی کینوا اعلام کرد. گیاه کینوا دارای تنوع ژنتیکی گستردهای است که به آن اجازه میدهد در برابر سرما، شوری و شرایط خشکی بسیار مقاوم باشد (Hussain et al., 2021; Saeidi et al., 2021). کینوا یک گیاه چند منظوره است که امروزه در رژیم غذایی انسان، بهعنوان جایگزینی برای محصولات حیوانی به عنوان منبع پروتئین استفاده میشود. کینوا حاوی مقدار بالایی از پروتئین (12-18 درصد)، ترکیبات فعال زیستی (ساپونین و پلیفنول)، اسیدهای آمینه ضروری حاوی ۹ اسیدآمینه ضروری، اسیدهای چرب مانند اسید لینولئیک (غیراشباع)، اسید اولئیک (غیراشباع)، اسید آلفا-لینولنیک (غیراشباع)، اسید پالمیتیک (اشباع) و اسید استئاریک (اشباع) و مواد معدنی نظیر آهن، روی، منیزیم و کلسیم و ویتامینهایی مانند E و گروه B است (Mahmoudi et al., 2023). از دانهها و برگهای کینوا به عنوان غذا استفاده میشود، در حالی که زیست توده آن در خوراک دام نیز استفاده میشود. علاوه بر این، محتویات بالای ساپونینها و رنگها، آن را برای مصارف صنعتی و دارویی مفید میکند. کینوا منبعی غنی از پروتئین با کیفیت بالا است که حاوی تمامی ۹ اسیدآمینه ضروری است، همچنین این گیاه دارای فیبر غذایی است. علاوه بر این، کینوا فاقد گلوتن بوده و گزینهای مناسب برای افراد مبتلا به بیماری سلیاک یا عدم تحمل گلوتن به شمار میرود. بیشترین سطح زیر کشت این گیاه در بولیوی (100هزار هکتار)، بیشتر در جنوب کشور و نزدیک نمکزارها است (Oustani et al., 2023).
کادمیوم توسط آسیب رساندن به عملکرد اجزای مختلف سلولی از جمله غشای تیلاکوئید در کلروپلاستها، لیپیدها و پروتئینها، سبب اختلال در فرآیندهای زیستی گیاه و در نتیجه محدودیت رشد آن میشوند. همچنین، کادمیوم با القای تنش اکسیداتیو، منجر به افزایش تولید رادیکالهای آزاد میشود. این اختلالات ساختاری و عملکردی موجب کاهش رشد و توسعه گیاه و کاهش بازده محصول میشوند.کادمیوم به علّت دخالت گسترده آن در آلودگی زنجیره غذایی اهمیت فوق العادهای یافته است، زیرا به راحتی توسط ریشه گیاهان جذب و در اندامهای هوایی گونههای مختلف گیاهی منتشر میشود. کادمیوم به آسانی در آب حل میشود، بنابراین توسط یک سازوکار انتقال فعال (Huang et al., 2024) (جذب و انتقال کادمیوم میتواند توسط همزیستی مسیر آپوپلاست تحت سلطه انتشار آزاد که تعرق بر آن غالب است و مسیر سلولی که جذب فعال بر آن غالب است، حاصل شود و مسیر سلولی فعال که انرژی زیادی مصرف میکند، نقش غالب را ایفا میکند) وارد غشای نیمه تراوا سلولهای ریشه میشود و مسیر مشابهی را دنبال میکند که برای انتقال استفاده میشود. با وجود این، گیاهان دارای سازوکارهای دفاعی متعددی برای مقابله با آثار منفی کادمیوم هستند که از جمله مهمترین آنها میتوان به فعالسازی سیستم آنتیاکسیدانی اشاره کرد. با توجه به پیشرفتهای بخش کشاورزی و صنعتی، توجه جدی به مسائل مربوط به سمیت کادمیوم در چند دهه گذشته مورد بررسی قرار گرفته است ( Jawad Hassan et al., 2020). کادمیوم سبب کاهش شاخصهای جوانهزنی بذر و رشدی گیاهچهها در گاوزبان (Borago officinalis L.) (Mahmoudi et al., 2019; Sheikhzadeh et al., 2021)، سورگوم (Sorghum) (Jawad Hassan et al., 2020)، رازیانه (Foeniculum vulgare) (Zhao et al., 2021) و نخود (Cicer arietinum) (Singhal et al., 2022) شده است. بر اساس برآورد پژوهشگران، حدود یکششم از زمینهای کشاورزی جهان با فلزات سنگین سمی آلوده شدهاند و حدود 4/1 میلیارد نفر در سراسر جهان در مناطق پرخطر زندگی میکنند. تقریباً ۱۴ تا ۱۷ درصد از زمینهای کشاورزی در سراسر جهان (معادل حدود ۲۴۲ میلیون هکتار) حداقل به یکی از فلزات سمی مانند آرسنیک، کادمیم، کبالت، کروم، مس، نیکل یا سرب آلوده هستند و میزان این آلودگی از حد مجاز فراتر رفته است (Rezaei et al., 2022).
از آنجایی که تنش کادمیوم، موجب کاهش جوانهزنی و شاخصهای رشدی گیاهچهها مانند طول ریشهچه و ساقهچه میشود، بنابراین بهکار بردن روشهایی که بتواند منجر به کاهش تأثیر منفی تنش فلزهای سنگین از جمله کادمیوم شده، اهمیت بسیاری دارد. کاهش سرعت جوانه زنی بذر توسط کادمیوم در گیاهان شنبلیله (Zayneb et al., 2015) و زیره سبز (Salarizadeh et al., 2016) نشان داده شده است. همچنین، کاهش جوانهزنی بذر ممکن است به آثار منفی کادمیوم بر جذب و حرکت آب یا تجزیه و یا تغییر در ویژگیهای نفوذپذیری غشای سلولی مرتبط باشد ( Zayneb et al., 2015; Salarizadeh et al., 2016).
