نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
گروه زیستشناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه بوعلی سینا، همدان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Centella asiatica L. is a valuable medicinal plant species whose growth and physiological responses are highly influenced by nutritional and environmental factors. This study aimed to investigate the effects of foliar-applied zinc oxide nanoparticles (ZnO-NPs) and compare them with those of zinc sulfate (ZnSO4) on the growth, physiological, and biochemical traits of C. asiatica. Treatments were applied as foliar sprays at concentrations of 250, 500, and 1000 mg L-1 every three days for two weeks. The results indicated that both zinc sources at 250 and 500 mg L-1 significantly enhanced plant growth (runner length and leaf area), increased photosynthetic pigments, and improved relative water content. The highest accumulation of phenolic compounds, flavonoids, anthocyanins, and the greatest antioxidant enzyme activities (catalase and peroxidase) were observed in plants treated with 1000 mg L-1 ZnO-NPs, suggesting a defensive response to nanoparticle-induced stress. Overall, ZnO-NP treatments demonstrated superior performance compared to ZnSO4 in many parameters. These findings indicated that foliar application of ZnO-NPs at optimal concentrations could be an effective strategy to enhance the production of bioactive compounds in medicinal plants such as C. asiatica.
Introduction
Centella asiatica (L.) is a medicinal herb producing valuable secondary metabolites, particularly triterpenoids such as asiaticoside and madecassoside, which exhibit antioxidant, anti-inflammatory, and antitumor properties (Gray et al., 2018; Roy & Awasthi, 2017). Enhancing the yield and biochemical quality of this species through sustainable agronomic strategies has become a research priority (Harakotr et al., 2024). Zinc plays a central role in chlorophyll biosynthesis, cellular metabolism, and enzyme activation (Faizan et al., 2021). Still, conventional zinc fertilizers often show limited efficiency due to low leaf penetration and restricted bioavailability. Zinc oxide nanoparticles (ZnO-NPs) have gained attention for their higher surface area, controlled ion release, and greater elicitation potential compared with traditional zinc salts (Davarpanah et al., 2016). These characteristics may enhance plant growth and induce bioactive compound accumulation by promoting moderate ROS production and activating defence pathways (Hatami et al., 2019). Despite numerous studies on the effects of ZnO-NPs on various crops, their influence on C. asiatica remains poorly understood, and direct comparisons with zinc sulfate (ZnSO4) are lacking. This study aimed to evaluate and compare the effects of foliar-applied ZnO-NPs and ZnSO4 on key morphological, physiological, and biochemical traits of C. asiatica.
Materials and Methods
Uniform seedlings of C. asiatica were obtained from the Cell Fanavar Daru Company and cultivated under controlled conditions (18–26 °C, natural daylight) in one-kilogram pots filled with a mixture of peat moss, cocopeat, and perlite. The plants were maintained in a greenhouse at Bu-Ali Sina University. Plants were irrigated daily to maintain optimal substrate moisture. Foliar treatments were initiated ten days after transplantation. Zinc oxide nanoparticles (10–30 nm, 99% purity) and zinc sulphate (ZnSO4· 7H2O) were applied at 250, 500, and 1000 mg L-1, based on previous studies (Zafar et al., 2016; Strekalovskaya et al., 2024). Solutions were homogenized ultrasonically before application. Plants received 10 mL of each treatment solution per pot every three days for two weeks, with distilled water as the control. Three fully expanded leaves were collected per treatment (three replicates) three days post-treatment.
Morphological traits (leaf area, runner length), relative water content (RWC) (Arndt et al., 2015), and electrolyte leakage (Shiferaw & Baker, 1996) were measured. Photosynthetic pigments were extracted and quantified spectrophotometrically (Lichtenthaler, 1987). Total phenolics (Plessi et al., 2007), flavonoids (Chang et al., 2002), and anthocyanins (Wagner, 1979) were measured colorimetrically. Catalase (Beers & Sizer, 1952) and peroxidase (Herzog & Fahimi, 1976) activities were measured in enzyme extracts. Total protein was determined using the Bradford method (Bradford, 1976). Data were analyzed using factorial CRD with Duncan's test at p ≤ 0.05.
Results and Discussion
Foliar zinc application significantly influenced all measured traits in C. asiatica, with responses dependent on concentration and zinc source. Both ZnO-NPs and ZnSO4 at 250 and 500 mg L-1 enhanced leaf area and runner length, indicating improved cellular expansion and nutrient assimilation (Ahmed et al., 2023). Growth improvement coincided with increased RWC and reduced electrolyte leakage, particularly under ZnO-NP treatments, suggesting enhanced membrane stability and water retention (Al-Selwey et al., 2023). At 1000 mg L-1, growth declined, and electrolyte leakage increased, reflecting stress from excessive Zn exposure (Ahmed et al., 2023).
Photosynthetic pigments peaked at 500 mg L-1 ZnO-NPs, highlighting superior nanoparticle efficiency in promoting chlorophyll biosynthesis (Rossi et al., 2019). Zinc affects carbonic anhydrase activity, facilitating the diffusion of CO2 to carboxylation sites (Pullagurala et al., 2018). A concentration of 1000 mg L-1 from both sources led to pigment degradation, likely due to increased H2O2 production, enhanced lipid peroxidation, and reduced pigment biosynthesis (Ruiz-Torres et al., 2021; García et al., 2017).
