نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه سیستان و بلوچستان، زاهدان، ایران
2 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه زابل، زابل، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
In the present study, the biochemical responses and antioxidant enzyme activities of the unicellular green alga Dunaliella salina were investigated following exposure to phytosynthesized silver nanoparticles synthesized using aqueous extracts of German chamomile (Matricaria chamomilla) leaves and flowers. Algal cultures grown in 1.5 M NaCl and harvested during the exponential growth phase were exposed to 0, 5, 15, and 25 picomolar (pM) concentrations of silver nanoparticles. Cell number, reducing sugars, non-reducing sugars, and starch content either increased or remained unchanged following exposure to 5 pM silver nanoparticles. However, at higher nanoparticle concentrations, cell number and soluble sugar contents decreased markedly. In addition, the contents of chlorophyll, β-carotene, starch, proteins, and amino acids, as well as the activities of catalase and ascorbate peroxidase, declined significantly at all nanoparticle concentrations, whereas cell fresh weight increased. These results indicate that silver nanoparticle-induced stress in algal cells is tolerated through changes in carbon partitioning rather than through enhanced antioxidant enzyme activity or β-carotene accumulation. Therefore, tolerance of D. salina to silver nanoparticles appears to be associated with physiological and metabolic reprogramming, particularly through the redistribution of carbon toward alternative metabolic pathways, such as glycerol and lipid accumulation, which may contribute to nanoparticle tolerance.
Introduction
Silver nanoparticles (AgNPs) are among the most extensively utilized engineered nanomaterials because of their unique physicochemical properties and broad applications in medicine, agriculture, environmental remediation, and industrial processes. The increasing release of these nanoparticles into aquatic environments has raised concerns regarding their potential impacts on aquatic organisms, particularly primary producers such as microalgae. Microalgae constitute the foundation of aquatic food webs and play a vital role in global carbon cycling. Therefore, understanding their physiological and biochemical responses to nanoparticle exposure is essential for evaluating the ecological consequences of nanomaterial contamination.
Dunaliella salina is a unicellular halotolerant green microalga widely recognized as a model organism for investigating stress physiology, carotenoid biosynthesis, and metabolic adaptation. The remarkable ability of this microalga to survive under extreme environmental conditions makes it a valuable system for studying cellular responses to abiotic stress factors. In recent years, increasing attention has been directed toward understanding how nanoparticles influence the metabolism and stress-response mechanisms of D. salina. The present study aimed to investigate the metabolic and biochemical responses of D. salina exposed to phytosynthesized silver nanoparticles produced using aqueous extracts of German chamomile (Matricaria chamomilla).
Materials and methods
Silver nanoparticles were synthesized biologically and characterized using UV–Visible spectroscopy and transmission electron microscopy. The synthesized nanoparticles exhibited a characteristic surface plasmon resonance peak at approximately 410 nm and were predominantly spherical with an average particle size of approximately 13 nm. Exponentially growing cultures of D. salina were exposed to different concentrations of silver nanoparticles (0, 5, 15, and 25 pM). After 48 h of treatment, various physiological and biochemical parameters were evaluated, including cell number, fresh biomass, photosynthetic pigments, soluble sugars, starch, proteins, free amino acids, and antioxidant enzyme activities.
Results and discussion
The results revealed that exposure to silver nanoparticles significantly influenced algal growth and metabolism. Cell number decreased progressively with increasing nanoparticle concentration, particularly at 15 and 25 pM. This reduction suggests that silver nanoparticles negatively affect cell division and cellular proliferation. In contrast, fresh biomass increased significantly under nanoparticle treatments, indicating that nanoparticle exposure induced substantial physiological and metabolic modifications. The observed inverse relationship between cell number and fresh biomass suggests that factors other than cell proliferation contribute to biomass accumulation under nanoparticle stress. Photosynthetic pigments were highly sensitive to nanoparticle treatment. Chlorophyll a, chlorophyll b, total chlorophyll, and β-carotene contents decreased significantly at higher nanoparticle concentrations. The reduction in chlorophyll content indicates impairment of the photosynthetic apparatus and decreased photosynthetic efficiency. Moreover, the decline in β-carotene accumulation suggests a reduction in photoprotective capacity because β-carotene functions as a major antioxidant pigment in Dunaliella species. The decrease in the β-carotene-to-total chlorophyll ratio further confirms the greater sensitivity of carotenoid metabolism to nanoparticle-induced stress.
Silver nanoparticles also altered carbon metabolism. Low nanoparticle concentration (5 pM) stimulated the accumulation of soluble sugars, whereas higher concentrations significantly reduced reducing sugars, non-reducing sugars, total soluble sugars, and starch content. These findings indicate that silver nanoparticles affect carbon allocation and storage metabolism. The observed decline in carbohydrate reserves at elevated nanoparticle concentrations suggests that carbon resources may be redirected toward alternative metabolic pathways involved in stress adaptation and cellular protection. Protein metabolism was similarly affected. Both total protein and soluble protein contents decreased substantially in nanoparticle-treated cells. Total free amino acids exhibited relatively minor changes, suggesting alterations in protein turnover and amino acid homeostasis. The reduction in protein content may result from enhanced proteolytic activity, decreased protein synthesis, or both. These responses indicate extensive metabolic reorganization under nanoparticle stress conditions.
Antioxidant enzyme activities also declined significantly following silver nanoparticle treatment. Catalase and ascorbate peroxidase activities were markedly reduced, especially at higher nanoparticle concentrations. These observations suggest that tolerance to silver nanoparticles is not associated with enhanced antioxidant enzyme activity. Instead, nanoparticle exposure appears to impair antioxidant defense systems, thereby increasing susceptibility to oxidative damage. Collectively, the results demonstrate that silver nanoparticles induce extensive metabolic disturbances in D. salina. The simultaneous reduction of photosynthetic pigments, carbohydrates, proteins, amino acids, and antioxidant enzyme activities indicates that nanoparticle exposure imposes substantial physiological stress. Nevertheless, the increase in fresh biomass suggests the activation of alternative adaptive mechanisms. The findings support the hypothesis that tolerance to silver nanoparticles is achieved primarily through changes in carbon partitioning and metabolic reprogramming rather than through increased antioxidant enzyme activity or carotenoid accumulation.
