نویسندگان
گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
In this research, the effect of etylendiamintetraacetic acid (EDTA) on chromium accumulation and growth of Raphanus sativus L. was studied. 10-day old seedlings were cultured in hydroponic conditions containing different concentrations of chromium (1, 2, 4 and6 mg/L) and EDTA (1 and 3mg/L) for 4 weeks. After harvesting, growth parameters, amount of chromium in shoot and root and also prolin in shoot were measured. The results of this study showed shoot and root length, leaf area and root area, root/shoot ratio significantly increased at 6 mg/lit cr by using of EDTA, compared to chromium alone. Measurement of prolin showed that the amount of prolin in shoot was significantly decreased compared to chromium, at 6 mg/lit cr and 1 and 3 mg/L EDTA. According to the results of this research, appropriate concentration of EDTA decreased stress of chromium, so that not only did not have any negative effect on plant growth it enhanced the growth of the plant.
کلیدواژه‌ها [English]
فلزات سنگین از آلاینده‌های مهم محیط‌زیست محسوب می‌شوند. بسیاری از این فلزات حتی در غلظت‌های بسیار اندک نیز سمّی هستند (Chen and Cutright, 2001). کروم، فلزی سنگین است که در گروه عناصر ضروری گیاهان قرار ندارد (Ghani, 2011)، اما برای حیات جانوران ضروری است. در انسان کمبود کروم موجب تأخیر رشد، کوتاه شدن عمر و کم شدن مقاومت در برابر تنش های فیزیولوژیک می‌شود، تغذیه از گیاهان و استفاده از کروم موجود در منابع گیاهی می‌تواند نیاز فیزیولوژیک جانوران را نسبت به این عنصر تأمین کند (Khodadoust et al., 1976). سمیّت کروم در گیاهان به ظرفیت آن بستگی دارد. کروم شش ظرفیتی دارای درجه بالایی از سمیّت و تحرک است، در حالی که کروم سه ظرفیتی سمیّت کمتری دارد. آثار سمّیت کروم بر رشد و نمو گیاه در مراحل جوانه‌زنی، رشد ریشه، ساقه و برگ مشاهده می‌شود (Shanker et al., 2005). غلظت‌های زیاد کروم بر جوانه‌زنی و زیست‌پذیری دانه‌ها تأثیر منفی دارد و رشد گیاهچه‌ها را محدود می‌کند (Akinci and Akinci, 2010). بر اساس نظر Zurayk و همکاران (2001)، کاهش جوانه‌زنی دانه در اثر تنش کروم به علت کاهش فعالیت آنزیم آمیلاز است. کاهش رشد ریشه تحت تأثیر فلزات سنگین در گیاهان می‌تواند به علت جلوگیری از فرآیندهای تقسیم سلولی در ریشه باشد. کروم تأثیر نامطلوبی بر رشد بخش هوایی دارد و علت عمده آن را می‌توان به کاهش رشد ریشه و متعاقب آن انتقال کمتر آب و مواد غذایی به بخش‌های هوایی گیاه نسبت داد. علاوه بر این، انتقال کروم به بخش هوایی اثر مستقیمی بر متابولیسم سلولی در بخش‌های هوایی دارد و به کاهش ارتفاع گیاه منجر می‌شود. همچنین، کروم تأثیر نامطلوبی بر فرآیندهای فیزیولوژیک نظیر فتوسنتز، روابط آبی و تغذیه معدنی دارد. تأثیر کروم بر مراحل مختلف فتوسنتز شامل تثبیت دی اکسید کربن، انتقال الکترون، فسفریلاسیون نوری و فعالیت‌های آنزیمی اعمال می‌شود. کروم به علت شباهت ساختاری با برخی عناصر ضروری، تغذیه معدنی گیاه را تحت تأثیر قرار می‌دهد (Shanker et al., 2005). تغییرات متابولیک نیز توسط کروم در گیاهان ایجاد می‌شود. این تغییرات از طریق اثر مستقیم فلز کروم بر آنزیم‌ها، متابولیت‌ها و یا توانایی آن در تولید گونه‌های فعال اکسیژن (Reactive Oxygen Species) و ایجاد تنش اکسیداتیو، اعمال می‌شود. تنش اکسیداتیو به آسیب سلولی منجر می‌شود (Shanker et al., 2005). کروم همچنین بر فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز، سیتوکروم اکسیداز و نیترات ردوکتاز تأثیر می‌گذارد (Ghani, 2011). انباشته شدن یون‌های فلزی توسط گیاه، تعادل یونی داخل سلول را تحت تأثیر قرار می‌دهد (Yadav, 2010).
