نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زیستشناسی- فیزیولوژی گیاهی، دانشکده علوم، دانشگاه گلستان، گرگان، ایران
2 گروه تحقیقات خاک و آب، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی گلستان، گرگان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Azospirillum is one of the most important plant growth-promoting bacteria, with the ability to fix nitrogen. The current study aimed to investigate the physiological responses of rice plants with different nitrogen concentrations when inoculated with Azospirillum brasilense. In this experiment, the growth and physiological responses of 21-day-old rice seedlings (Oryza sativa L., cv. Hashemi) were investigated after 4 weeks of treatment with different nitrogen levels, including complete nitrogen (N), half (N/2), fourth (N/4), and zero nitrogen (control) concentrations under two inoculated (AB) and non-inoculated (NI) conditions. The experiment was conducted in a completely randomized design with 4 replications. The current data showed that nitrogen concentration significantly affects all measured parameters in both AB and NI plants. The highest values of growth traits, biomass accumulation, photosynthetic pigments, soluble sugars, and antioxidant enzyme activities (catalase and peroxidase) were observed in plants treated with full nitrogen and inoculated with A. brasilense. These findings highlight the potential of A. brasilense to enhance nitrogen efficiency in agricultural crops. Meanwhile, our data showed that inoculation with A. brasilense can improve rice plant productivity, especially under optimal nitrogen conditions.
Introduction
Rice (Oryza sativa) is a monocotyledonous plant that belongs to the Poaceae family. Rice is a strategic crop and the primary food source for more than half of the world’s population. The increase in rice cultivation areas in our country and the widespread use of chemical fertilizers have led to the emergence of various diseases. Today, the use of Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) is considered an alternative to chemical fertilizers. These bacteria are present in the rhizosphere of plants and enhance plant growth in various ways, including increasing nutrient absorption, producing plant hormones, and protecting plants against pathogens. These bacteria enhance mineral nutrient uptake by stimulating root system development. A group of PGPRs is called endophytes. Endophytes are non-pathogenic bacteria that spend part of their life cycle within plant tissues. So far, various types of nitrogen-fixing endophytes have been identified and reported in the stems, roots, and seeds of rice.
Azospirillum is one of the most important plant growth-promoting bacteria, capable of fixing nitrogen. Recently, this bacterium has been used as a biofertilizer, especially in areas facing nitrogen deficiency. By fixing atmospheric nitrogen and converting it into a usable form, Azospirillum brasilense improves nitrogen efficiency and reduces demand for chemical fertilizers. The current study aimed to investigate the physiological responses of rice seedlings to different nitrogen concentrations when inoculated with Azospirillum brasilense.
Methods and Materials
In this experiment, Azospirillum brasilense was prepared from the Soil Biology Laboratory of the Agricultural Research and Education Center of Golestan province. Then, the bacteria were cultured and identified on a specific RC medium. After selecting a single colony of the desired bacteria, the bacteria were cultured on NFB liquid medium at 30 °C for 48 hours. Rice seeds of the Hashemi cultivar were obtained from the National Rice Research Institute (AML). After surface sterilization, the seeds were placed on moist filter paper at 29 °C for germination. Then, the 7-day-old seedlings were transferred to Yoshida culture medium under a photoperiod of 18 h day (33 °C) and 6 h night (22 °C), with a relative humidity of 71%. In the next step, 21-day-old rice seedlings were treated with Yoshida medium containing nitrogen levels: complete nitrogen (N), half nitrogen (N/2), quarter nitrogen (N/4), and zero nitrogen (control) under two inoculation conditions: inoculated (AB) and non-inoculated (NI). After 4 weeks of treatment, the roots of rice seedlings were collected, and various growth parameters and several biochemical factors were examined. The experiment was conducted in a completely randomized design with four replications.
Results and Discussion Microscopic observations revealed that the bacteria first settled on the root epidermis and then entered the root cells. After passing through the epidermis, the bacteria penetrated the parenchyma layer and formed colonies. The results showed that small and large colonies, with single or scattered bacteria, were observed in the root cells. On the other hand, the current data showed that nitrogen concentration significantly affects all measured parameters in both AB and NI plants. The highest amount of root and shoot length, root fresh and dry weight, shoot dry weight, total dry and fresh weight, relative growth, soluble and total shoot sugar, chlorophyll b, and total chlorophyll were observed in the treatment with both full nitrogen concentration and inoculation with A. brasilense. Also, the present data revealed that seedlings inoculated with Azospirillum performed better than the non-inoculated samples.Meanwhile, current data showed that catalase enzyme activity increased with increased nitrogen concentration (in both inoculated and non-inoculated conditions). However, catalase enzyme activity was higher in inoculated seedlings at all nitrogen levels, compared to non-inoculated seedlings. These data indicate that inoculation with A. brasilense increases oxidative stress tolerance in rice seedlings. This evidence suggests that this bacterium improves plant resilience to treatment with different nitrogen concentrations and enhances their ability to scavenge reactive oxygen species (ROS) produced during nitrogen metabolism. The present data showed that peroxidase enzyme activity increased with higher nitrogen concentrations, in both inoculated and non-inoculated conditions.
Conclusion
The present results showed that inoculating rice seedlings with A. brasilense can significantly enhance their physiological responses. At all nitrogen concentrations, treatment improved the growth of inoculated plants, which showed higher protein content and enzyme activity compared to non-inoculated seedlings. These findings highlight the potential of A. brasilense to enhance nitrogen efficiency in crops. Meanwhile, our data showed that inoculation with A. brasilense can improve rice seedling productivity, especially under optimal nitrogen conditions.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
امروزه میکروارگانیسمها نقش مهمی را در کشاورزی پایدار ایفا میکنند. میکروارگانیسمها با افزایش جذب مواد مغذی، مقاومت در برابر تنشهای زیستی و غیرزیستی، بهبود سلامت خاک و حمایت از تنوع زیستی به عملکرد اکوسیستم کمک میکنند (Elsheikh et al., 2021).
اندوفیتها میکروارگانیسمهایی هستند که بدون ایجاد بیماری در بافتهای گیاهی زندگی میکنند. این موجودات با افزایش جذب مواد مغذی، تولید هورمونهای گیاهی و محافظت از گیاهان در برابر عوامل بیماریزا، رشد گیاه را افزایش میدهند (Prasad, 2023). باکتریهای اندوفیت به کمک سازوکارهای مختلف رشد گیاه را افزایش میدهند. این باکتریها فیتوهورمونهایی مانند اکسین، جیبرلین و سیتوکینین تولید میکنند که رشد ریشه را تحریک کرده و جذب مواد مغذی را بهبود میبخشند. این هورمونها با توسعه سیستم ریشه، گیاهان را قادر میسازند تا به آب و مواد مغذی بیشتری از خاک دسترسی پیدا کنند. علاوه بر این، اندوفیتها میتوانند فسفر را حل کرده و این ماده مغذی حیاتی را در دسترس گیاهان قرار دهند. آنها همچنین نیتروژن اتمسفر را که برای رشد گیاه ضروری است، تثبیت میکنند (Adeleke et al., 2021). باکتریهای اندوفیت همچنین سبب ایجاد مقاومت سیستمیک در گیاهان شده و در دفع پاتوژنها و آفات نقش دارند که این امر نیاز به آفتکشهای شیمیایی را کاهش داده و به کشاورزی پایدار کمک میکنند (Elsheikh et al., 2021; Prasad, 2023).
