نویسندگان
گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Papaver pseudo-orientale in section Oxytona of Papaver genus is an important source of alkaloids such as isothebaine. In this research, callus production and regeneration of this species from hipocotyl-cotyledon explants under in vitro conditions were investigated on Murashige and Skoog (MS) and Gamborg (B5) basic media supplemented with different levels of Kinetin (Kin), Benzyladenine (BA) and Naphthalene acetic acid (NAA) at 16-h photoperiod and 20 °C. Analysis of variance showed significant (P
کلیدواژه‌ها [English]
گیاهان به عنوان منبع مهمی برای داروها، نقش کلیدی در سلامت مردم جهان دارند و بسیاری از مواد دارویی با ارزش جزو متابولیتهای ثانویه گیاهان هستند (Constabel, 1990). در برخی موارد سنتز مصنوعی این مواد مشکل است و یا اینکه تولید مصنوعی آنها از لحاظ اقتصادی مقرون به صرفه نیست. در چنین مواردی، استفاده از کشت بافت و سلول گیاهی ابزار قدرتمندی برای تولید متابولیتهای ثانویه محسوب می‌شود (Ravishankar and Venkataraman, 1998). تولید گیاهان دارویی در سیستم درون شیشه‌ای، مواد گیاهی یک شکل و استریل را فراهم می‌کند (Miura et al., 1987).
جنس Papaver که مهمترین جنس تیره Papaveraceae است، دارای چندین گروه آلکالوئیدی مهم است که در داروسازی اهمیّت زیادی دارند
(Furst and Hosztafi, 1998). P. pseudo-orientale گیاهی هگزاپلوئید با 42n=2 کروموزوم است که از تلاقی دو گونه P. Bracteatum و orientale.P ایجاد شده است که به همراه دو گونه فوق به بخش درون جنسی Oxytona تعلق دارد (Goldblatt, 1974). برگهای این گونه در قسمت میانی ساقه قرار گرفته‌اند و گلبرگ‌های آن به رنگ قرمز مایل به نارنجی دیده می‌شود و گل‌ها اغلب دارای براکته هستند (Mihalik, 1998). آلکالوئید اصلی موجود در این گونه ایزوتبائین است که اثر آرام‌بخشی دارد (Sariyar, 2002; Tétényi, 1986). در این گونه آلکالوئیدهای دیگری نظیر اورینتالیدین، مکرانتالین، سلیوتاریدین نیز وجود دارند (Sariyar and Baytop, 1980).
در کشت بافت Papaver از محیط‌کشت‌‌های MS (Murashige and Skooge, 1962) و B5 (Gamborg et al. 1968) استفاده شده است (Daneshvar, 2005; Rostampour et al., 2010). Day و همکاران (1986) به طور موفقیت‌آمیز گیاهانی را از کشت کالوسهای دو واریته گونهP. bracteatum تولید کردند. مطالعات Ilahi و Ghauri (1994) نشان داد که اضافه کردن
2، 4 دی کلرو فنوکسی استیک اسید (2,4-D) به مقدار
1 میلی‌گرم بر لیتر به همراه بنزیل آدنین (BA) به مقدار 5/0 یا 1 میلی‌گرم بر لیتر به محیط‌کشت نصف MS باعث ایجاد کالوس در P. bracteatum می‌شود، اما کالوسهای ایجاد شده پس از گذشت چند هفته قهو‌ه‌ای شده، اندام‌زایی در آنها صورت نمی‌گیرد.
Kamo و همکاران (1982) در گیاه
P. somniferum توانستند با استفاده از محیط‌کشت MS حاوی هورمون IPA (ایزوپنتینل آدنین) یا کینتین (Kin) ساقه و در محیط‌کشت MS حاوینفتالین استیک اسید (NAA) و Kin ریشه تولید کنند. آنها همچنین نشان دادند که بافت کالوس کمتر از ساقههای باززایی شده دارای آلکالوئیدهای مورفین‌دار بوده، تولید آلکالوئیدها تحت تأثیر بافت و اندامهای تمایز یافته قرار می‌گیرد؛ به طوری که مورفین فقط در ساقههای تمایز یافته ساخته می‌شود.
