نویسندگان
1 گروه زیست‌شناسی، دانشگاه پیام نور، تهران 3697 - 19395، تهران، ایران
2 گروه اکولوژی، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Glycyrrhiza glabra L. (Licorice) is one of the oldest medicinal plants in Iran and secondary metabolites present in the plant root is used in food and pharmaceutical industries. With the use of heavy metals as elicitors, plant secondary metabolite production can be increased. In this study, the effects of the concentrations of 1 and 10 µM of zinc oxide and copper oxide on the contents of reducing sugars (as precursor of secondary metabolites), proline, glycyrrhizin, total phenolic compounds, flavonoids and anthocyanins in Glycyrrhiza glabra seedlings were investigated. Also, the correlation between the content of these metabolites in the treated seedlings was examined using Pearson's test. The amount of reducing sugars at concentration of 10 µM zinc oxide was decreased. Whereas, the amounts of proline and glycyrrhizin under treatment 1 and 10 µM copper oxide and 1 µM zinc oxide compared with the control plants was increased. The content of total phenolic compounds was increased with increasing concentrations of copper oxide. The highest amount of flavonoids was observed at concentrations of 1 and 10 µM copper oxide. Anthocyanin content was increased in concentration of 1 µM copper oxide. Also, the tannin content of the Glycyrrhiza glabra seedlings at concentrations of 10 µM zinc oxide was increased. Based on the result it seemed that at concentrations of 1 and 10 µM copper oxide the amount of glycyrrhizin, phenolic compounds, flavonoids, anthocyanins were significantly increased, whereas, zinc oxide had no significant impact on the levels of these metabolites.
کلیدواژه‌ها [English]
شیرینبیان (Glycyrrhiza glabra L.) گیاهی از تیره باقلائیان (Fabaceae)، بومی شمال‌شرق اروپا و جنوب‌غرب آسیا از جمله ایران است. ریشه‌های این گیاه منابع با ارزشی از مواد شیمیایی مفید مانند متابولیت‌های ثانویه و آنزیم‌ها را دارند که در صنعت داروسازی و صنایع غذایی کاربرد دارند (Irani et al., 2010). مهم‌ترین ترکیبات آن گلیسیریزین و ترکیبات فنلی هستند (Shibata, 2000). قندهای احیا کننده می‌توانند در مسیر پنتوزفسفاتاکسیداتیو سنتز به عنوان پیش‌سازهایی برای تولید متابولیت ثانویه در گیاهان استفاده شوند (Vincenzo et al., 2005). آنزیم
β-آمیرین‌سنتاز، آنزیم کلیدی برای سنتز ساپونین‌تری‌ترپنوئیدهاست. گلیسیریزین نوعی ساپونین‌تری‌ترپنوئید است که از طریق مسیر موالونیک اسید سنتز می‌شود (Shibuya et al., 2009)، در حالی که ترکیبات فنلی از طریق مسیر شیکمیک اسید سنتز می‌شوند (Michalak, 2006).
فلزات سنگین گروهی از عناصر هستند که وزن مولکولی بالاتر از gcm-3 5 دارند. برخی از این فلزات ریزمغذی‌های ضروری برای رشد گیاه هستند که در واکنش‌های اکسایش-کاهش، انتقال الکترون و سایر فرآیندهای متابولیک مهم گیاه نقش دارند. این فلزات در غلظت بالا برای گیاه سمیّت ایجاد می‌کنند (Michalak, 2006). ورود این آلاینده‌ها به محیط از طریق فعالیت‌های شهری، عملیات کشاورزی و صنعتی است (Clemens, 2001). فلزات سنگین فرآیندهای فیزیولوژیک مانند: تنفس، فتوسنتز، طویل شدن سلول، روابط آبی گیاه، متابولیسم نیتروژن و تغذیه معدنی گیاه را مهار می‌کنند (Zornoza et al., 2002). مس عنصری کم‌مصرف، اما ضروری برای تمام گیاهان عالی است (Patcikka et al., 2002). این عنصر در سطح سلولی ترکیب ساختاری و کاتالیتیک بسیاری از آنزیم‌ها و پروتئین‌هایی است که در برخی از مسیرهای متابولیکی درگیر هستند (Pilon et al., 2006). مس نقش‌های متابولیکی فراوانی در گیاه دارد و در فرآیندهای تنفس و فتوسنتز ایفای نقش می‌کند. زمانی که غلظت آن در خاک از سطح بسیار اندک (50 میکرومولار) تجاوز کند به شدت سمّی می‌شود (Berglund et al., 2000). روی نیز عنصری ضروری برای رشدونمو گیاهان بوده، در بسیاری از فرآیندهای متابولیک گیاه نقش دارد. این فلز فعال کننده و کوفاکتور برخی از آنزیم‌های حیاتی گیاه از جمله: کربونیک‌انیدرازها، دهیدروژنازها، آلکالین‌‌فسفاتازها، فسفولیپاز‌ها و RNAپلی‌مرازها در متابولیسم پروتئین‌ها، قندها، اسیدهای نوکلئیک و چربی‌ها، فتوسنتز گیاه و بیوسنتز اکسین است (Rion and Alloway, 2004).