در گیاهان سازوکار‌هایی برای کاهش آثار فلزات سنگین وجود دارد. اساس این سازوکار‌ها بر پایه همبند شدن فلز و کده‌بندی (compartmentalization) آن در سلول است. گیاهان برای رشد در خاک‌های آلوده به فلزات سنگین از سه راهکار اساسی استفاده می‌کنند. راهکار اول: گیاهان به طور مؤثر از ورود فلز به بخش هوایی جلوگیری می‌کنند. راهکار دوم: گیاهان فلزات را در اندام‌هایی که بیرون از خاک قرار گرفته‌اند انباشته می‌کنند و میزان فلز در بافت‌های این گیاهان نشان‌دهنده میزان فلز در خاک است. راهکار سوم، گونه‌های گیاهی می‌توانند فلزات را در مقادیری بیش از آنچه که در خاک و یا گونه‌های غیر انباشت‌گر مجاور یافت می‌شود، در اندام‌های بیرون از خاک خود انباشته کنند (Memon et al., 2001). انباشت فرآیندی است که بخشی از آن تحت تأثیر توارث و بخشی از آن در اثر شرایط اکولوژیک حاصل می‌شود.
همبندکننده‌ها باعث جذب فلزات سنگین و افزایش تحرک آنها در گیاهان می‌شوند (Römkens et al., 2002). اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) همبندکننده‌ای سنتزی است که ظرفیت بالایی در همبند کردن فلزات دارد و کمپلکس آن با فلزات به آسانی توسط گیاه جذب می‌شود (Wu et al., 2004).
EDTA آثار متفاوتی بر رشد و متابولیسم گیاهان دارد. برای مثال، EDTA جوانه‌زنی دانه و مقدار کلروفیل و پرولین را در Lolium perenne و Festuca arundinacea افزایش می‌دهد (Duo et al., 2005). بررسی‌ها نشان داده است که در گیاه برنج رشد یافته در خاک آلوده با کادمیوم، EDTA مقدار پرولین و فعالیت آنزیم سوپراکسید دسموتاز را افزایش می‌دهد، در حالی که فعالیت پراکسیداز و کاتالاز را کاهش می‌دهد. EDTA همچنین در گیاه برنج سبب افزایش مقدار پرولین در بافت گیاهی می‌شود (Li et al., 2010).
بیش از 500 گونه متعلق به 101 تیره گیاهی به عنوان گونه‌های "بیش انباشت‌گر" گزارش شده است. این صفت به طور ویژه‌ای در تیره شب‌بو (Brassicaceae) مشهود است (Kramer, 2010). تیره شب‌بو دارای 87 گونه بیش انباشت‌گر که به 11 جنس تعلق دارند (Suresh and Ravishankar, 2004). گیاه تربچه (Raphanus sativus L.) از تیره شب‌بو، گیاهی انباشت‌گر است (Baker and Brooks, 1989). آبیاری گیاه تربچه با پساب‌های صنعتی نشان داده است که تربچه قادر به بیش انباشت فلزات کروم، مس، نیکل و روی است (Pandey, 2006). همچنین انباشت فلزات سرب و کادمیوم نیز در گیاه تربچه گزارش شده است (Ouihamn et al., 2012).
با توجه به این که همبندکننده‌ها باعث افزایش انباشت فلز در بافت‌های گیاهی می‌شوند و این روش یکی از سازوکار‌های دفاعی گیاهان در برابر تنش فلزات سنگین است و از سوی دیگر بر اساس مطالعات پیشین که نشان داده‌اند گیاه تربچه به عنوان عضوی از تیره شب‌بو توانایی انباشت فلزات سنگین را دارد، فرضیه انتخاب شده در پژوهش حاضر آن بود که EDTA انباشت کروم را در گیاه تربچه افزایش می‌دهد. همچنین، در حضور EDTA علیرغم انباشت کروم در گیاه کاهش رشد معنی‌داری مشاهده نمی‌شود، بنابراین EDTA آستانه تحمل گیاه تربچه را نسبت به کروم سه ظرفیتی افزایش می‌دهد.
پژوهش حاضر به منظور بررسی تأثیر غلظت‌های مختلف EDTA بر انباشت فلز سنگین کروم سه ظرفیتی و همچنین، چگونگی تأثیر آن بر رشد و فیزیولوژی گیاه تربچه انجام شد، تا به این ترتیب غلظتی از همبندکننده انتخاب شود که ضمن کمک به افزایش تجمع فلز در گیاه، آستانه تحمل آن را به طور جدی کاهش ندهد، بلکه آن را افزایش دهد.