باکتری Azospirillum brasilense یک باکتری تثبیتکننده نیتروژن شاخص است که به طور گسترده به علّت نقش آن در تقویت رشد گیاهان، به ویژه در غلاتی مانند برنج، ذرت و گندم شناخته شده است. این باکتری به عنوان یک ریزوباکتری محرک رشد گیاه یا (PGPR) Plant Growth promoting hizobacteria طبقهبندی میشود که بر همکنشهای مفیدی را با ریشه گیاهان جهت رشد و افزایش جذب مواد مغذی و مقاومت در برابر تنش ایجاد میکند. به تازگی از این باکتری به عنوان کود زیستی، به ویژه در مناطقی که با کمبود نیتروژن مواجه هستند، استفاده میشود. توسط تثبیت نیتروژن اتمسفر و تبدیل آن به شکل قابل استفاده توسط A. brasilense، کارایی مصرف نیتروژن در گیاهان بهبود یافته و نیاز به کودهای شیمیایی کاهش مییابد (Zeffa et al., 2019).
نیتروژن (N) یکی از حیاتیترین مواد مغذی برای برنج است که فرآیندهای کلیدی مانند سنتز پروتئین، تجمع زیستتوده و رشد کلی گیاه را تحت تأثیر قرار میدهد. از نظر فیزیولوژیکی، نیتروژن مستقیماً بر روی رشد ریشه و اندام هوایی و همچنین توانایی گیاه در جذب سایر مواد مغذی تأثیر می گذارد (Xin et al., 2019). تثبیت زیستی نیتروژن یا (BNF) Biological Nitrogen Fixation فرآیندی است که در آن باکتریهایی مانند A. brasilense نیتروژن اتمسفر (N2) را به آمونیاک (NH3) تبدیل میکنند. این فرآیند برای گیاهان مختلف از جمله برنج از اهمیت خاصی برخوردار است. پژوهشها نشان داده است که A. brasilense میتواند جذب نیتروژن را به طور قابل توجهی در برنج افزایش دهد و در نتیجه منجر به عملکرد بالاتر و بهبود کارایی مصرف نیتروژن شود (Thomas et al., 2019).
پژوهشگران نشان دادهاند تلقیح گیاه برنج با A. brasilense سبب افزایش زیست توده بخش هوایی در مراحل حیاتی رشد مانند تولید برگ و پرکردن دانه شود (García et al., 2010). همچنین نتایج برخی دیگر از پژوهشگران نشان داده که تلقیح همزمان گیاهانی مانند برنج، گوجه فرنگی و فلفل قرمز با باکتریهایی مانند Methylobacterium oryzae و A. brasilense سبب افزایش غلظت نیتروژن و فسفر در این گیاهان شده و همچنین فعالیت آنزیمهای نیتروژناز و فسفاتاز را افزایش میدهد (Madhaiyan et al., 2010). پژوهشهای انجام شده بر روی گیاه ذرت نشان داده که تیمار توام کود نیتروژن به همراه تلقیح با A. brasilense سبب افزایش رشد، محتوای کلروفیل و فعالیت آنزیمهای کلیدی میشود. این پژوهش نشان داد تلقیح گیاهان با A. brasilense، زمانی که با تیمار کود نیتروژن همراه شود، رشد گیاه و سلامت خاک را افزایش میدهد (Morais et al., 2021). نتایج پژوهشهای انجام شده بر روی گیاه گندم تلقیح شده با A. brasilense که به طور همزمان با سه سطح مختلف کود نیتروژن نیز تیمار شده بودند نشان داد که تلقیح سبب افزایش جذب نیتروژن، فعالیت آنزیم نیترات ردوکتاز و گلوتامینسنتتاز و محتوای کلروفیل شده است. همچنین این پژوهشگران نشان دادند که حتی در گیاهانی که با سطوح پائین نیتروژن تیمار شده بودند، تلقیح باکتری سبب افزایش رشد در این گیاهان میشود (Silveria et al., 2016). سایر پژوهشها نیز نشان دادند تیمار توام غلظتهای مختلف نیتروژن و تلقیح با A. brasilense بر رشد گیاه و تبادل گاز در گیاه ذرت تأثیر دارد. نتایج این پژوهش نشان داد غلظتهای بالاتر نیتروژن در ترکیب با تلقیح باکتریایی، فتوسنتز، هدایت روزنهای و شاخصهای رشد گیاه مانند قطر ساقه و سطح برگ را به طور قابل توجهی بهبود میبخشد (Palheta, 2021). از سوی دیگر، نتایج پژوهشهای دیگر پژوهشگران نیز نشان داد که تلقیح توام گیاهچههای برنج با باکتری A. brasilense به همراه تیمار هورمونی سبب افزایش شاخصهای رشدی در گیاه برنج میشود (Sharifalsadat et al., 2023).
برنج یکی از مهمترین محصولات کشاورزی در سراسر جهان است که بیش از نیمی از جمعیت جهان از آن تغذیه میکنند. قاره آسیا بیش از 90 درصد از تولید جهانی برنج را به خود اختصاص داده است (Fukagawa & Ziska, 2019). برنج مانند همه محصولات زراعی برای رشد، نمو و عملکرد مناسب نیاز به تأمین متعادلی از عناصر درشت مغذی و ریز مغذی دارد. نیتروژن یک ماده مغذی حیاتی برای رشد و عملکرد برنج است. این عنصر برای رشد برگ و تشکیل کلروفیل ضروری بوده و در فتوسنتز نقش دارد (White & Brown, 2010). هدف از پژوهش حاضر بررسی اثر غلظتهای مختلف نیتروژن بر پاسخهای فیزیولوژیکی گیاهان برنج تلقیح شده با باکتری اندوفیت A. brasilense است. این پژوهش به بررسی چگونگی تأثیر سطوح مختلف نیتروژن بر رشد، فعالیتهای آنزیمی و فاکتورهای بیوشیمیایی در گیاهان برنج، با تمرکز بر نقش بالقوه A. brasilense در تخفیف اثرات ناشی از کمبود نیتروژن میپردازد.
مواد و روشها
خالصسازی و آمادهسازی کشت باکتری: به این منظور، باکتریها به شکل یک کلنی منفرد از روی محیط کشت اختصاصی RC جامد شناسایی شده و برای خالصسازی در محیط کشت مایع Nfb غنیشده با مقدار یک گرم در لیتر کلرور آمونیوم، در انکوباتور (30 درجه سانتیگراد) رشد داده شدند. پس از 48 ساعت، باکتریها بر اساس تولید هاله سفید- رنگ (که نشان دهنده رشد آنها است) شناسایی و به مدت 20 دقیقه در 5000 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. سپس محلول رویی حذف شده و سپس توده باکتری توسط محلول بافر فسفات نمکی (شامل 2/0 گرم KH2PO4، 15/1 گرم K2HPO4 و 5/7 گرم NaCl در 1000سیسی آب با 2/7pH=) دو بار شستشو شدند. سپس با افزودن بافر فسفات نمکی به توده باکتری جذب نوری محلول در طول موج 540 نانومتر برابر 05/1 تنظیم شد. در این وضعیت غلظت باکتری CFU/ml 109 است، که با رقیقکردن مداوم این محیط و مطابقت با معیار مک فارلند، غلظت CFU/ml 106 بدست آمد. برای اطمینان، رقتهایی از غلظتهای فوق تهیه شده و بر روی محیط کشت RC کشت شدند. شمارش کلنی و ضرب تعداد آن در ضریب رقت، غلظت CFU/ml 106 را تأئید کرد.