Conclusion
In conclusion, phytosynthesized silver nanoparticles significantly affect the physiological and metabolic characteristics of Dunaliella salina. The observed responses emphasize the importance of nanoparticle properties in determining biological outcomes and highlight the complexity of nanoparticle–microalga interactions. These findings contribute to a better understanding of the ecological implications of silver nanoparticle contamination and provide valuable insights into stress-adaptation mechanisms in microalgae. Future studies should focus on identifying the specific metabolic pathways involved in carbon reallocation and evaluating long-term responses to nanoparticle exposure under environmentally relevant conditions.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
نانوذرات، ذرات فلزی یا غیرفلزی با ابعاد کمتر از 100 نانومتر هستند که به علّت ویژگیهای منحصربه فرد فیزیکوشیمیایی و زیستی به طور گستردهای در زمینههای مختلف صنعتی، دارویی، پزشکی، کشاورزی و بیوتکنولوژی مورد استفاده قرار میگیرند (Wang et al., 2018; Aminzai et al., 2024; Srinivasan & Rana, 2024). کاربردهای وسیع سبب افزایش تولید مهندسی شده نانوذرات شده است، به طوری که نانوذراتی با ترکیب شیمیایی یکسان و ویژگیهای کاربردی متفاوت تولید شدهاند (Azizian-Shermeh et al., 2017; Xiong et al., 2022). تولید گسترده نانوذرات منجر به آزاد شدن آنها در محیط زیست و بر همکنش آنها با موجودات زنده شده است. این مساله می تواند اثرات اکولوژیکی و زیست محیطی مختلفی ایجاد نموده و به عنوان یک تهدید برای اکوسیستم در نظر گرفته شود (Zou et al., 2017; Khan et al., 2021; Wang et al., 2024). این اثرات بسته به نوع، غلظت و اندازه نانوذره و همچنین نوع موجود زنده و مدت زمان قرارگیری آن در معرض نانوذرات می تواند متفاوت باشند (Lalau et al., 2015; Bandyopadhyay et al., 2015; Aigbe & Osibote, 2024; Rajput et al., 2024).
نانوذرات نقره به علّت کاربرد گسترده در بسیاری از صنایع، یکی از تجاریترین و پرمصرفترین نانوذرات به حساب می آیند (Zou et al., 2016). این کاربرد گسترده احتمال انتشار این نانوذره را در محیط زیست افزایش داده و یک تهدید بالقوه برای سیستمهای زنده به حساب میآید (Panyala et al., 2008; Impellitteri et al., 2009). علاوه بر باکتریها و جانوران، اثرات سمی این نانوذرات بر رشد و متابولیسم گیاهان مختلف مثل آرابیدوپسیس (Ma et al., 2010; Syu et al. 2014) ، (Yin et al., 2011)Lolium multiforum ، (Krishnaraj et al., 2012)Bacopa monnieri و سایر گیاهان آبزی و جلبک ها مثل Wolffia globosa (Zou et al., 2017)، (Oukarroumet al., 2012a, 2012b) Chlorella vulgaris و Dunaliella tertiolecta گزارش شده است. این اثرات مخرب در سطوح مختلف سلولی، بیوشیمیایی و یا فیزیولوژیک مشاهده شده و شامل کاهش کارایی فتوسیستم II؛ ممانعت از جوانه زنی دانه، بیوسنتز کلروفیل، فعالیت چرخه کالوین؛ القای تنش اکسیداتیو و ممانعت از مسیر سیگنالی اتیلن است (Xu et al., 2010; Oukarroumet al., 2012a, 2012b; Syu et al., 2014). علاوه بر این، اثرات تحریک کننده نانوذرات نقره بر رشد ریشه Brassica juncea (Sharma et al., 2012) یا بر تقسیم سلولی، متابولیسم و مسیرهای سیگنالی هورمون اتیلن در آرابیدوپسیس (Syu et al. 2014) نیز گزارش شدهاند. با این وجود، درک دقیق پاسخ گیاهان به نانوذرات مهندسی شده از جمله نانوذرات نقره نیازمند بررسی سازوکارهای سمیت آنها بر روی گونههای بیشتری است.
جلبک سبز تک سلولی Dunaliella یک میکروارگانیسم یوکاریوت فاقد دیواره سلولی بوده که در برابر تنشهای غیرزیستی تحمل خوبی نشان داده و به همین علّت اغلب به عنوان یک سیستم مدل در پژوهشهای فیزیولوژی تنش مورد استفاده قرار میگیرد (Avron & Ben-Amotz, 1992; Borowitzka, 2013; Barbosa et al., 2023). برخی از گونههای این جلبک مثل D. salina و D. bardawil میتوانند به واسطه تجمع مقادیر بالای بتاکاروتن، شرایط نامساعد محیطی را تحمل کنند. این واکنش به عنوان پاسخ اصلی و رایج این گونهها تحت تنش اکسیداتیو گزارش شده است (Ben-Amotz et al., 1982; Shaish et al., 1993; Salguero et al., 2003; Einali & Shariati, 2015; Goswami et al., 2022). با این وجود، گونههای Dunaliella که مقادیر اندکی بتاکاروتن ذخیره میکنند، از قبیل D. viridis نیز به خوبی تنش اکسیداتیو را تحمل میکنند که این امر میتواند نشان دهنده دخالت سایر راهکارها از جمله آنزیمهای آنتی اکسیدان در تحمل تنش باشد (Jimenez & Pick, 1993; Haghjou et al., 2009). جلبک Dunaliella یک مدل بسیار مفید برای پژوهشهای نانوذرات است، زیرا برخلاف اکثر ریزجلبکها، فاقد دیواره سلولی سلولزی بوده و در عوض، تنها توسط یک غشای پلاسمایی و یک لایه خارج سلولی شبیه گلیکوکالیکس احاطه شده است. این امر سبب میشود که نسبت به برهمکنشها و جذب نانوذرات-سلول حساستر باشد (Johari et al., 2018; Bahador et al., 2019). جذب نانوذرات نقره توسط سلولهای جلبکی مانند Dunaliella معمولاً توسط ترکیبی از فرآیندهای غیرفعال و فعال، شامل جذب سطحی روی سطح سلول از طریق برهمکنشهای الکترواستاتیک، نیروهای وان در والس، اتصال به پلیساکاریدها و پروتئینهای خارج سلولی و یا نفوذ به غشاء شامل نفوذ مستقیم به غشاء، جذب شبه اندوسیتوز و انتقال توسط کانالهای غشایی، رخ میدهد (Miao et al., 2010). از آنجایی که استفاده نانوذرات می تواند قابلیت تولید ترکیبات زیستی مهم اقتصادی توسط ریزجلبکها را به شدت تحت تأثیر قرار دهد (Bahador et al., 2019; Nguyen et al., 2019; Yuan et al., 2023)، بنابراین تغییرات متابولیکی القا شده توسط نانوذرات نقره میتواند بر میزان تولید و تجمع این ترکیبات زیستی با ارزش در ریزجلبک Dunaliella تأثیرگذار بوده و بیانگر اهمیت تأثیر هر دو جنبه بیوتکنولوژیک و اکولوژیک نانوذرات باشد. بنابراین، هدف از پژوهش حاضر، بررسی پاسخهای متابولیکی و آنتی اکسیدانی جلبک سبز D. salina به نانوذرات نقره به عنوان یک نانوذره پرکاربرد است.