مواد و روش‌ها
روش کشت گلدانی گیاه تربچه و اعمال تیمارها
بذرهای گیاه تربچه پس از چند بار شستشو با آب، با هیپوکلریت سدیم 20 درصد به مدت 5 دقیقه ضدعفونی شدند و به منظور جذب رطوبت، با آب مقطر شسته، به مدت 24 ساعت در آب قرار گرفتند. پس از این مدت بذرها در گلدان‌های 1500 میلی‌لیتری حاوی ماسه (5 بذر در هر گلدان) کشت شدند و در اتاقک رشد، در دوره نوری 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی با شدت نور 2600 لوکس و دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. آبیاری روزانه گلدان‌ها با 200 میلی‌لیتر محلول غذایی هوگلند با اسیدیته 8/5 حاوی نیترات کلسیم، نیترات پتاسیم، سولفات منیزیم و فسفات دی هیدروژن پتاسیم به مدت 10 روز انجام شد. 11 روز پس از کشت، محلول غذایی هوگلند حاوی غلظت‌های مورد نظر از فلز کروم و همبندکننده EDTA تهیه و پس از تنظیم اسیدیته به گیاهان افزوده شد. تیمارها عبارت بودند از: چهار سطح نیترات کروم (1، 2، 4 و 6 میلی‌گرم در لیتر) (2/19، 4/38، 6/76 و 2/115 میکرومول) به همراه شاهد و دو سطح EDTA (1 و 3 میلی‌گرم در لیتر) (4/3 و 2/10 میکرومول). آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد.
زمان و روش نمونه‌برداری از گیاهان
گیاهان 4 هفته پس از شروع تیمارها برداشت شدند. در این مدت محلول غذایی هوگلند به صورت هفتگی تهیه و پس از افزودن تیمارهای مورد نظر و تنظیم اسیدیته به گیاهان اعمال شد. بخش هوایی، ریشه و بخش غده‌ای ریشه از یکدیگر جدا شد و پس از اندازه‌گیری صفات مورد بررسی، بخشی از نمونه‌ها برای سنجش‌های بیوشیمیایی بعدی خشک و بخشی دیگر در دمای 20- درجه سانتیگراد منجمد شدند.
اندازه‌گیری شاخص‌های رشد
سطح برگ گیاهان پس از جدا شدن از ساقه با استفاده از دستگاه اسکنر Ligt box (مدل Delta-T) اندازه‌گیری شد. وزن تر اندام هوایی، ریشه و بخش غده‌ای ریشه به طور جداگانه با ترازوی دیجیتال Sartorius با دقت 001/0 گرم و وزن خشک آنها پس از قرار گرفتن در آون (دمای 75 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت) تعیین شد. برای اندازه‌گیری سطح ریشه، نخست ریشه‌ها با محلول آبی رنگ متیل بنفش (برای ایجاد تضاد)، رنگ آمیزی شدند و سپس با دستگاه اسکنر Ligt box (مدل Delta-T)، سطح آنها تعیین شد.
سنجش‌های بیوشیمیایی
تعیین غلظت کروم موجود در اندام‌های گیاهی
برای سنجش مقدار کروم در بافت‌های گیاهی، نخست خاکستر تر با روش Wallis (1958) تهیه شد. برای این منظور 050/0 گرم بافت خشک گیاهی (برگ یا ریشه) درون ارلن‌های 25 میلی‌لیتری قرار گرفت. به هر یک از آنها 3 میلی‌لیتر نیتریک اسید غلیظ افزوده شد و روی هر یک از ارلن‌ها یک شیشه ساعت قرار داده شد (برای هضم بافت گیاهی)، پس از 48 تا 72 ساعت، ارلن‌ها به مدت 5/1 تا 2 ساعت روی اجاق‌گاز آزمایشگاه به آرامی حرارت داده شدند تا محلول درون آنها بی‌رنگ و نیتریک اسید تبخیر شود. سپس، حجم هر یک از ارلن‌ها در بالن ژوژه با آب مقطر به 25 میلی‌لیتر رسانده شد. پس از صاف کردن، جذب اتمی هر نمونه با دستگاه Hermle Atomic absorption (مدل AA-670G) ثبت شد.
سنجش مقدار پرولین
برای استخراج و سنجش پرولین از روش Bates و همکاران (1973) استفاده شد. پس از آماده شدن نمونه‌ها میزان جذب با دستگاه اسپکتروفتومتر Shimadzu (مدل UV-120-02) در طول موج 520 نانومتر ثبت شد.
تحلیل داده‌ها
برای تحلیل آماری داده‌ها و همچنین برای تحلیل واریانس داده‌ها از نرم‌افزارهای Jmp و Mstat-c استفاده شد. میانگین‌ها با آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 05/0≥P مقایسه و نمودارها با نرم‌افزار Excel رسم شد.