حضور آلکالوئیدهای مورفین‌دار (مورفین، نیکوتین و تبائین) در کشت بافت P. somniferum توسط Galewsky و Nessler (1986) گزارش شده است. Swankar و Bohra (1989) نیز گزارش کردند که 2,4-D از تولید ساقه جلوگیری می‌کند، اما Kin و اندول استیک اسید (IAA) باعث تولید ساقه در
P. somniferum می‌شوند. Ovecka و همکاران (1998) توانستند جنین سوماتیکی را در
P. somniferumدر محیط‌کشت پایه MS حاوی ترکیبهای مختلف از هورمونهای کینتین و NAA تولید کنند. Kaya و Lockwood (1999) نیز تفاوت بین واریته‌ای را از لحاظ تولید کالوس در محیط‌کشت‌‌های MS و گامبورگ حاوی غلظتهای مختلف Kin و 2,4-D در گونه P. somniferum گزارش نمودند.
مشاهدات Abdelmajid و Jacquin (2001) نشان داد که در P. somniferum ریزنمونههای برگرفته از هیپوکوتیل و کوتیلدون هر دو جنین سوماتیکی تولید می‌کنند، اما در مورد P. orientale فقط ریزنمونههای برگرفته از کوتیلدون جنین سوماتیکی تولید می‌کنند. سنجش از طریق HPLC نشان داد که ریشه‌های هر دو گونه کدئین، تبائین و پاپاورین می‌سازند، اما مورفین تنها در بخش‌های هوایی ساخته می‌شود.
در حال حاضر، استفاده بی‌رویه از ذخایر ژنتیکی، به ویژه گیاهان دارویی به آسیب‌پذیری منابع طبیعی منجر شده است. یکی از راهکارهای امید‌بخش و موفق در این زمینه تولید متابولیتهای ثانویه و ترکیبات دارویی گیاهی در شرایط آزمایشگاهی و سیستم راکتورهای زیستی گیاهی است، که با فراهم آوردن امکان کنترل دقیق‌تر عوامل مؤثر در تولید بیشتر این متابولیتهای ثانویه در موارد متعددی به تولید اقتصادی ترکیبات مهم گیاهی منتج شده است (Tisserat and Berhow, 2009; Paek et al., 2005). علاوه بر این، مهندسی ژنتیک گیاهی ابزار مفیدی را برای مهندسی مسیرهای متابولیکی در جهت افزایش تولید متابولیتهای مهم گیاهی فراهم می‌کند. پیش نیاز اصلی و مهم در همه این موارد، وجود یک سیستم بهینه کالوس‌زایی و باززایی در هر یک از اکوتیپ‌های گیاه مورد نظر است. با توجه به مطالعات محدود در مورد کالوس‌زایی و باززایی گیاه دارویی P. pseudo-orientale در شرایط درون شیشه‌ای، به ویژه در مورد توده‌های بومی ایران، این پژوهش با هدف ارزیابی اثر محیطهای مختلف کشت و نوع و غلظتهای مختلف تنظیم‌کننده‌های رشد بر کالوس‌زایی و باززایی این گیاه دارویی انجام گرفت. یافته‌های این مطالعه می‌تواند در استحصال آلکالوئید ایزوتبائین تحت شرایط آزمایشگاهی مفید باشد.
مواد و روش‌ها
بذرهای گونه P. pseudo-orientale جمع‌آوری شده از اطراف شهرستان خلخال استان اردبیل
("50 ´37 °48E ، "12 ´35 °37 N) پس از شستشو با آب معمولی به مدت چند دقیقه، با آب مقطر شستشو داده شدند. سپس به مدت 30 ثانیه در الکل 70 درصد غوطه‌ور شده، 3 بار با آب مقطر استریل شسته شدند. سپس در محلول هیپوکلریت سدیم 1 درصد به مدت 30 دقیقه ضدعفونی سطحی شدند و در پایان 3 بار با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. سپس بذرها در محفظه هود و تحت شرایط استریل 5 بار با آب مقطر استریل شستشو داده شده، در محیط‌کشت MS کشت شدند. ظروف، پس از پوشش در اتاقک رشد در شرایط دمایی 20 درجه سانتیگراد و 16 ساعت روشنایی با شدت نور 50 میلی‌مول بر متر بر ثانیه و 8 ساعت تاریکی قرار داده شدند.