گزارش‌های متعددی وجود دارد که نشان می‌دهد تولید متابولیت‌های ثانویه را می‌توان با کاربرد محرک‌های زیستی و غیر زیستی مثل فلزات سنگین افزایش داد در این راستا، Tumova و Polivkova (2006) افزایش مقدار فلاونوئید توسط فلزات نقره و کروم در گیاه Ononis arvensis را گزارش کردند. همچنین، Bota و Deliu (2011) افزایش مقدار فلاونوئید توسط فلز مس را در گیاه Digitalis lanata گزارش کردند. Diaz و همکاران (2001) نشان دادند که استفاده از فلز مس در گیاه Capsicum annum L. به افزایش میزان ترکیبات فنلی در این گیاه منجر می‌شود. فلز روی باعث افزایش اسانس در گیاه Matricaria chamomilla شده است (Nasiri et al., 2010). Shabani و همکاران (2009) بیان کردند که تولید گلیسیریزین در گیاه شیرینبیان با استفاده از الیسیتورهای متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید در شرایط کشت در شیشه افزایش می‌یابد. همچنین، Winida و همکاران (2011) گزارش کردند که متیل جاسمونات افزایش تولید گلیسیریزین در ریشه‌های مویین گیاه شیرینبیان را تحریک می‌کند.
گیاه شیرینبیان از گیاهان مهم دارویی ایران محسوب می‌شود که با تولید تری‌ترپن گلیسیریزین در ریشه‌های خود، از دیربار توجه پژوهشگران را به خود معطوف داشته است و از آنجا که ویژگی‌های درمانی گیاهان دارویی اغلب ناشی از تجمع متابولیت‌های ثانویه در آنهاست، نیاز به پژوهش بیشتر برای شناسایی و بررسی مکانیسم‌های مؤثر بر افزایش تولید این مواد مؤثره وجود دارد. بنابراین، پژوهش حاضر با هدف بررسی عکس‌العمل گیاهچههای شیرینبیان در پاسخ به تنش‌های فلزات سنگین مس و روی در تولید گلیسیریزین و سایر متابولیت‌ها از جمله قندهای احیا‌کننده، پرولین، ترکیبات فنلی کل، فلاونوئیدها، آنتوسیانینها و تاننها و رسیدن به دانش بیشتری درباره مکانیسم‌های دفاعی و تغییرات فیزیولوژیک این گیاه انجام شده است.
مواد و روش‌ها
بذرهای گیاه شیرینبیان (Glycyrrhiza glabra L.) از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد. بذرها پس از ضدعفونی شدن (20 دقیقه در سولفوریک اسید 100 درصد، سه بار شستشو با آب‌مقطر استریل، 15 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 3 درصد) در ظروف شیشه‌ای با 3 تکرار حاوی محیط‌کشت جامد آگار 8/0 درصد و محلول غذایی هوگلند کامل تحت تیمارهای اکسید روی و اکسید مس در غلظت‌های صفر، 1 و 10 میکرومولار کشت شدند (در ظروف شیشه‌ای اتوکلاو شده) بذرهای کشت شده در شرایط طبیعی گلخانه و فتوپریود 8 ساعت تاریکی و 16 ساعت نور با شدت نور 14 کیلو لوکس نگهداری شد. دمای گلخانه در حدود 25 تا 27 درجه سانتیگراد تنظیم شد. برای سنجش ترکیبات مورد نظر از گیاهچههای کامل (شامل اندام هوایی و ریشه) 21 روزه حاصل از کشت بذرها استفاده شد.
