نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه بوعلی سینا، همدان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Selenium (Se) can regulate plant growth and antioxidant metabolism, though its effects depend strongly on the form and concentration used. This study compared the effects of conventional selenium (sodium selenate) and selenium nanoparticles (SeNPs) on the physiological responses of saffron (Crocus sativus L.) callus cultured in vitro. Uniform calli were treated with 5 mg L-1 sodium selenate or SeNPs, while untreated calli served as the control. Both Se forms increased callus biomass, compatible solutes, phenolic compounds, total protein, and antioxidant enzyme activities. Sodium selenate reduced hydrogen peroxide and malondialdehyde contents, indicating improved redox regulation and reduced membrane lipid peroxidation. Conversely, SeNPs increased both oxidative-stress markers despite inducing stronger antioxidant responses, suggesting that the activated defense system was insufficient to prevent oxidative damage. Both treatments reduced photosynthetic pigment contents, with a more pronounced decline under SeNP exposure. Overall, sodium selenate produced a more favorable physiological response, whereas SeNPs at 5 mg L-1 induced both metabolic stimulation and oxidative toxicity. These findings emphasize the need to optimize the concentration of each Se form independently before its application in saffron tissue culture.
Introduction
Saffron (Crocus sativus L.) is a sterile, vegetatively propagated geophyte of considerable economic and medicinal importance. Propagation through corms is slow and may transmit pathogens; therefore, tissue culture is valuable for rapid clonal propagation, production of pathogen-free material, and controlled production of bioactive metabolites. Its success depends on plant growth regulators and the mineral composition of the culture medium. Selenium (Se), although not essential for higher plants, can exert beneficial effects at low concentrations by promoting growth and stimulating antioxidant systems. At excessive concentrations, however, Se may become pro-oxidant and impair cellular functions. Selenium nanoparticles (SeNPs) have attracted attention because their distinctive physicochemical properties may alter cellular uptake and biological activity. Nevertheless, plant responses depend on the form, concentration, species, and culture conditions of Se, and comparative information for saffron callus remains limited. This study compared the effects of sodium selenate and SeNPs, applied at the same nominal concentration, on growth, metabolites, oxidative-stress markers, and antioxidant enzymes in saffron callus cultured in vitro.
Materials and Methods
Healthy saffron corms were washed under running water and surface-disinfected sequentially with 70% ethanol for 5 min and 0.1% mercuric chloride for 10 min, followed by three rinses with sterile distilled water. Corm-derived explants were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium containing 3% sucrose and 1 mg L⁻¹ each of 1-naphthaleneacetic acid (NAA) and 6-benzylaminopurine (BAP) to induce callus formation. After five subcultures, morphologically uniform calli were transferred to MS media with the same plant-growth-regulator composition and assigned to three treatments: an untreated control, 5 mg L-1 conventional Se supplied as sodium selenate, and 5 mg L-1 SeNPs. Cultures were maintained in darkness under controlled conditions in a culture room. At the end of the treatment period, calli were harvested, and samples intended for biochemical analyses were stored at −80 °C.
Fresh and dry weights were recorded as indices of biomass accumulation. Photosynthetic pigments, including chlorophyll a, chlorophyll b, total chlorophyll, and carotenoids, were determined spectrophotometrically. Soluble sugars and free proline were measured as indicators of carbon status and osmotic adjustment. Total phenolics, flavonoids, and anthocyanins were assayed to evaluate non-enzymatic antioxidant and secondary-metabolic responses. Malondialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H₂O₂) were quantified as indicators of lipid peroxidation and oxidative status, respectively. Total soluble protein was determined using the Bradford assay. The activities of peroxidase (POD), catalase (CAT), and superoxide dismutase (SOD) were also measured spectrophotometrically. Data were analyzed using SPSS, and treatment means were compared using Duncan’s multiple range test at P ≤ 0.05.
Results and Discussion
Both Se treatments significantly affected most of the evaluated physiological and biochemical traits, but the magnitude and direction of the responses differed between sodium selenate and SeNPs. Application of either Se form increased callus fresh and dry weights relative to the control, indicating that Se at the tested nominal concentration could promote biomass accumulation under the present culture conditions. This response may reflect improved cellular redox regulation and metabolic activity. Nevertheless, the growth-promoting effect should be interpreted alongside the oxidative-stress responses, because increased biomass does not necessarily imply the absence of cellular stress.
The highest concentrations of chlorophyll a, chlorophyll b, total chlorophyll, and carotenoids were observed in untreated calli. Both sodium selenate and SeNPs reduced pigment contents, with SeNPs generally exerting the stronger negative effect, particularly on carotenoids. Because the cultures were maintained in darkness and callus is a largely undifferentiated tissue, pigment values should be regarded as biochemical characteristics of the callus rather than direct measures of photosynthetic performance. The decline may be associated with inhibition of pigment biosynthesis or reduced pigment stability under Se-induced changes in cellular redox status. The stronger response to SeNPs is consistent with their potentially greater interaction with cellular surfaces; however, nanoparticle uptake and intracellular localization were not directly measured in this study and require further investigation.
Both Se forms enhanced the accumulation of phenolics, flavonoids, and anthocyanins, and the highest phenolic levels were generally recorded in SeNP-treated calli. These compounds contribute to non-enzymatic antioxidant capacity and may accumulate when secondary-metabolic pathways are stimulated by moderate redox perturbation. Selenium may influence phenylpropanoid metabolism, including processes associated with phenylalanine ammonia-lyase activity, whereas the pronounced response to SeNPs may reflect a stronger elicitation signal. Proline and soluble sugars also increased following both treatments, with the greatest accumulation under SeNP exposure. In cultured tissues, these compatible solutes may support osmotic balance, stabilize macromolecules, store carbon, and buffer redox. Their accumulation, however, may represent either improved protective capacity or a response to treatment-induced stress; thus, it should not be interpreted solely as evidence of enhanced tolerance.
The clearest distinction between the two Se forms was observed in oxidative-stress markers. Sodium selenate reduced both H₂O₂ and MDA contents relative to the control, suggesting improved control of reactive oxygen species and lower membrane lipid peroxidation. In contrast, SeNPs at the same nominal concentration markedly increased H₂O₂ and MDA levels, indicating increased oxidative stress and membrane damage. These findings show that equal mass concentrations of conventional and nanoparticulate Se are not necessarily physiologically equivalent. Differences in dissolution, surface reactivity, cellular contact, and effective availability could account for the contrasting responses, although these mechanisms were not directly assessed. Consequently, the increase in protective metabolites and antioxidant enzymes under SeNP treatment should be viewed as a compensatory defense response rather than unequivocal evidence of a beneficial effect.