پس از اینکه گیاهچه‌های بذری به اندازه 20 میلی‌متر رشد کردند، برای انتقال به محیطهای کشت MS (Murashige and Skooge, 1962) و B5 (Gamborg et al., 1968) حاوی 30 گرم بر لیتر سوکروز، 15 میلی‌گرم بر لیتر آسکوربیک اسید و 8 گرم بر لیتر آگار به همراه غلظتهای مختلف هورمونهای اکسین و سیتوکینین، 7/5pH= (جدول 1) برای کالوس‌زایی انتخاب شدند. بخش هیپوکوتیل-کوتیلدون گیاهچه به عنوان ریزنمونه استفاده شد؛ به این ترتیب که قسمت بالای گیاهچه که شامل هیپوکوتیل و کوتیلدون بود، در ظروف پتری حاوی ترکیبهای هورمونی مختلف کشت شد. سپس اطراف ظروف پتری با پارافیلم پوشانده شده، به اتاقک رشد منتقل شدند و بازکشت هر 20 روز یک بار انجام شد. شایان ذکر است که محیط‌کشت پایه MS و B5 بدون هورمون نیز به عنوان شاهد در آزمایش استفاده شد که ریزنمونه های مورد استفاده کالوس تولید نکرده، پس از دو هفته از بین رفتند.
پس از تولید کالوس، درصد کالوس‌زایی در محیطهای مختلف کشت محاسبه شد و پس از اینکه کالوسها به حد کافی رشد کردند (پس از گذشت دو ماه) وزن تر کالوسها اندازه‌گیری شد. در مراحل بعدی درصد ساقه‌دهی، وزن ساقه، درصد ریشه‌دهی و وزن ریشه اندازه‌گیری شد.
تجزیه و تحلیل داده‌ها در مرحله تولید کالوس به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با حداقل 3 تکرار و مقایسه میانگین صفات به روش SNK (Student-Newman, Keuls test) انجام شد. به علت عدم تولید ساقه و ریشه در تعداد زیادی از محیطهای کشت و عدم امکان توزیع نرمال داده‌ها، در تجزیه واریانس صفات درصد ساقه‌زایی، وزن تر ساقه، درصد ریشه‌زایی و وزن تر ریشه، فقط محیطهای کشتی که ساقه یا ریشه در آنها تولید شده بود، به صورت طرح کاملاً تصادفی استفاده شد. نرم‌افزار‌های آماری Excel و SPSS نسخه 16 برای تجزیه آماری استفاده شدند.
جدول 1- نوع محیط‌کشت و ترکیب هورمونی استفاده شده برای تولید کالوس، ساقه و ریشه
|
محیط‌کشت MS حاوی |
|
محیط‌کشت B5 حاوی |
||||||
|
شماره |
BA (mg/l) |
Kin (mg/l) |
NAA (mg/l) |
|
شماره |
BA (mg/l) |
Kin (mg/l) |
NAA (mg/l) |
|
1 |
5/0 |
0 |
5/0 |
|
1 |
5/0 |
0 |
5/0 |
|
2 |
5/0 |
0 |
1 |
2 |
5/0 |
0 |
1 |
|
|
3 |
1 |
0 |
5/0 |
3 |
1 |
0 |
5/0 |
|
|
4 |
1 |
0 |
1 |
4 |
1 |
0 |
1 |
|
|
5 |
0 |
5/0 |
5/0 |
5 |
0 |
5/0 |
5/0 |
|
|
6 |
0 |
5/0 |
1 |
6 |
0 |
5/0 |
1 |
|
|
7 |
0 |
1 |
5/0 |
7 |
0 |
1 |
5/0 |
|
|
8 |
0 |
1 |
1 |
8 |
0 |
1 |
1 |
|
نتایج
ریزنمونههای کشت شده پس از گذشت یک هفته در تعدادی از محیطهای کشت شروع به تولید کالوس کردند. در محیط‌کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم بر لیتر BA یا Kin و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA و محیط‌کشت B5 حاوی 1 میلی‌گرم بر لیتر Kin و 1 میلی‌گرم بر لیتر NAA کالوس تولید نشد و ریزنمونه‌ها پس از گذشت چند روز از بین رفتند. تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که اختلاف معنی‌داری از لحاظ درصد کالوس‌زایی بین غلظتهای مختلف اکسین (NAA در غلظتهای 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر)، نوع و غلظتهای متفاوت سیتوکینین (Kin و BA در غلظتهای 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و همچنین