Secondary metabolites (phenolics, flavonoids, anthocyanins) increased markedly at high ZnO-NP concentrations (1000 mg L-1), confirming the nanoparticles' role as elicitors of secondary metabolism. ZnO-NPs induce controlled ROS levels, activating defence pathways that lead to metabolite accumulation. Nanoparticles show higher transport potential and bioavailability, enabling interactions with intracellular structures that stimulate ROS formation (Mahendra et al., 2008).
Antioxidant enzymes (CAT, POD) increased sharply at 1000 mg L-1 ZnO-NPs, supporting stress-induced ROS-scavenging activation (Tirani et al., 2019). Since catalase and peroxidase activities are induced by H2O2 (Gechev et al., 2002), nanoparticle treatments were perceived as stress inducers, increasing enzyme activity to protect against ROS. High ZnSO4 concentrations were associated with lower enzymatic activity, possibly due to cellular damage or regulatory disruption. Protein content decreased under ZnSO4 treatment, whereas no such reduction was observed with ZnO-NPs.
Conclusion
This study demonstrates that foliar application of ZnO-NP at optimal concentrations (250–500 mg L-1) significantly enhances growth, water status, membrane stability, pigment accumulation, and secondary metabolite production in C. asiatica. A high concentration (1000 mg L-1) induced oxidative stress, as evidenced by reduced pigment levels and elevated antioxidant enzyme activity, underscoring the importance of dose management. Compared with ZnSO4, ZnO-NPs showed superior performance, confirming their potential as efficient and sustainable tools for improving the physiological and medicinal quality of C. asiatica. These findings support the use of nano-enabled micronutrient delivery systems in medicinal plant cultivation.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
آببشقابی با نام علمی Centella asiatica L.، یک گیاه چند ساله، علفی، کوچک و رونده از خانواده چتریان (Apiaceae) است (Gray et al., 2018). این گیاه بومی تالابهای جنوب شرقی آسیا است، امّا اکنون به علّت ارزش دارویی آن، در نقاط مختلف جهان از جمله آفریقای جنوبی، ماداگاسکار، سیشل، ایالات متحده آمریکا، مکزیک و اکوادور کشت میشود (Orhan, 2012; Wright et al., 2022). همچنین در ایران، در منطقه هیرکانی شمال کشور یافت میشود (Nav et al., 2021). آببشقابی در طب سنتی، سابقه طولانی مدت در درمان بیماریهای مختلف دارد (Prasad et al., 2019) و با داشتن ترکیباتی مانند اسید آسیاتیک، اسید مادکاسیک، آسیاتیکوزید و مادکاسید (سنتلوزیدها) منبع غنی از متابولیتهای ثانویه با خواص آنتیاکسیدانی، ضد التهابی، ضد دیابتی و ضد توموری است و کاربرد گستردهای در صنایع داروسازی یافتهاست (Roy & Awasthi, 2017; Nongrum et al., 2020). با وجود پتانسیل درمانی بالای این گونه دارویی، توسعه روشهایی نوآورانه و پایدار جهت افزایش تولید و بهبود کیفیت ترکیبات زیستفعال در آن، از اهمیت ویژهای برخوردار است (Harakotr et al., 2024). از سوی دیگر، استفاده از محرکها (elicitors) بهعنوان رویکردی مؤثر برای تحریک مسیرهای بیوسنتزی گیاهان و افزایش تولید ترکیبات ثانویه مورد توجه پژوهشگران قرار گرفته است (Hatami et al., 2019). از نظر عملکرد، این ترکیبات به عنوان سیگنال عمل میکنند و توسط گیرندههای اختصاصی موجود در سلولهای گیاهی شناسایی و موجب القاء پاسخهای دفاعی و در نهایت افزایش تولید متابولیتهای ثانویه میشوند (Halder et al., 2019).
نانوذرات (NPs) بهعنوان یکی از محرکهای غیرزیستی نوظهور میتوانند با تحریک تولید مولکولهای سیگنالینگ و گونههای فعال اکسیژن (ROS) نقش مهمی در تنظیم بیان ژنها و متابولیسم ثانویه گیاه ایفا کنند (Marsline et al., 2017). با این وجود، عنصر روی بهعنوان ماده مغذی ضروری برای انسان، حیوانات و گیاهان جایگاه ویژهای یافته است و در گیاهان در فرآیندهای فیزیولوژیکی مختلف مانند سنتز پروتئین، کلروفیل و کربوهیدرات نقش دارد (Faizan et al., 2021). همچنین عنصر روی در شکل نانوذره دارای مزایایی از جمله سطح ویژه بالا، انحلالپذیری بهتر و قابلیت آزادسازی تدریجی مواد مغذی است، به همین علّت نیاز به مقادیر کمتری از آن نسبت به کودهای معمولی است وکارایی آن نسبت به کودهای سنتی بیشتر است (Davarpanah et al., 2016). با توجه به یافتههای پژوهشگران، استفاده از نانوذرات روی به طور قابل توجهی رشد و عملکرد محصول را در پنبه (Venkatachalam et al., 2017)، ذرت و گندم (Srivastav et al., 2021)، محتوای فلاونوئیدها را در بادرشبو (Nekoukhou et al., 2022) و خردل (Geremew et al., 2023) افزایش میدهد. کاربرد برگی نانوذرات روی به علّت نفوذ بیشتر، تأثیر بیشتری از نمکهای روی بر رشد و فیزیولوژی گیاهان قهوه (Coffea arabica L.) داشته است (Rossi et al., 2019).