نتایج
تأثیر کروم بر شاخص‌های رشد
در این پژوهش، نشانه‌های سمیّت کروم در غلظت‌های 4 و 6 میلی‌گرم در لیتر، به صورت زردی در برگ‌های جوان و کوچک انتهایی مشاهده شد. اغلب ویژگی‌های رشد (طول، وزن تر و خشک اندام هوایی، سطح برگ و ریشه، نسبت وزن تر ریشه به وزن تر اندام هوایی، نسبت سطح برگ به سطح ریشه) در غلظت 6 میلی‌گرم در لیتر کروم نسبت به شاهد افزایش یافت. با وجود این، افزایش تنها در مورد سطح برگ معنی‌دار بود. بنابراین، در پژوهش حاضر، آستانه تحمل گیاه تربچه نسبت به کروم سه ظرفیتی بیشتر از غلظت‌هایی بود که در این تحقیق استفاده شد.
اثر متقابل کروم و همبندکننده بر شاخص‌های رشد
افزایش طول اندام هوایی، هنگام استفاده از 6 میلی‌گرم در لیتر کروم همراه با 1 میلی‌گرم در لیتر کلاتور، نسبت به شاهد معنی‌دار بود. همچنین، طول بخش هوایی با تیمارهای 1 و 6 میلی‌گرم در لیتر کروم، همراه با 1 میلی‌گرم در لیتر کلاتور، در مقایسه با گیاهان تیمار شده با غلظت‌های مشابه کروم بدون کلاتور به طرز معنی‌داری افزایش داشت (05/0≥(P (شکل 1).
طول ریشه تنها در تیمارهای 4 و 6 میلی‌گرم در لیتر کروم همراه با 3 میلی‌گرم در لیتر EDTA نسبت به تیمار کروم بدون همبندکننده افزایش معنی‌دار داشت (05/0≥P) (شکل 2).
کاربرد همبندکننده (3 میلی‌گرم در لیتر) همراه با کروم (4 و 6 میلی‌گرم در لیتر کروم) باعث افزایش معنی‌دار سطح برگ شد. این افزایش حتی در مقایسه با گیاهان شاهد هم معنی‌دار بود (05/0≥P) (شکل 3).
سطح ریشه در تیمار 6 میلی‌گرم در لیتر کروم همراه با همبندکننده (1 و 3 میلی‌گرم در لیتر) نیز نسبت به تیمار کروم به تنهایی و همین طور گیاهان شاهد افزایش معنی‌دار نشان داد (05/0≥P) (شکل 4).
انباشت کروم در بافت گیاهی
با افزایش غلظت کروم در محیط‌کشت، انباشت این فلز در اندام هوایی و ریشه افزایش یافت، با وجود این، روند افزایش نسبت به شاهد معنی‌دار نبود. اگر چه میزان تجمع کروم در ریشه بیشتر از بخش هوایی بود، اما این برتری نیز معنی‌دار نبود (جدول 1).
در این بررسی، حضور همبندکننده جذب فلز توسط گیاه را افزایش داد و میزان تجمع کروم در اندام‌های گیاه بیشتر از تیمار کروم بدون همبندکننده بود، اما این افزایش معنی‌دار نبود (جدول 1).
|
شکل 1- تأثیر سطوح مختلف Cr+3 و همبندکننده EDTA بر طول اندام هوایی. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0≥P) است. |
شکل 2- تأثیر سطوح مختلف Cr+3 و همبندکننده EDTA بر طول ریشه. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0≥P) است. |
|
شکل 3- تأثیر سطوح مختلف Cr+3 و همبندکننده EDTA بر سطح برگ. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0≥P) است. |
شکل 4- تأثیر سطوح مختلف Cr+3 و همبندکننده EDTA بر سطح ریشه. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0≥P) است. |
جدول 1- مقایسه میانگین داده‌های حاصل از تأثیرکروم و همبندکننده بر انباشت کروم در بافت‌های گیاه تربچه. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0≥P) است.