کشت بذر و تولید گیاهچه: بذر برنج (Oryza sativa L.) رقم هاشمی از موسسه تحقیقات برنج کشور (آمل) تهیه شد. سپس بذرها با آب ژاول 3% به مدت 5 دقیقه و به دنبال آن با اتانول 96 % به مدت 30 ثانیه به خوبی ضدعفونی شدند. پس از 3 بار شستشو با آب مقطر استریل، بذرها بر روی کاغذ صافی مرطوب در دمای 29 درجه سانتیگراد قرار گرفتند تا جوانه زنی صورت گیرد. پس از انتقال گیاهچههای 7 روزه به محیط کشت یوشیدا (Yoshida & Coronel, 1975)، در اتاق کشت با درجه حرارت حداقل و حداکثر در شب و روز به ترتیب 22 و 33 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 70 درصد وumolm-2s-1 720 Photosynthetic photon folx با طول موج بین 700-400 نانومتر نگهداری شدند. به طور روزانه pH محلول غذایی یوشیدا بر روی 2/0 ± 6 تنظیم و در پایان هر هفته محلولهای غذایی تعویض شدند. گیاهچهها پس از دو هفته آماده تلقیح با باکتری A. brasilense شدند.
تلقیح باکتری: در ادامه گیاهچههای (21 روزه) از محیط کشت یوشیدا خارج و در سوسپانسیون حاوی A. brasilense با غلظت 100 باکتری در هر میلیلیتر قرار داده شدند. پس از 24 ساعت مجددا گیاهچهها به محیط کشت یوشیدا حاوی غلظت های مختلف نیتروژن (کامل، یک دوم، یک چهارم و فاقد نیتروژن یا شاهد) منتقل شدند. منبع اصلی نیتروژن در محیط کشت یوشیدا نیترات آمونیوم است که در این آزمایش جهت بررسی اثر غلظتهای مختلف نیتروژن از غلظتهای مختلف نیترات آمونیوم به صورت کامل، یک دوم، یک چهارم و بدون نیترات آمونیوم (شاهد یا کنترل) در محیط کشت استفاده شد. پس از چهار هفته رشد در شرایط اتاقک کشت، گیاهچهها برداشت شده و فاکتورهای مختلف رشد و بیوشیمیایی مورد بررسی قرار گرفتند.
مشاهدات میکروسکوپی: برای اطمینان از ورود باکتری به ریشه، رنگ آمیزی ساده آنیلین بلو انجام شد. جهت انجام آن ریشه گیاهچهها به مدت 5 دقیقه در آب مقطر قرار داده شده و سپس با آنیلین بلو 05/0 به مدت 3 الی 5 دقیقه رنگآمیزی شدند. پس از سه بار شستشو با آب مقطر، نمونهها نمونهها با میکروسکوپ نوری مجهز به دوربین دیجیتال (BH2, Olympus, Japan) با بزرگنمایی 100× مورد بررسی و عکسبرداری شدند.
اندازهگیری وزن خشک و تر نمونهها: پس از نمونهبرداری، وزن خشک و تر ریشه و اندام هوایی در کلیه تیمارها به طور جداگانه اندازهگیری شد. برای تعیین وزن تر نمونهها با ترازو توزین شدند و برای تعیین وزن خشک نمونهها در دستگاه آون در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت سه روز خشک شده و مجددا با ترازو توزین شدند.
اندازهگیری سرعت رشد نسبی: سرعت رشد نسبی گیاه بر اساس وزن خشک کل در روز و با استفاده از معادله زیر محاسبه شد:
|
|
PGR= (ln W₂- ln W₁) / (T2-T₁) |
که در آن PGR سرعت رشد نسبی، W2 وزن خشک نهایی بعد از تیمار، W وزن خشک گیاه یک روز بعد از تیمار و T نشاندهنده روزهای تیمار در روزهای 1و ۲۸ است.
سنجش قندهای محلول: سنجش قندهای محلول به روش McCready et al. (1950) صورت گرفت. در ابتدا به 05/0 گرم از پودر خشک نمونهها پنج میلی لیتر اتانول 70% اضافه و به مدت یک هفته دریخچال نگهداری شد. سپس عصاره موردنظر به مدت 15 دقیقه در 10000 دور در دقیقه ودر دمای اتاق سانتریفیوژ شد. از سوپرناتانت (محلول بالایی) برای سنجش قندهای محلول استفاده شد. در نهایت طول موج نمونهها در 485 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری شده و مقدار قند محلول نمونهها توسط منحنی استاندارد گلوکز و براساس میلیگرم بر گرم وزن خشک گیاه محاسبه شد.
پروتئین محلول: ابتدا مقدار 1/0 گرم از بافت تر ریشه در هاون چینی با دو میلیلیتر بافر فسفات 1/0 مولار با 8/6 = pH هموژن شده و سپس به مدت ۱۵ دقیقه در 13000 دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. از فاز بالایی عصاره بهدست آمده برای اندازهگیری پروتئین محلول به روش Bradford (1976) و توسط رنگ کوماسی برلیانت بلو انجام شد. در این آزمایش مقدار جذب نمونهها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج ۵۹۵ نانومتر اندازهگیری شد. در ادامه مقدار پروتئین محلول نمونهها توسط منحنی استاندارد آلبومین محاسبه شد.
پروتئین کل: استخراج پروتئین کل توسط روش مارکول انجام شد (Markwell et al., 1981). در این روش مقدار 05/0 گرم بافت تر ریشه با 1 میلیلیتر بافر تریس 100 میلیمولار با 9=pH حاوی EDTA 1 میلیمولار، PMSF 1 میلیمولار، Triton 1/0 درصد و PVPP 06/0 درصد در هاون چینی سرد سائیده شد و در g 15000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس مقدار 100 میکرولیتر از عصاره پروتئینی استخراج شده با 3 میلیلیتر معرف مخلوط و به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق قرار داده شد. در ادامه مقدار 300 میکرولیتر از معرف فولین رقیقشده به آن اضافه و به شدت ورتکس شد. پس از 45 دقیقه جذب در طول موج 750 نانومتر خوانده شد. در این آزمایش منحنی استاندارد توسط سرم آلبومین رسم شد.
اندازه گیری فعالیت آنزیم های کاتالاز و پراکسیداز
تهیه عصاره آنزیمی: مقدار 05/0 گرم از بافت ریشه در یک هاون چینی سرد (که بر روی ظرف یخ قرار داده شده بود) با دو میلی لیتر بافر فسفات 1/0 مولار (8/6 pH=) سائیده شده و سپس به مدت 15 دقیقه در 16000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. از فاز رویی برای اندازهگیری فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز استفاده شد (Kar & Mishra, 1976).
اندازهگیری فعالیت کاتالاز در مد سینتیک و در طول موج 240 نانومتر انجام شد (Maehly & Chance, 1954). جهت این کار، به۱۰۰ میکرولیتر از عصاره آنزیمی، سه میلیلیتر مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی مولار با 8/6 pH=، آب اکسیژنه ۱۵ میلی مولار اضافه شد.
فعالیت آنزیم پراکسیداز محلول نیز در مد سینتیک و در طول موج 471 نانومتر اندازهگیری شد. در این آزمایش معرف مورد نیاز گایاکول است. جهت انجام کار، به 51 میکرولیتر عصاره آنزیمی مقدار 3 میلیلیتر مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 25 میلی مولار (8/6 pH=)، گایاکول 21 میلی مولار،آب اکسیژنه 41 میلی مولار اضافه شد. در نهایت فعالیت آنزیمی(پراکسیداز وکاتالاز) براساس معادله زیر محاسبه شد:
Activity (U/mL) = (ΔA / (Ɛ × d)) × V
که در این معادله ΔA برابر با تغییر جذب نور در دقیقه، Ɛ برابر با ضریب خاموشی مولی گایاکول، d برابر با طول مسیر نور (معمولاً 1 سانتیمتر) و V برابر با حجم نهایی مخلوط واکنش (بر حسب میلیلیتر) است.