با وجود پژوهشهای متعدد در زمینه تأثیر نانوذرات فلزی بر رشد و فیزیولوژی گیاهان، تاکنون پژوهشی در مورد اثر ZnO-NP بر روی رشد، فیزیولوژی و تولید ترکیبات زیستفعال گیاه آببشقابی (Centella asiatica L.) انجام نشدهاست. از سوی دیگر، مقایسه کارایی نانوذرات با نمکهای رایج از جمله ZnSO₄ در بهبود پاسخهای رشدی و متابولیتی نیز کمتر مورد توجه قرار گرفته است. از اینرو، پژوهش حاضر با هدف بررسی تأثیر نانوذره اکسید روی و مقایسه آن با سولفات روی بر شاخصهای رشدی و فیزیولوژیکی گیاه آببشقابی انجام شد.
مواد و روش
در این پژوهش، ZnO-NPs با اندازه ذرات ۳۰-۱۰ نانومتر، خلوص ۹۹ درصد، مساحت سطح ۶۰-۲۰ مترمربع بر گرم و چگالی واقعی 606/5 گرم بر سانتیمترمکعب از شرکت نانوسانی (US-Nano) مشهد خریداری شد. خواص ذرات، شامل میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)، میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) و نمودار پرتو ایکس (XRD) در شکل 1 ارائه شد. ZnSO4.7H2O تولیدی شرکت مرک (آلمان)
است.
شکل 1- مشخصات نانوذره اکسیدروی توسط تکنیکهای مختلف. A: تصویر میکروسکوپ TEM نانوذره ZnO با ریختشناسی کروی و میانگین اندازه حدود ۳۰-۱۰ نانومتر. B: تصویر میکروسکوپ SEM نانوذره ZnO نشاندهنده ریختشناسی سطح و شکل ذرات. C: نمودار XRD نانوذره ZnO.
Figure 1- Characterization of ZnO nanoparticles using different techniques. A: Transmission electron microscopy (TEM) image of ZnO nanoparticles showing spherical morphology with an average size of approximately 10–30 nm. B: Scanning electron microscopy (SEM) image of ZnO nanoparticles illustrating surface morphology and particle shape. C: X-ray diffraction (XRD) pattern of ZnO nanoparticles.
جهت بررسی تأثیر این ترکیبات بر گیاه دارویی آببشقابی (Centella asiatica L.)، نهالهای همسن از شرکت سلول فناور دارو تهیه شد. سپس این نهالها در گلدانهایی با ظرفیت یک کیلوگرم و حاوی بستر کشت متشکل از پیت ماس،کوکوپیت و پرلیت کاشته و در گلخانه پردیس دانشگاه بوعلیسینا در دمای ۲۶-۱۸ سانتیگراد و دوره نوری طبیعی نگهداری شدند. آبیاری گلدانها به صورت روزانه انجام شد و بعد از ده روز، زمانی که نهالها به رشد کافی رسیدند، تیمار گیاهان به صورت محلول پاشی برگی انجام شد. بر اساس پژوهشهای قبلی، غلظتهای ۲۵۰ و ۵۰۰ میلیگرم در لیتر برای بررسی اثرات تحریککننده ZnO-NP و غلظت ۱۰۰۰ میلیگرم در لیتر برای ارزیابی اثرات منفی احتمالی انتخاب شدند (Zafar et al., 2016; Strekalovskaya et al., 2024). همچنین غلظت مشابهی از ZnSO4 به عنوان شاهد مثبت بود و بر روی هر گیاه، به میزان ۱۰ میلیلیتر از محلول تیمار اسپری شد. در تیمار شاهد منفی از هیچ گونه روی استفاده نشد و تنها محلول آب مقطر بر روی گیاهان اسپری شد.
محلولپاشی توسط یک بطری اسپری دستی هر سه روز یکبار به مدت دو هفته انجام شد. برای جلوگیری از تجمعZnO-NPs و انحلال آن، پیش از اعمال تیمارها، محلولها با کمک دستگاه اولتراسونیک کاملاً همگنسازی شدند. سه روز بعد از آخرین تیمار از هر گلدان سه برگ جوان بالغ در سه تکرار برای تجزیه و تحلیل جمعآوری شد. جهت بررسی تأثیر تیمارها بر رشد گیاه، صفات ریختشناسی مانند طول رانر (سانتیمتر) و سطح برگ (سانتیمتر مربع) اندازهگیری شد. همچنین برای اندازهگیری محتوای نسبی آب برگ [RWC (%)]، ابتدا وزن تر (FW) نمونهها اندازهگیری و سپس هر نمونه به مدت 6 ساعت با آب مقطر در نور معمولی و در دمای اتاق کاملاً آبدهی شد. پس از آبدهی، وزن تورژسانس (TW) نمونهها به دست آمد. برای تعیین وزن خشک (DW)، نمونهها به مدت 72 ساعت در دمای 60 درجه سانتیگراد خشک و وزن شدند. در نهایت،RWC (%) محاسبه شد (Arndt et al., 2015).
برای سنجش پایداری غشاء، دیسکهای برگی (۱×۱ سانتیمتر) به مدت ۲۴ ساعت در آب دیونیزه قرار داده شدند. سپس رسانایی اولیه توسط EC متر اندازهگیری شد. پس از اتوکلاو کردن نمونهها در دمای ۱۲۰ درجه سانتیگراد به مدت ۲۰ دقیقه، رسانایی نهایی یادداشت و درصد نشت الکترولیت محاسبه شد (Shiferaw & Baker, 1996). همچنین جهت سنجش محتوای کلروفیل و کارتنوئید از روش Lichtenthaler (1987) استفاده شد. در نهایت جذب نمونهها در طول 663، 646 و 470 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Visible مدل Perkin Elmer خوانده و غلظت آنها بر حسب میلیگرم بر گرم وزن تر محاسبه شد.