تأثیرات متقابل آنها در سطح احتمال یک درصد وجود دارد (جدول 2). محیط‌کشت MS حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر BA و 5/0 یا 1 میلی‌گرم بر لیتر NAA با حدود 70 درصد و محیط‌کشت B5 حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر Kin و 1 میلی‌گرم بر لیتر NAA با 5/75 درصد کالوس‌زایی، محیطهای کشت مناسبی برای کالوس‌زایی بودند (جدول 4). برای تولید کالوس بین محیط‌کشت‌‌های MS و B5 تفاوت معنی‌داری وجود نداشت، ولی کاربرد 1 میلی‌گرم بر لیتر NAA نسبت به 5/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA، 5/0 میلی‌گرم بر لیتر Kin نسبت به 1 میلی‌گرم بر لیتر Kin و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر BA نسبت به 1 میلی‌گرم بر لیتر BA تأثیر بیشتری برای تولید کالوس در این گونه داشتند. رشد کالوسها در محیطهای مختلف کشت متفاوت بود و در برخی از محیط‌ها رشد بیشتری نسبت به محیطهای دیگر مشاهده شد. محیط‌کشت MS حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر BA و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA و محیط‌کشت B5 دارای 5/0 میلی‌گرم بر لیتر Kin و 1 میلی‌گرم بر لیتر NAA بهترین محیط‌کشت برای رشد کالوس بودند (جدول 4).
پس از گذشت دو ماه از کشت، کالوسهای تولید شده در برخی از محیطهای کشت، شامل محیطهای کشت B55، B54، B53، MS6، MS5، MS2 و MS1 (جدول 1) ساقه تولید کردند (شکل 1، ج و د) که درصد ساقه‌زایی در این 7 محیط‌کشت متفاوت بود. در محیط‌کشت‌هایی که ساقه تولید نشد کالوسها قهو‌ه‌ای شده، از بین رفتند. تجزیه واریانس نشان داد که اختلاف معنی‌داری از لحاظ درصد ساقه‌زایی بین محیطهای مختلف کشت وجود دارد (جدول 3). محیط‌کشت B5 حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر Kin و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA با 1/86 درصد ساقه‌دهی و وزن تر ساقه بیشتر، مناسب‌ترین محیط‌کشت برای تولید ساقه در این گونه بود (جدول 4). در محیط‌کشت MS حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر Kin و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA نیز 73 درصد ساقه‌دهی و وزن تر ساقه بیشتری مشاهده شد (جدول 4).
پس از گذشت سه ماه از کشت ریزنمونه، پس از بازکشت کالوسهای ساقه‌دار، ریشه‌دهی در محیطهای کشت حاوی غلظتهای مختلف کینتین شامل محیطهای کشت B57، B56، B55، MS6 و MS5 (جدول 1) مشاهده شد، اما در محیطهای کشت دارای هورمون BA ریشه تولید نشد. می‌توان نتیجه گرفت که سیتوکینین مناسب برای تولید ریشه در این گونه، کینتین به مقدار 5/0 میلی‌گرم بر لیتر است. تجزیه واریانس نشان داد که اختلاف معنی‌داری از نظر درصد تولید ریشه بین محیطهای مختلف کشت وجود دارد (جدول 3). محیط‌کشت B5 حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر Kin و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA با 52 درصد ریشه‌دهی و بیشترین وزن تر ریشه، بهترین محیط‌کشت برای تولید ریشه بود (جدول 4). برگ و ریشه حاصل از کالوس در شکل 1 (ز و ح) نشان داده شده است. گیاهان باززا شده از نظر مورفولوژیک کاملاً مشابه گیاهان والدی بوده، هیچ گونه خصوصیات ظاهری غیرطبیعی مانند تغییر شکل برگ‌ها، ابلق بودن و غیره نشان ندادند.