Total soluble protein increased in response to both Se forms. Moreover, POD, CAT, and SOD activities were enhanced, with the highest activities generally occurring in SeNP-treated calli. SOD provides an initial line of enzymatic defense by converting superoxide radicals to H₂O₂, whereas CAT and POD participate in H₂O₂ detoxification. The coordinated induction of these enzymes indicates activation of the antioxidant defense network. Under sodium selenate treatment, this activation coincided with reduced H₂O₂ and MDA, suggesting that antioxidant capacity was sufficient to constrain oxidative damage. Under SeNP treatment, however, elevated enzyme activities did not prevent H₂O₂ accumulation or lipid peroxidation, suggesting that reactive oxygen species production exceeded the tissue's detoxification capacity. Thus, the stronger biochemical response elicited by SeNPs included both defense stimulation and evidence of toxicity at 5 mg L-1.
Conclusion
Conventional Se and SeNPs both modified growth and metabolism in saffron callus, but they produced distinct redox outcomes. Sodium selenate promoted biomass, compatible-solute accumulation, phenolic metabolism, protein content, and antioxidant activity while reducing H₂O₂ and MDA. SeNPs also stimulated biomass and defense-related traits, often more strongly, but simultaneously decreased pigment contents and increased oxidative-stress markers. Therefore, the SeNP response at 5 mg L-1 cannot be regarded as uniformly beneficial. The results emphasize that Se form and concentration must be optimized independently before using Se-based treatments in saffron tissue culture. Dose-response experiments, physicochemical characterization of SeNPs in the culture medium, and direct assessment of Se uptake and localization are recommended to distinguish beneficial elicitation from nanoparticle-induced toxicity and to define a safe and effective application range.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
زعفران مزرعی (Crocus sativus L.) گیاهی علفی از تیره زنبقیان و متعلق به جنس Crocus با حدود ۸۰ گونه است. این گیاه قابلیت رشد در شرایط مختلف محیطی از مناطق نیمه‌گرمسیری تا اقلیم مدیترانه‌ای را دارا است. زعفران علاوه بر ارزش اقتصادی بالا، به‌عنوان یکی از گیاهان دارویی مهم شناخته میشود و در طب سنتی کاربردهای متعددی دارد. همچنین این گیاه از نظر مصرف آب، یکی از کارآمدترین گیاهان زراعی در دنیا محسوب شده و از نظر نیاز به عناصر غذایی نیز، گیاهی کم‌توقع به شمار می‌رود ((Cardone et al., 2020. با وجود اهمیت بالای زعفران، این گیاه از نظر تکثیر و به نژادی با محدودیت‌های قابل توجهی مواجه است، زیرا گیاهی عقیم بوده و تکثیر آن به‌طور عمده توسط بنه انجام میشود که خود کندی تکثیر، کاهش کیفیت بنهها و انتقال عوامل بیماری‌زا را در پی دارد. از این‌رو، توسعه سیستم‌های کشت بافت مناسب جهت تکثیر انبوه، افزایش رشد و تولید بنه‌های عاری از عوامل بیماری‌زا در این گیاه ارزشمند، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است (Chib et al., 2020). نتایج پژوهشهای پیشین نشان دادهاست که شرایط محیط کشت و ترکیب تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی نقش مهمی در موفقیت کشت بافت زعفران دارند. به‌طوری‌که بیشترین میزان القاء کالوس و باززایی شاخه در زعفران توسط محیط MS حاوی 5 درصد سوکروز و ۴ میلیگرم در لیتر TDZ و NAA گزارش شدهاست (Ahmed et al., 2012). همچنین تولید ترکیبات ثانویه زعفران از طریق کشت کالوس، امکان تولید انبوه این ترکیبات ارزشمند را در شرایط کنترل‌شده فراهم نمودهاست (Castillo et al., 2003). عوامل متعدد فیزیولوژی و عملکرد گیاهان را در شرایط کشت بافت تحت تأثیر قرار میدهند که از جمله می‌توان به عناصر ریزمغذی در محیط کشت اشاره کرد. در میان عناصر غذایی، سلنیوم (Se) به علّت ویژگیهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی خود در دهه گذشته توجه زیست شناسان را جلب کردهاست. سلنیوم به عنوان یک عنصر مفید نقش مهمی در فیزیولوژی و متابولیسم گیاهان ایفا میکند. این عنصر در مقادیر کم موجب بهبود رشد، افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی و تنظیم فرآیندهای فیزیولوژیکی گیاهان میشود، اما در سطوح بالا میتواند سبب القای تنش اکسیداتیو شود (Thakur et al., 2023). از سوی دیگر، استفاده از عناصر غذایی به شـکل نـانوذرات بـه علّت خـواص فیزیکوشـیمیایی و سرعت بالای جـذب آنها از رویکردهای مهم در کشاورزی نوین اســت. در سال‌های اخیر، استفاده از نانوذرات سـلنیوم بـه علّت سمیت کم، سرعت جذب و فراهمی زیستی بالا و توانـایی قـوی در حذف رادیکالهای آزاد بیشـتر مورد توجه قـرار گرفتهاست ( El-Ramady et al., 2015). نانوذرات سلنیوم می‌توانند از طریق تأثیر بر تکثیر سلولی، تمایز بافتی و تنظیم مسیرهای متابولیکی، بر پاسخهای بیوشیمیایی گیاهان تأثیر بگذارند. پژوهش‌ها نشان دادند کاربرد سلنیوم و نانوسلنیوم موجب افزایش سرعت فتوسنتز، تجمع زیست‌توده (Farooq et al., 2022)، افزایش محتوای ترکیبات فنلی و پروتئین و در نهایت بهبود رشد و عملکرد گیاهان مختلف شدهاست (Adhikary et al., 2022; Sher et al., 2022; Abdullahi et al., 2023; Huang et al., 2023; Ramezan et al., 2024). همچنین گزارش شدهاست که نانوذرات سلنیوم به همراه محرکهای زیستی می‌توانند ارزش تغذیه‌ای و فعالیتهای زیستی گیاهان را افزایش دهند (Almutairi et al., 2023)، با توجه به فقدان گزارشهای علمی در مورد اثر سلنیوم و نانوذرات سلنیوم بر شاخصهای فیزیولوژیکی زعفران مزروعی، این پژوهش با هدف ارزیابی اولیه الگوی پاسخهای فیزیولوژیکی کالوس زعفران به دو شکل سلنیوم طراحی شد. در این پژوهش سیستم کشت کالوس به علّت کنترل‌پذیری بهتر شرایط محیطی، یکنواختی ژنتیکی بافت و امکان ارزیابی سریع پاسخهای سلولی به تیمارهای اعمال شده، به‌عنوان مدل آزمایشی اولیه انتخاب شد که میتواند جهت پژوهشهای بعدی در مورد مسیر بیوسنتزی آپوکاروتنوئیدهای شاخص زعفران نظیر کروسین نیز مورد استفاده قرار گیرد.
مواد و روش ها
آمادهسازی بنهها: بنه‌های زعفران مزروعی (Crocus sativus L.) از سازمان جهاد کشاورزی شهرستان ملایر خریداری و برای کشت بنه‌های سالم به قطر 5/2-۳ سانتی‌متر و وزن 8-7 گرم انتخاب شدند. ابتدا بنهها پس از جدا کردن فلس‌های روی آنها با آب جاری شسته شدند. سپس بنهها به مدت 5 دقیقه در اتانول۷۰ درصد و 10 دقیقه در محلول کلرید جیوه 1/0 درصد ضدعفونی و در نهایت سه بار با آب مقطر سترون شستشو داده شدند (Guang & Shi, 1995).