نیم گرم از بافت تازه برگ با محلول استخراج (ترکیبی از 1 میلیلیتر اسید کلریدریک و 99 میلیلیتر متانول خالص) آسیاب شد و از عصاره حاصل برای سنجش میزان فنول کل، فلاونوئید و آنتوسیانین برگها استفاده شد.
برای اندازهگیری میزان ترکیبات فنلی کل از روش Plessi et al. (2007) استفاده شد و در نهایت میزان جذب محلولها در طول موج 765 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد و مقدار کل ترکیبات فنلی بر اساس منحنی استاندارد اسید گالیک محاسبه و بر حسب میلیگرم به ازای هر گرم وزن تر نمونه گزارش شد.
برای سنجش فلاونوئید کل، از روش رنگسنجی با کلرید آلومینیوم استفاده شد و در نهایت، جذب آنها در طول موج 415 نانومتر خوانده شد. مقدار فلاونوئید کل توسط منحنی استاندارد کوئرستین و بر اساس میلیگرم در گرم وزن تر نمونه بیان شد (Chang et al., 2002).
برای سنجش آنتوسیانین برگها، عصارهها یک شب در دمای اتاق نگهداری شدند. میزان جذب نمونهها در طول موج 550 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر اندازهگیری (Wagner, 1979) و مقدار آنتوسیانین کل بر حسب میلیمول در گرم وزن تر محاسبه شد.
جهت استخراج آنزیمها، 1/0 گرم از بافت برگ توسط نیتروژن مایع در هاون سرد پودر شد. سپس 1 میلیلیتر بافر فسفات سدیم (5/0 مولار، 7pH=) به نمونه افزوده و به مدت 10 دقیقه روی یخ هموژنیزه شد. سپس، نمونهها در سانتریفیوژ یخچالدار با سرعت 12000 دور در دقیقه به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شدند و مایع رویی برای ارزیابی فعالیت آنزیمها و محتوای پروتئین مورد استفاده قرار گرفت.
برای تعیین فعالیت آنزیم کاتالاز، از روش Beers & Sizer (1952) استفاده شد و ثبت تغییرات جذب نور نمونه در طولموج 240 نانومتر به ﻣﺪﺕ ۲ ﺩﻗﻴﻘﻪ (ﻫﺮ 30 ﺛﺎﻧﻴﻪ ﻳﮏ ﺑﺎﺭ خواندن) انجام ﺷﺪ. فعالیت آنزیم کاتالاز براساس تجزیه ۱ میکرومول H₂O₂ در دقیقه به ازای هر میلیگرم پروتئین اندازهگیری شد.
همچنین جهت تعیین فعالیت آنزیم پراکسیداز از روش Herzog & Fahimi (1976) استفاده شد. سپس، جذب محلول در طول موج 470 نانومتر به مدت 2 دقیقه (هر 30 ثانیه یک بار خواندن) اندازهگیری شد. یک واحد پراکسیداز معادل با حداقل اکسید پیروگالول به ازای هر میلیگرم پروتئین بود. علاوه بر این، برای سنجش محتوای پروتئین کل از روش Bradford, 1976 استفاده شد. سپس جذب نمونهها درطول موج 595 نانومتر خوانده شد. در نهایت محتوای پروتئین کل توسط منحنی استاندارد سرم آلبومینگاوی (BSA) محاسبه و بر اساس میکروگرم بر گرم وزن تر گزارش شد.
آزمایشها به صورت یک آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی در 3 تکرار انجام شدند. نتایج توسط نرم افزار آماری SAS (نسخه 4/9) و مقایسه میانگینها توسط آزمون چند دامنهای دانکن در سطح احتمال پنج درصد انجام شد.
نتایج و بحث:
نتایج سنجش فاکتورهای رشدی گیاه آببشقابی
کاربرد برگی ZnO-NP و ZnSO4 در غلظتهای متفاوت، تأثیر قابل توجهی بر طول رانر و سطح برگ در گیاه دارویی آببشقابی دارد (جدول 1). در بین تیمارهای اعمالشده، تیمار ۲۵۰ میلیگرم در لیتر ZnSO4 بیشترین تأثیر مثبت را بر سطح برگ داشته است (3/121 سانتیمتر مربع)، که از نظر آماری تفاوت معنیداری با سایر تیمارها نشان داد. با این وجود، با افزایش غلظت ZnSO4، کاهش سطح برگ بهطور وابسته به غلظت مشاهده شد. در تیمار ZnO-NP به صورت مشابه، بهترین عملکرد در تیمار ۲۵۰ میلیگرم در لیتر مشاهده شد (75 سانتیمتر مربع)، با این وجود، افزایش غلظت به ۵۰۰ و ۱۰۰۰ میلیگرم در لیتر منجر به کاهش معنیدار سطح برگ شد.
تفاوت معنیداری بین اثر غلظتهای مختلف ZnSO4 و ZnO-NP بر طول رانر مشاهده نشد، اما تیمار ۵۰۰ میلیگرم در لیتر ZnO-NP با میانگین 37 سانتیمتر، بیشترین رشد را نسبت به سایر تیمارها نشان داد. با این وجود، در غلظت ۱۰۰۰ میلیگرم، کاهش قابلتوجهی در طول رانر (23/33 سانتیمتر) مشاهده شد.