مواد و روشها
بیوسنتز و مشخصهیابی نانوذرات نقره
در این پژوهش، نانوذرات نقره توسط روش سنتز سبز توصیف شده توسط Azizian-Shermeh et al. (2017) توسط ترکیب محلول 1 میلی مولار نیترات نقره (AgNO3) و عصاره آبی گیاه بابونه آلمانی (Matricaria comomilla) شامل برگ و گل به عنوان یک عامل احیاکننده در نسبت حجمی 2 به 1 در درجه حرارت اتاق سنتز شدند. گیاه بابونه از گلخانه جمعآوری و بخشهای مورد استفاده به مدت یک هفته در دمای اتاق و دور از نور خورشید خشک شدند. عصاره آبی صاف شده با غلظت 5 درصد، از پودر تهیه شده از این بخشها از طریق افزودن آب مقطر و قرار گرفتن در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه تهیه شد. ریخت شناسی نانوذرات نقره بیوسنتز شده توسط میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) تعیین شد. همچنین غلظت مولی نانوذرات نقره سنتز شده توسط رابطه (1) ارائه شده توسط (2007) Liu et al. محاسبه شد.
رابطه 1: C = NTotal/NVNA
که در این رابطه، Ntotal، معادل مقدار اولیه نمک نقره اضافه شده به محلول واکنش، N، میانگین تعداد اتمهای نقره در هر نانوذره، V، حجم محلول واکنش بر حسب لیتر و NA عدد آووگادرو است.
کشت جلبک و تیمارهای آزمایشی
جلبک Dunaliella salina سویه UTEX 200 از مجموعه کشت جلبک دانشگاه تگزاس آمریکا تهیه شد. سلولهای جلبکی در محلول غذایی تعدیل شده جانسون (pH=7.5) حاوی غلظت 5/1 مولار نمک NaCl، بر اساس روشهای ذکر شده در منابع پیشین کشت شدند (Johnson et al., 1968; Shariati & Lilley, 1994). سوسپانسیونهای جلبکی در اتاق کشت در دمای 25 درجه سانتیگراد با یک رژیم نوری 16 ساعت روشنایی (شدت نور 70 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه) و 8 ساعت تاریکی روی شیکر (100 دور بر دقیقه) به صورت مداوم قرار گرفتند تا به مرحله لگاریتمی رشد برسند. سپس سوسپانسیونها با غلظتهای 0، 5، 15 و 25 پیکومولار نانوذرات نقره تیمار شدند. سوسپانسیون تیمار نشده با نانوذرات به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. هر تیمار در سه تکرار و نمونهبرداری قبل از تیمار با نانوذرات نقره (بهعنوان زمان صفر) و 48 ساعت پس از آن انجام شد.
شمارش سلولی، وزن تر و میزان رنگیزهها
شمارش سلولهای جلبکی توسط لام هموسایتومتر زیر میکروسکوپ نوری انجام شد (Schoen, 1988). رسوب جلبکی حاصل از سانتریفیوژ 30 میلی لیتر سوسپانسیون جلبکی برای مدت 10 دقیقه با نیروی g 2000، با استفاده از محیط کشت تازه حاوی 2/0 مولار نمک شستشو داده شده و پس از سانتریفیوژ دوباره، وزن تر آن تعیین شد (Haghjou et al., 2014). جهت استخراج رنگیزههای فتوسنتزی شامل کلروفیل و بتاکاروتن، رسوب جلبکی حاصل از سانتریفیوژ یک میلی لیتر سوسپانسیون جلبکی برای مدت 5 دقیقه با نیروی g 2000 با 1 میلی لیتر استون 80 درصد مخلوط و پس از ورتکس شدید دوباره به مدت 2 دقیقه در نیروی g 10.000 سانتریفیوژ شد. جهت اندازهگیری میزان کلروفیلها، جذب محلول رویی در طول موج های 663، 645 و 652 تعیین و غلظت کلروفیلها توسط روابط 2 تا 4 محاسبه شدند (Arnon, 1949).
رابطه 2:
Chl a (mg ml-1) = 0.0127 A663- 0.00269 A645
رابطه 3:
Chl b (mg ml-1) = 0.0229 A645 - 0.00468 A663
رابطه 4:
Total Chl (mg ml-1) = A652/34.5
همچنین، جذب محلول رویی در طول موج 480 نانومتر نیز اندازهگیری و مقدار بتاکاروتن توسط ضریب جذب برابر با 2273E1cm1% = محاسبه شد (Ben-Amotz & Avron, 1983).