کشت بنهها: جهت کشت ریزنمونه‌های بنه از محیط کشت MS حاوی 3 درصد سوکروز (Murashige & Skoog, 1962) و یک میلیگرم در لیتر از هورمونهای BAP وNAA (5/5-8/7pH=) استفاده شد. قبل از انجام کشت، همه مواد و لوازم کشت در اتوکلاو با دمای ۱۲۰ درجه سانتیگراد و فشار یک اتمسفر به مدت ۱۵ دقیقه سترون شدند. کالوسها هر ۲۱ روز یک‌بار در محیط کشت تازه با همان ترکیب هورمونی واکشت و در تاریکی نگه داری شدند. پس از 4 دوره واکشت، کالوسها به مدت 3 هفته به محیط کشتMS حاوی یک میلیگرم در لیتر BAP و NAAو ۵ میلیگرم در لیتر سلنات سدیم یا نانوذرات سلنیوم (با اندازه 20-35 نانومتر و خلوص ۹8 درصد، تهیه شده از پژوهشکده نانو دانشگاه شیراز) منتقل شدند. غلظت سلنیوم بر اساس پژوهشهای پیشین کاربرد آن در شرایط در شیشه انتخاب شد و جهت مقایسه اثرات دو شکل مختلف آن، از غلظت یکسان آنها استفاده شد. پس از پایان دوره تیمار، کالوسها برداشت شده و پس از اندازهگیری وزن تر و وزن خشک آنها با ترازوی دقیق، جهت انجام سنجش شاخصهای فیزیولوژیکی در فریزر ۸0- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
ارزیابی شاخصهای فیزیولوژیکی
محتوای رنگیزههای فتوسنتزی: ارزیابی محتوای کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها توسط روش Lichtentaler (1987) انجام شد. بدین منظور ۲/۰ گرم بافت تر کالوس در هاون چینی حاوی ۵ میلیلیتر استون 80 درصد سائیده شد و سپس مخلوط حاصل با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره 1 صاف شد، سپس میزان جذب نوری نمونهها در طول موج های ۲/۶۶۳، ۸/۶۴۶ و۴۷۰ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر UV- Visible مدل Perkin Elmer خوانده شد و در نهایت محتوای کلروفیلها و کاروتنوئیدها با استفاده از رابطه‌های (1 تا 4) محاسبه و بر حسب میلیگرم بر گرم وزن تر کالوس بیان شد (Lichtentaler, 1987).
رابطه 1:
W × 1000V/ × ] (647A) 69/2 - (663A) 7/12 [= کلروفیل a
رابطه 2:
W × 1000V/ × ] (663A) 68/4 - (647A) 9/22 [ = کلروفیل b
رابطه 3:
W× 1000V/ × ] (663A) 02/8 + (647A) 2/20 [ = کلروفیل کل
رابطه 4:
198/ (Chlb × 02/85 – Chla × 82/1– 480 A ×1000) = کاروتنوئیدها
محتوای فنل، فلاونوئید و آنتوسیانین کل: بدین منظور 5/0 گرم بافت تر کالوس با محلول استخراج (متانول حاوی 1 درصد HCl) سائیده شد و از عصاره حاصل برای سنجش محتوای فنل، فلاونوئید و آنتوسیانین کل استفاده شد. محتوای فنل کل به روش فولین سیوکالتو (McDonald et al., 2002) ارزیابی شد. میزان جذب نوری نمونهها در طول موج 760 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. محتوای فنل کل توسط منحنی استاندارد اسید گالیک محاسبه و بر حسب میلیگرم بر گرم وزن تر کالوس گزارش شد. برای سنجش محتوای فلاونوئیـد کـل از روش رنگ سنجی با کلرید آلومینیوم استفاده شد و میزان جذب نوری نمونههـا توسط دستگاه اسـپکتروفتومتردر طـول مـوج 498 نـانومتر خوانده شد. محتوای فلاونوئید کل با استفاده از منحنی استاندارد کوئرستین محاسبه و بر اساس میلیگرم بر گرم وزن تر کالوس گزارش شد (Chang et al., 2002). سنجش محتوای آنتوسیانین کل به روش Wagner (1979) انجام شد. ابتدا 1/0 بافت برگ با 10 میلی لیتر متانول اسیدی (متانول حاوی 1 درصد HCl) در هاون چینی بطور کامل همگن شد. سوسپانسیون حاصل به مدت24 ساعت در تاریکی و در دمای اتاق قرار داده شد و سپس به مدت 10 دقیقه با سرعت 4000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. میزان جذب نمونهها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 550 نانومتر خوانده شد. همچنین از متانول اسیدی به عنوان بلانک استفاده شد. در نهایت محتوای آنتوسیانین کل بر اساس رابطه زیر و توسط ضریب خاموشی معادلmM-1 cm-1 33000 محاسبه و بر حسب میلیگرم بر گرم وزن تر کالوس بیان شد (رابطه 5).
A= εBC
A= میزان جذب خوانده شده در 550 نانومتر، ε= ضریب خاموشی، B= عرض کووت (یک سانتی‌متر) و C= غلظت برحسب مول در لیتر
محتوای پرولین: جهت ارزیابی محتوای پرولین، 3/0 گرم بافت تر کالوس با یک میلیلیتر سولفوسالیسیلیک اسید 3 درصد سائیده شد و سپس سانتریفیوژ شد. در مرحله بعد سپس به 200 میکرولیتر از محلول رویی، 200 میکرولیتر نینهیدرین و 200 میکرولیتر اسید استیک گلاسیال اضافه شد. نمونهها به مدت یک ساعت در دمای 100 درجه سانتیگراد قرار گرفته و پس از خنکشدن، 200 میکرولیتر تولوئن به آنها اضافه و به مدت 10 تا 15 ثانیه ورتکس شدند. در نهایت جذب نمونهها در طول موج 520 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد و محتوای پرولین بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر کالوس بیان شد (Bates et al., 1973).
محتوای قند محلول: برای سنجش محتوای قند محلول از روش فنل- اسید سولفوریک استفاده شد (Dubious et al., 1956). بدین منظور، 02/0 گرم بافت خشک کالوس در3 میلیلیتر اتانول80 درصد (v/v) سائیده شد. محلول حاصل به مدت 15دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی برداشت شد. به یک میلیلیتر از محلول رویی، یک میلیلیتر محلول فنل 5 درصد اضافه و به‌خوبی مخلوط شد. سپس 5 میلیلیتر اسید سولفوریک غلیظ به آن اضافه و به‌شدت مخلوط شد. نمونهها به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد و در نهایت جذب نوری آنها در طول موج 480 نانومتر توسط دستگاه اســپکتروفتومتر خوانده شد. همچنین محتوای قند محلول نمونهها با استفاده از منحنی استاندارد گلوکز محاسبه و برحسب میلیگرم برگرم وزن خشک کالوس بیان شد.