این نتایج نشان دادند روی ممکن است به علّت آزادسازی مواد مغذی مورد نیاز برای گیاه، در افزایش رشد مؤثر باشد (Khanm, 2018). Ahmed et al. (2023) گزارش کردند که ارتفاع بوته و سطح برگ دو رقم گوجهفرنگی به طور قابل توجهی تحت تأثیر محلولپاشی کودهای Zn و ZnO-NP قرار گرفتند. همچنین این نانوذرات منجر به افزایش ارتفاع گندم در مقایسه با شاهد شد (Munir et al., 2018).
جدول ۱- مقایسه میانگین اثر غلظتهای مختلف سولفات روی و نانوذره اکسیدروی بر سطح برگ و طول رانر در گیاه آببشقابی.
Table 1– Comparison of the mean effects of different concentrations of zinc sulfate and zinc oxide nanoparticles on leaf area and runner length in Centella asiatica.
|
Treatment |
(cm2) Leaf Area |
(cm) Runner length |
|
ZnSo4 |
|
|
|
250 mg/L |
121.3a |
27.50a |
|
500 mg/L |
98.7b |
32.33a |
|
1000 mg/L |
59.7f
88.0c |
29.66a
30.66a |
|
Control |
||
|
ZnO-NP |
||
|
250 mg/L |
75.0d |
30.66a |
|
500 mg/L |
58.2g |
37.00a |
|
1000 mg/L |
63.2e |
23.33a |
در هر گروه تیماری، میانگینهای با حداقل یک حرف مشابه نشان دهنده عدم وجود اختلاف معنیدار در سطح احتمال پنج درصد توسط آزمون چند دامنهای دانکن است.
Means within each treatment group followed by at least one common letter are not significantly different at the 5% probability level according to Duncan’s multiple range test.
نتایج تست نشت الکتریکی و محتوای نسبی آب برگ
نتایج حاصل از بررسی تأثیر ZnO-NP و ZnSO4 در سه غلظت متفاوت (۲۵۰، 500 و ۱۰۰۰ میلیگرم در لیتر) بر دو شاخص فیزیولوژیک مهم گیاه آببشقابی یعنی محتوای نسبی آب برگ (RWC) و نشت الکتریکی (%EC)، نشاندهندهی اثرات معنادار و وابسته به غلظت تیمارها است (جدول 2).
در تیمار ZnSO4 ، بالاترین میزان RWC در غلظت ۲۵۰ میلیگرم در لیتر مشاهده شد (58/71%) که تفاوت معنیداری با تیمار شاهد (29/67%) نشان نداد. در غلظت 1000 میلیگرم در لیتر، مقدار RWC مجدداً افزایش یافت (56/63%) و در محدودهی مشابه شاهد قرار گرفت. در تیمار ZnO-NP، بیشترین RWC (72/71%) در غلظت 1000 میلیگرم در لیتر مشاهده شد. این یافته با پژوهشهای Semida et al. (2021) بر بادمجان و Al-Selwey et al. (2023) بر روی سیبزمینی مطابقت دارد که گزارش کردند ZnO-NP توسط بهبود پایداری غشاء و تنظیم روابط آبی سلولی، میتواند تحمل گیاهان به تنش را افزایش دهد.
الگوی EC در بین تیمارها تغییرات کمتری نسبت به RWC نشان داد. در تیمار ZnSO4 ، بیشترین میزان EC در غلظت 1000 میلیگرم در لیتر (77/17%) مشاهده شد که بهطور معنیداری بالاتر از سایر تیمارها بود. افزایش غلظت Zn²⁺ سبب ایجاد استرس اکسیداتیو و پراکسیداسیون لیپید و در نهایت منجر به آسیب غشاء و نشت یون میشود (Ahmed et al., 2023).
همچنین در تیمارZnO-NP ، EC در محدودهی 26/13-52/14% قرار داشت که اختلاف معنیداری با تیمار شاهد (80/10%) نشان نداد که این یافتهها نشان دادندZnO-NPs اثرات خفیفتری بر پایداری غشاء در مقایسه با ZnSO4 داشته باشند. سازوکار احتمالی این اثر وابسته به غلظت ZnO-NP، آزادسازی کنترلشده و تدریجی یون Zn²⁺ از نانوذرات است که از تجمع سریع و سمیت ناشی از آن جلوگیری میکند (Shirvani-Naghani et al., 2024).
جدول 2- مقایسه میانگین اثر غلظتهای مختلف سولفات روی و نانوذره اکسیدروی بر محتوای نسبی آب و نشت الکتریکی گیاه آببشقابی.
Table 2– Comparison of the mean effects of different concentrations of zinc sulfate and zinc oxide nanoparticles on relative water content and electrolyte leakage in Centella asiatica.
|
Treatment |
Relative Water Content (%) |
Electrolyte Leakage (%) |
|
ZnSo4 |
|
|
|
250 mg/L |
71.58a |
11.96cd |
|
500 mg/L |
55.97cb |
10.84d |
|
1000 mg/L |
63.56ab
67.29ab
|
17.77a
10.80d |
|
Control |
||
|
ZnO-NP |
||
|
250 mg/L |
45.11c |
13.45bc |
|
500 mg/L |
66.49ab |
14.52b |
|
1000 mg/L |
71.72a |
13.26bc |
در هر گروه تیماری، میانگینهای با حداقل یک حرف مشابه نشان دهنده عدم وجود اختلاف معنیدار در سطح احتمال پنج درصد توسط آزمون چند دامنهای دانکن است.
Means within each treatment group followed by at least one common letter are not significantly different at the 5% probability level according to Duncan’s multiple range test.