اندازه‌گیری محتوای قندهای احیا کننده
میزان قندهای احیا کننده در گیاهچه با روش Nelson-Somogyi (1952) اندازه‌گیری شد. مقدار 02/0 گرم بافت تر گیاهچه در 15 میلی‌لیتر آب‌مقطر ساییده شد. سپس، محتوای هاون به بشر کوچکی منتقل شد. به محض آن که به نقطه جوش رسید، حرارت قطع و محتوای بشر با کاغذ صافی واتمن شماره یک صاف شد و عصاره گیاهی به دست آمد. شدت جذب محلو‌ل‌ها در طول موج 600 نانومتر خوانده شد و با منحنی استاندارد، غلظت قندهای احیا کننده بر حسب میلی‌گرم بر لیتر محاسبه شد.
اندازه‌گیری محتوای پرولین
محتوای پرولین با روش Bates و همکاران(1973) اندازه‌گیری شد. مقدار 01/0 گرم بافت تازه گیاهچه در 10 میلی‌لیتر سولفوسالیسیلیک اسید 3 درصد ساییده و به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ (مدل 2028R، شرکت Napco، ساخت آمریکا) شد. سپس، 1 میلی‌لیتر از محلول رویی با 1 میلی‌لیتر استیک اسید و 1 میلی‌لیتر معرف نین‌هیدرین مخلوط و به مدت یک ساعت در دمای 100 درجه سانتیگراد آب گرم قرار داده شد. سپس، نمونه‌ها در حمام آب یخ قرار گرفت و 2 میلی‌لیتر تولوئن به مخلوط اضافه شد تا دو لایه مجزا تشکیل شود. از لایه رنگی بالایی که حاوی تولوئن و پرولین است برای سنجش استفاده شد و جذب با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل Cary 50، شرکت Varian، ساخت استرالیا) در طول موج 520 نانومتر خوانده شد.
اندازه‌گیری محتوای گلیسیریزین
برای سنجش میزانگلیسیریزین بر اساس روش تغییر یافته Jeffry و همکاران (1983) و Mukhopadhyay و Panja (2008) به 5/0 گرم بافت خشک گیاهچه شیرینبیان، 10 میلی‌لیتر آب‌مقطر افزوده شد و محلول به مدت 60 دقیقه در دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 بار اتوکلاو شد. پس از خنک شدن، به محلول حاصل قطره قطره سولفوریک اسید غلیظ 95 درصد اضافه شد تا گلیسریزیک اسید به تدریج رسوب نماید. پس از جدا کردن محتویات فوقانی رسوب به منظور حذف باقیمانده اسید، به آن آب و اتانول به نسبت (1 به 1) اضافه و توسط دستگاه سانتریفیوژ به مدت 15 دقیقه با دور
g 10000 سانتریفیوژ شد. پس از جدا کردن آب و اتانول از بخش فوقانی، رسوب به دست آمده در آون در دمای 60 درجه سانتیگراد خشک شد (Mukhopadhyay and Panja, 2008). سپس، به این ترکیب 3 میلی‌لیتر متانول افزوده شد تا به شکل محلول در آید و شدت جذب در طول موج 254 نانومتر، با دستگاه اسپکتروفتومتر
UV-visible خوانده شد. با استفاده از منحنی استاندارد، غلظت گلیسریزین محاسبه شد. برای رسم منحنی استانداردمقدار 10 میلی‌گرم از پودر نمک آمونیوم‌گلیسریزیک‌اسید با متانول 80 درصد به حجم 10 میلی‌لیتر رسانده شد. بنابراین، محلول استانداردی با غلظت یک میلی‌گرم در یک میلی‌لیتر تهیه شد (Shabani et al., 2009). سپس، از این محلول استانداردهایی با غلظت‌های 5/10، 21، 42، 83 و 167میلی‌گرم در لیتر تهیه شدند و شدت جذب محلول‌های استاندارد و نمونه‌های گیاهی در طول موج 245 نانومتر با اسپکتروفتومتر خوانده شد و منحنی جذب بر حسب غلظت رسم شد.