کاهش درصد جوانهزنی روزانه در اثر سمیت مس در کاهو گزارش شده است (Shams et al., 2018). جوانهزنی از مهمترین و حساسترین مراحل رشدی محصولات زراعی است. یکنواختی و درصد سبز شدن بذر میتواند تأثیر زیادی بر عملکرد و کیفیت محصول داشته باشد Najafi et al., 2015)). در پژوهشی که بر روی بذرهای کلزا و زنیان انجام شده بود، تیمار پلاسمای سرد 50 وات و به مدت 20 دقیقه، در مجموع منجر به افزایش 16 درصدی جوانهزنی نسبت به نمونه شاهد شد و همچنین سرعت جوانهزنی را از 07/5 به مقدار 01/8 بذر در روز رساند (Gholami et al., 2016). بدین ترتیب با توجه به نوع گونه گیاهی و ساختار بذر آن، شدت و مدت زمان مناسب پلاسمای سرد باید در نظر گرفته شود. بر این اساس، در پژوهشی از روش پلاسمای سرد هلیوم برای بررسی جوانه زنی، رشد و عملکرد گندم استفاده شد. نتایج نشان دادند تیمار 12 وات میتواند جوانهزنی بذر را 07/6 درصد نسبت به گروه شاهد افزایش دهد (Jiafeng et al., 2014). با توجه به افزایش جمعیت جهان، نیاز به تأمین مواد غذایی بیشتر وجود دارد. از طرف دیگر، نقش فناوریهای جدید در افزایش سلامت و تولید سهم قابل توجهی دارد. از پلاسما اغلب به عنوان حالت چهارم ماده یاد میشود. سطح انرژی از جامد به مایع و گاز، و در نهایت به حالت یونیزه پلاسما افزایش مییابد (Ling et al., 2015). در سالهای اخیر، پلاسمای فشار اتمسفر سرد (CAP) توجه بیشتری را برای کاربردهای زیست پزشکی، زیست محیطی و کشاورزی به خود جلب کرده است. طیف وسیعی ازآثار تیمار با پلاسمای سرد در کاربردهای کشاورزی، مانند تأثیر بر روی جوانهزنی بذر و رشد گیاهچه مشاهده میشود (Bozhanova et al., 2024). تیمار با پلاسمای سرد روشی پیشرفته و جدید است که برای افزایش درصد و سرعت جوانهزنی بذرها، ماندگاری در برابر آفات و همچنین سترون کردن در حوزههای مختلف ازجمله کشاورزی، پزشکی و صنایع غذایی به کار گرفته میشود. از روشهای دیگر برای دستیابی به اهداف یاد شده میتوان به تیمار نمونهی مورد نظر با تابش اشعه گاما، پرتوهای الکترونی، اشعه ماوراءبنفش، میدان الکتریکی پالسی و فشار هیدرواستاتیک بالا اشاره کرد (Adhikari et al., 2020). در برخی از روشهای بیان شده، از جمله در روش فشار هیدرواستاتیک بالا، هرچند مواد غذایی از نظر شیمیایی سالم هستند، اما نیازمند سرمایه اولیه بسیار بالایی هستند. از بین روشهای یاد شده، روش تیمار با پلاسمای سرد، نه تنها روشی سریع و اقتصادی، بلکه، روشی بدون آلودگی نیز است (Billah et al., 2020). خواص پلاسما و آثار مربوطه به شدت به نوع منبع پلاسما مورد استفاده و شرایط عملیاتی بستگی دارد. برای یک منبع پلاسما معین، زمان تیمار باید بهینه شود و میتواند به طور گستردهای برای منابع مختلف پلاسما متفاوت باشد (Kocira et al., 2022). از مزایای پلاسما این است که تنها بر سطح بذر و بهبود جوانهزنی اثر میگذارد و برخلاف پرتو گاما و اشعه ایکس بهدرون سیتوپلاسم بذر نفوذ نمیکند و تغییری در ارزش مواد غذایی و ژنتیک بذر ایجاد نمیکند (Rezaei et al., 2021). فناوری پلاسمای سرد اثر قابل توجهی را در ارتقاء انعطاف پذیری گیاه در برابر تنشهای غیرزیستی مختلف مانند خشکی، شوری، سرما و سمیت فلزات سنگین نشان داده است (Kumar, 2022). به عنوان مثال، پیشتیمار دانههای کلزا و جو در مرحله جوانهزنی، تحمل به خشکی را با افزایش فعالیت آنزیمهای پاد اکسیدانی (SOD و CAT) و افزایش تجمع محافظت کننده اسمزی بهبود میبخشد (Li et al., 2015, Perea-Brenes et al., 2023). همچنین تیمار پلاسمای سرد موجب افزایش جوانهزنی گندم در شرایط تنش کادمیوم (Ghasemzadeh et al., 2024) و کلزا در شرایط تنش خشکی (Ling et al., 2025) شد.
Fereydoni & Alizaheh (2022) گزارش کردند درصد جوانهزنی نخود در تیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد نسبت به تیمار شاهد افزایش یافت. (Noormohammadi et al. (2019 افزایش شاخصهای جوانهزنی گیاه پریوش (Catharanthus roseus L.) در تیمار 50 ثانیه پلاسمای سرد را گزارش کردند.همچنین (Goudarzi et al. (2021 افزایش شاخصهای جوانهزنی کنجد را در تیمار 10 ثانیه پلاسمای سرد گزارش کردند.
Tabakovic et al. (2020) علل جوانهزنی بهتر و سریع تر در رقمهای متفاوت را داشتن اندازه و اندوخته غذایی بیشتر در بذرها گزارش کردند. محیط های نامناسب با تغییرات در ویژگیهای ساختاری و شیمیایی پوشش بذر در گونههای Chenopodium بر شاخصهای جوانهزنی و خواب بذر تأثیرگذار است (Ceccato et al., 2019). Imbert (2002) پیشنهاد کرد تفاوت ساختاری بین انواع بذرها در برخی از گونههایAsteraceae با تفاوت بین تمایز ساختاری اندام پریکارپ و جنین آن مرتبط است که به نوبهی خود سرعت جوانهزنی آن را تعیین میکندکه با یافتههای (Toderich et al., 2023) مطابقت دارد.
(2017) Li et al. در گندم و Švubová et al. (2021) در سویا افزایش سرعت جوانهزنی را گزارش کردند که احتمالاً به علّت تأثیر مثبت پلاسما بر فعالیت آنزیمهایی مانند آلفاآمیلاز است که در مراحل اولیه جوانهزنی ضروری هستند. همچنین سایر پژوهشگران بیان کردند که افزایش شاخصهای جوانهزنی ممکن است به علّت تأثیر پلاسما بر روی پوسته بذر و اختلال در ماکرومولکولهای تشکیل شده در سطح بذر باشد که سبب افزایش آزاد سازی گروههای عاملی نیترات توسط پوشش بذر به داخل دانه میشود (Gómez-Ramírez et al., 2017).
پلاسمای سرد با ایجاد تغییراتی در سطح بذر از جمله افزایش نفوذ پذیری پوسته بذر، تحریک مسیرهای هورمونی و زیستی و افزایش فعالیت آلفا آمیلاز به جوانهزنی و رشد گیاهچه کمک میکند (Fereydoni & Alizaheh, 2022).
پلاسمای سرد اتمسفری سبب افزایش درصد جوانهزنی و رشد گیاهچه در زیره سبز (Cuminum cyminum) (Mahdizadeh et al., 2023)، قدومه شیرازی (Alyssum homalocarpum) (Yadegari et al., 2022)، سویا (Glycine max) (Sayahi et al., 2022)، کاملینا (Camelina sativa)، کرفس کوهی (Kelussia odoratissima Mozaff)، گلپر (Heracleum persicum) (Rezaei et al., 2021) و گندم ((Ghasemzadeh et al., 2024; Bozhanova et al., 2024 شده است.
با توجه به اینکه کادمیوم یک عنصر آسیبرسان برای انسان و دام است، اگر در دانه و اندامهای هوایی انباشته شود و بیش از حد استاندارد باشد، قابلیت مصرف تغذیهای نخواهد داشت و تجمع آن در اندامهای هوایی و دانه گیاهان زراعی میتواند موجب بروز عوارض جدی برای سلامت مصرفکنندگان شود، به همین علّت، استفاده از پلاسمای سرد میتواند راهکار مؤثری برای کاهش آثار زیانبار کادمیوم و بهبود عملکرد گیاه باشد. از این رو، این پژوهش با هدف بررسی تأثیر پیشتیمار پلاسمای سرد اتمسفری و تنش کادمیوم بر شاخصهای جوانهزنی و بیوشیمیایی ژنوتیپهای مختلف کینوا انجام شد.