نتایج سنجش رنگیزههای فتوسنتزی
پژوهش حاضر نشان داد کاربرد ZnSO₄ و ZnO-NP در سطوح مختلف، تأثیر معناداری بر تجمع رنگیزههای فتوسنتزی در برگهای گیاه دارویی آببشقابی دارد (جدول 3). ZnO-NP در غلظت ۵۰۰ میلیگرم در لیتر بهترین عملکرد را در افزایش محتوای کلروفیل a، b، کل و کاروتنوئید داشت. این نتایج نشان دادند ZnO-NP در غلظت مناسب میتواند بهعنوان یک گزینه مؤثر در تحریک رشد و بهبود عملکرد فتوسنتزی گیاهان به ویژه گیاهان دارویی بهکار رود. ZnSO₄ نیز در غلظت ۵۰۰ میلیگرم عملکرد قابلقبولی از خود بهویژه در میزان کلروفیل a و b نشان داد، امّا اثربخشی آن نسبت به نانوذره کمتر بود. غلظت ۱۰۰۰ میلیگرم هر دو تیمار ZnSO₄ و ZnO-NP سبب کاهش معنادار در تمامی رنگیزهها شد که این میتواند ناشی از اثرات سمیت فلزی، بروز تنش اکسیداتیو یا تخریب ساختارهای کلروپلاستی باشد. همچنین نتایج ما با یافتههای Ruiz-Torres et al. (2021) مطابقت دارد، آنها گزارش کردند که غلظتهای بین 100 تا 300 میلیگرم بر کیلوگرم نانوذرات ZnSO4 و ZnO منجر به افزایش رنگدانههای فتوسنتزی و کاروتنوئیدها شد، امّا با افزایش غلظت، تجمع کلروفیل و کاروتنوئیدها کاهش یافت که نشان میدهد غلظت بالای Zn++ میتواند اثرات سمی ایجاد کند که بر بیوسنتز کلروفیل تأثیر میگذارد و به سیستم فتوسنتزی آسیب میرساند (Wang et al., 2016). نتایجSamreen et al. (2017) نشان داد تأمین روی توسط سیستم هیدروپونیک در گیاهان لوبیا منجر به افزایش محتوای کلروفیل و مواد معدنی شد. با این وجود، در سایر پژوهشها، افزودن ZnO-NP به خاک در غلظتهای بالا (400-800 میلیگرم بر کیلوگرم) اثرات مضری بر تجمع کلروفیلها و کاروتنوئیدها در برنج (Samart et al., 2017)، لوبیا و گوجهفرنگی (García-Gómez et al., 2017) نشان دادند. آنزیمهای مهمی مانند کربنیک انیدراز که هیدراتاسیون CO2 را کاتالیز میکند و انتشار دی اکسید کربن به مکانهای کربوکسیلاسیون را تسهیل میکند، حاوی اتم روی هستند، بنابراین روی برای بیوسنتز کلروفیل مورد نیاز است (Pullagurala et al., 2018)، امّا در غلظتهای بالا، میتواند تولید H2O2 و پراکسیداسیون لیپید را القاء کند و منجر به کاهش بیوسنتز رنگدانههای فتوسنتزی شود (Wang et al., 2018).
جدول 3- مقایسه میانگین اثر غلظتهای مختلف سولفات روی و نانوذره اکسیدروی بر محتوای رنگیزههای فتوسنتزی گیاه آببشقابی.
Table 3– Comparison of the mean effects of different concentrations of zinc sulfate and zinc oxide nanoparticles on photosynthetic pigments of Centella asiatica.
|
Treatment |
Chlorophyll a (mg.g-1 FW) |
Chlorophyll b (mg.g-1 FW) |
Total Chlorophyll (mg.g-1 FW) |
Carotenoids (mg.g-1 FW) |
|
ZnSo4 |
|
|
|
|
|
250 mg/L |
0.34c |
0.43c |
0.78d |
3.95b |
|
500 mg/L |
0.43b |
0.61b |
1.05b |
4.09b |
|
1000 mg/L |
0.34c
0.37c
|
0.16d
0.17d |
0.51e
0.54e |
3.40c
4.06b |
|
Control |
||||
|
Zn-ONP |
||||
|
250 mg/L |
0.42b |
0.47c |
0.89c |
4.10b |
|
500 mg/L |
0.50a |
0.68a |
1.18a |
4.86a |
|
1000 mg/L |
0.30d |
0.100e |
0.40f |
2.68d |
در هر گروه تیماری، میانگینهای با حداقل یک حرف مشابه نشان دهنده عدم وجود اختلاف معنیدار در سطح احتمال پنج درصد توسط آزمون چند دامنهای دانکن است.
Means within each treatment group followed by at least one common letter are not significantly different at the 5% probability level according to Duncan’s multiple range test.