|
کروم (میلی‌گرم/لیتر) |
همبندکننده EDTA (میلی‌گرم/لیتر) |
مقدار کروم (گرم در 100 گرم وزن خشک) |
|
|
ریشه در گیاه |
اندام هوایی در گیاه |
||
|
1 |
0 |
a004/0±0324/0 |
a003/0±0142/0 |
|
1 |
1 |
ab004/0±0232/0 |
a003/0±0050/0 |
|
1 |
3 |
ab004/0±0133/0 |
a003/0±0108/0 |
|
2 |
0 |
b004/0±0073/0 |
a003/0±0099/0 |
|
2 |
1 |
ab004/0±0155/0 |
a003/0±0117/0 |
|
2 |
3 |
ab004/0±0152/0 |
a003/0±0104/0 |
|
4 |
0 |
ab004/0±0227/0 |
a003/0±0127/0 |
|
4 |
1 |
ab004/0±0267/0 |
a003/0±0187/0 |
|
4 |
3 |
ab004/0±0246/0 |
a003/0±0118/0 |
|
6 |
0 |
ab004/0±0180/0 |
a003/0±0092/0 |
|
6 |
1 |
ab004/0±0149/0 |
a003/0±0104/0 |
|
6 |
3 |
ab004/0±0271/0 |
a003/0±0129/0 |
تأثیر کروم و همبندکننده بر مقدار پرولین در بافت گیاهی
در بررسی حاضر، مقدار پرولین در اندام هوایی با افزایش غلظت کروم در محیط‌کشت افزایش یافت. مقدار پرولین در بیشترین سطح کروم (6 میلی‌گرم در لیتر) در مقایسه با گیاهان تیمار شده با کمترین سطح از فلز (یک میلی‌گرم در لیتر) افزایش معنی‌دار نشان داد (05/0≥P).
همچنین، استفاده از EDTA هم‌زمان با فلز کروم در محیط‌کشت، باعث کاهش مقدار پرولین در بخش هوایی گیاه تربچه شد. این کاهش در برخی تیمارها کاملاً مشخص بود (mg/L EDTA 3 + g/L Cr+3 6 و mg/L EDTA 3 +mg/L Cr+3 2) که می‌تواند نشانه‌ای از کاهش شرایط تنش‌زا توسط همبندکننده باشد (شکل 5). به نظر می‌رسد که با کاهش انتقال فلز از ریشه به بخش هوایی در حضور همبندکننده، مقدار پرولین در این بخش به طور معنی‌داری نسبت به تیمارهای فاقد همبندکننده کاهش می‌یابد.
شکل 5- تأثیر سطوح مختلف Cr+3 و همبندکننده EDTA بر مقدار پرولین در اندام هوایی. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0≥P) است.
بحث
در مجموع می‌توان گفت که غلظت‌های استفاده شده فلز سنگین کروم در این بررسی، تأثیر معنی‌دار و درخور توجهی بر رشد گیاه تربچه نداشتند، زیرا شاخص‌های رشد مانند طول اندام هوایی، طول ریشه، وزن تر و خشک اندام هوایی و ریشه در هیچ کدام از سطوح کروم نسبت به شاهد تغییر معنی‌داری نداشتند. با وجود این، افزایش سطح برگ در غلظت 6 میلی‌گرم در لیتر کروم معنی‌دار بود. با توجه به این نتایج می‌توان گفت که در پژوهش حاضر آستانه تحمل گیاه تربچه نسبت به کروم سه ظرفیتی بیشتر از غلظت‌هایی بود که در این طرح استفاده شد.
آثار سمّی کروم بر رشد در بسیاری از گونه‌های گیاهی بررسی شده است. برای مثال، Zaker (2004) با کشت گیاهچه‌های جعفری در محیط هیدروپونیک حاوی غلظت‌های مختلف Cr+3 نشان داد که جذب کروم رشد و میزان کلروفیل را درگیاهان به شدت تحت تأثیر قرار می‌دهد، به طوری که با افزایش غلظت کروم در محیط طول ریشه، وزن خشک ریشه، وزن خشک اندام هوایی و میزان کلروفیل به تدریج به طور معنی‌دار کاهش می‌یابد.
یافته‌های Panda و Patra (2000) نشان داد که طول ریشه در نهال‌های گیاه گندم تحت تأثیر یک میکرومول کروم افزایش و در غلظت‌های بیشتری از فلز کاهش می‌یابد.