مواد و روشها
برای بررسی تأثیر پلاسمای سرد اتمسفری و تنش کادمیوم بر شاخصهای جوانهزنی و بیوشیمیایی ژنوتیپهای مختلف کینوا، آزمایشی بهصورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کامل تصادفی در سه تکرار در سال 1403 دانشگاه محقق اردبیلی انجام شد. تیمارهای آزمایش شامل غلظتهای کادمیوم در سه سطح (صفر (شاهد)، 50 و 150 میلیگرم در لیتر)، مدت زمان پلاسمای سرد در سه سطح (صفر (شاهد)، 10 و 30 ثانیه) و ژنوتیپهای کینوا در سه سطح (Titicaca، Q26 و Giza) بود. کادمیوم کلراید (CdCl2 H2O) (شرکت سازنده مرک آلمان) برای اعمال تیمارها تهیه شدند. بذر کینوای مورد استفاده در این پژوهش (درصد خلوص بذر 99 درصد و قوه نامیه 95 درصد با وزن هزار دانه 6/2 گرم) بود که از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد. قبل از اعمال تیمارها، بذرها با هیپوکلرید سدیم دو درصد (حجمی-حجمی، 2 درصد هیپوکلرید سدیم، 98 درصد آب مقطر) به مدت یک دقیقه ضدعفونی و سپس با آب مقطر شستشو داده شدند (Sheikhzadeh et al., 2021). برای اعمال پیشتیمار با پلاسمای سرد اتمسفری، بذرها به مدت 10 و 30 ثانیه در معرض پلاسمای سرد آرگون (Ar) قرار گرفتند. پیشتیمار با پلاسمای سرد اتمسفری در دستگاه پلاسمای سرد (DBD) (مدل ED-DBD PLASMA 3MED ساخت ایران) انجام شد که سرعت ورود گاز به دستگاه 2 لیتر با فرکانس13 هرتز بود. پلاسمای سرد(CP) در فشار اتمسفر بین دو صفحه شیشهای بهعنوان موانع دیالکتریک تولید میشود که الکترودهای مسی (شعاع = 5/5 سانتیمتر) دو صفحه دایرهای را میپوشاند. فاصله بین دیالکتریکها 3 میلیمتر بود. آرگون به عنوان یک گاز عملکردی بین دیالکتریکها استفاده شد. هنگامی که پتانسیل در سراسر فضا به ولتاژ شکست رسید و سبب ایجاد تعداد زیادی ریز تخلیه شد، دیالکتریک به عنوان یک ماده پایدار عمل کرد. منبع تغذیه جریان متناوب ولتاژ بالا (AC) بهبود یافته برای تولید CP استفاده شد. بعد از اعمال پیشتیمار پلاسمای سرد بذوها برای آزمون جوانهزنی به پتری ها منتقل شدند. جهت انجام آزمون جوانهزنی،50 عدد بذر کینوا بهطور تصادفی و در سه تکرار بر روی کاغذ صافی واتمن در داخل پتریها قرار داده شد و بر اساس تیمارهای موردنظر، محلول کادمیوم در غلظتهای 50 و 150 میلیگرم در لیتر به پتری ها اضافه شدند (برای تیمار شاهد از آب مقطر استفاده شد). نمونهها سپس به ژرمیناتوری با دمای 20 درجه سلسیوس انتقال داده شده و به مدت 10 روز در این شرایط قرار گرفتند. تعداد بذرهای جوانهزده هر 12 ساعت شمارش و یادداشت شدند. ظهور ریشهچه بهاندازهی 2 میلیمتر معیاری برای جوانهزنی بذرها در نظر گرفته شد (ISTA, 2017). پس از اتمام 10 روز مدت جوانهزنی، تعداد جوانههای طبیعی شمارش و درصد جوانهزنی، میانگین مدت جوانهزنی (Ellis & Roberts, 1981)، سرعت جوانهزنی (Salehzade et al., 2006)، زمان تا 90 درصد جوانهزنی (Yari et al., 2012) و متوسط جوانهزنی روزانه (Hunter et al., 1984) تعیین شد. همچنین طول گیاهچه با استفاده از خط کش مدرج و وزن خشک گیاهچه با استفاده از ترازو اندازهگیری شد و شاخصهای جوانهزنی از روابط (روابط 1 تا 5) زیر محاسبه گردید:
رابطه 1: درصد جوانهزنی(Germination percentage) (ISTA, 2017): GP=N/n1×100
رابطه 2: میانگین سرعت جوانهزنی(Mean Germination Time) (Ellis & Roberts, 1981): MGT=
رابطه 3: میانگین جوانهزنی روزانه (Mean Daily Germination) (Hunter et al., 1984): MDG=
رابطه 4: زمان تا 90 درصد جوانهزنی (D90) (Yari et al., 2012): D90 =ti+
رابطه 5: سرعت جوانهزنی (Germination rate) (Salehzade et al., 2009): GR=
که در رابطههای بالا N تعداد کل بذر،:Si تعداد بذرهای جوانه زده در هر شمارش، :Di تعداد روز تا شمارش n ام، :n دفعات شمارش، :D تعداد روزهای سپری شده از شروع آزمایش، n تعداد بذرهای جوانه زده در روز، GP درصد جوانهزنی، :St تنوع زمان جوانهزنی، t: زمان جوانهزنی، K: تعداد کل فواصل زمانی است.
جهت اندازهگیری صفات بیوشیمیایی گیاهچهها، نمونههایی از گیاهچههای طبیعی (کل گیاهچه) 10 روزه بهصورت تصادفی انتخاب و همزمان نمونههای جمعآوری شده بلافاصله در فلاسک حاوی ازت مایع قرار داده و سپس تا هنگام سنجش در فریزر با دمای 80- درجه سلسیوس نگهداری شدند. برای تهیه عصاره آنزیمی از روش (1988) Chang & Koa استفاده شد. میزان فعالیت آنزیم کاتالاز از روش Aebi (1984) استفاده شد که بر پایه تجزیه پراکسید هیدروژن توسط این آنزیم استوار است. مخلوط واکنش شامل سه میلی لیتر بافر فسفات 50 میلی مولار (7pH=)، 10 میکرولیتر پر اکسید هیدروژن 15 میلی مولار و 50 میکرولیتر عصاره بود. پس از اضافه کردن عصاره، کاهش جذب در طول موج 240 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری و همچنین از محلول بلانک برای صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده شد. محلول جذب زمینه شامل تمام مواد واکنش به جز عصاره آنزیمی استخراج شده بود. برای سنجش میزان فعالیت این آنزیم در اثر اعمال تیمارهای محرک، از رابطه 6 استفاده شد:
رابطه 6: Unit/ ml enzyme extract =
در این فرمول، df بیان کننده فاکتور رقیقسازی، عدد 3 نشان دهنده حجم محلول مورد سنجش بر حسب میلیلیتر، 05/0 نشان دهنده حجم عصاره آنزیمی، عدد 40 بیان کننده ضریب خاموشی پراکسید هیدروژن و 240A∆ بیان کننده عدد خوانده شده توسط اسپکتروفتومتری در طول موج 240 نانومتر است. عدد بهدست آمده بیان کننده میزان فعالیت آنزیم بر حسب هر واحد از آنزیم است.
آنزیم پراکسیداز از روش (1976) Kar & Mishra بر پایه تشکیل تتراگایاکول از گایاکول در حضور پراکسید هیدروژن و گایاکول اندازه گیری شد. اندازهگیری فعالیت این آنزیم بر پایه تشکیل تتراگایاکول از گایاکول (guaiacol) در حضور پراکسید هیدروژن و آنزیم گایاکول است. مخلوط واکنش شامل سه میلیلیتر بافر پتاسیم فسفات 50 میلیمولار (7pH=)، 50 میکرولیتر گایاکول 20 میلی مولار، 50 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 15 میلی مولار و 50 میکرولیتر عصاره سلولی بود. پس از اضافه کردن عصاره سلولی، کاهش جذب در طول موج 470 نانومتر به مدت یک دقیقه توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی (Ɛ=26.6 mM-1cm-1) برای تتراگایاکول برحسب واحد در میلیلیتر عصاره آنزیمی محاسبه شد (رابطه 7) (Mahmoudi et al., 2023, 2019).
رابطه 7: Unit/ ml enzyme =
که در آن، ΔA470 میزان جذب خوانده شده از هر نمونه توسط اسپکتروفتومتر، 3 مقدار حجم واکنش، df ضریب رقت که از طریق تقسیم حجم نهایی واکنش مورد استفاده یعنی سه میلی لیتر (3000 میکرو لیتر) بر حجم اولیه عصاره آنزیمی مورد استفاده یعنی 50 میکرولیتر محاسبه میشود، 6/26 ضریب خاموشی تتراگایاکول و 05/0 هم حجم عصاره آنزیمی مورد استفاده برحسب میلیلیتر است.
همچنین فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز توسط روش (1976) Kar & Mishra اندازهگیری شد. استخراج پرولین از جوانترین برگها توسط روش Bates et al. (1973) صورت گرفت. برای اندازهگیری میزان ساپونین از روش Koziol (1991) استفاده شد. مقدار نیم گرم از بذرهای هوا خشک (بذرهایی که در معرض هوا خشک شدند) وزن و آسیاب شد. سپس در لولههای درپوشدار با طول 160 میلیمتر و قطر 16 میلیمتر قرار گرفته و 5 میلیلیتر آب مقطر بهآنها اضافه، سپس لولهها بهمدت 30 ثانیه بهشدت تکان داده شد (با فرکانس 4 تکان در ثانیه) و ارتفاع کف ایجاد شده بر روی سطح آب اندازهگیری و محتوی ساپونین با استفاده از رابطه 8 محاسبه شد:
رابطه 8:
(008/0×وزن بذر (گرم)) +(423/0×ارتفاع کف (سانتیمتر))=میزان ساپونین (میلیگرم)
تجزیه و تحلیل آماری دادهها توسط نرم افزار آماری SAS 9.4انجام شد. همچنین نرمال بودن توزیع دادهها توسط آزمون کولموگروف-اسمیرنوف ارزیابی شد. مقایسه میانگینها نیز توسط آزمون چنددامنهای دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام شد. برای رسم نمودارها از نرمافزار Excel استفاده شد.