بحث
در این مطالعه، NAA به عنوان اکسین در ترکیب با غلظتهای مختلف سیتوکینین شامل BA و Kin به طور جداگانه برای تولید کالوس و باززایی گیاه
P. pseudo-orientale استفاده شد. برای تولید کالوس در این گیاه، وجود هورمونهای گیاهی در محیط‌کشت ضروری است؛ به طوری که در محیطهای فاقد هورمون ریزنمونههای مورد استفاده کالوس تولید نکرده، از بین رفتند. هورمونهای گیاهی اکسین و سیتوکینین به طور گسترده در کشت بافت گیاهی برای تولید کالوس و باززایی استفاده می‌شوند
(Gang et al., 2003). وجود اثر متقابل معنی‌دار بین نوع محیط کشت و غلظت و نوع سیتوکینین (جدول 2) نشان می‌دهد که بسته به نوع محیط‌کشت پایه مورد استفاده، غلظت و نوع سیتوکینین مورد نیاز برای به دست آوردن حداکثر کالوس‌زایی متفاوت است؛ به طوری که در محیط‌کشت MS حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر BA حداکثر کالوس‌زایی مشاهده شد، در حالی که در محیط‌کشت B5 حداکثر درصد تولید کالوس در محیط حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر Kin اتفاق افتاد (جدول 4).
جدول 2- جدول تجزیه واریانس برای صفات درصد کالوس‌زایی و وزن تر کالوس بر اساس آزمایش فاکتوریل. **: معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد و ns معنی‌دار نیست.
|
منابع تغییر |
درصد کالوس‌زایی |
|
وزن تر کالوس |
||
|
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
|
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
|
|
محیط‌کشت |
1 |
ns5/13 |
|
1 |
**93503 |
|
اکسین |
1 |
**1945 |
|
1 |
**71103 |
|
سیتوکینین |
3 |
**3940 |
|
3 |
**630023 |
|
محیط‌کشت × اکسین |
1 |
**2162 |
|
1 |
**409982 |
|
محیط‌کشت × سیتوکینین |
3 |
**318 |
|
3 |
**277187 |
|
اکسین × سیتوکینین |
3 |
**1552 |
|
3 |
**180133 |
|
محیط‌کشت × اکسین × سیتوکینین |
3 |
**1798 |
|
3 |
**366474 |
|
خطا |
32 |
1/64 |
|
64 |
2261 |
|
ضریب تغییرات (%) |
|
6/19 |
|
|
9/10 |
جدول 3- جدول تجزیه واریانس محیطهای مختلف کشت بر اساس طرح کاملاً تصادفی برای صفات مختلف مورد مطالعه در باززایی
|
وزن تر ریشه (mg) |
|
درصد ریشه‌دهی |
|
وزن تر ساقه (mg) |
|
درصد ساقه‌دهی |
|
||||
|
MS |
df |
|
MS |
df |
|
MS |
df |
|
MS |
df |
منبع تغییر |
|
**8/185 |
4 |
|
**7/534 |
4 |
|
**18425 |
6 |
|
**2431 |
6 |
محیط‌کشت |
|
4/5 |
20 |
|
5/22 |
10 |
|
2477 |
28 |
|
8/75 |
14 |
خطا |
|
66/11 |
|
|
76/13 |
|
|
57/6 |
|
|
83/17 |
ضریب تغییرات (%) |
|
جدول 4- مقایسه میانگین محیطهای مختلف کشت با ترکیبهای هورمونی متفاوت برای صفات درصد کالوس‌زایی، وزن تر کالوس، درصد ساقه‌زایی، وزن تر ساقه، درصد ریشه‌زایی و وزن تر ریشه در گونه P. pseudo-orientale
|
محیطهای کشت |
درصد کالوس‌زایی |
وزن تر کالوس (mg) |
درصد ساقه‌زایی |
وزن تر ساقه (mg) |
درصد ریشه‌زایی |
وزن تر ریشه (mg) |
|
MS+5/0BA+5/0NAA |
a70 |
a2/810 |
e1/15 |
c2/682 |
0 |
0 |
|
MS+5/0BA+1NAA |
ab9/60 |
b2/687 |
c6/55 |
bc4/764 |
0 |
0 |
|
MS+1BA+5/0NAA |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
MS+1BA+1NAA |
d1/41 |
f330 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
MS+5/0Kin+5/0NAA |
d5/38 |
ef8/387 |
b3/73 |
bc8/762 |
d4/16 |
c4/15 |
|
MS+5/0 Kin +1NAA |
bc3/59 |
c6/540 |
bc9/63 |
bc2/762 |
c8/27 |