استخراج و اندازهگیری قندهای محلول و نشاسته
قندهای محلول شامل قندهای احیاکننده، غیراحیاکننده و کل، از رسوب جلبکی (حاصل از 30 میلی لیتر سوسپانسیون جلبکی، همانطور که در بالا توصیف شد) رنگبری شده با استون، توسط اتانول 80% در دمای 70 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه استخراج شدند (Mirshekari et al., 2017). از عصارههای اتانولی تغلیظ شده برای تعیین میزان قندهای محلول استفاده شد. قندهای احیاکننده بر اساس روش دی نیتروسالیسیلیک اسید توصیف شده توسط (1959) Miller در طول موج 575 نانومتر و توسط گلوکز به عنوان استاندارد اندازهگیری شدند. قندهای غیراحیاکننده از طریق روش (1968) van Handle و پس از حذف قندهای احیاکننده از طریق افزودن محلول هیدروکسید پتاسیم 30 درصد به عصاره اتانولی و حرارت در 100 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه، در طول موج 620 نانومتر توسط سوکروز به عنوان استاندارد تعیین شدند. میزان قند محلول کل از مجموع قندهای احیاکننده و غیراحیاکننده به دست آمد. بقایای حاصل از استخراج قندهای محلول برای استخراج نشاسته با استفاده از روش اصلاح شده هیدرولیز اسیدی مورد استفاده قرار گرفتند (McCready et al., 1950; Mirshekari et al., 2017). بر اساس این روش، پس از افزودن اسید پرکلریک 52% به بقایای حاصل از استخراج قندهای محلول، میزان گلوکز حاصل از شکستن نشاسته موجود در بقایا از روش آنترون با استفاده از گلوکز به عنوان استاندارد اندازهگیری شد (McCready et al., 1950). جهت انجام این کار، 2/0 میلی لیتر از عصاره حاصل از هیدرولیز اسیدی نشاسته با 3 میلی لیتر معرف آنترون (150 میلیگرم آنترون در 100 میلیلیتر اسید سولفوریک 13 مولار) مخلوط و پس از 20 دقیقه حرارت در 100 درجه سانتیگراد، میزان جذب نمونه در 620 نانومتر ثبت شد. غلظت نشاسته توسط اعمال ضریب 9/0 در مقدار گلوکز به دست آمده محاسبه شد (McCready et al., 1950).
تعیین مقادیر پروتئین کل و آمینواسید آزاد کل
استخراج پروتئین کل از رسوب جلبکی (حاصل از 30 میلی لیتر سوسپانسیون جلبکی) رنگبری شده با استون با استفاده از روش توصیف شده توسط (1997) Stone & Gifford همراه با تغییراتی (Mirshekari et al., 2017) انجام شد. بهطور خلاصه، 5/0 میلی لیتر بافر استخراج پروتئین کل (شامل 60 میلی مولار بافر تریس (pH=6.8)، 10% گلیسرول و 2% سدیم دودسیل سولفات) به رسوب جلبکی اضافه و مخلوط حاصل به مدت 60 دقیقه در دمای 90 درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از سانتریفیوژ با نیروی g 10.000 به مدت 15 دقیقه، میزان پروتئین کل عصاره حاصل طبق روش فولین توصیف شده توسط (1981) Markwell et al. در طول موج 750 نانومتر با استفاده از منحنی استاندارد آلبومین سرم گاوی تعیین شد. استخراج اسیدهای آمینه آزاد مشابه قندهای محلول انجام شد با این تفاوت که رسوب تازه جلبکی به جای رسوب رنگبری شده مورد استفاده قرار گرفت (Mirshekari et al., 2019). رنگزدایی عصاره اتانولی غلیظ با افزودن کلروفرم به عصاره به نسبت 1 به 5 انجام شد. مقدار کل محتوای اسیدآمینه آزاد، با روش نین هیدرین (1955) Yemm et al. توسط گلیسین به عنوان استاندارد تعیین شد. بدین منظور، 1/0 میلی لیتر عصاره الکلی با 1 میلی لیتر اتانول 80 %، 1 میلی لیتر بافر سیترات (pH=5) و 2 میلی لیتر معرف نین هیدرین (1% نین هیدرین و 06/0% سیانید پتاسیم در استون) مخلوط و حجم نهایی با آب مقطر به 1/5 میلی لیتر رسید. مخلوط واکنش به مدت 15 دقیقه در دمای 100 درجه سانتیگراد قرار گرفته و جهت توقف واکنش به مدت 5 دقیقه در آب معمولی قرار داده شد. جذب هریک از نمونهها پس از افزودن 8 میلی لیتر آب مقطر، در طول موج 570 نانومتر خوانده شد.
استخراج و سنجش پروتئینهای محلول و آنزیمها
عصاره سلولی حاوی پروتئینهای محلول و آنزیمها از رسوب تازه جلبکی (حاصل از 30 میلی لیتر سوسپانسیون جلبکی) با 1 میلیلیتر از بافر استخراج آنزیمی حاوی 100 میلیمولار بافر پتاسیم فسفات سرد (pH 7.0)، 10 درصد گلیسرول، 1 میلیمولار EDTA، 10 میلیمولار KCl، 1 میلیمولارMgSO4 ، 1 میلی مولار فنیل متیل سولفونیل فلوراید (PMSF)، 50 میلی مولار 2- مرکاپتواتانول، 1/.% تریتون-X-100 و 1% پلی وینیل پلی پیرولیدون (PVPP) استخراج شد. برای استخراج آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX)، 5 میلی مولار آسکوربیک اسید به بافر استخراج اضافه شد. سوسپانسیون جلبکی برای دو دوره 30 ثانیه ای با فاصله زمانی دو دقیقه در معرض امواج اولتراسونیک قرار داده شده و سپس در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت قرار گرفت. رنگ زدایی از مخلوط با افزودن 10 میلیگرم زغال فعال و سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه در نیروی g 10.000 تحت دمای 4 درجه سانتیگراد انجام شد. مایع رویی (حاوی پروتئینهای محلول) برای تعیین فعالیت آنزیمی استفاده شد. محتوای پروتئین محلول بر اساس روش (1976) Bradford در طول موج 595 نانومتر با استفاده از منحنی استاندارد آلبومین سرم گاوی اندازه گیری شد. مقدار فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) با روش Lück (1965) تعیین شد. مخلوط واکنش (1 میلی لیتر) شامل 50 میلیمولار بافر فسفات پتاسیم (pH 7.0)، 5/12 میلیمولار H2O2، و 30 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. نرخ تجزیه هیدروژن پراکسید در مدت زمان یک دقیقه در240 نانومتر با استفاده از ضریب خاموشی cm2 μmol−10394/0 تعیین شد. میزان فعالیت APX با روش (1992) Chen & Asada تعیین شد. مخلوط واکنش (1 میلی لیتر) شامل 50 میلیمولار بافر فسفات پتاسیم (pH 7.0)، 1 میلیمولار H2O2، 5/0 میلیمولار آسکوربیک اسید و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. میزان تولید دهیدروآسکوربات در مدت زمان یک دقیقه در290 نانومتر با فرض ضریب خاموشی cm2 μmol−18/2 تعیین شد.