نتایج
درصد جوانهزنی: نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس دادهها (جدول 1) نشان دادند درصد جوانهزنی تحت تأثیر آثار ساده، تأثیر متقابل دو جانبه و آثار سه جانبه مدت زمان تیمار پلاسمای سرد، ارقام و تنش کادمیوم قرار گرفت.
بیشترین درصد جوانهزنی (33/99 درصد) در تیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد در رقم Q26 در شرایط عدم تنش کادمیوم بدست آمد که اختلاف معنیداری با رقم Titicaca در شرایط بدون تنش کادمیوم و تنش 50 میلیگرم در لیتر را نداشت. تنش کادمیوم سبب کاهش معنیدار درصد جوانهزنی بذرهای کینوا شد. مقایسه میانگین دادهها نشان دادند درصد جوانهزنی بذرهای کینوا با افزایش غلظت کادمیوم کاهش یافته است، اما پیشتیمار پلاسمای سرد در تمام سطوح تنش کادمیوم درصد جوانهزنی را در تمام ارقام کینوا افزایش داده است (شکل 1). در بین تیمارهای مورد بررسی، کمترین درصد جوانهزنی با کاربرد غلظت 150 میلیگرم در لیتر کادمیوم در شرایط عدم پیشتیمار پلاسمای سرد در رقم Giza مشاهده شد. بهطور کلی در شرایط تنش کادمیوم، پیشتیمار پلاسما اثر مثبتی بر درصد جوانهزنی بذرهای ارقام کینوا داشت (شکل 1).
جدول 1- تجزیه واریانس آثار پلاسمای سرد و تنش کادمیوم بر جوانهزنی بذر و رشد گیاهچههای ارقام کینوا
Table 1- Analysis variance of cold plasma effects and Cadmium stress on seed germination and growth of quinoa seedlings
|
Seedling length |
Seedling dry weight |
Time to 90 percentage germination |
Mean daily germination |
Mean germination time |
Germination rate |
Germination percentage |
df |
S.O.V |
|
44.54** |
0.00003457** |
2.62** |
20.26** |
0.27** |
437.49** |
3980.79** |
2 |
Plasma cold |
|
1.29* |
0.00000496** |
5.45** |
3.31** |
0.28** |
79.94** |
649.23** |
2 |
Varitey |
|
2.33** |
0.00000516** |
1.76** |
8.31** |
0.10** |
153.65** |
1629.67** |
2 |
Cadmium stress |
|
1.63** |
0.00000151** |
3.84** |
1.169** |
0.11** |
21.34** |
229.01** |
4 |
Plasma cold × Varitey |
|
0.61ns |
0.00000102** |
0.63** |
0.57** |
0.05** |
17.91** |
112.79** |
4 |
Plasma cold × Cadmium stress |
|
1.11* |
0.00000042ns |
1.89** |
0.07* |
0.05** |
1.23ns |
14.56* |
4 |
اCadmium stress × Varitey |
|
0.61ns |
0.00000048ns |
2.81** |
0.60** |
0.20** |
11.09** |
118.01** |
8 |
Plasma cold × Varitey× Cadmium stress |
|
0.32 |
0.00000025 |
0.01 |
0.01 |
0.0002 |
1.11 |
5.18 |
54 |
Error |
|
14.85 |
24.72 |
2.69 |
2.95 |
0.89 |
3.55 |
2.95 |
|
CV % |
ns،* و ** به ترتیب غیرمعنیدار و معنیدار سطح احتمال پنج درصد، یک درصد
ns, * and ** are non-significant and significant at the five percent, one percent probability level, respectively
شکل 1- تأثیر مدت تیمار پلاسمای سرد بر درصد جوانهزنی بذرهای ارقام کینوا تحت تنش کادمیوم. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حروف یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال یک درصد توسط آزمون دانکن را نشان میدهند.
Figure 1- Effect of cold plasma treatment duration on germination percentage of quinoa cultivars under cadmium stress. The values are the mean values of three repetitions ± standard deviation and the same letters indicate the existence of a significant difference at the 1% probability level using Duncan's test.
شکل 2- تأثیر مدت تیمار پلاسمای سرد بر سرعت جوانهزنی بذرهای ارقام کینوا تحت تنش کادمیوم. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حروف یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال یک درصد با استفاده از آزمون دانکن را نشان میدهند.
Figure 2- Effect of cold plasma treatment duration on the germination rate of quinoa cultivars under cadmium stress. The values are the mean values of three repetitions ± standard deviation and the same letters indicate the existence of a significant difference at the 1% probability level using Duncan's test.
سرعت جوانهزنی: نتایج جدول تجزیه واریانس دادهها، بیانگر وجود اختلاف معنیدار تیمارهای آزمایشی از نظر سرعت جوانهزنی بود (جدول 1). با افزایش مدت زمان تیمار پلاسمای سرد، سرعت جوانهزنی افزایش یافت، بهطوری در بین تیمارهای مورد بررسی بیشترین سرعت جوانهزنی در پیشتیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد در رقم Q26 در شرایط بدون تنش کادمیوم مشاهده شد که بطور معنیداری بیشتر از سایر تیمارها بود (شکل 2). تنش کادمیوم سبب کاهش معنیدار سرعت جوانهزنی بذرهای کینوا شد، اما پیشتیمار پلاسمای سرد سرعت جوانهزنی را در تمام سطوح تنش کادمیوم افزایش داد. بهطوری که کمترین سرعت جوانهزنی در شرایط عدم پیشتیمار پلاسمای سرد در رقم Giza و تنش کادمیوم 150 میلیگرم در لیتر مشاهده شد که حدود 73/77 درصد کمتر از بذرهای تیمار شده با 30 ثانیه پلاسمای سرد در رقم Q26 در شرایط بدون تنش کادمیوم بود (شکل 2).
میانگین مدت جوانهزنی: نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس دادهها (جدول 1) نشان داد که میانگین مدت جوانهزنی تحت تأثیر تیمارهای مورد آزمایش معنیدار شد. تنش کادمیوم سبب افزایش معنیدار میانگین مدت جوانهزنی بذرهای ارقام کینوا شد، اما تیمار پلاسمای سرد میانگین مدت جوانهزنی را کاهش داد. با توجه به نتایج حاصله؛ در بین تیمارهای مورد بررسی بیشترین میانگین مدت جوانهزنی بذرها (07/2 روز) در شرایط تنش کادمیوم 150 میلی گرم در لیتر در شرایط عدم پیشتیمار پلاسمای سرد در رقم Titicaca مشاهده شد. پیشتیمار نمودن بذرهای کینوا با پلاسمای سرد موجب شد تا میانگین مدت جوانهزنی بذرها هم در شرایط بدون تنش و هم در شرایط تنش کادمیوم کاهش یابد، بهطوری که کمترین میانگین مدت جوانهزنی (45/1 روز) در شرایط عدم تنش کادمیوم در تیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد در رقم Q26 دیده شد (شکل 3).
شکل 3- تأثیر مدت تیمار پلاسمای سرد بر میانگین مدت جوانهزنی بذرهای ارقام کینوا تحت تنش کادمیوم. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حروف یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال یک درصد با استفاده از آزمون دانکن را نشان میدهند.
Figure 3- Effect of cold plasma treatment duration on the average germination time of quinoa cultivars under cadmium stress. The values are the mean values of three repetitions ± standard deviation and the same letters indicate the existence of a significant difference at the 1% probability level using Duncan's test.