bc6/17 |
|
MS+1Kin +5/0NAA |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
MS+1Kin +1NAA |
bcd8/51 |
de4/451 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
B5+5/0BA+5/0NAA |
bc4/65 |
c2/566 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
B5+5/0BA+1NAA |
cd9/43 |
de6/418 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
B5+1BA+5/0NAA |
e1/21 |
de6/444 |
e4/13 |
cd6/694 |
0 |
0 |
|
B5+1BA+1NAA |
cd3/44 |
d469 |
d4/34 |
b769 |
0 |
0 |
|
B5+5/0Kin+5/0NAA |
de7/35 |
de2/452 |
a1/86 |
a2/868 |
a2/52 |
a6/30 |
|
B5+5/0 Kin +1NAA |
a5/75 |
a4/822 |
0 |
0 |
b9/36 |
b4/19 |
|
B5+1Kin +5/0NAA |
cd3/44 |
c2/581 |
0 |
0 |
b9/38 |
bc17 |
|
B5+1Kin +1NAA |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
شکل 2- نمودار تغییرات درصد تولید کالوس در دو غلظت NAA تحت تأثیر نوع و غلظت سیتوکینین |
|
شکل 1- کالوس‌زایی و باززایی درون شیشه‌ای در Papaver pseudo-orientale. الف و ب) کالوسهای حاصل از ریزنمونه هیپوکوتیل-کوتیلدون در محیط‌کشت MS حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر BA و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA، ج و د) تولید برگ از کالوس در مراحل اولیه در محیط‌کشت MS حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA، ه و و) برگهای حاصل از کالوس پس از گذشت 4 ماه از کشت در محیط‌کشت MS حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA،
ز و ح) ریشه‌زایی پس از گذشت 5 ماه از کشت در محیط‌کشت B5 حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر کینتین و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA.
غلظت اکسین مورد استفاده در محیط‌کشت نیز عامل مهمی در القای کالوس‌زایی بود؛ به طوری که درصد تولید کالوس در غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر NAA به طور معنی‌داری بیشتر از غلظت 5/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA بود. Rostampour و همکاران (2010) نشان دادند که در کالوس‌زایی گونه P. bracteatum غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D مؤثرتر از غلظتهای دیگر آن است. به علاوه، اثر متقابل بین غلظت NAA و نوع محیط‌کشت نیز در کالوس‌زایی ریزنمونه مؤثر بوده و نیز تأثیر غلظت NAA برای کالوس‌زایی در گیاه
P. pseudo-orientale بسته به نوع و غلظت سیتوکینین متفاوت بود (جدول2)؛ به طوری که در سطح پایین هورمون BA (5/0 میلی‌گرم بر لیتر (BA غلظت 5/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA نسبت به غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر آن کالوس‌زایی بیشتری را نشان داد، در حالی که در سطح بالای هورمون BA (1 میلی‌گرم بر لیتر (BA غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر NAA درصد کالوس‌زایی بیشتری از غلظت 5/0 میلی‌گرم بر لیتر آن داشت (شکل 2)؛ حال آن که در مورد کینتین هر چند در سطح پایین آن (غلظت 5/0 میلی‌گرم بر لیتر) بین دو غلظت NAA تفاوت قابل ملاحظه‌ای وجود نداشت، ولی این تفاوت در غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر کینتین قابل ملاحظه بود (شکل 2). وجود چنین اثر متقابلی در کالوس‌زایی گیاه Petunia (Rao et al., 1973) و گیاه Dioscoreophyllum (Oselebe and Ene-Obong, 2007) نیز گزارش شده است.