محتوای مالوندیآلدئید: برای سنجش محتوای مالوندیآلدئید (MDA) از روش Heath & Packer (1968) استفاده شد. ابتدا 2/0 گرم بافت تر کالوس در هاون چینی حاوی 5 میلیلیتر تری‌کلرو‌استیک اسید 1/0 درصد سائیده شد. عصاره حاصل به مدت 5 دقیقه با سرعت 6000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس به یک میلیلیتر از محلول رویی، 5 میلیلیتر محلول تری‌کلرو‌استیک اسید 20 درصد حاوی 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید (TBA) اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 95 درجه سانتیگراد حرارت داده شد و سپس بلافاصله در حمام یخ سرد شد. آنگاه میزان جذب محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 523 نانومتر خوانده شد و محتوای مالوندیآلدئید بـر حسب میکرومول بر گرم وزن تر کالوس گزارش شد.
محتوای پراکسید هیدروژن: برای سنجش محتوای پراکسید هیدروژن، 5/0 گرم بافـت تر کـالوس با یک میلیلیتر تری کلرواستیک اسید 1/0 درصد سائیده شـد. مخلـوط همگن به مدت 15 دقیقه با سرعت 12000 دور در دقیقه و در دمـای 4 درجـه سـانتی‌گـراد سانتریفیوژ شد. ســپس 700 میکرولیتـر از محلـول رویـی با 700 میکرولیتـر بـافر فسـفات پتاسیم 10 میلی‌مولار (7PH=) و700 میکرولیتر یدیـد پتاسـیم یک مـولار مخلوط شد. محتوای پراکسید هیدروژن توسط منحنی استاندارد تهیه شده از غلظتهای مشخص H2O2 محاسبه و بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر کالوس بیان شد (Nareshkumar et al., 2015).
محتوای پروتئین کل: برای ارزیابی محتوای پروتئین کل از روش برادفورد استفاده شد (Bradford, 1976). جهت تهیه عصاره پروتئینی، 5/0 گرم بافت تر کالوس در هاون چینی حاوی 7 میلی لیتر بافر فسفات سدیم (5/0 مولار، 7pH=) به مدت 30 ثانیه روی یخ سائیده شد. سپس نمونهها درسانتریفیوژ یخچالدار با سرعت 12000 دور در دقیقه به مدت ۳0 دقیقه سانتریفیوژ شدند. پس از این مرحله، 1/0 میلیلیتر از فاز رویی برداشته شد و به آن 5 میلیلیتر معرف برادفورد اضافه شد. سپس محلول سریعاً ورتکس شد و به مدت 25 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. میزان جذب نوری محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 595 نانومتر خوانده شد و محتوای پروتئین کل بر اساس منحنی استاندارد سرم آلبومین گاوی (BSA) محاسبه و بر اساس میلیگرم بر گرم وزن تر کالوس گزارش شد.
فعالیــت آنزیمهای آنتیاکسیدانی: از عصاره پروتئینی استخراج شده، جهت سنجش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی استفاده شد. ارزیابی فعالیــت آنــزیم پراکســیداز بر اساس روش MacAdam et al. (1992) انجـام شـد. مخلـوط واکنش شـامل 81/0 میلـیلیتـر بـافر فسـفات پتاسـیم 100 میلـیمـولار (7 =pH)، 20 میکرولیتـر عصـاره پروتئینی،90 میکرولیتر گایاکول 10 میلیمـولار و90 میکرولیتــر آب اکســیژنه 5 میلــی‌مــولار بــود. تغییرات جذب مخلوط واکنش در طـول مـوج 425 نـانومتر بـه مـدت 2 دقیقه (هر30 ثانیـه یک بار) توسط دستگاه اســپکتروفتومتر خوانده شــد. فعالیــت آنــزیم پراکسیداز بر حسـب تغییـرات جـذب در دقیقـه بـه ازای میلیگرم پروتئین بیان شد. بــرای ارزیابی فعالیــت آنــزیم کاتــالاز از روش Chance & Maehly (1995) استفاده شد. بدین منظور از 250 میکرولیتر بافر فسـفات سـدیم 20 میلـیمـولار (7=pH) و 250 میکرولیتر آب اکسیژنه 15 میلیمـولار به عنوان پذیرنده الکترون اسـتفاده شـد که سـپس 60 میکرولیتر عصاره پروتئینی در حمام یخ به آن ها اضـافه شد. تغییرات جذب نـوری مخلوط واکنش در طـول مـوج 240 نـانومتر به ﻣﺪﺕ ۲ ﺩﻗﻴﻘﻪ (ﻫﺮ 30 ﺛﺎﻧﻴﻪ ﻳﮏ ﺑﺎﺭ) توسط دستگاه اســپکتروفتومتر خوانده شـد. همچنین فعالیــت آنــزیم کاتالاز بر حسـب تغییـرات جـذب در دقیقـه بـه ازای میلیگرم پروتئین بیان شد. برای ارزیابی فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز از روش Beauchamp & Fridovich (1971) استفاده شد. بدین منظور 3 میلی لیتر محلول واکنش شامل بافر فسفات 50 میکرومولار (7/8=pH)، متیونین 9/9 میکرومولار، نیتروبلوتترازولیوم (NBT) 5/7 میکرومولار و تریتون-100 به عصاره افزوده شد. فعالیت آنــزیم سوپراکسید دیسموتاز بر حسب تغییرات NBT در برابر نور در طول موج 560 نانومتر توسط دستگاه اســپکتروفتومتر اندازهگیری شد و بر حسـب تغییـرات جـذب در دقیقـه بـه ازای میلیگرم پروتئین بیان شد.
آنالیز آماری
آزمایش‌ها به صورت فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی در 3 تکرار و تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از نرم افزارآماری SPSS انجام شد. همچنین مقایسه میانگینها بر اساس آزمون چند دامنهای دانکن و در سطح احتمال 5 درصد (P ≤ 0.05) انجام شد.