میانگین درصد جوانهزنی روزانه: بر اساس نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس دادهها (جدول 1) میانگین درصد جوانهزنی روزانه تحت تأثیر آثار ساده، تأثیرات متقابل دو جانبه و آثار سه جانبه مدت زمان تیمار پلاسمای سرد، ارقام و تنش کادمیوم معنیدار شد. میانگین درصد جوانهزنی روزانه با افزایش تنش کادمیوم بطور معنیداری کاهش یافت، اما تیمار پلاسمای سرد سبب افزایش میانگین درصد جوانهزنی روزانه در سه رقم کینوا شد، بهطوری که بیشترین میانگین درصد جوانهزنی روزانه (09/7 درصد) در شرایط بدون تنش کادمیوم در پیشتیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد در رقم Q26 مشاهده شد که اختلاف معنیداری در پیشتیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد با رقم Titicaca در شرایط عدم تنش کادمیوم و تنش 50 میلیگرم در لیتر نداشت (شکل 4). کمترین میانگین درصد جوانهزنی روزانه (76/3 درصد) در تیمار عدم کاربرد پلاسمای سرد در تنش کادمیوم 150 میلی گرم در لیتر در رقم Giza مشاهده شد که حدود 23/87 درصد کمتر از سایر تیمارها بود (شکل 4).
شکل 4- تأثیر مدت تیمار پلاسمای سرد بر میانگین درصد جوانهزنی روزانه بذرهای ارقام کینوا تحت تنش کادمیوم. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حروف یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال یک درصد با استفاده از آزمون دانکن را نشان میدهند.
Figure 4- Effect of cold plasma treatment duration on the average daily germination percentage of quinoa cultivars under cadmium stress. The values are the mean values of three repetitions ± standard deviation and the same letters indicate the existence of a significant difference at the 1% probability level using Duncan's test.
زمان تا 90 درصد جوانهزنی: نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس دادهها (جدول 1) نشان داد که زمان تا 90 درصد جوانهزنی تحت تأثیر مدت پلاسمای سرد، ارقام و تنش کادمیوم و اثر متقابل پلاسمای سرد × ارقام، پلاسمای سرد × تنش کادمیوم، تنش کادمیوم × ارقام و اثر سه جانبه پلاسمای سرد × ارقام× تنش کادمیوم معنیدار شد. پیشتیمار مدت پلاسمای سرد سبب کاهش زمان تا 90 درصد جوانهزنی شد، امّا تنش کادمیوم منجر به افزایش زمان تا 90 درصد جوانهزنی بذرهای کینوا شد. با توجه به نتایج، در بین تیمارهای مورد بررسی بیشترین زمان تا 90 درصد جوانهزنی (06/5 ساعت) با کاربرد غلظت 150 میلیگرم در لیتر کادمیوم در پیشتیمار شاهد پلاسمای سرد در رقم Giza مشاهده شد که اختلاف معنیداری با رقم Titicaca نداشت (شکل 5). همچنین با کاربرد پیشتیمار مدت پلاسمای سرد، مدت زمان لازم برای رسیدن به 90 درصد جوانهزنی نسبت به پیشتیمار عدم کاربرد پلاسمای سرد بهطور معنیداری کاهش یافت. همچنین نتایج نشان دادند پیشتیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد زمان تا 90 درصد جوانهزنی را کاهش داد (شکل 5). کمترین زمان تا 90 درصد جوانهزنی (53/2 ساعت) در پیشتیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد زمان در شرایط طبیعی در رقم Q26 مشاهده شد (شکل 5).
شکل 5- تأثیر مدت تیمار پلاسمای سرد بر میانگین زمان تا 90 درصد جوانهزنی بذرهای ارقام کینوا تحت تنش کادمیوم. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حروف یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال یک درصد با استفاده از آزمون دانکن را نشان میدهند.
Figure 5 - Effect of cold plasma treatment duration on the average time to 90% germination of quinoa cultivars under cadmium stress. The values are the mean values of three repetitions ± standard deviation and the same letters indicate the existence of a significant difference at the 1% probability level using Duncan's test.
شکل 6- تأثیر مدت پیشتیمار پلاسمای سرد بر میانگین وزن خشک گیاهچه بذرهای ارقام کینوا. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حروف یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال یک درصد با استفاده از آزمون دانکن را نشان میدهند.
Figure 6- Effect of cold plasma treatment duration on the average dry weight of quinoa seed seedlings. The values are the mean values of three repetitions ± standard deviation and the same letters indicate the existence of a significant difference at the 1% probability level using Duncan's test.
وزن خشک گیاهچه: بر اساس نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس دادهها (جدول 1) وزن خشک گیاهچه بهجز آثار دو جانبه ارقام × تنش کادمیوم و اثر سه جانبه پلاسمای سرد × ارقام× تنش کادمیوم تحت تأثیر سایر آثار ساده و دو جانبه معنیدار شد.
پیشتیمار نمودن بذرهای کینوا با پلاسمای سرد موجب شد تا وزن خشک گیاهچه افزایش یابد. بهطوری که بیشترین میزان وزن خشک گیاهچه (1/4 میلیگرم) در شرایط پیشتیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد در رقم Q26 مشاهده شد که بطور معنیداری بیشتر از سایر تیمارها بود و حدود 71/85 درصد بیشتر از تیمار شاهد بود (شکل 6). کمترین میزان وزن خشک گیاهچه در پیشتیمار شاهد پلاسمای سرد در رقم Titicaca بدست آمد (شکل 6). تنش کادمیوم سبب کاهش معنیدار وزن خشک گیاهچه کینوا در حدود 18/90 درصد در تیمار شاهد (عدم تنش کادمیوم) شد، امّا پیشتیمار مدت پلاسمای سرد میزان وزن خشک را افزایش داد (شکل 7). در بین تیمارهای مورد بررسی کمترین وزن خشک گیاهچه با کاربرد غلظت 150 میلیگرم در لیتر کادمیوم در شرایط عدم پیشتیمار پلاسمای سرد مشاهده شد (شکل 7)
شکل 7- تأثیر مدت پیشتیمار پلاسمای سرد بر میانگین وزن خشک گیاهچه کینوا تحت تنش کادمیوم. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حروف یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال یک درصد با استفاده از آزمون دانکن را نشان میدهند.
Figure 7- Effect of cold plasma treatment duration on the average dry weight of quinoa seedlings under cadmium stress. The values are the mean values of three repetitions ± standard deviation and the same letters indicate the existence of a significant difference at the 1% probability level using Duncan's test.
طول گیاهچه: نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس دادهها (جدول 1) نشان داد که طول گیاهچه تحت تأثیر مدت پلاسمای سرد، ارقام و تنش کادمیوم و اثر متقابل پلاسمای سرد × ارقام و تنش کادمیوم × ارقام قرار گرفت، امّا اثر دو جانبه و پلاسمای سرد × تنش کادمیوم و اثر سه جانبه پلاسمای سرد × ارقام× تنش کادمیوم معنیدار نشد.
بیشترین طول گیاهچه در پیشتیمار مدت 30 ثانیه پلاسمای سرد در رقم Q26 مشاهده شد که اختلاف معنیداری با رقم Titicaca نداشت. پیشتیمار مدت 30 ثانیه پلاسمای سرد طول گیاهچه را 79/53 درصدنسبت به تیمار شاهد افزایش داد (شکل 8). تنش کادمیوم سبب کاهش طول گیاهچه کینوا در حدود 18/40 درصد در تیمار شاهد شد (شکل 9). در بین تیمارهای مورد بررسی کمترین طول گیاهچه با کاربرد غلظت 150 میلیگرم در لیتر کادمیوم در رقم Titicaca مشاهده شد (شکل 9)
شکل 8- تأثیر مدت پیشتیمار پلاسمای سرد بر میانگین طول گیاهچه بذرهای ارقام کینوا. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حروف یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال یک درصد با استفاده از آزمون دانکن را نشان میدهند.
Figure 8- Effect of cold plasma treatment duration on the average seedling length of quinoa seed cultivars. The values are the mean values of three repetitions ± standard deviation and the same letters indicate the existence of a significant difference at the 1% probability level using Duncan's test.
شکل 9- تأثیر تنش کادمیوم بر میانگین طول گیاهچه بذرهای ارقام کینوا. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حروف یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال یک درصد با استفاده از آزمون دانکن را نشان میدهند.
Figure 9- The effect of cadmium stress on the average seedling length of quinoa seed cultivars. The values are the mean values of three repetitions ± standard deviation and the same letters indicate the existence of a significant difference at the 1% probability level using Duncan's test.