اندازهگیری فسفر و نیتروژن
عصارهگیری: ابتدا مقدار 1 گرم از نمونههای پودر شده را در بوتههای چینی ریخته و سپس به مدت ۱۲-۴ ساعت در کورهی الکتریکی با دمای ۵۵۰ درجه سانتیگراد سوزانده شده تا به خاکستر تبدیل شوند. پس از سردشدن کامل نمونهها، آب مقطر به همراه 5 میلی لیتر اسید کلریدریک 2 نرمال به خاکستر به آن اضافه شد. نمونهها به مدت نیم ساعت در حمام آبی در دمای ۱۰۰ درجه سانتیگراد حرارت داده شدند و سپس محتویات بوته به بالن ژوژه۵۰ میلیلیتری منتقل و با آب مقطر به حجم ۵۰ میلی لیتر رسانده شدند. در انتها نمونهها توسط کاغذ واتمن ۴۲ صاف شده و در ظروف پلاستیکی کوچک دربدار در یخچال تا زمان مصرف نگهداری شدند (Ugulu, 2015).
برای اندازهگیری فسفر، 5 میلیلیتر عصاره گیاهی به یک فلاسک 25 میلیلیتری منتقل و به آن پنج میلیلیتر محلول آمونیوم وانادات اضافه شد. مقدار جذب نمونهها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 470 نانومتر اندازهگیری شد. همچنین مقدار فسفر توسط منحنی استاندارد فسفات پتاسیم محاسبه شد (Olsen & Wateanabe, 1963).
نیتروژن کل: در این توسط اسید سولفوسالیسیلیک غلیظ، کل ترکیبات حاوی نیتروژن موجود در بافتهای گیاهی، در اثر حرارت و مجاورت با کاتالیزور به سولفات آمونیوم تبدیل شده و سپس با تقطیر مخلوط حاوی سولفات آمونیوم و در مجاورت سود 10 نرمال، گاز آمونیاک متصاعد می شود که بعد از سرد شدن توسط اسید بوریک جمع آوری شده وبا استفاده از یک اسید رقیق تیتر شد. حجم اسید مصرفی متناسب با مقدار نیتروژن موجود در نمونههای گیاهی است (Kjeldahl, 1983).
رنگیزههای فتوسنتزی: ابتدا پنج گرم بافت تازه گیاهی در هاون با 10 میلی لیتر استون 80% هموژن و سپس مخلوط به دست آمده به مدت 10 دقیقه در 2000 دور سانتریفیوژ شد. جذب نمونهها در طول موج 480، 510، 645 و 663 نانومتر خوانده و مقدار رنگیزهها محاسبه شد (Arnon, 1949).
تحلیل آماری: در این پژوهش کلیه سنجشها در 4 تکرار انجام شد. تجزیه و تحلیل دادهها توسط نرم افزار SPSS 16 با آزمون ANOVA دو طرفه (کمترین تفاوت معنی دارLSD) با سطح معنیداری 05/0< P انجام شد. علاوه بر این، از نرم افزار Excel برای رسم نمودارها استفاده شده است.
نتایج
مشاهدات میکروسکوپی
نتایج حاصل از مشاهدات میکروسکوپی نشان داد که ابتدا باکتریها در سطح لایهی اپیدرم ریشه مستقر شده و پس از آن باکتریها به درون سلولهای ریشه راه یافتند. پس از عبور از لایه اپیدرم، باکتریها به لایه پارانشیم نفوذ کرده و کلنی تشکیل دادند. در نهایت کلنیهای کوچک و بزرگ و با آرایش منفرد و پراکنده از باکتریها در سلولهای ریشه مشاهده شد (شکل 1).
شکل 1- تشکیل کلنی باکتریایی در ریشه گیاه برنج تلقیح یافته با باکتری A.brasiliensis بعد از 24ساعت
Figure 1- Colony formation in rice root inoculated with Azosperilum braziliensis after 24 hours
فاکتورهای رشد
بررسی و تحلیل دادههای به دست آمده نشان داد که اثر تیمار غلظتهای مختلف نیتروژن بر صفات رشدی مورد بررسی معنیدار است. علاوه بر این، با افزایش غلظت نیتروژن در محیط کشت، صفات مورد بررسی افزایش معنیداری را در مقایسه با نمونه شاهد نشان دادند. بالاترین مقدار صفات رشدی اندازهگیری شده در تیمار با نیتروژن کامل (N) مشاهده شد. همچنین کمترین مقدار فاکتورهای رشد در نمونه شاهد (محیط کشت فاقد نیتروژن) مشاهده شد. از سوی دیگر، این نتایج نشان داد در تیمار شاهد تلقیح گیاهچهها تحت آزوسپریلوم (AB)، سبب افزایش معنیدار در فاکتورهای رشد نشده است. همچنین بررسی دادهها در سایر نمونهها نیز نشان داد که تفاوت معنیداری در مقدار فاکتورهای رشد در نمونههای تلقیح شده با آزوسپریلوم در مقایسه با نمونه تیمار نشده در همان غلظت نیتروژن تیمار شده وجود ندارد. بهترین مقدار فاکتورهای رشد در تیمار غلظت کامل نیتروژن و در نمونههای تلقیح شده با آزوسپریلوم مشاهده شد (جدول 1).
فاکتورهای بیوشیمیایی
نتایج حاصل از اندازهگیری مقدار قند محلول در اندام هوایی گیاهچههای برنج هاشمی تلقیح شده و تلقیح نشده با A. brasilense در تیمار با غلظتهای مختلف نیتروژن (نیتروژن کامل، یک دوم نیتروژن و یک چهارم نیتروژن) نشان داد که سطوح قند با افزایش غلظت نیتروژن در هر دو تیمار تلقیح یافته و تلقیح نشده افزایش یافته است (شکل 2). همچنین نتایج نشان داد گیاهچههای در شرایط تلقیح یافته محتوای قند بالاتری نسبت به گیاهچههای تلقیح نشده داشتند. از سوی دیگر، نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که در تیمار با غلظت یک چهارم نیتروژن (N/4) مقدار قند محلول در هر دو نمونه تلقیح شده و تلقیح نشده اختلاف معنیداری را با یکدیگر نشان نمیدهند. بالاترین مقدار قند محلول (53/6 میلی گرم در هر گرم وزن تر) در گیاهچههای تیمار شده با نیتروژن کل و در تلقیح با باکتری مشاهده شد (شکل A2).
نتایج حاصل از بررسی مقدار قند محلول در ریشه در گیاهچههای تیمار شده با غلظت های مختلف نیتروژن در شرایط تلقیح شده و تلقیح نشده نشان داد که مقدار قند محلول در ریشه گیاهچهها با افزایش غلظت نیتروژن در هر دو گروه افزایش مییابد. همچنین نتایج حاضر نشان داد که اختلاف معنیداری در غلظتهای تیمار شده در ریشه گیاهچههای تلقیح شده نسبت به گیاهچههای تلقیح نشده وجود دارد. همچنین با افزایش غلظت نیتروژن، مقدار قند محلول در نمونهها افزایش نشان داد. از سوی دیگر، در بالاترین غلظت نیتروژن به کار رفته (N) در بین دوگروه تلقیح شده و تلقیح نشده تفاوت معنیداری دیده نمیشود. آنالیز بیشتر نتایج نشان داد که در گروه کنترل، مقدار قند محلول در ریشهی گیاهچههای تلقیح شده بالاتر از نمونه تلقیح نشده بوده و تفاوت معنیداری را نسبت به یکدیگر نشان میدهند. دادههای حاضر نشان داد که بالاترین مقدار قند محلول (98/8 میلیگرم در هر گرم وزن تر) در گیاهچههای تیمار شده با نیتروژن کل و در تلقیح با باکتری مشاهده شد. پائینترین مقدار قند محلول ( 85/0 میلیگرم در هر گرم وزن تر) نیز در تیمار شاهد و در نمونه های تلقیح نشده مشاهده شد (شکل B2).