تجزیه و تحلیل آماری
نتایج به صورت میانگین و انحراف معیار (SD) سه اندازهگیری از سه سوسپانسیون جلبکی مجزا بیان شد. تفاوت معنیدار آماری بین تیمارها توسط آنالیز واریانس (ANOVA) و آزمون دانکن در سطح 05/0 (0.05> P) تعیین شد.
نتایج و بحث
ویژگیهای نانوذرات نقره بیوسنتز شده:
تغییر رنگ مخلوط واکنش از قهوهای کمرنگ به قهوهای به شدت تیره، بلافاصله پس از ترکیب نمک نیترات نقره و عصاره آبی گیاه، نشاندهنده تشکیل نانوذرات نقره است (شکل 1-A)، که میتوان آن را به احیای یونهای نقره توسط عصاره آبی برگ و گل گیاه بابونه آلمانی، به علّت سرشار بودن این بخشها از اسانس و ترکیبات طبیعی (Rehmat et al., 2020)، نسبت داد (Rajasekharreddy et al., 2010; Azizian-Shermeh et al., 2017). طیف جذبی نانوذرات نقره (شکل 1-B)، پیک جذب در 410 نانومتر را نشان داد که مربوط به رزونانس پلاسمون سطحی (SPR) نانوذرات نقره است (Kouvaris et al., 2012). همچنین در تصویر TEM، نانوذرات نقره به صورت ذرات منفرد پراکنده با شکل کروی همگن و اندازه 5 تا 20 نانومتر با اندازه متوسط 13 نانومتر مشاهده شدند (شکل 1-C). هیستوگرام توزیع اندازه نانوذرات نقره، نانوذراتی با بیشترین فراوانی با قطر 15 نانومتر را نشان داد (شکل 1-D).
شکل 1- تغییر رنگ (A)، طیف جذبی (B)، تصویر میکروسکوپ الکترونی گذاره (C) و توزیع اندازه نانوذرات (D) نقره سنتز شده از طریق ترکیب محلول 1 میلیمولار نیترات نقره (AgNO3) و عصاره آبی برگها و گلهای بابونه آلمانی (Matricaria comomilla) با نسبت 1:2 (حجمی/حجمی) در دمای اتاق.
Figure 1- Color change (A), Absorption spectrum (B), Transmission electron microscope image (C) and particle size distribution (D) of synthesized AgNPs by combining 1 mM silver nitrate (AgNO3) solution and the aqueous extract of leaves and flowers of German chamomile (Matricaria comomilla) at a ratio of 1: 2 (v/v) at room temperature.
تغییرات در تعداد سلول، وزن تر و میزان رنگیزههای فتوسنتزی:
تعداد سلولها در پاسخ به غلظتهای مختلف نانوذرات نقره به ویژه در 15 و 25 پیکومولار در مقایسه با کنترل کاهش پیدا کرد (شکل 2-A). این امر بیانگر آن است که نانوذرات نقره می تواند بر تقسیم سلولی در غلظتهای بالا تأثیر داشته باشد، به عبارت دیگر، سلولهای جلبکی این غلظتها را به خوبی تحمل می کنند. اثرات منفی نانوذرات فلزی به ویژه نانوذرات نقره بر شاخص میتوزی و تقسیم سلولی گیاهان مختلف از جمله جلبک D. salina قبلاً نیز گزارش شده است (Fouad & Hafez, 2018; Bahador et al., 2019; Wang et al., 2020). بنابراین، نقطه هدف نانوذرات نقره در سلولهای جلبکی که موجب کاهش تعداد سلولها شده است می تواند چرخه و تقسیم سلولی باشد. با وجود این، گزارشهایی در مورد نقش مثبت نانوذرات نقره به ویژه در غلظتهای پائین در بهبود تجمع پروتئینهای دخیل در چرخه سلولی در ریشههای گیاه آرابیدوپسیس که منجر به افزایش طولی ریشه شده وجود دارد (Syu et al., 2014; Wang et al., 2020). این نقش مثبت در برخی دیگر از گیاهان نیز مشاهده شده است (Salama, 2012; Latif et al., 2017; Nghia et al., 2017). همچنین طبق پژوهشها مشخص شده است که نانوذرات نقره با ریخت شناسی و اندازههای مختلف که میتواند به منشاء ساخت آنها مربوط باشد (Azizian-Shermeh et al., 2017)، پاسخهای متفاوتی را در رشد گیاه و بیان ژنها در گیاهچههای آرابیدوپسیس موجب شدهاند (Syu et al., 2014). همچنین اثرات متفاوت دو نوع نانوذره نقره سنتز شده توسط زیستی و شیمیایی بر صفات فیزیولوژیکی گیاه Eschscholzia californica نیز مشاهده شده است (Hajian et al., 2022). به این ترتیب، پاسخهای متفاوت موجودات مختلف به نانوذرات نقره میتواند ناشی از اختلاف در فرمهای این نانوذرات باشد. بر عکس، وزن تر سلولهای جلبکی به تدریج تحت تأثیر نانوذرات نقره افزایش یافته و در غلظتهای 15 و 25 پیکومولار افزایش معناداری نسبت به کنترل نشان دادند (شکل 2-B). مقایسه اثرات نانوذرات نقره بر تعداد و وزن تر سلولهای جلبکی (شکل 2) نشان میدهد که یک همبستگی منفی بین آنها وجود دارد. مشابه با نتایج ما، یک رابطه عکس بین تعدادسلول و وزن تر در D. tertiolecta در معرض تابش فرا بنفش (Garcia-Gomez et al., 2012)، D. viridis تیمار شده با مناداین (Haghjou et al., 2014)، D. bardawil در معرض پروپیل گالات (Einali, 2018)، D. salina تحت کمبود نیتروژن (Mirshekari et al., 2019) و D. salina تیمار شده با نانوذرات نقره سنتز شده با عصاره برگ Momordica charantia (Bahador et al., 2019) گزارش شده است. به هر حال، بر خلاف پژوهشهای ذکر شده که در آنها افزایش وزن تر ناشی از تجمع لیپیدها یا سایر متابولیتها است، در D. bardawil تیمار شده با نانوذرات اکسید مس (Bamary et al., 2025) فاکنورهای دیگری مثل سنتز گلیسرول ممکن است نقش داشته باشند. در پژوهش حاضر، فاکتورهایی مثل افزایش اگزوپلیمرهای خارجی سلول جلبک (شامل پلیساکاریدها، پروتئینها، لیپیدها، مواد موکوسی و مواد پلیمری خارج سلولی) (Nguyen et al., 2020; Vargas-Estrada et al., 2020)، سنتز احتمالی گلیسرول یا لیپید، اختلال در قابلیت و سلامت غشاءها و همچنین اختلال در نفوذپذیری غشاء (Bhuvaneshwari et al., 2015; Wang et al., 2016) ممکن است در افزایش وزن تر سلولها دخیل باشند.