در محیطهای کشت حاوی 1 میلی‌گرم بر لیتر Kin ساقه‌زایی مشاهده نشد، در حالی که در محیطهای کشت حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر Kin ساقه‌زایی اتفاق افتاد (جدول 4). مشخص شده است که در گونه
P. somniferum، کینتین تولید ساقه را تحریک می‌کند (Swankar and Bohra, 1989). معمولاً زمانی که نسبت سیتوکینین بیشتر از اکسین است، انتظار می‌رود ساقههای نابه‌جا ایجاد شوند، اما بر همکنش هورمونهای درون‌زا و برون‌زا نقش مهمی در تمایز بافت در شرایط درون شیشه‌ای ایفا می‌کند (Rout et al., 2006)؛ به طوری که Rostampour و همکاران (2010) محیط‌کشت مناسب برای تولید ساقه نابجا در گونه P. bracteatum را، محیط‌کشت MS حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر BA و 1 میلی‌گرم بر لیتر NAA گزارش کردند، در حالی که Kaya و Lockwood (1999) در گونه P. somniferum توانستند کالوس‌‌هایی را به طور موفقیت‌آمیز در محیطهای کشت MS و B5 تولید کنند و گزارش کردند که ساقه‌زایى از بافت کالوس در این گونه، در محیط‌کشت دارای نسبت مساوی از اکسین و سیتوکینین مشاهده می‌شود. Daneshvar (2005) گزارش کرد که محیط‌کشت مناسب برای ساقه‌زایی نابجا در گونه
P. bracteatum، بسته به اکوتیپ متفاوت است؛ به طوری که یک اکوتیپ در محیط‌کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم بر لیتر Kin، 5/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA و 1/0 میلی‌گرم بر لیتر GA3 و اکوتیپ دیگر در محیط‌کشت MS شامل 1 یا 2 میلی‌گرم بر لیتر Kin، 2 میلی‌گرم بر لیتر NAA و 1/0 میلی‌گرم بر لیتر GA3 بیشترین ساقه‌زایی را نشان داد و در گونه P. pseudo-orientale ساقه‌زایی بدون نیاز به هورمون سیتوکینین در حضور هورمونهای 2,4-D و NAA انجام می گیرد. در این مطالعه، بیشترین درصد ریشه‌زایی (52 درصد) در محیط‌کشت B5 حاوی NAA و کینتین مشاهده شد، در حالی که درصد ریشه‌زایی در گونه P. pseudo-orientale در مطالعه Daneshvar (2005) در حدود 40درصد بود که در محیط‌کشت MS حاوی 5/0 میلی‌گرم IBA به دست آمد.
بر اساس اطلاعات به دست آمده، نتایج حاصل از این تحقیق، نخستین گزارش از کالوس‌زایی و باززایی درون شیشه‌ای گونه P. pseudo-orientale بومی ایران است. با توجه به اینکه در برخی از محیطهای کشت مورد استفاده، درصد تولید و رشد کالوس و نیز باززایی مناسب بود، از این محیطهای کشت می‌توان برای شروع کشت سوسپانسیون به منظور تولید متابولیتهای ثانویه مهم این گیاه در کالوس و اندامهای حاصل از کالوس در شرایط درون‌شیشه‌ای استفاده کرد. همچنین، از این محیطهای کشت می‌توان در استفاده از روش‌های بیوتکنولوژی برای بهبود ژنتیکی و مهندسی مسیرهای متابولیکی این گونه بهره گرفت.
)