بررسی مقدار قند کل در اندام هوایی گیاهچههایی که در تیمار با غلظتهای مختلف نیتروژن قرار گرفته بودند، نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن در محیط کشت مقدار قند کل در اندام هوایی گیاهچهها افزایش یافت. از سوی دیگر، در تیمار شاهد و نیز نمونههای تیمار شده با غلظتهای یک چهارم (N/4) و نصف (N/2) تفاوت معنیداری بین نمونههای تلقیح شده با گیاهچههای تلقیح نشده با باکتری وجود ندارد. بالاترین مقدار قند کل در نمونههایی که به طور همزمان با نیتروژن کامل (N) و باکتری تلقیح شدهاند مشاهده شد. در این آزمایش بالاترین مقدار قند کل (65/17 میلیگرم در هر گرم وزن تر) در گیاهچههای تیمار شده با نیتروژن کل و در تلقیح با باکتری مشاهده شد (شکل C2). اندازهگیری و بررسی مقدار قند کل ریشه در گیاهچههای برنج هاشمی تیمار شده با غلظتهای مختلف نیتروژن نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن مقدار قند کل در ریشه گیاهچهها نیز افزایش پیدا میکند (شکل D2). همچنین نتایج نشان دادند ریشه گیاهچههای تلقیح شده در مقایسه با ریشه گیاهچههای تلقیح نشده دارای مقدار قند کل بیشتری هستند. بر اساس نتایج حاضر، تفاوت معنیداری بین نمونههای تلقیح شده و تلقیح نشده در هر غلظت از نیتروژن تیمار شده وجود ندارد (شکل D2).
جدول 1- مقایسه اختلاف میانگین صفات رشد در گیاهچههای برنج رقم هاشمی (Oryza sative) در تیمار با غلظتهای مختلف نیتروژن و تلقیح با باکتری آزوسپریلوم برازیلنس .(Azospirillum brazilense) نتایج میانگین 4 تکرار است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنیداری در سطح 5% توسط آزمون کمترین تفاوت معنیدار (LSD) نشان نمیدهند. Ctrl: کنترل؛ N/4: یک چهارم غلظت نیتروژن؛ N/2: نیمی از غلظت نیتروژن؛ N: غلظت نیتروژن کامل؛ AB: در شرایط تلقیح یافته؛ NI: در شرایط تلقیح نشده.
Table 1- Mean comparison of the growth parameters in rice seedlings (Hashemi cultivar) in treatment with different concentrations of Nitrogen and inoculation with Azospirillum brazilense. The results are the average of 4 replicates. Different letters show significant differences according to LSD test at P ≤ 0.05. Ctrl: Control, N/4: ¼ Nitrogen concentrations, N/2: ½ Nitrogen concentrations, N: Full Nitrogen concentration, AB: Inoculated with Azospirillum brazilense, NI: Without Inoclusion.
|
Growth parameters |
AB/NI |
N |
N/2 |
N/4 |
Ctrl |
|
Root length |
AB |
12/92±0/01 a |
11/43±0/66 bc |
9/64±067 c |
6/05±0/40 de |
|
|
NI |
10/48±0/06 ab |
9/46±0/67 bc |
7/5±0/01cd |
4/87±0/83 de |
|
Aerial part length |
AB |
28/61±0/18 a |
26/47±0/78 bc |
19/98±0/19 cd |
16/76±0/59 de |
|
|
NI |
24/09±0/05 ab |
22/72±1/51 bc |
18/83±0/16 cd |
14/4±0/95 de |
|
Fresh Root weight |
AB |
78/48±/012 a |
73/47±1/19b |
69/63±0/66 c |
64/44±0/34 e |
|
|
NI |
72/4±0/14 ab |
67/13±1/08bc |
64/27±0/85 cd |
59/59±1/21de |
|
Aerial part fresh weight |
AB |
16/62±1/15 ab |
15/34±1/18bc |
14/04±1/46 cd |
13/47±0/65 de |
|
|
NI |
14/95±0/47 ab |
13/24±0/30bc |
11/21±0/25 cd |
10/23±0/95 de |
|
Root dry weight |
AB |
0/57±0/012 a |
0/53±0/015b |
0/5±0/008 c |
0/44±0/01 de |
|
|
NI |
0/44±0/006 ab |
0/42±0/012bc |
0/4±0/008 cd |
0/36±0/008 de |
|
Aerial part dry weight |
AB |
1/71±0/027 a |
1/63±0/028b |
1/55±0/012 c |
1/38±0/07 e |
|
|
NI |
1/49±0/026 ab |
1/42±0/023bc |
1/41±0/012 cd |
0/99±0/07 de |
|
Total dry weight |
AB |
19/42±0/064 a |
18/2±0/20b |
17/19±0/23 c |
15/79±0/6 e |
|
|
NI |
17/28±0/095 ab |
16/33±0/46bc |
14/32±0/20 cd |
13/52±0/58 de |
|
Total fresh weight |
AB |
95/39±0/10 a |
88/77±0/57b |
84/56±0/68 c |
76/53±2/34 de |
|
|
NI |
86/49±0/26 ab |
80/47±0/43bc |
76/66±0/39 cd |
72/83±1/82 de |
|
Relative growth |
AB |
0.60±0.02 a |
0.55±0.04 c |
0.52±0.07 c |
0.45±0.03 e |
|
|
NI |
0.53±0.072 ab |
0.51±0.048 cd |
0.46±0.051 cd |
0.39±0.023 de |
نتایج حاصل از سنجش مقدار پروتئین محلول در ریشه گیاهچههای مورد بررسی نشان داد که در هر دو گروه گیاهچههای تلقیح شده و تلقیح نشده، با افزایش غلظت نیتروژن مقدار پروتئین محلول در ریشه افزایش مییابد. همچنین نتایج حاضر نشان دادند، اگر چه مقدار پروتئین محلول ریشه در تمام غلظتها در گیاهچههای تلقیح شده در مقایسه با گیاهچههای تلقیح نشده بالاتر هستند، امّا تفاوت معنیداری بین این دو گروه وجود ندارد. بالاترین مقدار پروتئین محلول در گیاهچههای تلقیح شده با باکتری که با غلظت کامل نیتروژن تیمار شدهاند به مقدار 72/0 میلیگرم در هر گرم وزن تر مشاهده شد (شکل A3). از سوی دیگر نتایج حاصل نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن در محیط کشت، مقدار پروتئین کل افزایش مییابد، امّا تفاوت معنیداری بین نمونههای تلقیح شده و تلقیحنشده با باکتری وجود ندارد. در این آزمایش بالاترین مقدار پروتئین کل (5/7 میلیگرم در هر گرم وزن تر) در گیاهچههای تیمار شده با نیتروژن کل و در تلقیح با باکتری مشاهده شد. همچنین پائینترین مقدار پروتئین کل ( 5/3 میلیگرم در هر گرم وزن تر) نیز در تیمار شاهد و در نمونههای تلقیح نشده مشاهده شد (شکل B3).
آنزیمهای آنتی اکسیدانت
بررسی فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمارهای مختلف نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن فعالیت آنزیم افزایش مییابد. همچنین این نتایج نشان داد که تلقیح گیاهچهها با باکتری آزوسپریلیوم سبب افزایش معنیدار در فعالیت آنزیم کاتالاز در مقایسه با نمونههای تلقیح نشده میشود. علاوه بر این، بالاترین میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (8/2 میکرومول در دقیقه در هر گرم وزن تر) در گیاهچههای تیمار شده با غلظت کامل نیتروژن و در تلقیح با باکتری دیده شده است. با این وجود، پائینترین میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (32/1 میکرومول در دقیقه در هر گرم وزن تر) در گیاهچههای شاهد تلقیح نشده دیده شده است (شکل A4). بررسی فعالیت آنزیم پراکسیداز در گیاهچه های برنج هاشمی تلقیح شده و تلقیح نشده با A. brasilense در غلظتهای مختلف نیتروژن نشان داد با افزایش غلظت نیتروژن میزان فعالیت آنزیم نیز افزایش یافته و تفاوت معنیداری بین نمونههای مختلف وجود دارد. نتایج حاضر نشان داد که بالاترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز ( 75/20 میکرومول در دقیقه در هر گرم وزن تر) در گیاهچههای تیمار شده با غلظت کامل نیتروژن و در تلقیح با باکتری دیده شده است. از سوی دیگر، پائینترین میزان فعالیت این آنزیم (60/9 میکرومول در دقیقه در هر گرم وزن تر) گیاهچههای شاهد تلقیح نشده دیده شده است (شکل B4).