اندازه‌گیری ترکیبات فنلی
برای اندازه‌گیری ترکیبات فنلی مقدار 1/0گرم از بافت تازه گیاهچه در 5 میلی‌لیتر اتانول 95 درصد ساییده شد و به مدت 24 ساعت در تاریکی نگهداری شد. سپس 1 میلی‌لیتر از محلول رویی به 1 میلی‌لیتر اتانول 95 درصد اضافه و با آب دوبار تقطیر حجم محلول به 5 میلی‌لیتر رسانده شد. مقدار 5/0 میلی‌لیتر معرف فولین 50 درصد و 1 میلی‌لیتر کربنات سدیم 5 درصد به آن اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت یک ساعت در تاریکی نگهداری شد. سپس جذب هر نمونه در طول موج 725 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر UV-visible خوانده شد (Soland and Lima, 1999). برای محاسبه غلظت ترکیبات فنلی از منحنی استاندارد استفاده شد. برای رسم منحنی استاندارد غلظت‌های 5، 10، 25، 50 و 100 میلی‌گرم بر لیتر گالیک اسید تهیه شد. مقدار 1 میلی‌لیتر از محلول‌های استاندارد در لوله آزمایش ریخته شد. سایر مراحل مشابه با نمونه‌های مجهول انجام شد. پس از رسم منحنی استاندارد، غلظت ترکیبات فنلی نمونه‌ها تعیین شد.
اندازه‌گیری فلاونوئیدها
برای سنجش میزان فلاونوئیدها مقدار 1/0گرم وزن تر گیاهچه در 10 میلی‌لیتر اتانول اسیدی (شامل الکل اتیلیک 95 درصد و استیک اسید گلاسیال به نسبت 99 به 1) ساییده و عصاره حاصل به مدت 10 دقیقه با دور g4000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی جدا شد و به مدت 10 دقیقه به آرامی در حمام آب‌گرم با دمای 80 درجه سانتیگراد حرارت داده شد. سپس، شدت جذب با دستگاه اسپکتروفتومتر در سه طول موج 270، 300 و 330 نانومتر خوانده شد. برای تنظیم دستگاه اسپکتروفتومتر از اتانول اسیدی به عنوان شاهد استفاده شد. مقایسه میزان این ترکیبات بر اساس شدت جذب خوانده شده در این طول موج‌ها انجام شد (Krizek et al., 1988).
اندازه‌گیری میزان آنتوسیانین
برای سنجش میزان آنتوسیانینها، 1/0 گرم برگ تر گیاهچه با دقت وزن شد و با 5 میلی‌لیتر متانول اسیدی (الکل متیلیک 5/99 درصد و کلریدریک اسید خالص به نسبت 99 به 1) به خوبی ساییده شد. سپس 5 میلی‌لیتر متانول اسیدی دیگر به آن اضافه شد (حجم نهایی محلول با متانول اسیدی به 10 میلی‌لیتر رسانده شد). عصاره حاصل به لوله آزمایش در‌پیچ‌دار منتقل و به مدت 24 ساعت در تاریکی در دمای آزمایشگاه نگهداری شد. پس از آن نمونه‌ها به مدت 10 دقیقه در دور g4000 سانتریفیوژ شدند و از محلول رویی برای خواندن شدت جذب نمونه‌ها در طول موج 550 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر UV-visible استفاده شد (Wanger, 1979). برای تعیین غلظت آنتوسیانینها از ضریب خاموشی معادل mM-1cm-133000 استفاده شد. برای محاسبه غلظت از رابطه εbc=A استفاده شد. در این رابطه: A = میزان جذب خوانده شده در طول موج 550 نانومتر، ε= ضریب خاموشی، b = عرض کووت (1 سانتی‌متر) و c = غلظت بر حسب میلی‌مولار است.
اندازه‌گیری میزان تانن
برای اندازه‌گیری محتوای تاننها از روش Luthar و Kreft (1999) استفاده شد. مقدار 5/0 گرم بافت تازه گیاهچه در 10 میلی‌لیتر متانول عصاره‌گیری شد و به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت. 1 میلی‌لیتر از محلول رویی با 5 میلی‌لیتر معرف وانیلین (وانیلین 1 درصد، کلریدریک اسید 8 درصد با نسبت 50:50 در متانول) حل و به مدت 20 دقیقه در 28 درجه سانتیگراد نگهداری شد. سپس، شدت جذب هر نمونه در طول موج 500 نانومتر خوانده شد.
نتایج
نتایج تجزیه واریانس حاصل از تأثیر اکسید روی و اکسید مس بر میزان متابولیت‌های گیاهچههای شیرینبیان نشان داد که میزان قندهای احیا کننده، پرولین، گلیسیریزین، ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و محتوای آنتوسیانین‌های گیاهچه‌ها تحت تأثیر تیمارها در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار است (جدول 1).