فعالیت آنزیم کاتالاز: بر اساس نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس دادهها (جدول 2) فعالیت آنزیم کاتالاز تحت تأثیر مدت پلاسمای سرد، ارقام و تنش کادمیوم و اثر متقابل پلاسمای سرد × ارقام، پلاسمای سرد × تنش کادمیوم و اثر سه جانبه پلاسمای سرد × ارقام× تنش کادمیوم قرار گرفت، اما اثر متقابل تنش کادمیوم × ارقام معنیدار نشد. تنش کادمیوم فعالیت آنزیم کاتالاز را افزایش داد، بهطوری که 150 میلیگرم در لیتر تنش کادمیوم فعالیت آنزیم کاتالاز را 59/68 درصد نسبت به تیمار شاهد افزایش داد (شکل 10). پیشتیمار نمودن بذرهای کینوا با پلاسمای سرد موجب شد تا فعالیت آنزیم کاتالاز افزایش یابد. با توجه به نتایج، بیشترین فعالیت آنزیم کاتالاز در شرایط تنش 150 میلیگرم در لیتر و پیشتیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد در رقم Q26 مشاهده شد که بهطور معنیداری بیشتر از سایر تیمارها بود ،اما اختلاف معنیداری بین غلظتهای کادمیوم (صفر، 50 و 150 میلیگرم در لیتر) وجود نداشت. همچنین کمترین فعالیت آنزیم کاتالاز در شرایط بدون پیشتیمار مدت پلاسمای سرد و بدون تنش کادمیوم در رقم Titicaca مشاهده شد که بطور معنیداری کمتر از سایر تیمارها بود (شکل 10).
جدول 2- تجزیه واریانس اثرات مدت تیمار پلاسمای سرد و تنش کادمیوم بر فعالیت بیوشیمیایی و میزان ساپونین گیاهچههای ارقام کینوا
Table 3- Analysis of variance of the effects of cold plasma treatment duration and cadmium stress on biochemical activity and saponin content of quinoa cultivar seedlings
|
Saponin content |
Proline |
Polyphenol oxidase enzyme activity |
Peroxidase enzyme activity |
Catalase enzyme activity |
df |
S.O.V |
|
1.68** |
0.48** |
1040.76** |
1023.38** |
3354.07** |
2 |
Plasma cold |
|
164.83** |
0.03** |
103.52** |
95.003** |
393.04** |
2 |
Varitey |
|
12.88 ns |
0.01* |
25.09** |
53.02** |
121.01** |
2 |
Cadmium stress |
|
0.037 ns |
0.05** |
12.57** |
27.08** |
135.59** |
4 |
اPlasma cold × Varitey |
|
0.02 ns |
0.01 ns |
0.52ns |
2.79ns |
8.61* |
4 |
Plasma cold × Cadmium stress |
|
1.05 ns |
0.003 ns |
0.89ns |
1.02ns |
4.70ns |
4 |
Cadmium stress × Varitey |
|
0.06 ns |
0.002 ns |
1.44ns |
2.14ns |
6.87* |
8 |
Plasma cold × Varitey× Cadmium stress |
|
1.20 |
0.004 |
1.94 |
2.05 |
2.600 |
54 |
Error |
|
16.72 |
11.73 |
8.53 |
3.83 |
3.61 |
|
CV % |
ns،* و ** به ترتیب غیرمعنیدار و معنیدار در سطح احتمال پنج درصد، یک درصد
ns, * and ** are non-significant and significant at the five percent, one percent probability level, respectively
شکل 10- تأثیر مدت پیشتیمار پلاسمای سرد بر فعالیت آنزیم کاتالاز گیاهچههای ارقام کینوا تحت تنش کادمیوم. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حروف یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال یک درصد با استفاده از آزمون دانکن را نشان میدهند.
Figure 10- Effect of cold plasma treatment duration on catalase enzyme activity of quinoa cultivar seedlings under cadmium stress. The values are the mean values of three repetitions ± standard deviation the same letters indicate the existence of a significant difference at the 1% probability level using Duncan's test.
فعالیت آنزیم پراکسیداز: فعالیت آنزیم پراکسیداز تحت تأثیر اثر ساده مدت پلاسمای سرد، ارقام و تنش کادمیوم و اثر متقابل پلاسمای سرد × ارقام قرار گرفت، امّا اثر متقابل تنش کادمیوم × ارقام، پلاسمای سرد × تنش کادمیوم و اثر سه جانبه پلاسمای سرد × ارقام× تنش کادمیوم معنیدار نشد (جدول 2). پیشتیمار نمودن بذرهای کینوا با پلاسمای سرد موجب شد تا فعالیت آنزیم پراکسیداز افزایش یابد. بهطوریکه بیشترین فعالیت آنزیم پراکسیداز در پیشتیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد در رقم Q26 مشاهده شد که بطور معنیداری بیشتر از سایر تیمارها بود اما اختلاف معنیداری با رقم Titicaca وجود نداشت. همچنین کمترین فعالیت آنزیم پراکسیداز در شرایط بدون پیشتیمار مدت پلاسمای سرد در رقم Titicaca مشاهده شد که بهطور معنیداری کمتر از سایر تیمارها بود که حدود 36/66 درصد کمتر از پیشتیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد بود (شکل 11).
شکل 11- تأثیر مدت پیشتیمار پلاسمای سرد بر فعالیت آنزیم پراکسیداز گیاهچههای ارقام کینوا. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حروف یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال یک درصد با استفاده از آزمون دانکن را نشان میدهند.
Figure 11- Effect of cold plasma treatment duration on peroxidase enzyme activity of quinoa cultivar seedlings. The values are the mean values of three repetitions ± standard deviation and the same letters indicate the existence of a significant difference at the 1% probability level using Duncan's test.
فعالیت آنزیم پلیفنلاکسیداز: بر اساس نتایج جدول تجزیه واریانس، فعالیت آنزیم پلیفنلاکسیداز تحت تأثیر اثر ساده مدت پلاسمای سرد، ارقام و تنش کادمیوم و اثر متقابل پلاسمای سرد × ارقام قرار گرفت، اما اثر متقابل تنش کادمیوم × ارقام، پلاسمای سرد × تنش کادمیوم و اثر سه جانبه پلاسمای سرد × ارقام× تنش کادمیوم معنیدار نشد (جدول 2). همانطور که در شکل 12 مشاهده میشود بیشترین و کمترین فعالیت آنزیم پلیفنلاکسیداز بهترتیب در پیشتیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد در رقم Q26 و بدون پیشتیمار مدت پلاسمای سرد در رقم Titicaca مشاهده شد. در شرایط پیشتیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد، بین رقم Q26 و رقم Titicaca اختلاف معنیداری وجود نداشت (شکل 12).
شکل 12- تأثیر مدت پیشتیمار پلاسمای سرد بر فعالیت آنزیم پلی فنل پراکسیداز گیاهچههای ارقام کینوا. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حروف یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال یک درصد با استفاده از آزمون دانکن را نشان میدهند.
Figure 12 - Effect of cold plasma treatment duration on polyphenol peroxidase enzyme activity of quinoa cultivar seedlings. The values are the mean values of three repetitions ± standard deviation and the same letters indicate the existence of a significant difference at the 1% probability level using Duncan's test.
شکل 13- تأثیر مدت پیشتیمار پلاسمای سرد بر میزان پرولین گیاهچههای ارقام کینوا. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حروف یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال یک درصد با استفاده از آزمون دانکن را نشان میدهند.
Figure 13- Effect of cold plasma treatment duration on proline content of quinoa cultivar seedlings. The values are the mean values of three repetitions ± standard deviation and the same letters indicate the existence of a significant difference at the 1% probability level using Duncan's test.