شکل 2- مقدار قند محلول در اندام هوایی، قند محلول در ریشه، قند کل در اندام هوایی و قند کل در ریشه در گیاهچههای برنج (Oryza sative) رقم هاشمی در تیمار با غلظتهای مختلف نیتروژن و تلقیح با باکتری آزوسپریلوم برازیلنس .(Azospirillum brazilense) نتایج میانگین 4 تکرار است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنیداری در سطح 5% توسط آزمون کمترین تفاوت معنیدار (LSD) نشان نمیدهند. Ctrl: کنترل؛ N/4: یک چهارم غلظت نیتروژن؛ N/2: نیمی از غلظت نیتروژن؛ N: غلظت نیتروژن کامل؛ AB: در شرایط تلقیح یافته؛ NI: در شرایط تلقیح نشده.
Figure 2- The amount of Aerial part soluble sugar, Root soluble sugar, Aerial part total sugar and Root total sugar in rice seedlings Hashemi Cultivar inoculated or uninoculated with A. brasiliensis in treatment with different concentarations of Nitrogen. The results are the average of 4 replicates. Different letters show significant differences according to LSD test at P ≤ 0.05. Ctrl: Control, N/4: ¼ Nitrogen concentrations, N/2: ½ Nitrogen concentrations, N: Full Nitrogen concentration, AB: Inoculated with Azospirillum brazilense, NI: Without Inoclusion.
شکل 3- مقدار پروتئین محلول و پروتئین کل در گیاهچههای برنج (Oryza sative) رقم هاشمی در تیمار با غلظتهای مختلف نیتروژن و تلقیح با باکتری آزوسپریلوم برازیلنس .(Azospirillum brazilense) نتایج میانگین 4 تکرار است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنیداری در سطح 5% توسط آزمون کمترین تفاوت معنیدار (LSD) نشان نمیدهند. Ctrl: کنترل؛ N/4: یک چهارم غلظت نیتروژن؛ N/2: نیمی از غلظت نیتروژن؛ N: غلظت نیتروژن کامل؛ AB: در شرایط تلقیح یافته؛ NI: در شرایط تلقیح نشده.
Figure 2- The amount of Soluble Protein and Total Protein in rice seedlings Hashemi Cultivar inoculated or uninoculated with A. brasiliensis in treatment with different concentarations of Nitrogen. The results are the average of 4 replicates. Different letters show significant differences according to LSD test at P ≤ 0.05. Ctrl: Control, N/4: ¼ Nitrogen concentrations, N/2: ½ Nitrogen concentrations, N: Full Nitrogen concentration, AB: Inoculated with Azospirillum brazilense, NI: Without Inoclusion.
اثر تیمار نیتروژن بر مقدار فسفر و نیتروژن
بررسی اثر تیمارهای مختلف بر مقدار فسفر گیاهچههای برنج هاشمی تلقیح شده و تلقیح نشده با باکتری نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن مقدار فسفر گیاهچهها افزایش مییابد، اما اختلاف معنی داری بین گیاهچههای تلقیح شده و گیاهچه های تلقیح نشده وجود ندارد. بالاترین مقدار فسفر در گیاهچههای تیمار شده با غلظت کامل نیتروژن و در تلقیح با باکتری ( 89/6 میلیگرم بر گرم وزن خشک) دیده شد (شکل A5). بررسی اثر تیمارهای مختلف نشان داد که افزایش غلظت نیتروژن در محیط کشت سبب افزایش معنیداری در مقدار نیتروژن گیاهچهها در تمامی غلظتها نسبت به کنترل میشود. نتایج بیشتر نشان داد که در تیمار شاهد وتیمار با غلظتهای N/2 و نیتروژن کامل بین گیاهچههای تلقیح شده و گیاهچههای تلقیح نشده اختلاف معنیداری وجود دارد. بالاترین مقدار نیتروژن ( 9/8 درصد وزن خشک) در گیاهچههای تیمار شده با غلظت کامل نیتروژن و در تلقیح با باکتری دیده شد. پایینترین مقدار نیتروژن ( 22/1 درصد وزن خشک) در گیاهچههای شاهد تلقیح نشده مشاهده شد (شکل B5).
شکل 4- فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز در گیاهچههای برنج (Oryza sative) رقم هاشمی در تیمار با غلظتهای مختلف نیتروژن و تلقیح با باکتری آزوسپریلوم برازیلنس .(Azospirillum brazilense) نتایج میانگین 4 تکرار است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنیداری در سطح 5% توسط آزمون کمترین تفاوت معنیدار (LSD) نشان نمیدهند. Ctrl: کنترل؛ N/4: یک چهارم غلظت نیتروژن؛ N/2: نیمی از غلظت نیتروژن؛ N: غلظت نیتروژن کامل؛ AB: در شرایط تلقیح یافته؛ NI: در شرایط تلقیح نشده.
Figure 4- The enzyme activity of Catalase and Peroxidase in rice seedlings Hashemi Cultivar inoculated or uninoculated with A. brasiliensis in treatment with different concentarations of Nitrogen. The results are the average of 4 replicates. Different letters show significant differences according to LSD test at P ≤ 0.05. Ctrl: Control, N/4: ¼ Nitrogen concentrations, N/2: ½ Nitrogen concentrations, N: Full Nitrogen concentration, AB: Inoculated with Azospirillum brazilense, NI: Without Inoclusion.
شکل 5- مقدار فسفر و نیتروژن در گیاهچههای برنج (Oryza sative) رقم هاشمی در تیمار با غلظتهای مختلف نیتروژن و تلقیح با باکتری آزوسپریلوم برازیلنس .(Azospirillum brazilense) نتایج میانگین 4 تکرار است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنیداری در سطح 5% توسط آزمون کمترین تفاوت معنیدار (LSD) نشان نمیدهند. Ctrl: کنترل؛ N/4: یک چهارم غلظت نیتروژن؛ N/2: نیمی از غلظت نیتروژن؛ N: غلظت نیتروژن کامل؛ AB: در شرایط تلقیح یافته؛ NI: در شرایط تلقیح نشده.
Figure 5- The amount of Phosphor and Nitrogen in rice seedlings Hashemi Cultivar inoculated or uninoculated with A. brasiliensis in treatment with different concentarations of Nitrogen. The results are the average of 4 replicates. Different letters show significant differences according to LSD test at P ≤ 0.05. Ctrl: Control, N/4: ¼ Nitrogen concentrations, N/2: ½ Nitrogen concentrations, N: Full Nitrogen concentration, AB: Inoculated with Azospirillum brazilense, NI: Without Inoclusion.