نتایج و بحث
وزن تر و وزن خشک کالوس
بررسی ریخت‌شناسی کالوسهای زعفران مزروعی در تیمارهای مختلف نشان داد که سلنیوم بویژه در شکل نانو، موجب بهبود رشد و کیفیت ظاهری کالوسها شد (شکل 1). همچنین نتایج مقایسه میانگین وزن‌تر و وزن‌خشک کالوس نشان داد که اثر هر دو تیمار سلنیوم و نانوسلنیوم در غلظت 5 میلیگرم در لیتر بر این دو شاخص معنیدار بود (جدول 1). بر اساس نتایج حاصل وزن‌تر کالوس از 23/4 گرم در تیمار شاهد، به 17/5 گرم در تیمار سلنیوم و به 93/5 گرم در تیمار نانوسلنیوم افزایش یافت. تغییرات وزن‌خشک کالوس نیز با الگویی مشابه از 830/0 گرم در تیمار شاهد، به 020/1 و 055/1 گرم به‌ترتیب در تیمارهای سلنیوم و نانوسلنیوم رسید، با این تفاوت که اختلاف میان دو تیمار سلنیوم و نانوسلنیوم معنیدار نبود (شکل 2). نتایج حاصل از پژوهشهای مختلف نشان دادهاست که فاکتورهای مختلف فیزیولوژیکی کالوس (رشد، بیوسنتز رنگیزهها، فعالیتهای آنزیمی و شاخصهای تنش اکسیداتیو) هر یک دامنه پاسخ وابسته به دوز اختصاصی خود را دارند و الزاماً هم‌زمان وارد فاز مهاری نمی‌شوند. در یک پژوهش بر روی کالوس گیاهSantalum album ، تیمار نانوسلنیوم موجب افزایش وزن تر و خشک کالوس شده و این افزایش به تحریک جذب عناصر غذایی و افزایش فعالیت متابولیکی سلولها توسط نانوسلنیوم نسبت داده شدهاست (Mazhar et al., 2024). همچنین در پژوهش دیگر بر روی کالوس گیاهDracocephalum kotschyi ، نانوذرات سلنیوم در مقایسه با سلنیت سدیم، عملکرد برتری در بهبود شاخصهای رشدی و زیست‌توده کالوس نشان دادند که احتمالاً به علّت توانایی بیشتر این نانوذرات در جذب و توزیع یکنواخت‌تر آنها در بافت کالوس است (Khanizadeh et al., 2025). همچنین در کالوس گیاه Caralluma tuberculate، افزایش وزن‌تر هم‌زمان با افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی (سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز و کاتالاز) تحت تیمار نانوسلنیوم گزارش شدهاست که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد (Zahedi et al., 2019; Ali et al., 2023)
شکل 1- کالوس حاصل از کشت ریزنمونه بنه زعفران مزروعی (A) چهار ماه پس از واکشت در محیط کشت پایه MS حاوی یک میلیگرم در لیتر از هورمونهای BAP و NAA. (B) دو هفته پس از انتقال به محیط کشت پایه MS حاوی یک میلیگرم در لیتر از هورمونهای BAP و NAA و 5 میلیگرم در لیتر سلنات سدیم. (C) دو هفته پس از انتقال به محیط کشت پایه MS حاوی یک میلیگرم در لیتر از هورمونهای BAP و NAA و 5 میلیگرم در لیتر نانوذرات سلنیوم.
Figure 1- Saffron calli from corm explant (A) 4 months after subculture in MS medium supplemented with 1 mg L-1 each of NAA and BAP. (B) 2 weeks after transfer to MS medium supplemented with 1 mg L-1 each of NAA and BAP and 5 mg L-1 sodium selenate. (C) 2 weeks after transfer to MS medium supplemented with 1 mg L-1 each of NAA and BAP and 5 mg L-1 selenium nanoparticles.
جدول 1- تجزیه واریانس اثر تیمارهای سلنیوم و نانوذرات سلنیوم بر شاخصهای فیزیولوژیکی کالوس زعفران مزروعی.
Table 1- Analysis of variance of the effects of selenium and selenium nanoparticles treatments on physiological indices of Crocus sativus calli.
|
S.O.V. |
df |
Selenium |
Selenium nanoparticles |
Error |
CV (%) |
|
Fresh weight |
2 |
36.1** |
36.1** |
0.0669 |
0.45 |
|
Dry weight |
2 |
65.6** |
65.6** |
0.00157 |
0.43 |
|
Chl a |
2 |
99.1** |
99.1** |
0.000114 |
0.23 |
|
Chl b |
2 |
4.31ns |
4.31ns |
0.000220 |
32.1 |
|
Total Chl |
2 |
210** |
210** |
0.0000825 |
0.14 |
|
Carotenoids |
2 |
45.0** |
45.0** |
0.00203 |
0.87 |
|
Total phenol |
2 |
52.9** |
52.9** |
0.0937 |
0.44 |
|
Total flavonoid |
2 |
41.3** |
41.3** |
0.128 |
0.49 |
|
Total anthocyanin |
2 |
23.4** |
23.4** |
0.000171 |
0.38 |
|
Proline |
2 |
685177** |
685177** |
0.00000077 |
0.001 |
|
Soluble sugar |
2 |
199** |
199** |
5.92 |
0.43 |
|
H₂O₂ |
2 |
3527** |
3527** |
0.0000841 |
0.018 |
|
MDA |
2 |
216** |
216** |
0.00105 |
0.055 |
|
Total protein |
2 |
9737** |
9737** |
0.000000196 |
0.002 |
|
Peroxidase |
2 |
36.6** |
36.6** |
0.000154 |
1.23 |
|
Catalase |
2 |
90.7** |
90.7** |
0.505 |
1.64 |
|
Superoxide dismutase |
2 |
3802** |
3802** |
0.0455 |
0.031 |
S.O.V: منبع تغییرات، df: درجات آزادی، CV: ضریب تغییرات. ** و ns به ترتیب بیانگر معنیدار بودن در سطح 5% و عدم معنیدار بودن است.
S.O.V: Source of variation, df: Degree of freedom, CV: Coefficient of variation. ** and ns represent significant at 5% probability level and not significant, respectively.
شکل 2- مقایسه میانگین اثر سلنیوم (Se) و نانوذرات سلنیوم (SeNPs) بر وزن تر (A) و وزن خشک (B) کالوسهای زعفران مزروعی.
Figure 2– Comparison of the effects of selenium (Se) and selenium nanoparticles (SeNPs) on the fresh (A) and dry (B) weights of Crocus sativus calli.