پرولین: بر اساس نتایج جدول تجزیه واریانس، محتوای پرولین تحت تأثیر مدت پلاسمای سرد، ارقام و تنش کادمیوم و اثر متقابل پلاسمای سرد × ارقام قرار گرفت، اما اثر دو جانبه پلاسمای سرد × تنش کادمیوم، تنش کادمیوم × ارقام و اثر سه جانبه پلاسمای سرد × ارقام× تنش کادمیوم معنیدار نشد (جدول 2). همانطور که در شکل 13 مشاهده میشود با افزایش پیشتیمار مدت پلاسمای سرد، محتوای پرولین افزایش یافت. بهطوری که بیشترین محتوای پرولین در پیشتیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد بدست آمد که بین ارقام کینوا اختلاف معنیداری در این تیمار وجود نداشت. کمترین محتوای پرولین در شرایط بدون پلاسمای سرد در رقم Titicaca بدست آمد که حدود 99/72 درصد کمتر از پیشتیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد در رقم Q26 بود (شکل 13)
ساپونین: بر اساس نتایج جدول تجزیه واریانس، محتوای ساپونین تحت تأثیر آثار ساده مدت پلاسمای سرد و ارقام کینوا معنیدار شد، امّا سایر تأثیرات بر محتوای ساپونین معنیدار نبود (جدول 2). همانطور که در شکل a 14 مشاهده میشود، با افزایش مدت پیشتیمار پلاسمای سرد از 10 به 30 ثانیه محتوای ساپونین در حدود 35/10 تا 42/23 درصد نسبت به تیمار شاهد افزایش یافت. بیشترین محتوای ساپونین در رقم Q26 مشاهده شد که بطور معنیداری بیشتر از سایر تیمارها بود. همچنین کمترین محتوای ساپونین در رقم Titicaca بدست آمد (شکل b 14)
شکل 14- تأثیر مدت پیشتیمار پلاسمای سرد (a) و ارقام کینوا (b) بر محتوای ساپونین. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حروف یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال یک درصد با استفاده از آزمون دانکن را نشان میدهند.
Figure 14 - Effect of cold plasma treatment duration (a) and quinoa cultivars (b) on saponin content. The values are the mean values of three repetitions ± standard deviation and the same letters indicate the existence of a significant difference at the 1% probability level using Duncan's test.
بحث
در پژوهش حاضر، تأثیر مثبت تیمار پلاسمای سرد اتمسفری در ارقام کینوا در شرایط سمیت کادمیوم در شرایط آزمایشگاهی بررسی شد. بر اساس نتایج این پژوهش درصد جوانهزنی بذرهای کینوا با افزایش غلظت کادمیوم کاهش یافته است (شکل 1)، که با نتایج Sheikhzadeh et al. (2021) روی گیاه گاوزبان (Borago officinalis)، Silva et al. (2021) بر روی پنبه (Gossypium) مطابقت داشت. Anwar et al. (2021) گزارش کردند سمیت کادمیوم در جوانه زدن گیاهچههای سورگوم (Sorghum) دو رنگ فعالیت آنزیم هیدرولیز کننده )مانند آمیلازها، پروتئازها و لیپازها( را مختل میکند و تأثیر منفی بر انتقال محصولات هیدرولیز (پروتئینها و لیپیدها) به سمت محور جنینی در حال رشد دارد و در نتیجه سبب افزایش میانگین مدت جوانهزنی میشود. بنابراین تنش کادمیوم با تأثیر منفی بر انتقال مواد، منجر به کاهش سرعت جوانهزنی میشود. در واقع سرعت جوانهزنی رابطه معکوسی با میانگین مدت زمان جوانهزنی دارد، بهنحوی که هر چه سرعت جوانهزنی افزایش یابد، مدت زمان لازم برای جوانه زدن بذر نیز کاهش پیدا میکند. میانگین مدت جوانهزنی همچنین با کیفیت توده بذری رابطه عکس دارد، بنابراین هر چه میانگین مدت جوانهزنی بذر کمتر باشد، نمونه بذری از کیفیت بیشتری برخوردار است (Mahmoudi et al., 2023).
تنش کادمیوم سبب کاهش طول گیاهچه شد که با نتایج Sheikhzadeh et al. (2021) بر روی گیاه گل گاوزبان (Borago officinalis)، Silva et al. (2021) بر روی پنبه (Gossypium) مطابقت داشت. یونهای کادمیوم بیش از حد به آسانی توسط ریشه گیاه جذب میشوند، سپس به اندامهای هوایی منتقل میشوند و تغییرات پیچیدهای را در گیاهان در سطوح مختلف ایجاد میکنند (Salarizadeh et al., 2016).
مهار رشد توسط کادمیوم میتواند به علت مهار تقسیم سلولی و سرعت طویل شدن سلولها باشد که اغلب توسط مهار غیر قابل برگشت پمپ پروتون که مسؤل این فرآیند است، رخ میدهد (Amooaghaie et al., 2013) که با نتایج Amjad et al. (2021) بر روی گیاه کینوا مطابقت دارد. بسیاری از پژوهشگران گزارش کردهاند تحت تنش کادمیوم کاهش قابل توجهی در رشد گیاهان وجود دارد (Rehman et al., 2019). به طور مشابه، Amjad et al. (2021) دریافتند که رشد گیاه کینوا با افزایش سطح کادمیوم خاک از 30 به 90 میلیگرم در کیلوگرم به ترتیب کاهش مییابد. این کاهش ناشی از کادمیوم در رشد کینوا به ناهنجاریهای متعددی مانند جذب محدود مواد مغذی، سمیت یون کادمیوم، محدودیت روابط آبی گیاهی، فرآیند فتوسنتزی و فعالیتهای آنزیمی نسبت داده میشود (Rehman et al., 2019 Abdal et al., 2021;). افزایش شاخصههای رشدی گیاهچه مانند طول و وزن گیاهچه ارتباط بسیار نزدیکی با سرعت جوانهزنی دارند. زیرا، بذرهای تحت پیشتیمار زودتر جوانهزده و گیاهچه بزرگتری را ایجاد میکنند. در حالیکه، تمامی تیمارها در یک زمان مشخص ارزیابی میشوند. گیاهان برای تعدیل تنش اکسیداتیو، فعالیت آنزیمهای پاد اکسیدان نظیر کاتالاز، پراکسیدازها و سوپر اکسید دیسموتاز، همچنین سنتز پاد اکسیدانهای غیرآنزیمی را افزایش میدهند تا وضعیت پتانسیل ردوکس سلولی را کنترل کنند (Jafarhaddadian et al., 2020). این موضوع بهخوبی اثبات شده است که سیستم پاداکسیدانی نقش مهمی در تحمل گیاه به شرایط تنشزا دارد و فعالیت یک یا تعداد بیشتری از آنزیمهای پاد اکسیدان در گیاهان قرارگرفته در شرایط تنش افزایش مییابد و سبب افزایش تحمل گیاه به تنش میشود (Gerami et al., 2018; Mahmoudi et al., 2023; Khaliliaqdam et al., 2024). نتایج این پژوهش نشان داد پیشتیمار بذرهای کینوا با پلاسمای سرد منجر به بهبود فاکتورهای رشدی شامل طول گیاهچه، وزن خشک گیاهچه و همچنین شاخصهای جوانهزنی مانند سرعت و درصد جوانهزنی در شرایط تنش کادمیوم شد. این بهبود رشدی همزمان با افزایش فعالیت آنزیمهای پاداکسیدانی کاتالاز، پراکسیداز و پلیفنلاکسیداز مشاهده شد. به نظر میرسد پیشتیمار پلاسمای سرد با تحریک سیستم دفاعی آنتیاکسیدانی گیاه، موجب کاهش آسیبهای ناشی از گونههای فعال اکسیژن (ROS) تولیدشده تحت تنش کادمیوم شده و در نتیجه، با حفظ یکپارچگی ساختاری در سلولها سبب تداوم تقسیم و طویل شدن سلولی و در نهایت افزایش رشد گیاه شده است. افزایش معنیدار طول گیاهچه و وزن خشک گیاهچه در تحت تیمار پلاسمای سرد در سویا (Ling et al., 2014)، کنجد (Goudarzi et al., 2021)، نخود (Fereydoni & Alizaheh, 2022)، پریوش (Noormohammadi et al., 2019) و گندم گزارش (Guo et