رنگیزه های فتوسنتزی
بررسی اثر تیمارهای مختلف بر گیاهچه های برنج هاشمی تلقیح شده و تلقیح نشده با A. brasiliensis نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن مقدار کلروفیل a در گیاهچهها افزایش مییابد. از سوی دیگر، این افزایش در همه غلظتها در گیاهچههای تلقیح شده اختلاف معنیداری را با نمونه کنترل نشان میدهد، امّا در ارتباط با گیاهچههای تلقیح نشده این اختلاف تنها در غلظتهای کامل و یک دوم نیتروژن معنیدار است. بررسیهای بیشتر نشان داد، اگرچه اختلاف معنیدار در مقدار کلروفیل a بین گیاهچههای تلقیح شده و گیاهچه های تلقیح نشده در گروه کنترل وجود دارد ولی با افزایش غلظت نیتروژن در محیط کشت، در هیچ یک از غلظتهای به کار رفته تفاوت معنیداری بین گیاهچههای تلقیح شده و گیاهچه های تلقیح نشده وجود ندارد (شکل A6). همچنین پژوهش حاضر نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن مقدار کلروفیل b افزایش می یابد. از سوی دیگر، در همه غلظتهای به کار رفته اختلاف معنیداری در گروه گیاهچههای تلقیح شده در مقایسه با کنترل مشاهده میشود، امّا در ارتباط با گیاهچههای تلقیح نشده این اختلاف تنها در غلظتهای کامل و یک دوم نیتروژن معنیدار میباشد. همچنین با افزایش غلظت نیتروژن تنها در غلظت نیتروژن کامل بین گیاهچههای تلقیح شده و گیاهچههای تلقیح نشده اختلاف معنیدار مشاهده شد. همچنین نتایج حاضر نشان داد که بالاترین مقدار کلروفیل b (35/1 میلیگرم بر گرم وزن تر) در گیاهچههای تیمار شده با غلظت کامل نیتروژن و در تلقیح با باکتری دیده شد. از سوی دیگر، کمترین مقدار کلروفیل b (16/0 میلی گرم بر گرم وزن تر) در گیاهچههای شاهد تلقیح نشده مشاهده شد (شکل B6). نتایج حاصل از سنجش کلروفیل کل گیاهچههای برنج هاشمی تلقیح شده و تلقیح نشده با A. brasiliensis نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن مقدار کلروفیل کل گیاهچهها نیز افزایش مییابد. همچنین نتایج حاضر نشان داد که اختلاف معنیداری در مقدار کلروفیل کل بین گیاهچههای تلقیح شده و گیاهچههای تلقیح نشده در گروه کنترل وجود دارد، امّا در تیمار N/4 تفاوت معنیداری بین دو گروه تلقیح شده و تلقیح نشده وجود ندارد. با افزایش بیشتر غلظت نیتروژن (تیمار N/2 و N/4) مجددا تفاوت معنیداری در مقدار کلروفیل کل بین دو گروه تلقیح شده و تلقیح نشده با باکتری وجود دارد. در این تیمار ها مقدار کلروفیل کل به طور معنیداری در نمونههای تلقیح شده بالاتر از گیاهچههای تلقیح نشده بوده است. بالاترین مقدار کلروفیل کل (65/1 میلیگرم بر گرم وزن تر) در گیاهچههای تیمار شده با غلظت کامل نیتروژن و در تلقیح با باکتری و پائینترین مقدار کلروفیل کل (43/0 میلی گرم بر گرم وزن تر) در گیاهچههای شاهد تلقیح نشده مشاهده شد (شکل C6).
شکل 6- مقدار کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل گیاهچههای برنج (Oryza sative) رقم هاشمی در تیمار با غلظتهای مختلف نیتروژن و تلقیح با باکتری آزوسپریلوم برازیلنس .(Azospirillum brazilense) نتایج میانگین 4 تکرار است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنیداری در سطح 5 توسط آزمون کمترین تفاوت معنیدار (LSD) نشان نمیدهند. Ctrl: کنترل؛ N/4: یک چهارم غلظت نیتروژن؛ N/2: نیمی از غلظت نیتروژن؛ N: غلظت نیتروژن کامل؛ AB: در شرایط تلقیح یافته؛ NI: در شرایط تلقیح نشده.
Figure 6- The amount of Chlorophyll a, Chlorophyll b and Total chlorophyll in rice seedlings Hashemi Cultivar inoculated or uninoculated with A. brasiliensis in treatment with different concentarations of Nitrogen. The results are the average of 4 replicates. Different letters show significant differences according to LSD test at P ≤ 0.05. Ctrl: Control, N/4: ¼ Nitrogen concentrations, N/2: ½ Nitrogen concentrations, N: Full Nitrogen concentration, AB: Inoculated with Azospirillum brazilense, NI: Without Inoclusion.
بحث
در پژوهش حاضر، اثر غلظتهای مختلف نیتروژن بر برخی فاکتورهای بیوشیمیایی و رشد گیاهچههای برنج تلقیح شده با باکتری A. brasiliensis مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاضر نشان داد که گیاهچههای تلقیح شده از رشد بهتری در مقایسه با نمونه تلقیح نشده برخوردار بوده و غلظتهای بالاتر نیتروژن نتایج بهتری را به همراه داشتند. نتایج حاضر نشان داد که تلقیح با A. brasiliensis کارایی استفاده از نیتروژن را به ویژه در غلظتهای بالاتر افزایش میدهد. نتایج پژوهشگران مختلف بر روی غلات و به ویژه برنج نشان دادند گیاهان تلقیح شده با A. brasiliensis، زیست توده و محتوای نیتروژن بالاتری را در تیمار با غلظتهای مختلف نیتروژن نشان میدهند (Saubidet et al., 2002; Garcia et al., 2010). همچنین پژوهش حاضر نشان داد تلقیح گیاهچهها با A. brasiliensis بر نرخ رشد نسبی اثر مثبت دارد. نتایج دیگر پژوهشگران نشان دادند این امر ممکن است به علّت تولید هورمونهای گیاهی مانند اسید ایندول استیک (IAA) باشد (Tien et al., 1976).
پژوهش حاضر نشان داد که اگر چه اختلاف معنیداری بین فاکتورهای رشد در تیمار شاهد (نیتروژن صفر) بین دو گروه تلقیحشده و تلقیح نشده وجود ندارد، امّا گیاهان تلقیح شده همچنان عملکرد نسبتاً بهتری (دارای فاکتور رشد بیشتری) نسبت به گیاهان تلقیح نشده داشتند که این امر با یافتههای سایر پژوهشگران همخوانی دارد. آنها نشان دادند که تلقیح با A. brasiliensis محتوای نیتروژن و عملکرد را حتی در شرایط محدود نیتروژن بهبود میبخشد (Pedraza et al., 2009). همچنین نتایج Skonieski et al. (2019) نشان دادند تلقیح A. brasiliensis کارایی استفاده از نیتروژن (NUE) و عملکرد ذرت را در تیمار با کودهای حاوی نیتروژن کم افزایش میدهد که این امر میتواند در ترویج کشاورزی پایدار مفید باشد. یافتههای حاضر نشان دادند با افزایش غلظت نیتروژن، محتوای قند به طور نسبی افزایش یافته است. علاوه بر این، گیاهان تلقیح شده مقدار قند بالاتری نسبت به گیاهان تلقیح نشده نشان دادند. در این راستا بعضی پژوهشگران نشان دادند تلقیح تحت A. brasiliensis، سبب بهبود جذب نیتروژن و متابولیسم کربوهیدرات در برنج شده و در نهایت به افزایش عملکرد دانه و محتوای نیتروژن بالاتر میشود. نتایج این پژوهشگران نشان دادند در دسترس قرار گرفتن مقادیر بالاتر نیتروژن به همراه تلقیح باکتریایی تجمع قند را در بافتهای هوایی و ریشه افزایش میدهد. احتمالاً تلقیح باکتریایی جذب نیتروژن، کارایی فتوسنتز و سنتز قند را افزایش میدهد (Pedraza et al., 2009). همچنین نتایج برخی از پژوهشگران نشان دادند تلقیح به طور قابل توجهی فعالیت آنزیم نیتروژناز و تبدیل نیتروژن خاک را بهبود بخشیده که منجر به افزایش زیست توده و محتوای قند در بافتهای گیاهی میشود (Pedrosa et al., 2020; Zhang et al., 2018).