شکل 2- تغییرات در تعداد (A) و وزن تر (B) سلولهای Dunaliella salina تیمار شده با غلظتهای مختلف نانوذرات نقره پس از ۴۸ ساعت نشان داده شده است. ستونها میانگین ± انحراف معیار سه اندازهگیری جداگانه هستند. تغییرات آماری معنیدار بین تیمارهای مختلف در سطح معنیداری P < 0.05 با استفاده از آزمون دانکن تعیین و با حروف متفاوت نشان داده شدهاند.
Figure 2- Changes in number (A) and fresh weight (B) of Dunaliella salina cells treated with different concentrations of phytosynthesized AgNPs are shown after 48 h. Columns are mean ± SD of three separate measurements. Statistically significant changes between different treatments at P < 0.05 were determined using Duncan’s test and indicated by different letters.
میزان رنگیزههای فتوسنتزی شامل کلروفیل a، b و کل در پاسخ به تیمارهای نانوذرات نقره به شدت کاهش نشان دادند، به عبارت دیگر، بیشترین کاهش در غلظت های 15 و 25 پیکومولار نانوذرات مشاهده شد (شکلهای 3-A تا C). این کاهش بیانگر تأثیر منفی نانوذرات نقره بر سیستم فتوسنتزی سلولهای جلبکی است. اثر منفی نانوذرات نقره بر تجمع رنگیزهها نیز قبلاً گزارش شده است (Oukarroum et al., 2012b; Zou et al., 2017). با وجود این،گزارشهایی در مورد تأثیر مثبت این نانوذرات بر میزان رنگیزهها و فتوسنتز نیز وجود دارد (Farghaly & Nafady, 2015; Latif et al., 2017; Sadak, 2019; Bahador et al., 2019). این اختلاف در میزان رنگیزهها در پاسخ به نانوذرات نقره می تواند بطور روشن بیان کننده آن باشد که اثر نانوذرات نقره بر فتوسنتز بسته به نوع و ویژگیهای نانوذره سنتز شده متفاوت است. نسبت کلروفیل a/b در همه تیمارهای نانوذرات به ویژه در غلظت 15 پیکومولار در مقایسه با کنترل به شدت کاهش پیدا کرد (شکل 3-D). این کاهش بیانگر حساسیت بیشتر کلروفیل a سلولهای جلبکی به نانوذرات نقره در مقایسه با کلروفیل b است. میزان بتاکاروتن سلولهای تیمار شده با غلظتهای 15 و 25 پیکومولار نانوذرات بیشترین کاهش را نسبت به کنترل نشان داد (شکل 3-E). از آنجا که بتاکاروتن یک آنتی اکسیدان بسیار مهم در اغلب سلولهای Dunaliella به شمار میرود (Ben-Amotz & Avron, 1983; Jahnke & White, 2003; Mishra et al., 2008; Mishra & Jha, 2011; Einali, 2018)، کاهش مقدار آن تحت تأثیر نانوذرات نقره، حساسیت سیستمهای فتوسنتزی سلولهای جلبکی به این نانوذرات را بیشتر تأئید می کند.
شکل 3- تغییرات در محتوای کلروفیل a (A)، کلروفیل b (B)، کلروفیل کل (C)، نسبت کلروفیل a/b (D)، بتاکاروتن (E) و نسبت بتاکاروتن به کلروفیل کل (F) در سلولهای Dunaliella salina تیمار شده با غلظتهای مختلف نانوذرات نقره پس از 48 ساعت. نتایج میانگین ± انحراف معیار سه آزمایش جداگانه هستند. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنیدار بین تیمارهای مختلف در سطح معنیداری P < 0.05 بر اساس آزمون دانکن هستند.
Figure 3- Changes in the content of Chl a (A), Chl b (B), total Chl (C), Chl a/b (D), β-carotene (E), and the ratio of β-carotene to total Chl (F) in Dunaliella salina cells treated with different concentrations of AgNPs after 48 h. Results are the mean ± SD of three separate experiments. Different letters show significant changes between different treatments at P < 0.05 based on Duncan’s test.
با توجه به نقش محافظتی بتاکاروتن در حفظ کلروفیل در برابر رادیکالهای آزاد اکسیژن در این جلبک (Einali, 2018; Panjekobi & Einali, 2021)، چنین کاهشی در میزان بتاکاروتن میتواند کاهش محتوای کلروفیل را در سلولهای تیمار شده با نانوذرات نقره توضیح دهد. به هر حال، این نتایج بر خلاف تأثیر مثبت نانوذرات نقره سنتز شده با عصاره برگ Momordica charantia بر میزان بتاکاروتن جلبک D. salina است (Bahador et al., 2019). این اختلاف میتواند به تفاوت در ویژگی های نانوذرات ساخته شده نسبت داده شود. نسبت بتاکاروتن به کلروفیل کل در همه تیمارهای نانوذرات به ویژه غلظتهای 15 و 25 پیکومولار به صورت معنی دار کاهش پیدا کرد (شکل 3-F). کاهش این نسبت در سلولهای جلبکی، بیانگر حساسیت بیشتر رنگدانه بتاکاروتن به نانوذرات نقره در مقایسه با کلروفیل است.