al., 2018) شده است. همچنین گزارش شده که تیمار پلاسمای سرد سبب افزایش سرعت جابجایی ذخایر غذایی بذر (کربوهیدارتها و پروتئینها) در مرحله جوانهزنی میشود و در نتیجه، گیاهچههای قویتر و با وزن خشک بالاتر حاصل میشود (Singh et al., 2019). رقمهایی با کارایی استفاده از ذخیره بذر بالاتر، بنیه بالاتری داشته و بدون در نظر گرفتن وزن بذر، سریعتر جوانه زده و گیاهچههایی با ماده خشک بالاتر تولید میکنند (Andrade et al., 2019). نتایج حاصل در بررسی 4 ژنوتیپ کینوا UDEC-5 (Q4) و Kcoito (Q3) ،Red Faro (Q2), Tumeko (Q1) تشان داد که رقمهای Q2 وQ4 دارای وزن خشک گیاهچه بالاتری نسبت به دو رقم دیگر بود (Derbali et al., 2020). در بررسی دو رقم کینوا نیز گزارش شده است که وزن خشک گیاهچه تحت تأثیر رقم قرار میگیرد (Amiryousefi et al., 2021) که با نتایج این پژوهش مطابقت دارد. پژوهش حاضر نشان داد تحت تنش کادمیوم، پیشتیمار بذرهای کینوا با پلاسمای سرد منجر به افزایش در فعالیت آنزیمهای پاداکسیدانی نظیر کاتالاز و پراکسیداز شد، که همزمان با بهبود فاکتورهای رشدی مانند طول و وزن خشک گیاهچه و شاخصهای جوانهزنی بود. این نتایج با یافتههای Alharby et al. (2021) همراستا است که نشان میدهد که فعالیتهای CAT، APX و POD روند افزایشی بر سمیت کادمیوم را نشان میدهد. پژوهش حاضر نشان داد که تحت تنش کادمیوم فعالیت هر دو این آنزیم افزایش یافته است. افزایشهای مشابهی در فعالیت این آنزیمها نیز تحت تنش کادمیوم هم در آزمایشهای خاک و هم در کشت محلول در کینوا مشاهده شد (Amjad et al., 2021; Abdal et al., 2021; Iftikhar et al., 2021). بنابراین، میتوان استنباط کرد که هر دو آنزیم کاتالاز و پراکسیداز نقش مهمی در سم زدایی H2O2 و آسیب سلولی حاصل در گیاهان تحت تنش کادمیوم دارند (Abdal et al., 2021; Iftikhar et al., 2021). نتایج این پژوهش نشان داد که پیشتیمار بذرهای کینوا با پلاسمای سرد توانست تا حد زیادی آثار منفی تنش کادمیوم را کاهش داده و موجب افزایش معنیدار در فعالیت آنزیمهای پاداکسیدانی مانند کاتالاز، پراکسیداز و پلیفنلاکسیداز شود. Kamalvand et al. (2022) نشان دادند تنش کادمیوم بسته به نوع آنزیم، الگوی متفاوتی از تغییرات فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان ایجاد میکند. همچنین Dawuda et al. (2020)در گیاه کاهو افزایش فعالیتPOD ، PPO و تجمع پرولین را در پاسخ به CdCl₂ گزارش کردند. بهطور مشابه، Pakbaz et al. (2023) افزایش فعالیت آنزیمهای دفاعی را در گیاه یونجه تحت تنش کادمیوم مشاهده نمودند. همانطور که توسط چندین پژوهش نشان داده شده است، پلاسمای سرد و محلولهای فعال شده با پلاسما میتوانند به عنوان محرکهای اکسیداتیو عمل کنند و تعادل ردوکس را بر هم بزنند. عدم تعادل ردوکس، تعامل RONS (Reactive Oxygen and Nitrogen Species) با مولکولهای زیستی را تقویت میکند و منجر به تغییر یا آسیب اکسیداتیو میشود. RONS زیاد میتواند با سایر واکنشهای متابولیک، فیتوهورمونها و آبشارهای سیگنالدهنده رشد و نمو که گیاه را در سطوح مختلف فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی تغییر میدهند، تداخل داشته باشد (Adhikari et al., 2020). هرچند RONS در غلظتهای بالا میتواند سبب آسیب اکسیداتیو شود، اما در غلظتهای پائین نقش تنظیمکننده در فرآیندهای رشد، تعادل ردوکس، آبشارهای سیگنالدهی و فعالیت فیتوهورمونها دارد (Rahman et al., 2018; Mhamdi & Breusegem, 2018). بدین ترتیب، به نظر میرسد پلاسمای سرد با القای ملایم پاسخهای دفاعی، تعادل سیستم آنتیاکسیدانی را در برابر سمیت کادمیوم بازیابی کرده و توسط کاهش تنش اکسیداتیو، بهبود وضعیت جوانهزنی و افزایش شاخصهای رشدی گیاه کینوا را به دنبال داشته است.. همچنین پژوهش اثر پلاسمای سرد بر بذر گوجهفرنگی (Lycopersicon esculentum) و تعیین زمان پردازش روی آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز و پلیفنلاکسیداز و نتایج اثر پلاسمای سرد در مدت زمان 2 دقیقه بر ویژگیهای فیزیکی، شیمیایی و میکروبی رشتههای خشک زعفران (Fazeli et al., 2019) با نتایج حاصل مطابقت دارد. همچنین نتایج پژوهش حاضر نشان دهنده افزایش محتوای ساپونین تحت تیمار پلاسمای سرد است که با نتایج برخی از پژوهشگران همخوانی دارد (Pulvento et al., 2012). محتوای ساپونین یک صفت وابسته به رقم در کینوا است (Ruiz et al., 2017). پژوهشهای Rabbani et al. (2022)کمتر بودن محتوای ساپونین در رقم Titicacaرا در مقایسه با رقم Q29 نشان داد که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت داشت. نتایج پژوهشهای Ruiz et al. (2017) در ارزیابی محتوای ساپونین پوسته بذر شش ژنوتیپ کینوا نشان داد، که توزیع محتوای ساپونین و فراوانی نسبی به رقمها و ویژگیهای زراعی آن بستگی دارد. همچنین محتوای ساپونین با منشاء و پیشینهی ژنتیکی متفاوت در رقمها تغییر میکند. ساپونین-ها دارای ظرفیت پاد اکسیدانی قوی هستند وکاهش محتوای ساپونین کینوا میتواند کیفیت و طعم آن را بهبود بخشد (Zurita- Silva et al., 2014). بنابراین میتوان نتیجه گرفت که استفاده از پیشتیمار پلاسمای سرد، با فعالسازی سازوکارهای دفاعی گیاه، راهکار مؤثری برای کاهش آسیبهای ناشی از فلزات سنگین مانند کادمیوم و بهبود عملکرد گیاه است.
نتیجهگیری کلی
نتایج این پژوهش نشان داد که تنش کادمیوم با ایجاد تنش اکسیداتیو موجب کاهش رشد و تغییر در فعالیت آنزیمهای پاداکسیدانی در گیاه کینوا میشود. با این حال، پیشتیمار بذر با پلاسمای سرد توانست با تحریک سیستم دفاعی گیاه و افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان نظیر کاتالاز، پراکسیداز و پلیفنلاکسیداز، آثار منفی ناشی از کادمیوم را تا حد زیادی کاهش داده و به بهبود فاکتورهای رشدی مانند طول و وزن خشک گیاهچه و شاخصهای جوانهزنی منجر شود. این نتایج بیانگر آن است که پلاسمای سرد میتواند بهعنوان یک تکنولوژی فیزیکی مؤثر و سازگار با محیط زیست برای افزایش مقاومت گیاهان در برابر تنش کادمیوم، بهویژه در مراحل اولیه رشد، مورد استفاده قرار گیرد. از اینرو، بهکارگیری آن در سیستمهای کشاورزی پایدار و مناطق آلوده به فلزات سنگین میتواند راهکاری نوین و عملی برای ارتقاء عملکرد گیاهان و کاهش آسیبهای زیستمحیطی باشد. در پژوهش حاضر، رقمQ26 و پیشتیمار 30 ثانیه پلاسمای سرد نتایج بهتری در مقایسه با تیمارهای دیگر نشان داد.
سپاسگزاری
بدین وسیله نویسندگان این مقاله برخود لازم میدانند که ازتمامی افرادی که در اجرای پژوهش همکاری داشتند کمال تشکر و قدردانی را نمایند.
)