نتایج به دست آمده از پژوهش حاضر نشان داد میزان قندهای احیا کننده گیاهچههای تیمار شده با اکسید مس و اکسید روی در غلظت 10 میکرومولار اکسید روی نسبت به گیاه شاهد کاهش معنی‌داری داشته است (شکل 1-a، جدول 2). این در حالی است که محتوای پرولین و گلیسیریزین در غلظت‌های 1 و 10 میکرومولار اکسید مس و 1 میکرومولار اکسید روی نسبت به نمونه شاهد افزایش معنی‌داری نشان داده است (به ترتیب شکل‌های 1-b و 1-d و جدول 2). میزان ترکیبات فنلی کل گیاهچه‌ها در غلظت 10 میکرومولار اکسید مس نسبت به گیاه شاهد افزایش معنی‌داری داشت (شکل 1-c، جدول 2). همچنین، میزان فلاونوئیدها در طول موج 300 نانومتر و میزان آنتوسیانینها در غلظت‌های 1 و 10 میکرومولار اکسید مس نسبت به نمونه شاهد افزایش معنی‌داری نشان داد (به ترتیب شکل‌های 2-B و 2-D، جدول 2). میزان تانن نیز در غلظت 1 میکرومولار اکسید روی نسبت به نمونه شاهد افزایش معنی‌داری نشان داد (شکل 2-E، جدول 2).
جدول 1- تجزیه واریانس حاصل از تأثیر تیمار اکسید روی و اکسید مس بر میزان متابولیت‌های گیاهچه شیرینبیان. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است.* و ** به ترتیب در سطح احتمال 5 درصد و 1 درصد معنی‌دار است.
|
میانگین مربعات |
درجه آزادی |
منابع تغییرات |
|
٭٭979/55 |
4 |
میزان قند احیا کننده (mgg-1FW) |
|
459/18** |
4 |
میزان پرولین (µML-1) |
|
٭٭819/80 |
4 |
میزان گلیسریزین (mgg-1FW) |
|
٭٭557/0 |
4 |
شدت جذب فلاونوئیدها (nm270) |
|
٭٭063/0 |
4 |
شدت جذب فلاونوئیدها (nm300) |
|
٭٭026/0 |
4 |
شدت جذب فلاونوئیدها (nm330) |
|
٭٭019/184 |
4 |
میزان ترکیبات فنلی (mg/L) |
|
٭٭007/0 |
4 |
میزان آنتوسیانینها (nM) |
|
٭٭005/0 |
4 |
میزان تاننها (A%) |
شکل 1- اثر اکسید روی و اکسید مس بر محتوای قند احیا کننده. (A پرولین، (B ترکیبات فنلی، (C گلیسریزین، (D در گیاهچه شیرینبیان. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.
جدول 2- تأثیر اکسید روی و اکسید مس بر میزان متابولیت‌های گیاهچه شیرینبیان. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.
|
شکل 2- اثر اکسید روی و اکسید مس بر شدت جذب فلاونوئیدها در طول موج 270 نانومتر (A)، 300نانومتر (B)، 330 نانومتر (C)، آنتوسیانینها (D) و تاننها (E) در گیاهچه شیرینبیان. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است. |
نتایج حاصل از مطالعه همبستگی متغیرها بر اساس آزمون پیرسون در گیاهچههای تیمار شده با اکسید مس، بین محتوای گلیسیریزین و میزان فلاونوئیدها در طول موج 270 نانومتر همبستگی منفی و معنی‌داری (*999/0-) نشان داد (جدول 3). در گیاهچههای تیمار شده با اکسید روی بین محتوای ترکیبات فنلی با میزان فلاونوئیدها در طول موج 300 نانومتر همبستگی مثبت و معنی‌داری (*999/0) مشاهده شد. همچنین، بین محتوای آنتوسیانینها با میزان فلاونوئیدها در طول موج 270 نانومتر نیز همبستگی مثبت و معنی‌داری (*998/0) وجود داشت (جدول 4).
جدول 3- همبستگی شاخص‌های اندازه‌گیری شده گیاهچه شیرینبیان در تیمار با اکسید مس. * و ** به ترتیب در سطح احتمال 5 درصد و 1 درصد معنی‌دار است.
جدول 4- همبستگی شاخص‌های اندازه‌گیری شده گیاهچه شیرینبیان در تیمار با اکسید روی. * و ** به ترتیب در سطح احتمال 5 درصد و 1 درصد معنی‌دار است.