تغییرات در میزان پروتئین کل، پروتئین محلول و آمینواسید آزاد کل:
منظور از پروتئین کل، پروتئینهای استخراجشده با بافر استخراج در حضور سدیم دودسیل سولفات است (Stone & Gifford, 1997; Einali & Sadeghipour, 2007)، در حالی که پروتئین محلول، پروتئینهای استخراج شده با بافر استخراج آنزیم است (Einali & Sadeghipour, 2007). مقدار پروتئینهای سلولهای جلبکی استخراجشده با بافر استخراج پروتئین کل در حالت کنترل بیش از دو برابر بیشتر از پروتئینهای استخراجشده با بافر استخراج آنزیمی بود (شکل 4-A و B). میزان پروتئینهای محلول و پروتئین کل سلولهای جلبکی تیمار شده با نانوذرات نقره نسبت به شاهد به شدت کاهش یافت و بیشترین کاهش در تیمار 25 پیکومولار مشاهده شد (شکل 4-A و B). محتوای آمینواسید آزاد کل تنها در غلظت 15 پیکومولار نانوذرات کاهش یافته و در سایر تیمارها نسبت به کنترل تغییر نکرد (شکل 4-C). این الگو میتواند ناشی از تغییر در بازچرخ پروتئین (protein turnover) باشد. باز چرخ پروتئین یک فرایند مهم سلولی است که نقش بسیار مهمی در هموستازی آمینواسید، بازآرایی پروتئینها و تعادل آنزیمی در طول تنش را دارد (Hildebrandt, 2018). فعالیتهای مرتبط با بیوسنتز و شکسته شدن پروتئینها در شرایط تنش پیشتر مشخص شده است (Khedr et al., 2003; Hildebrandt et al., 2015; Huang & Jander, 2017; Hildebrandt, 2018; Mirshekari et al., 2019). از آنجا که تغییر در بازچرخ پروتئین با فعالیتهای پروتئولیتیک مرتبط است (Bahador et al., 2019; Mirshekari et al., 2019)، بنابراین این تغییرات پروتئینی و آمینواسیدی میتواند نشان دهنده تغییر در فعالیت آنزیمهای پروتئازی در سلولهای جلبکی باشد. تغییر فرآیند بازچرخ پروتئین در نتیجه تغییر فعالیتهای پروتئولیتیک در سلولهای D. salina تیمار شده با نانوذرات نقره سنتز شده با عصاره برگ Momordica charantia نیز مشاهده شده است (Bahador et al., 2019).
شکل 4- تغییرات در سطوح پروتئین محلول (A)، پروتئین کل (B) و اسیدهای آمینه آزاد کل (C) سلولهایDunaliella salina تیمار شده با غلظتهای مختلف نانوذرات نقره پس از 48 ساعت. دادهها به صورت میانگین ± انحراف معیار سه اندازهگیری مستقل بیان شدند. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنیدار بین تیمارهای مختلف در سطح معنیداری P < 0.05 بر اساس آزمون دانکن هستند.
Figure 4- Changes in the levels of soluble protein (A), total protein (B) and total free amino acids (C) of Dunaliella salina cells treated with different concentrations of AgNPs after 48 h. Data were expressed as the mean ± SD of three independent measurements. Different letters indicate significant changes between different treatments at P < 0.05 based on Duncan’s test.
تغییرات در میزان قندهای محلول و نشاسته:
میزان قندهای محلول شامل قندهای احیاکننده، غیراحیاکننده و قند کل در تیمار 5 پیکومولار نانوذرات به صورت معنیدار افزایش نشان داد، امّا در دوزهای بالاتر نانوذره به شدت کاهش پیدا کرد (شکل 5-A تا C). میزان قندهای احیاکننده در پاسخ به غلظت 25 پیکومولار نانوذره بیشترین کاهش را نشان داد (شکل 5-A)، در حالی که بیشترین کاهش قندهای غیر احیایی در تیمار 15 پیکومولار مشاهده شد (شکل 5-B).
شکل 5- تغییرات در میزان قندهای احیاکننده (A)، قندهای غیراحیاکننده (B)، قندهای محلول کل (C)، نسبت قندهای احیاکننده به غیراحیاکننده (D) و نشاسته(E) سلولهای Dunaliella salina تیمار شده با غلظتهای مختلف نانوذرات نقره پس از 48 ساعت. دادهها به صورت میانگین ± انحراف معیار سه اندازهگیری مستقل بیان شدند. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنیدار بین تیمارهای مختلف در سطح معنیداری P < 0.05 بر اساس آزمون دانکن هستند.
Figure 5- Changes in reducing sugars, RS (A), non-reducing sugars, NRS (B), total soluble sugars, TSS (C), RS/NRS ratio (D), and starch (E) contents of Dunaliella salina cells treated with different concentrations of AgNPs after 48 h. Values are the mean ± SD of three independent experiments. Different letters indicate statistically significant changes at P < 0.05 with Duncan’s test.
کاهش در میزان قند کل در هر دو غلظت 15 و 25 پیکومولار نانوذرات مشاهده شد (شکل 5-C). نسبت قندهای احیاکننده به غیر احیاکننده در غلظت های 5 و 25 پیکومولار نانوذرات به شدت کاهش نشان داد، امّا در تیمار 15 پیکومولار افزایش چشمگیری نسبت به کنترل نشان داد (شکل 5-D).
افزایش این نسبت تنها در غلظت 15 پیکومولار نانوذره بیانگر کاهش بیشتر قندهای غیراحیاکننده در پاسخ به تیمار نانوذرات نقره نسبت به قندهای احیاکننده است. محتوای نشاسته در غلظت 5 پیکومولار نانوذرات تغییر معناداری پیدا نکرد، امّا در دوزهای بالاتر به شدت کاهش یافت و بیشترین کاهش در تیمار 25 پیکومولار مشاهده شد (شکل 5-E). افزایش میزان قندهای احیاکننده و غیراحیاکننده در غلظت پائین نانوذرات نقره نشان دهنده تأثیر این نانوذرات در متابولیسم قندها است. این تأثیر مثبت در سلولهای D. salina تیمار شده با نانوذرات نقره سنتز شده با عصاره برگ Momordica charantia نیز گزارش شده است (Bahador et al., 2019). با وجود این، کاهش تجمع قندهای محلول و نشاسته در مقادیر بالای نانوذرات نقره میتواند نشان دهندهی تغییر در تسهیم کربن و استراتژی متابولیسم قندها در سلول تحت تأثیر نانوذرات نقره باشد. تغییر در تسهیم کربن در سلولهای Dunaliella تحت تأثیر نانوذرات نقره (Bahador et al., 2019)، نانوذرات اکسید مس (Bamary et al., 2025) و سایر تنش ها (Mirshekari et al., 2019; Bamary & Einali, 2022) قبلا گزارش شده است.