در بررسی حاضر، استفاده از EDTA همراه با فلز سنگین باعث تحریک رشد گیاه تربچه شد. حضور EDTA به همراه کروم در محیط‌کشت باعث افزایش معنی‌دار صفات رشد مانند طول اندام هوایی و ریشه، سطح برگ و ریشه نسبت به تیمار کروم به تنهایی شد، به طوری که استفاده از 3 میلی‌گرم در لیتر EDTA (برخلاف غلظت یک میلی‌گرم در لیتر از آن) به همراه غلظت‌های 4 و 6 میلی‌گرم در لیتر کروم در محیط‌کشت، سبب افزایش معنی‌دار سطح برگ نسبت به تیمار کروم به تنهایی شد. افزایش سطح برگ یکی از عواملی است که می‌تواند با تقویت توان فتوسنتزی گیاه به رشد و سازش آن در شرایط تنش‌زا کمک کند. نتایج حاصل از این تحقیق نشان می دهد که غلظت 3 میلی‌گرم در لیتر EDTA می‌تواند علیرغم وجود فلز سنگین در محیط، طول ریشه را به طور قابل توجهی در گیاه تربچه افزایش دهد (به ویژه در غلظت‌های 4 و 6 میلی‌گرم در لیتر کروم). یکی از شاخص‌های مهم برای مقاومت گیاه نسبت به فلز سنگین تفاوت در طول ریشه است (Azhar et al., 2009). همچنین، استفاده از هر دو غلظت EDTA باعث افزایش معنی‌دار سطح ریشه نسبت به تیمار کروم به تنهایی شد. از آنجا که ریشه اندامی مهم در جلوگیری از انتقال فلزات سنگین به بخش هوایی است، بدیهی است که تقویت آن به ویژه در سطوح بالاتر فلز سنگین به سازگاری گیاه در برابر آثار مضر فلز کمک می‌کند. مشاهده افزایش معنی‌دار رشد ریشه در گیاهان تیمار شده با 3 میلی‌گرم در لیتر EDTA و 6 میلی‌گرم در لیتر کروم شاهدی بر این ادعا است. از این نظر، غلظت بالاتر همبندکننده تأثیر بیشتری داشت. به طور کلی، تأثیر همبندکننده بر طول و سطح ریشه بیشتر از تأثیر آن بر بخش هوایی بود و حضور آن باعث بهبود رشد گیاهان شد.
استفاده از EDTA همراه با فلزات سنگین و بررسی اثر آن بر رشد گیاهان مختلف توسط پژوهشگران متعددی انجام شده است و نتایج حاصل بسته به نوع گیاه و نوع فلز سنگین متفاوت است. برای مثال، در مطالعه‌ای که توسط Zeid و Abou El Ghate (2007) انجام شد، رشد گیاهچه‌های لوبیا که با پساب حاوی فلزات سنگین مس، روی، کادمیوم و سرب آبیاری شده بودند در حضور EDTA بررسی و مشخص شد که همبندکننده اثر ممانعتی فلزات سنگین بر رشد گیاهچه‌ها را کاهش می‌دهد.
بر اساس تحقیق Azhar و همکاران (2009) استفاده از EDTA و فلز به تنهایی، وزن خشک اندام هوایی و ریشه را در گیاه آفتابگردان کاهش داد. در حالی که استفاده از 1 و 5/1 میلی‌مول همبندکننده همراه با یک میلی‌مول سرب به ترتیب باعث بهبود وزن خشک اندام هوایی و وزن خشک ریشه شد.
طبق بررسی Krystofova و همکاران (2009) گیاهان آفتابگردان تیمار شده با غلظت‌های مختلف سرب به همراه EDTA، نسبت به شاهد سریع‌تر رشد کردند و افزایش مشخصی در وزن خشک و طول اندام هوایی و وزن تر ریشه داشتند (به جز در بالاترین غلظت‌ها).
از سوی دیگر، برخی گزارش‌ها نشان‌دهنده کاهش ماده خشک گیاهی تحت تأثیر EDTA هستند. برای مثال، در مطالعه‌ای Xu و همکاران (2009)، تأثیر روی، کادمیوم و EDTA بر رشدگیاه Vetiveria zizanioides بررسی شد. بر اساس نتایج به دست آمده در مقایسه با گیاهان شاهد، وزن خشک اندام هوایی و ریشه گیاه در حضور EDTA به ترتیب 10 و 15 درصد کاهش یافت.
مطالعه Cui و همکاران (2006) نشان داده است که EDTA اثر ممانعتی فلز بر طویل شدن ریشه را کاهش می‌دهد و باعث افزایش تعداد ریشه‌های جانبی می‌شود.
بر اساس نتایج پژوهش حاضر با افزایش مقدار فلز در محیط‌کشت، مقدار فلز سنگین در بافت‌های گیاهی (اندام هوایی و ریشه) نیز افزایش می‌یابد. همچنین، بررسی مقدار کروم موجود در ریشه و بخش هوایی گیاه تربچه، نشان داد که مقدار فلز در ریشه حدود 5/1 تا 2 برابر بیشتر از اندام هوایی است و بخش عمده‌ای از فلز سنگین که توسط گیاه جذب می‌شود، در خود ریشه باقی می‌ماند. این امر می‌تواند یکی از راه‌های تحمل و مقاومت گیاه نسبت به فلزات سنگین باشد.
علت انباشت بیشتر کروم در ریشه می‌تواند عدم تحرک کروم در واکوئل‌های سلول‌های ریشه باشد که به کاهش سمیّت کروم منجر می‌شود (Shanker et al., 2005).
تجمع بیشتر کروم در ریشه گیاهان نسبت به بخش هوایی توسط Jamshidi (2006) روی گیاه تربچه و Dogo و همکاران (2011) روی گیاه نعناع (Menthia piperita) گزارش شده است.