محتوای رنگیزههای فتوسنتزی: نتایج مقایسه میانگین اثر تیمارهای سلنیوم و نانوسلنیوم بر محتوای رنگیزههای فتوسنتزی نشان داد که هر دو تیمار سلنیوم اثر معنیداری بر محتوای رنگیزههای فتوسنتزی داشتند (جدول 1). بر اساس نتایج حاصل، بیشترین محتوای کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها در نمونه شاهد مشاهده شد و تیمارهای سلنیوم و نانوسلنیوم موجب کاهش محتوای رنگیزههای فتوسنتزی شدند و نانوسلنیوم در مقایسه با سلنیوم، اثرات منفی بیشتری نشان داد (شکل 3). نتایج پژوهشهای مختلف نشان دادهاند که پاسخهای فیزیولوژیکی گیاهان به سلنیوم، به گونه گیاهی، شکل سلنیوم مورد استفاده و غلظت آن وابسته است؛ بهطوری که سلنیوم در غلظت پائین رشد گیاه را تحریک میکند، امّا در غلظت بالا میتواند به عنوان اکسیدان عمل کرده و عملکرد گیاه را کاهش دهد. نتایج پژوهشی بر روی کالوسهای گیاه فلفل نشان داد که غلظت پائین نانوسلنیوم اثرات محرک رشدی داشته، در حالی که غلظتهای بالای آن (10 و۳۰ میلیگرم در لیتر) موجب سمیت شدید و ناهنجاری ساختاری برگ و ریشه شد (Sotoodehnia-Korani et al., 2020). همچنین در گیاهSesamum indicum ، نانوسلنیوم در غلظت کم سبب افزایش محتوای رنگیزههای فتوسنتزی و بهبود عملکرد فتوسنتزی شد، در حالی که در غلظتهای زیاد موجب کاهش محتوای آنها و القاء تنش اکسیداتیو گردید (Ahmad et al., 2024). در پژوهش حاضر کاهش محتوای رنگیزههای فتوسنتزی بویژه در تیمار نانوسلنیوم، نشاندهنده اثر بازدارنده این نانوذرات درغلظت مورد استفاده بر سنتز یا پایداری این رنگیزهها است. زیرا نانوذرات به علّت اندازه بسیار کوچک و سطح ویژه بالای خود می‌توانند بیشتر به درون سلولهای گیاهی نفوذ کرده و با ایجاد اختلال در غشاها، افزایش تولید رادیکالهای آزاد و آسیب به کلروپلاست‌ها، موجب کاهش سنتز یا تخریب رنگیزههای فتوسنتزی شوند (Sompura et al., 2026 ). همچنین همسو با نتایج حاصل از این پژوهش، گزارش شدهاست که سلنات سدیم در غلظتهای بالا موجب کاهش محتوای کلروفیل در گیاه تنباکو شده که احتمالاً ناشی از کاهش سنتز پورفوبیلینوژن مورد نیاز برای بیوسنتز کلروفیل است (Saffar Yazdi et al., 2012; Zsiros et al., 2019). از سوی دیگر کاهش محتوای رنگیزههای فتوسنتزی پس از افزودن سلنیوم و به ویژه نانوسلنیوم، به چندین دوره واکشت در محیط کشت و نگهداری طولانی آنها در تاریکی نیز مرتبط است. رشد بافت کالوس در تاریکی مانع از تمایز پلاستیدها به کلروپلاست‌های بالغ شده و منجر به تشکیل اتیوپلاست‌ها میشود. در غیاب نور، مسیر بیوسنتز کلروفیل در مرحله کلیدی تبدیل پروتوکلروفیلید به کلروفیلید، به علّت عدم فعالیت آنزیم وابسته به نورِ پروتوکلروفیلید اکسیدوردوکتاز متوقف میشود. در چنین شرایطی، ورود سلنیوم و نانوذرات آن به عنوان یک الیسیتور غیرزیستی به سلول سیگنال داده و با ایجاد تخصیص مجدد در منابع کربنی و انرژی سلول، مسیرهای بیوسنتزی کلروفیل و کاروتنوئید را مستقل از نور تحت تأثیر قرار میدهد. سلولهای کالوس برای مقابله با این عامل خارجی، جریان انرژی و اسکلت‌های کربنی پیش‌ساز پلاستیدی را از مسیرهای فرعی بیوسنتز رنگیزههای فتوسنتزی منحرف کرده و به سمت مسیر فنیل‌پروپانوئیدها جهت بیوسنتز متابولیتهای ثانویه فنلی سوق میدهند. در واقع، ارزیابی محتوای رنگیزههای فتوسنتزی بعنوان شاخصهای حساس اولیه برای بررسی پاسخ متابولیکی کالوس به سلنیوم نشان میدهد که این عنصر ممکن است با القاء تنش اکسیداتیو موجب کاهش محتوای رنگیزههای فتوسنتزی و برعکس تقویت مسیر فنیل پروپانوئیدی شود. کاهش معنیدار محتوای رنگیزههای فتوسنتزی در مقابل افزایش محتوای ترکیبات فنلی در تیمار سلنیوم بویژه در شکل نانو و در شرایط تاریکی، با یافته‌های Al-Khayri et al. (2023) همخوانی دارد.
شکل 3- مقایسه میانگین اثر سلنیوم (Se) و نانوذرات سلنیوم (SeNPs) بر محتوای کلروفیل a (A)، کلروفیل b (B)، کلروفیل کل (C) و کاروتنوئیدها (D) در کالوسهای زعفران مزروعی.
Figure 3– Comparison of the effects of selenium (Se) and selenium nanoparticles (SeNPs) on the content of chlorophyll a (A), chlorophyll b (B), total chlorophyll (C) and carotenoids (D) in Crocus sativus calli.
محتوای فنل، فلاونوئید و آنتوسیانین کل: نتایج مقایسه میانگین اثر تیمارهای سلنیوم و نانوسلنیوم بر محتوای ترکیبات فنلی زعفران مزروعی نشان داد که اعمال سلنیوم و نانوسلنیوم در غلظت ۵ میلیگرم در لیتر تأثیر معنیداری بر محتوای فنل، فلاونوئید و آنتوسیانین کل داشتند و موجب افزایش محتوای این ترکیبات شدند (جدول 1). همچنین بیشترین محتوای ترکیبات فنلی در تیمار نانوسلنیوم مشاهده شد (شکل 4). در این راستا، پژوهش انجام شده بر روی کالوس گیاهSantalum album نشان دادهاست که کاربرد نانوسلنیوم موجب افزایش معنیدار تولید متابولیتهای ثانویه از جمله ترکیبات فنلی در این گیاه شده که نشاندهنده اثر احتمالی این نانوذرات در مسیرهای بیوسنتزی مرتبط با آنتی‌اکسیدان‌های فنلی است (Mazhar et al., 2024). افزایش محتوای ترکیبات فنلی در تیمارهای سلنیوم و نانوسلنیوم نشاندهنده نقش مؤثر این عنصر در تحریک مسیرهای دفاعی و متابولیکی گیاهان است. احتمال می رود سلنیوم میتواند توسط فعال‌سازی آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز(PAL) که آنزیم کلیدی مسیر سنتز ترکیبات فنلی محسوب میشود، منجر به افزایش تجمع فنل‌ها در گیاهان شود (El-Shalakany et al., 2010 ). همچنین، سلنیوم با تسریع مسیر بیوسنتزی فنیل‌پروپانوئیدها، میتواند موجب افزایش تجمع فلاونوئیدها و سایر متابولیتهای ثانویه مرتبط با سیستم آنتیاکسیدانی گیاه شود (Mimmo et al., 2017). نانوذرات سلنیوم در شرایط کشت بافت، با القاء تنش اکسیداتیو در محیط سلولهای کالوس سبب تولید گونههای اکسیژن فعال میشوند و با ایجاد اختلال در تعادل ردوکس سلولی، موجب تغییر در فعالیت آنزیمهای دخیل در سنتز ترکیبات فنلی میشوند. بنابراین به منظور خنثیسازی اثرات سمی ایجاد شده، سنتز ترکیبات آنتیاکسیدانی مختلف با اهداف دفاعی در سلولهای گیاهی دچار فراتنظیمی میشوند. این نانوذرات بواسطه اندازه کوچک و سطح زیاد خود، به سهولت از مسیرهای آپوپلاستی و سیم پلاستی عبور میکنند و منجر به برهم کنشهای الکترواستاتیکی بیشتری با غشاهای سلولی شده و اثرات بیشتری در فعال نمودن مسیرهای بیوسنتزی ترکیبات فنلی و میزان تولید محصول‌ها این مسیر بروز میدهند (Rani et al., 2017; Zhang et al., 2022).