نتایج فنول، فلاونوئید و آنتوسیانین
غلظتهای مختلف، اثر قابل توجهی بر محتوای فنول، فلاونوئید و آنتوسیانین در گیاه دارویی آببشقابی دارد (جدول ۴). در تیمارهای ZnSO₄ بیشترین میزان فنول در غلظت ۲۵۰ میلیگرم در لیتر مشاهده شد (7/۳۶ میلیگرم بر گرم وزن تر) که به طور معنیداری از سایر تیمارها بیشتر بود. افزایش غلظت به ۵۰۰ و 1000 میلیگرم در لیتر موجب کاهش سطح فنول شد. این کاهش نشاندهنده اثر منفی غلظت بالای ZnSO₄ بر تولید ترکیبات فنولی است. محتوای فلاونوئید در غلظتهای ۵۰۰ و ۱۰۰۰ میلیگرم در لیتر بالاترین مقادیر را نشان داد (به ترتیب 29/80 و 80/58 میلیگرم بر گرم وزن تر). میزان آنتوسیانین در تیمارهای ZnSO₄ در غلظتهای ۲۵۰ و ۵۰۰ میلیگرم در لیتر به ترتیب 27/7 و 23/7 میلیگرم بر گرم وزن تر بود که تفاوت معنیداری با یکدیگر نداشتند، امّا در غلظت ۱۰۰۰ میلیگرم در لیتر به شدت کاهش یافت (74/3 میلیگرم بر گرم وزن تر). همچنین در تیمارهای ZnO-NP روند متفاوتی مشاهده شد. بیشترین میزان فنول (5/50 میلیگرم بر گرم وزن تر)، بالاترین مقدار فلاونوئید (02/81 میلیگرم بر گرم وزن تر) و بیشترین میزان آنتوسیانین (9/ 16 میلیگرم بر گرم وزن تر) در غلظت ۱۰۰۰ میلیگرم در لیتر مشاهده شد که به طور معنیداری از سایر تیمارها بیشتر بود.
جدول 4- مقایسه میانگین اثر غلظتهای مختلف سولفات روی و نانوذره اکسیدروی بر فنول، فلاونوئید و آنتوسیانین گیاه آببشقابی.
Table 4 –Comparison of the mean effects of different concentrations of zinc sulfate and zinc oxide nanoparticles on phenolic, flavonoid, and anthocyanin content of Centella asiatica.
|
Treatment |
Phenol (mg.g-1 FW) |
Flavonoid (mg.g-1 FW) |
Anthocyanin (mg.g-1 FW) |
|
ZnSo4 |
|
|
|
|
250 mg/L |
36.7a |
50.90b |
7.27b |
|
500 mg/L |
33.0b |
80.29a |
7.23b |
|
1000 mg/L |
29.1c
25.0 c |
80.58a
48.42b
|
3.74d
4.26d |
|
Control |
|||
|
ZnO-NP |
|||
|
250 mg/L |
32.5b |
60.50b |
5.76c |
|
500 mg/L |
42.3ab |
75.90a |
7.85ᵇ |
|
1000 mg/L |
50.5a |
81.02a |
9.16a |
در هر گروه تیماری، میانگینهای با حداقل یک حرف مشابه نشان دهنده عدم وجود اختلاف معنیدار در سطح احتمال پنج درصد توسط آزمون چند دامنهای دانکن است.
Means within each treatment group followed by at least one common letter are not significantly different at the 5% probability level according to Duncan’s multiple range test.
بهطور کلی، کاربرد ZnO-NP در غلظت بالا (۱۰۰۰ میلیگرم در لیتر) موجب افزایش معنیدار همه ترکیبات فنولی، فلاونوئیدی و آنتوسیانینی در گیاه آببشقابی شد. این در حالی است که ZnSO₄ در غلظتهای بالا اثر منفی بر تولید این متابولیتهای ثانویه داشت. این یافتهها نشان دادند ZnO-NP به علّت سطح ویژه بالاتر و جذب بهتر، کارآمدی بیشتری نسبت به فرم یونی Zn2+ دارند و میتوانند تولید ترکیبات دارویی مهم در گیاه را تا غلظتهای بالاتر افزایش دهند. مطابق با نتایج این پژوهش، نانوذرات مورد بررسی در غلظتهای 1000 و 2000 میلیگرم محتوای فنل کل، فلاونوئیدها کل و ظرفیت آنتیاکسیدانی در فلفل چینی (Capsicum chinense) را افزایش دادند (García-López et al., 2019). افزایش ترکیبات فنولی در گیاهان تحت تنش یکی از راههای تحمل تنش و کاهش اثرات مضر آن است (Khandani et al., 2024a). ترکیبات فنلی نقش مهمی در سازوکارهای سمزداییROS به عنوان اهداکنندگان الکترون در ساختارهای اندامک دارند و میتوانند به طور مستقیم گونههای مولکولی اکسیژن فعال را حذف کنند که عمدتاً به علّت خواص اکسایش-کاهش آنها است (Mahendra et al., 2008). همچنین این ترکیبات فنلی در جذب و خنثیسازی رادیکالهای آزاد، از بین بردن اکسیژن تکی و سهتایی یا تجزیه پراکسیدها دخیل هستند (Canadanovic-Brunet et al., 2009). این رفتار، جمع فنولها و فلاونوئیدها را در گیاهانی که در معرض تیمار با ZnO-NP قرار گرفتهاند توضیح میدهد.
نتایج سنجش پروتئین و آنزیمهای آنتیاکسیدانی
ZnSO₄ و ZnO-NP در سه غلظت مختلف، اثرات قابلتوجهی بر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی و مقدار پروتئین کل در گیاه دارویی آببشقابی داشتند (جدول 5). بیشترین فعالیت کاتالاز در غلظت 1000 میلیگرم در لیتر ZnO-NP (2/44 بر میلیگرم پروتئین) و کمترین فعالیت آن در نمونه شاهد مشاهده شد. همچنین ۱۰۰۰ میلیگرم در لیتر ZnO-NP بالاترین فعالیت پراکسیداز (33/0 واحد فعالیت آنزیم بر میلیگرم پروتئین) را نشان داد که این افزایش فعالیت دو آنزیم دفاعی (کاتالاز و پراکسیداز) نشاندهنده پاسخ دفاعی گیاه به استرس ناشی از غلظت بالای نانوذرات است. علاوه بر این، غلظت بالای ZnSO4(1000 میلیگرم در لیتر) بر خلاف نانوذره، فعالیت آنزیمی پائینتری را نشان داد که میتواند ناشی از آسیب سلولی یا اختلال در تنظیم فعالیتهای آنزیمی باشد. Tirani et al. (2019) گزارش کردند که گیاهچههای تیمار شده با ZnO-NP، فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی از جمله پراکسیداز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، پلیفنل اکسیداز و بهویژه سوپراکسید دسموتاز را افزایش دادند و این امر را میتوان به محافظت بهتر در برابر ROS نسبت داد. با توجه به افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز که معمولاً در حضور H2O2 القا میشوند (Gechev et al., 2002) میتوان پیشنهاد کرد که تیمارهای نانوذرات توسط گیاهان آببشقابی به عنوان القاءکنندههای استرس، حس شدهاند که منجر به افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی برای محافظت از گیاهان در برابر ROS شده است.