در کشت‌های هیدروپونیک چندین گونه گیاهی مانند تربچه، گوجه‌فرنگی، چغندر و کلم انتقال کروم از ریشه به بخش هوایی به طور گسترده‌ای توسط گیاهان محدود می‌شود، به طوری که مقدار انباشت کروم در ریشه 100 برابر بیشتر از بخش هوایی است (Zayed et al., 1998).
تأثیر مثبت همبندکننده EDTA بر جذب فلزات سنگین توسط ریشه گیاهان مختلف نظیر نخود‌فرنگی (Piechalak et al., 2003) و آفتابگردان (Chen and Cutright, 2001؛ (Lesage et al., 2005 گزارش شده است.
بررسی‌های نشان داده‌اند که جذب کمپلکس فلز-EDTA از طریق آپوپلاست به شکل غیر انتخابی انجام می‌شود (Hernández-Allica et al., 2007). اثر همبند شدن بر جذب فلز به مکانیسم‌های مختلف جذب فلز بستگی دارد. همبندکننده می‌تواند با اثر بر میزان حلالیت و تحرک فلز در خاک یا محیط‌کشت در جذب آن تأثیر بگذارد (Gupta et al., 2008). مکانیسم اصلی که در تحرک فلز توسط همبندکننده نقش دارد، تغییر در تعادل آلاینده‌ها بین فاز محلول خاک و فاز جامد آن است. هنگامی که همبندکننده‌ها به خاک اضافه می‌شوند، با فلزات کمپلکس‌های محلول تشکیل می‌دهند و به این ترتیب باعث تحرک فلز می‌شوند. مطابق با نظریه غالب مبنی بر جذب فلز همبند شده توسط گیاهان، تنها یون‌های آزاد جدا شده از کمپلکس فلز-لیگاند جذب ریشه‌های گیاه می‌شوند و لیگاند در محلول خاک باقی می‌ماند. بر اساس نظریه دیگر، کمپلکس‌های فلز-لیگاند جذب شده توسط ریشه‌های گیاه از طریق گزیلم به بخش هوایی منتقل در آن جا انباشته می‌شوند. علاوه بر این، نظریه دیگر وجود دارد که EDTA پروتونه آزاد پس از ورود به ریشه گیاه با فلز کمپلکسی را تشکیل و انتقال فلز را به بخش هوایی افزایش می‌دهد (Wu et al., 2007).
در تحقیق حاضر، جذب فلز توسط گیاه در حضور همبندکننده افزایش یافت و مقدار کروم انباشته شده در اندام‌های گیاه بیشتر از تیمار کروم بدون همبندکننده بود. اگر چه این افزایش از نظر آماری معنی‌دار نیست، اما ممکن است از تأثیر EDTA بر مقدار تثبیت فلز در سطح بستر کشت و حلالیت آن ناشی شده باشد. همچنین، این احتمال نیز مردود نیست که مقادیر استفاده شده از EDTA برای همبند کردن غلظت‌های به کار رفته از فلز کافی نبوده باشد.
انباشت پرولین به عنوان یک نشانگر برای شرایط تنش‌زای محیطی محسوب می‌شود و نقش حیاتی و مهمی در این زمینه دارد (Hajiboland and Hasani, 2007). پرولین می‌تواند به عنوان منبع کربن و نیتروژن در شرایط تنش‌زا عمل کند. همچنین، در نقش آنتی‌اکسیدان (Pál et al., 2006) با حذف گونه‌های فعال اکسیژن و رادیکال‌های آزاد به تثبیت ماکرومولکول‌ها کمک کند. این آمینو اسید می‌تواند همبندکننده فلزات باشد (Sharma and Dietz, 2006) و با تنظیم اسیدیته و تثبیت سنتز پروتئین‌ها، گیاه را در شرایط تنش‌زا حمایت کند (Pál et al., 2006).
در این مطالعه، مقدار پرولین در اندام هوایی گیاهان تیمار شده با کروم با افزایش غلظت کروم از 2 تا 6 میلی‌گرم در لیتر افزایش یافت که می‌تواند سازوکار احتمالی در گیاه تربچه برای تحفیف آثار سوء فلز سنگین کروم باشد.
به طور مشابه Schat و همکاران (1997) با مطالعه القای انباشت پرولین در حضور مس، کادمیوم و روی در اکوتیپ‌های مقاوم وغیر مقاوم Silene vulgaris گزارش کردند که مقدار پرولین در برگ اکوتیپ‌های مقاوم 5 تا 6 برابر بیشتر از اکوتیپ‌های غیرمقاوم است.