شکل 4- مقایسه میانگین اثر سلنیوم (Se) و نانوذرات سلنیوم (SeNPs) بر محتوای فنل (A) فلاونوئید (B) و آنتوسیانین کل (C) درکالوسهای زعفران مزروعی.
Figure 4 – Comparison of the effects of selenium (Se) and selenium nanoparticles (SeNPs) on the content of total phenol (A), flavonoid (B), and anthocyanin (C) in Crocus sativus calli.
پرولین: نتایج مقایسه میانگین اثر سلنیوم و نانوسلنیوم بر محتوای پرولین در کالوس زعفران مزروعی نشان داد که تیمارهای سلنیوم و نانوسلنیوم در غلظت ۵ میلیگرم در لیتر اثر معنیداری بر محتوای پرولین داشتند (جدول 1). بیشترین محتوای پرولین در تیمار 5 میلیگرم در لیتر نانوسلنیوم مشاهده شد که به‌طور معنیداری از تیمار سلنیوم بیشتر بود، هرچند سلنیوم خود نیز موجب افزایش معنیدار محتوای پرولین نسبت به شاهد شد (شکل 5). پرولین به‌عنوان تنظیم‌کننده اسمزی، تثبیت کننده ساختار پروتئین‌ها، حذف‌کننده رادیکالهای آزاد و بازدارنده پراکسیداسیون لیپیدی غشاء، نقش مهمی در افزایش تحمل گیاه ایفا میکند (Zhao et al., 2020; Madebo et al., 2021). افزایش پرولین در نتیجه تیمار هر دو شکل سلنیوم در پژوهش حاضر با نتایج گزارش‌شده در گیاه کلزا تحت تیمار نانوسلنیوم (Rezayian & Niknam, 2025)، گیاه جو تحت تیمار سلناتسدیم (Akbulut & Cakir, 2010) و گیاه نعناع تحت تیمار نانوسلنیوم (Nazerieh et al., 2018) همخوانی دارد. بنابراین به نظر میرسد این تیمارها توسط القاء بیان ژن‌های مسیر بیوسنتز پرولین به عنوان یک اسمولیت سازگار، سبب حفظ آب سلولی کالوسها در شرایط درون شیشه شدهاست.
قند محلول: نتایج مقایسه میانگین اثر تیمارهای سلنیوم و نانوسلنیوم بر محتوای قند محلول کالوس زعفران مزروعی حاکی از اثر معنیدار تیمار سلنیوم و نانوسلنیوم در غلظت ۵ میلیگرم در لیتر بر محتوای قند محلول بود (جدول 1). بیشترین محتوای قند محلول در تیمار نانوسلنیوم مشاهده شد، هرچند تیمار سلنیوم نیز خود موجب افزایش محتوای قند محلول نسبت به شاهد شد (شکل 5). اثر نانوذرات سلنیوم در افزایش محتوای قند محلول در پژوهشهای دیگر نیز گزارش شده است. به عنوان مثال، اسپری برگی نانوذرات سلنیوم در ژنوتیپ‌های گندم سبب افزایش معنیدار محتوای قند محلول شده است (Ikram et al., 2020). به نظر میرسد سلنیوم موجب افزایش محتوای قندهای محلول درگیاهان میشود و این ترکیبات علاوه بر نقش اصلی خود (تولید انرژی)، به عنوان تنظیم‌کننده اسمزی منجر به حفظ تورژسانس سلولها میشوند (Hong et al., 2000). افزایش قابلتوجه و هم‌زمان محتوای پرولین و قندهای محلول در تیمار نانوسلنیوم در پژوهش حاضر که به کاهش تنش اکسیداتیو و برقراری مجدد پایداری سلولی کمک می کند، با یافته‌های Rezayian & Niknam, 2025 در گیاه کلزا همخوانی دارد.
مالوندیآلدئید: نتایج مقایسه میانگین اثر سلنیوم و نانوذرات سلنیوم بر محتوای مالوندیآلدئید (MDA) در کالوس زعفران مزروعی نشان داد که تیمار سلنیوم در غلظت 5 میلیگرم در لیتر سبب کاهش محتوای مالوندیآلدئید و تقویت سیستم آنتیاکسیدانی، در حالی که نانوسلنیوم منجر به افزایش معنیدار محتوای مالوندیآلدئید شد (جدول 1، شکل 5). این پدیده به وضوح بیانگر نقش نانوذرات به عنوان محرک غیرزیستی است؛ به طوری که در غیاب تنش‌های محیطی، نانوذرات به علّت ابعاد کوچک و نفوذ پذیری بالا، یک تنش اکسیداتیو ملایم و کنترل‌شده را در سلول القا میکنند که به عنوان پیام محرک عمل میکند. گزارش شدهاست که سلنیوم در غلظتهای پائین (حدود ۱ میلیگرم در لیتر) که بسته به نوع گونه گیاهی و شرایط رشد متغیر است، با تقویت هماهنگ سیستم دفاع آنتیاکسیدانی به‌ویژه آنزیمهای کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز سبب حذف گونههای اکسیژن فعال، تعدیل پراکسیداسیون لیپیدها و حفظ یکپارچگی غشاء سلولی میشود (Hartikainen et al., 2005). پژوهشهای متعددی کاهش معنیدار محتوای مالوندیآلدئید در اثر کاربرد سلنیوم در گیاهانی نظیر گل صدتومانی (Wang et al., 2024)، لوبیا سبز (Rady et al., 2021) و قهوه (Mateus et al., 2021) را گزارش کرده‌اند.