بررسی تأثیر غلظتهای مختلف ZnSO₄ و ZnO-NP بر محتوای پروتئین کل گیاه آببشقابی نشان داد که تیمار ZnSO₄، در تمام غلظتهای استفاده شده سبب کاهش معنیداری نسبت به شاهد شد. در تیمار ZnO-NP، محتوای پروتئین در غلظتهای مختلف تقریباً مشابه بود و اختلاف معنیداری با شاهد نداشتند. همچنین در گیاه لوبیا کاهش محتوای پروتئین در تمام غلظتهای ZnSO₄ مشاهده شد ولی در تیمار ZnO-NP، فقط بالاترین غلظت آن (2000 میلیگرم در لیتر) سبب کاهش قابل توجهی در مقدار پروتئین شد .(Salehi et al., 2021) علاوه بر این، در شرایط تنش میزان محتوای پروتئین کاهش پیدا میکند (Khandani et al., 2024b)، این کاهش میتواند ناشی از استرس ناشی از افزایش غلظت روی باشد که منجر به اختلال در سنتز پروتئین و فعالیت متابولیکی سلول میشود (Ahmed et al., 2023).
جدول 5- مقایسه میانگین اثر غلظتهای مختلف سولفات روی و نانوذره اکسیدروی بر فعالیت آنزیمی و پروتئین گیاه آببشقابی.
Table 5– Comparison of the mean effects of different concentrations of zinc sulfate and zinc oxide nanoparticles on antioxidant enzyme activity and total protein content in Centella asiatica.
|
Treatment |
Catalase (U/ mg–1 protein) |
Peroxidase (U/mg–1 protein) |
Total Protein (umol. g-1 FW) |
|
ZnSo4 |
|
|
|
|
250 mg/L |
38.5a |
0.03c |
0.043b |
|
500 mg/L |
31.1b |
0.28a |
0.040b |
|
1000 mg/L |
19.6 c
20.7c |
0.01d
0.14bc |
0.056ab
0.065a |
|
Control |
|||
|
ZnO-NP |
|||
|
250 mg/L |
27.4c |
0.24c |
0.048ab |
|
500 mg/L |
37.8b |
0.26b |
0.057ab |
|
1000 mg/L |
44.2a |
0.33a |
0.043b |
در هر گروه تیماری، میانگینهای با حداقل یک حرف مشابه نشان دهنده عدم وجود اختلاف معنیدار در سطح احتمال پنج درصد توسط آزمون چند دامنهای دانکن است.
Means within each treatment group followed by at least one common letter are not significantly different at the 5% probability level according to Duncan’s multiple range test.
جمعبندی
یافتههای این پژوهش نشان داد که کاربرد برگی ZnSO₄ و ZnO-NP بر ویژگیهای ریختشناسی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه آببشقابی تأثیر معناداری دارد. اثرات مشاهدهشده بهطور قابل توجهی وابسته به نوع ترکیب روی و غلظت آن بود. در مجموع، تیمارهای با غلظتهای ۲۵۰ و ۵۰۰ میلیگرم در لیتر بهویژه در نانوذره، موجب بهبود شاخصهای رشدی، افزایش محتوای آب برگ، کاهش نشت الکتریکی، بهبود سنتز رنگیزههای فتوسنتزی و افزایش ترکیبات فنولی، فلاونوئیدی و آنتوسیانینی شدند. از سوی دیگر، در غلظت ۱۰۰۰ میلیگرم در لیتر بهویژه در تیمار ZnSO₄، منجر به کاهش شاخصهای عملکردی و افزایش علائم تنش شد، که خود را در کاهش رنگیزهها، افزایش نشت الکتریکی و کاهش متابولیتهای ثانویه نشان داد. فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی در پاسخ به نانوذرات در غلظت بالا افزایش یافت که بیانگر القای سیستم دفاعی گیاه در برابر استرس بود، در حالیکه در تیمار ZnSO₄، کاهش این فعالیت مشاهده شد. در نتیجه، ZnO-NP در غلظتهای بهینه میتوانند بهعنوان یک راهکار مؤثر برای بهبود عملکرد گیاهان دارویی باشد. بنابراین، تعیین غلظت بهینه در استفاده از عناصر ریزمغذی بهویژه در قالب نانو، نقش کلیدی در بهرهبرداری مؤثر و ایمن از این فناوری در کشاورزی نوین دارد.
تشکر و قدردانی
این پژوهش با حمایت مالی و پژوهانه معاونت پژوهشی دانشگاه بوعلی سینا انجام شده است که بدین وسیله مراتب قدردانی خود را اعلام می داریم.
)