در مطالعه‌ای که توسط Hajibolandو Hasani (2007) انجام شد، سمیّت منگنز و مس در گیاه برنج و آفتابگردان بررسی و افزایش معنی‌داری در مقدار پرولین مشاهده شد. مطالعات انجام شده روی گیاه آفتابگردان نشان داده است که حضور فلزات سرب و نیکل شدت تأثیر تنش شوری را در گیاه افزایش می‌دهد و به این ترتیب غلظت پرولین در برگ‌های گیاه افزایش می‌یابد (Saima et al., 2010).
در تحقیق حاضر، حضور هم‌زمان EDTA و کروم در محیط‌کشت باعث کاهش معنی‌دار مقدار پرولین در اندام هوایی گیاه تربچه شد. به طوری که مقدار پرولین در غلظت 6 میلی‌گرم در لیتر کروم به طور معنی‌داری نسبت به تیمار کروم به تنهایی کاهش یافت. همچنین، در حضور یک میلی‌گرم در لیتر EDTA به همراه 6 میلی‌گرم در لیتر کروم، مقدار پرولین نسبت به تیمار کروم به تنهایی به نصف کاهش یافت. از طرفی، مقدار پرولین در اندام هوایی گیاهان تیمار شده با 6 میلی‌گرم در لیتر کروم (بدون حضور همبندکننده)، 4 برابر مقدار آن در اندام هوایی گیاهان تیمار شده با 3 میلی‌گرم در لیتر EDTA و 6 میلی‌گرم در لیتر کروم بود. به این ترتیب غلظت بیشتر همبندکننده باعث کاهش بیشتر مقدار پرولین در بافت گیاهی نسبت به تیمار کروم به تنهایی می‌شود. این نتیجه می‌تواند تأییدی بر تأثیر مثبت همبندکننده بر کاهش تنش ناشی از کروم در گیاه تربچه باشد.
در تأیید این نتیجه می‌توان به مطالعه Saleh (2002) روی گیاه اسفناج آبی (Chorcorus olitorius) درباره اثر تنش نیکل و استفاده از EDTA اشاره کرد. این پژوهشگران نشان دادند که با افزایش غلظت نیکل مقدار پرولین در اندام هوایی به طور معنی‌داری افزایش و در صورت استفاده از تیمار EDTA کاهش می‌یابد.
جمع‌بندی
پژوهش حاضر برای نخستین بار تأثیر همبندکننده EDTA را بر رشد و انباشتگی کروم در گیاه تربچه بررسی کرد. نتایج نشان داد که گیاه تربچه می‌تواند تا غلظت 6 میلی‌گرم در لیتر کروم سه ظرفیتی را به خوبی تحمل کند، بدون آن که کاهش معنی‌دار و شدیدی در شاخص‌های رشد آن ایجاد شود.
استفاده هم‌زمان همبندکننده EDTA و فلز کروم می‌تواند در برخی غلظت‌ها باعث بهبود شاخص‌های رشد مانند طول اندام هوایی و ریشه، سطح برگ و سطح ریشه نسبت به تیمار فلز به تنهایی و حتی در برخی موارد نسبت به شاهد شود. در حضور همبندکننده مقدار انباشتگی کروم در اندام‌های زیرزمینی و هوایی گیاه به طور چشم‌گیر و معنی‌داری تغییر نکرد. بنابراین، به نظر نمی‌رسد که غلظت‌های به کار گرفته شده از کروم و EDTA بر جذب و انتقال فلز از ریشه به اندام هوایی تأثیر معنی‌داری داشته باشند و از این طریق تأثیر مثبت بر رشد گیاه اعمال نموده باشند.
کاهش معنی‌دار مقدار پرولین به عنوان ماده آنتی‌اکسیدان و ضد تنش با عملکردهای متعدد، در حضور همبندکننده می‌تواند نشانه‌ای از کاهش شدت تنش وارد به گیاه و تخفیف آن در حضور EDTA باشد. برای درک مکانیسم اثر همبندکننده بر بهبود رشد گیاه و تخفیف آثار تنش، بررسی‌های بیشتری نظیر چگونگی تأثیر آن بر سیستم‌های آنزیمی از جمله آنزیم‌های دخیل در متابولیسم یا آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، مقدار هورمون‌های تنظیم‌کننده رشد و شاخص‌های مربوط به روابط آبی نظیر پتانسیل آب برگ، پتانسیل اسمزی و فشار تورژسانس ضروری است.
سپاسگزاری
با سپاس فراوان از اساتید ارجمند، مسؤولان محترم پژوهشکده گیاهی، آزمایشگاه فیزیولوژی گیاهی و تجزیه دستگاهی که در مراحل گوناگون انجام این پژوهش نقش ویژه داشتند.
)