پراکسید هیدروژن: نتایج مقایسه میانگین اثر سلنیوم و نانوذرات سلنیوم بر محتوای پراکسید هیدروژن (H₂O₂) در کالوس زعفران مزروعی نشان داد که سلنیوم در غلظت ۵ میلیگرم در لیتر موجب کاهش محتوای H₂O₂نسبت به شاهد شد، اما نانوسلنیوم در همین غلظت سبب افزایش محتوای H₂O₂نسبت به تیمار سلنیوم و شاهد شد (جدول 1، شکل 5). بر اساس نتایج پژوهشگران؛ گزارش شدهاست که سلنیوم در غلظتهای پائین با تقویت سیستم آنتیاکسیدانی و افزایش تجزیه H₂O₂، از ساختار غشاء سلولی محافظت میکند (Hartikainen et al., 2005)، اما افزایش غلظت آن به‌ویژه در شکل نانوذره که به سهولت از غشاها عبور میکند، خود تنشزا بوده و میتواند تعادل سیستم اکسیدانی و آنتیاکسیدانی را بر هم زند. در پژوهش حاضر افزایش معنیدار فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی تحت تیمار سلنیوم، سبب کاهش محتوای پراکسید هیدروژن در کالوس زعفران مزروعی شد، لیکن فرایند آسیب غشایی در اثر تیمار نانوسلنیوم آغاز شده که با افزایش شاخص مالوندیآلدئید همراه بود. این یافتهها با نتایج پژوهش Beiramnvand et al. (2023) مطابقت داشته و نشاندهنده حساسیت کالوس زعفران مزروعی به غلظت سلنیوم در شکل نانوذره است. در واقع، تفاوت پاسخ کالوسهای زعفران به غلظت یکسان دو شکل از سلنیوم، نشاندهنده حساسیت وابسته به دوز و شکل این عنصر است. در حالی که سلنیوم توده‌ای در این غلظت نقش حمایتی ایفا نموده و با مهار تولید رادیکالهای آزاد، محتوای MDA و H2O2 را کاهش داد، نانوسلنیوم در همین غلظت منجر به تحریک گونههای فعال اکسیژن شد. این پدیده به ویژگیهای فیزیکوشیمیایی منحصربه‌فرد نانوذرات مربوط است؛ نانوذرات سلنیوم به دلیل نسبت سطح به حجم فوق‌العاده بالا، سطح باردار فعال و ابعاد نانومتری، سرعت جذب و فراهمی زیستی بسیار بالاتری در مقایسه با فرم توده‌ای دارند. در نتیجه غلظت ۵ میلیگرم در لیتر برای شکل نانو، یک دوز فراتر از آستانه تحمل تلقی شده و فراتر از ظرفیت هومئوستازی سلولهای کالوس عمل کردهاست. این ورود بیش از حد نانوذرات به درون سلولها، تعادل سیستم ردوکس را به نفع شرایط اکسیداتیو متمایل کرده و با آغاز پراکسیداسیون چربی‌های غشا، نشت یون‌ها و نهایتاً تخریب یکپارچگی غشاء سلولی را القا نمودهاست. این نتایج همسو با یافته‌های Sotoodehnia-Korani et al. (2020) در کالوس فلفل نشان دادند که دوزهای بالای نانوسلنیوم سبب سمیت شدید سلولی میشود.
شکل 5- مقایسه میانگین اثر سلنیوم (Se) و نانوذرات سلنیوم (SeNPs) بر محتوای پراکسید هیدروژن (A)، پرولین(B) ، مالوندیآلدئید (C) و قند محلول(D) درکالوسهای زعفران مزروعی.
Figure 5 – Comparison of the effects of selenium (Se) and selenium nanoparticles (SeNPs) on the content of H2O2 (A), proline (B), MDA (C) and soluble sugars (D) in Crocus sativus calli.
محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی: نتایج مقایسه میانگین اثر سلنیوم و نانوذرات سلنیوم بر محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی در کالوس زعفران مزروعی نشان داد که سلنیوم و نانوسلنیوم در غلظت ۵ میلیگرم در لیتر تأثیر معنیداری بر محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی داشتند (جدول 1). محتوای پروتئین کل تحت تأثیر هر دو شکل سلنیوم افزایش یافت که میتواند به علّت اثر این تیمارها بر تقویت وضعیت آنتیاکسیدانی سلولها جهت کاهش آسیب‌های اکسیداتیو، توسط افزایش سنتز و پایداری پروتئین‌ها است. همچنین نتایج پژوهش های انجام‌شده بر روی کالوس گیاهان Vigna unguiculata و Cardamin violifolia نشان دادهاست که نانوذرات سلنیوم می‌توانند بیان ژن‌های مرتبط با متابولیسم نیتروژن و سنتز پروتئین را تحریک نموده و محتوای پروتئین را افزایش دهند (Wu et al., 2020). همچنین بر اساس نتایج حاصل از این پژوهش، فعالیت آنزیمهای کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز در پاسخ به سلنیوم و نانوسلنیوم در غلظت 5 میلیگرم در لیتر افزایش یافت و بیشترین محتوای پروتئین و فعالیت آنزیم ها در تیمار نانوسلنیوم مشاهده شد (شکل 6). نتایج این پژوهش در مورد افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی با یافته‌های گزارش‌شده در گیاهان نعناع فلفلی (Jafari & Moghaddam, 2023)، خیار (Mousavi et al., 2023 ) و شاهی (Wu et al., 2020) تحت تیمار سلنیوم و نانوسلنیوم هم‌راستا است. همچنین بر اساس یافته ها گزارش شدهاست که نانوذرات سلنیوم به علت سطح ویژه بالا و قابلیت نفوذ بیشتر به سلولها، توانایی بیشتری در تحریک سیستم‌های دفاعی گیاه نسبت به شکل‌های معمول سلنیوم دارند و این امر علت افزایش بیشتر فعالیت آنزیمهای کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز در تیمار نانوسلنیوم را توجیه میکند (Silva et al., 2020).
شکل 6- مقایسه میانگین اثر سلنیوم (Se) و نانوذرات سلنیوم (SeNPs) بر محتوای پروتئین کل (A) و فعالیت آنزیمهای کاتالاز (CAT) (B)، پراکسیداز (POD) (C) و سوپراکسید دیسموتاز (SOD) (D) درکالوسهای زعفران مزروعی.
Figure 6 – Comparison of the effects of selenium (Se) and selenium nanoparticles (SeNPs) on the content of total protein (A) and activity of the enzymes catalase (CAT), (B), peroxidase (POD) (C) and superoxide dismutase (SOD) (D) in Crocus sativus calli.
نتیجه‌گیری
یافته‌های این پژوهش نشان داد که سلنیوم و نانوسلنیوم تأثیر معنیداری بر شاخصهای فیزیولوژیکی کالوس زعفران مزروعی داشته و موجب افزایش محتوای ترکیبات فنلی، قند محلول، پرولین، پروتئین و فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی از جمله کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز، ولیکن کاهش محتوای رنگیزههای فتوسنتزی شدند. از سوی دیگر، سلنیوم سبب کاهش محتوای مالوندیآلدئید و پراکسید هیدروژن شد و از سوی دیگر؛ نانوسلنیوم آنها را افزایش داد. تفاوت در پاسخهای فیزیولوژیکی مشاهده شده، نشاندهنده حساسیت کالوس زعفران مزروعی به شکل فیزیکوشیمیایی عنصر سلنیوم (توده‌ای در برابر نانو) در غلظت مورد بررسی است. در مجموع، نتایج این پژوهش تأئید میکند که استفاده هدفمند از سلنیوم به‌ویژه در شکل نانو در غلظت مناسب میتواند به‌عنوان ابزاری مؤثر جهت تنظیم اکثر پاسخهای فیزیولوژیکی گیاهان مورد استفاده قرار گیرد.
تعارض منافع
در مورد این پژوهش که مستخرج از رساله دکتری نویسنده اول است، هیچ یک از پژوهشگران تعارض منافع ندارند.
تشکر و قدردانی
این پژوهش با حمایت مالی دانشگاه بوعلی سینا همدان انجام شدهاست.
)