تغییرات در فعالیتهای آنزیمی:
فعالیت آنزیمهای کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز در سلولهای جلبکی تیمار شده توسط نانوذرات نقره در مقایسه با کنترل به شدت کاهش نشان داد، بهطوری که این کاهش در غلظت 5 پیکومولار نانوذره به ویژه برای آنزیم آسکوربات پراکسیداز شدیدتر بود (شکل 6). علّت احتمالی در این مورد، حساسیت این آنزیمها به ویژه آنزیم آسکوربات پراکسیداز به تجمع پراکسید هیدروژن است (Hiner et al., 2000). شواهد این احتمال از آنجا ناشی می شود که تیمار سلولهای Dunaliella با نانوذرات اکسید مس سبب افزایش پراکسید هیدروژن متناسب با غلظت نانوذره شده، امّا این الگو با تغییرات آنزیمهای آنتی اکسیدان کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز کاملاً متضاد است، بهطوری که با افزایش غلظت نانوذرات، فعالیت این آنزیمها کاهش یافته است (Bamary et al., 2025). همچنین، پاسخ غیرخطی نانوذرات به پدیدههای فیزیولوژیک از جمله فعالیتهای آنتیاکسیدانی و بنابراین ممانعت از آنزیمهای آنتی اکسیدان در مقادیر پائین نانوذرات نیز میتواند در این امر دخیل باشد (Agathokleous et al., 2019).
شکل 6- تغییرات در فعالیت آنزیمهای کاتالاز (A) و آسکوربات پراکسیداز (B) سلولهای Dunaliella salina تیمار شده با غلظتهای مختلف نانوذرات نقره پس از 48 ساعت. دادهها به صورت میانگین ± انحراف معیار سه اندازهگیری مستقل بیان شدند. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنیدار بین تیمارهای مختلف در سطح معنیداری P < 0.05 بر اساس آزمون دانکن هستند.
Figure 6- Changes in catalase, CAT (A) and ascorbate peroxidase, APX (B) activities of Dunaliella salina cells treated with different concentrations of AgNPs after 48 h. Values are the mean ± SD of three independent experiments. Different letters indicate statistically significant changes at P < 0.05 with Duncan’s test.
کاهش فعالیتهای آنزیمی در سلولهای جلبکی تحت تأثیر نانوذرات نقره می تواند به علّت تخریب پروتئینهای آنزیمی کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز تحت تأثیر آنزیمهای پروتئازی و همچنین تغییر در بازچرخ پروتئین و کاهش بیوسنتز پروتئینها نسبت به تجزیه آنها باشد. مشابه این کاهش فعالیت آنزیمی، در گیاهچههای گوجه فرنگی تیمار شده با نانوذرات نقره تحت شرایط in vitro مشاهده شده است (Razavizadeh, 2019). همچنین کاهش میزان پروتئینهای محلول سلولهای جلبکی تحت تأثیر نانوذرات نقره نیز نشان دهنده این مطلب است.
همچنین نتایج مقایسه پاسخهای بیوشیمیایی و متابولیکی سلولهای جلبک Dunaliella salina به نانوذرات نقره سنتز شده با دو گیاه خربزه تلخ (Bahador et al., 2019) Momordica charantia و بابونه آلمانی Matricaria comomilla در (جدول 1) نشان داده شده است.
جدول 1- مقایسه پاسخهای بیوشیمیایی و متابولیکی سلولهای جلبک Dunaliella salina به نانوذرات نقره سنتز شده با دو گیاه خربزه تلخ (Bahador et al., 2019) Momordica charantia و بابونه آلمانی Matricaria comomilla (پژوهش حاضر).
Table 1- Comparison of biochemical and metabolic responses of Dunaliella salina algae cells to silver nanoparticles synthesized with two plants, bitter melon, Momordica charantia (Bahador et al., 2019) and German chamomile, Matricaria comomilla (present study).
|
پاسخ سلولهای جلبک به نانوذرات نقره سنتز شده با گیاه Matricaria comomilla ( پژوهش حاضر) |
پاسخ سلولهای جلبک به نانوذرات نقره سنتز شده با گیاه Momordica charantia (Bahador et al., 2019) |
فاکتورهای مورد مقایسه |
|
کاهش |
کاهش |
تعداد سلول |
|
افزایش |
افزایش |
وزن تر |
|
کاهش |
افزایش |
کلروفیل ها |
|
کاهش |
افزایش |
بتاکاروتن |
|
کاهش |
افزایش |
قندهای محلول |
|
کاهش |
افزایش |
نشاسته |
|
کاهش |
افزایش |
پروتئین کل |
|
کاهش |
افزایش |
پروتئین محلول |
|
کاهش |
افزایش |
آمینواسیدهای آزاد |
|
کاهش |
افزایش |
فعالیت آنزیمی |
جمع بندی
نتایج حاصل از این پژوهش نشان دادند تیمار نانوذرات نقره سبب کاهش تعداد سلول، رنگیزههای فتوسنتزی، فعالیتهای آنزیمی و میزان متابولیتها شامل قندهای محلول، نشاسته، پروتئینها و آمینواسیدهای آزاد می شود، امّا در عین حال وزن تر سلولهای جلبکی افزایش مییابد. این امر نشان میدهد که تحمل تنش ناشی از نانوذرات نقره در سلولهای جلبکی نه تنها توسط فعالیتهای آنزیمی یا تجمع بتاکاروتن، بلکه احتمالاً به واسطه تغییر در تسهیم کربن القا میشود. به این ترتیب، به نظر میرسد که سازوکار تحمل جلبک به نانوذرات نقره با تغییرات متابولیکی همراه بوده و توسط هدایت جریان کربن به مسیرهای احتمالی دیگر مثل سنتز گلیسرول یا لیپید سبب القای تحمل جلبک به نانوذرات میشود. علاوه بر این، مقایسه نتایج حاضر با پژوهشهای قبلی نشان میدهد که نوع سنتز و ویژگیهای نانوذرات نقره میتواند نقش مهمی را در نوع پاسخ سلولهای جلبکی ایفا نماید.
)