نتایج پژوهش حاضر نشان داد افزایش غلظت نیتروژن بهطور معنیداری سبب افزایش پروتئین محلول و کل در ریشه گیاهچههای برنج نسبت به شاهد میشود که با یافتههای سایر پژوهشگران مطابقت دارد. از سوی دیگر، مقایسه گیاهچههای تلقیحشده و تلقیحنشده با A. brasiliensis نشان داد که تلقیح باکتری، علیرغم افزایش اندک مقدار پروتئین محلول و کل (در هر غلظت از نیتروژن) از نظر آماری تفاوت معنیداری را ایجاد نمیکند. این نتایج نشاندهنده آن است که اثر تلقیح باکتری ممکن است در شرایطی با غلظتهای بالاتر نیتروژن بهطور مؤثرتری نمایان شود یا آنکه نیازمند تعاملهای بیشتری با سایر عوامل محیطی باشد (Wang et al., 2019). به عبارت دیگر، این امر یک تناقض رایج در کشاورزی و فیزیولوژی گیاهی است و الزاماً افزایش مقدار نیتروژن در گیاه به معنی افزایش مقدار پروتئین نیست. این موضوع میتواند نشان دهنده وجود یک یا چند عامل محدود کننده باشد که مانع استفاده کامل گیاه از نیتروژن برای ساخت پروتئین باشد. به عنوان مثال میتوان به کمبود برخی عناصر معدنی مانند مولیبدن و یا مرحله رشد گیاه اشاره کرد. به این معنی که در مراحل اولیه رشد، گیاه ممکن است نیتروژن را جذب و به شکل نیترات یا اسید آمینه ذخیره کند و سپس در مرحله رشد زایشی آن را به سرعت به پروتئین تبدیل نماید (Hernandez et al., 2009).
نتایج حاضر نشان داد که فعالیت آنزیم کاتالاز با افزایش غلظت نیتروژن (در هر دو شرایط تلقیح شده و تلقیح نشده) افزایش یافته است. امّا در نمونههای تلقیح شده توسط باکتری، فعالیت بالاتری را نسبت به گیاهچههای تلقیح نشده در تمام سطوح نیتروژن نشان داد که این نتایج با سایر گزارشهای منتشر شده مطابقت دارد. این یافتهها نشان دادند که تلقیح با A. brasiliensis سبب افزایش تحمل تنش اکسیداتیو در برنج میشود. این شواهد نشاندهنده آن است که این باکتری انعطافپذیری گیاه را در تیمار با غلظتهای مختلف نیتروژن بهبود بخشیده و توانایی آنها را برای حذف گونههای فعال اکسیژن (ROS) تولید شده در طول متابولیسم نیتروژن افزایش میدهد (Garcia et al., 2010).
همچنین دادههای حاضر نشان دادند فعالیت آنزیم پراکسیداز در تیمار با غلظتهای بالاتر نیتروژن و در هر دو شرایط تلقیح شده و تلقیح نشده افزایش مییابد. دادههای Zhang و همکارانش نیز نشان دادند تلقیح A. brasiliensis سبب افزایش فعالیت پراکسیداز در برنج شده که در نهایت منجر به رشد بهتر و جذب نیتروژن میشود. افزایش فعالیت پراکسیداز در گیاهان تلقیح شده، نقش این باکتری را در بهبود توانایی گیاه در سم زدایی پراکسید هیدروژن به عنوان محصول جانبی تنش اکسیداتیو، به ویژه در شرایطی که مقدار نیتروژن قابل دسترس محدود میباشد را برجسته میکند (Zhang et al., 2018).
نتایج به دست آمده در این پژوهش نشان داد که تیمار نیتروژن و نیز تلقیح باکتریایی تأثیر مثبتی بر سطوح فسفر و نیتروژن داشتند. در این راستا گزارشها نشان دادند برهمکنش بین تیمار نیتروژن و تلقیح A. brasiliensis جذب عناصر معدنی و رشد را در سیب زمینی بهبود بخشیده است. همچنین نتایج آنها نشان دادند گیاهان تلقیح شده میتوانند با بهبود کارایی جذب مواد مغذی، کمبود نیتروژن را نیز جبران کنند (Fernandes et al., 2023).
دادههای حاضر نشان دادند محتوای فسفر به ویژه در نمونههای تیمار شده با غلظتهای پائین نیتروژن افزایش یافته است. این امر نشان میدهدکه A. brasiliensis نقش کلیدی در بهبود حلالیت فسفر ایفا میکند که با یافتههای سایر پژوهشگران تطابق دارد (Almari & Mostafa, 2009; Madhaiyan et al., 2010).
نتایج حاصل از پژوهش جذب نیتروژن و فسفر در گیاه ذرت تلقیح شده با A. brasiliensis در تیمار با سطوح مختلف نیتروژن نشان داد که مقدار نیتروژن و فسفر به ویژه در غلظتهای بالاتر نیتروژن افزایش مییابد. این امر نشاندهنده آن است که تیمار نیتروژن تأثیر مثبتی بر جذب مواد مغذی حتی در سطوح بالای نیتروژن دارد. الگوهای مشابه مشاهده شده در هر دو پژوهش نشان دادند این باکتری نقش مهمی در بهبود کارایی مصرف مواد مغذی ایفا کرده و آن را به یک روش ارزشمند برای افزایش جذب فسفر و نیتروژن در برنج و سایر محصولات غلات تبدیل میکند (Palheta, 2021).
دادههای حاضر نشان داد که تیمار توام نیتروژن و تلقیح باکتریایی میتوانند محتوای کلروفیل را در مقایسه با گیاهان تلقیح نشده افزایش دهند. همچنین در این راستا نتایج برخی از پژوهشگران نشان دادند تلقیح باکتریایی کارایی استفاده از نیتروژن و زیست توده را در برنج افزایش داده و منجر به تولید بیشتر کلروفیل میشود ( Zhang et al., 2018). در پژوهش حاضر اثر تیمار غلظتهای بالاتر نیتروژن بر مقدار کلروفیل a و b در مقایسه با شاهد بارزتر بود. این امر با یافتههای سایر پژوهشگران بر روی گیاه ذرت مطابقت دارد. همچنین آنها نشان دادند که تلقیح در غلظتهای بالاتر نیتروژن موثرتر است. به عبارتی دیگر، به ویژه در پژوهش حاضر، در گیاهان تلقیح شده که غلظتهای بالای نیتروژن تیمار شدهاند، مقدار کلروفیل b به طور قابلتوجهی افزایش یافته است ( Galindo et al., 2022).
نتیجه گیری کلی
نتایج حاضر نشان داد تلقیح گیاهچههای برنج با A. brasiliensis میتواند به طور محسوس پاسخهای فیزیولوژیکی آن را، بهویژه در شرایط کمبود نیتروژن، افزایش دهد. در تمام غلظتهای نیتروژن به کار رفته، رشد گیاهان تلقیحشده با باکتری بهبود یافته و محتوای پروتئین بالاتر و فعالیت آنزیمی بالایی را در مقایسه با گیاهان تلقیح نشده نشان دادند. این امر پتانسیل باکتری برای بهبود جذب مواد مغذی و تحمل تنش را برجسته میکند. این یافتهها نشان دادند A. brasiliensis میتواند در محیطهایی با دسترسی محدود نیتروژن کود زیستی مؤثری باشد و سبب ترویج شیوههای کشاورزی پایدار و کاهش اتکا به کودهای شیمیایی نیتروژندار شود.
سپاسگزاری
پژوهش حاضر با حمایت مالی حوزه تحصیلات تکمیلی دانشگاه گلستان انجام شده است.
)