بحث
نتایج حاصل از تأثیر اکسید روی و اکسید مس بر میزان قند گیاهچه شیرینبیان نشان داد که میزان قند در غلظت 10 میکرومولار اکسید روی نسبت به نمونه شاهد کاهش معنی‌داری داشته است، در حالی که محتوای پرولین در تیمار 10 میکرومولار اکسید روی در مقایسه با نمونه شاهد تفاوت معنی‌داری نداشت. همچنین، محتوای گلیسیریزین، ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و آنتوسیانینها در این تیمار نسبت با شاهد تفاوت معنی‌داری نشان نداد. قندهای احیا کننده می‌توانند در مسیر پنتوزفسفاتاکسیداتیو سنتز و به عنوان پیش‌سازهایی برای تولید متابولیت ثانویه در گیاهان استفاده شوند (Vincenzo et al., 2005). با توجه به نتایج به دست آمده در این پژوهش، به نظر می‌رسد قندهای احیا کننده در مسیر تولید این متابولیت‌ها وارد نشده‌اند. قند ترکیبی است که طی فتوسنتز تشکیل می‌شود. مهار فتوسنتز طی تنش فلزات سنگین در گیاهان عالی گزارش شده است. Kumar و همکاران (2012) بیان کردند که میزان قند گیاه گندم، در غلظت‌های 150، 280 و 600 ppm فلزات روی و مس با افزایش غلظت، کاهش می‌یابد. کاهش میزان قند گیاهچههای تیمار شده با اکسید روی ممکن است به علت کاهش سنتز یا انحراف از مسیر سنتز قندها به فرآیندهای سنتز متابولیت‌های دیگر باشد (Preeti and Tripathi, 2011).
در غلظت 10 میکرومولار اکسید روی میزان پرولین نسبت به گیاه شاهد تفاوت معنی‌داری نشان نداد، در حالی که میزان پرولین در غلظت‌های 1 و 10 میکرومولار اکسید مس و 1 میکرومولار اکسید روی نسبت به گیاه شاهد افزایش معنی‌داری داشت. پرولین طی واکنش‌های کاهشی از گلوتامات سنتز می‌شود. پیرولین -5-کربوکسیلات (P5C) و پرولین به عنوان تنظیم کننده‌های متابولیک شناخته شده‌اند و همانند جفت ردوکس عمل می‌کنند (Kalidas and Mark, 2004). کاهش P5C در سیتوزول، افزایش NADP+ را فراهم می‌کند که به فعال شدن چرخه پنتوزفسفاتاکسیداتیو منجر می‌شود. رابطه محکمی بین چرخه پنتوزفسفاتاکسیداتیو با سنتز قند و پرولین در گیاهان وجود دارد (Kalidas and Mark, 2004). افزایش پرولین در غلظت‌های 1 و 10 میکرومولار اکسید مس و 1 میکرومولار اکسید روی باعث تحریک چرخه پنتوزفسفاتاکسیداتیو می‌شود و در نهایت، به تولید متابولیت ثانویه در گیاهچه شیرین بیان منجر می‌شود. در گیاهان انباشته شدن پرولین آزاد در پاسخ به تنش فلزات سنگین مشاهده شده است Rastgoo and Alemzadeh, 2011)؛ Zengin and Munzurogiu, 2005). القا انباشته شدن پرولین در پاسخ به تنش‌های غیرزیستی ممکن است به علت افزایش سنتز از نو آن یا کاهش در تخریب پرولین باشد (Kasai et al., 1998).
میزان گلیسیریزین در غلظت‌های 1 و 10 میکرومولار اکسید مس و 1 میکرومولار اکسید روی نسبت به گیاه شاهد افزایش معنی‌داری داشت. گزارش‌های متعددی مبنی بر تولید گلیسریزین با به کارگیری الیسیتورهای مختلف در گیاه شیرینبیان وجود دارد برای مثال، Winida و همکاران (2011) نشان دادند که میزان گلیسیریزین در گیاه شیرینبیان در غلظت 100 میکرومولار متیل جاسمونات افزایش می‌یابد. علت افزایش گلیسیریزین به افزایش بیان ژن آنزیم β-آمیرین سنتاز نسبت داده شده است. همچنین، Shabani و همکاران (2009) گزارش کرده‌اند که متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید باعث افزایش گلیسیریزین در گیاه شیرینبیان می‌شود. متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید به عنوان مولکول‌های سیگنال در تولید متابولیت ثانویه عمل می‌کنند. در پاسخ به این مولکول‌های سیگنال مکانیسم دفاعی پیچیده مانند سنتز متابولیت‌های ثانویه توسط گیاه فعال می‌شود. این پاسخ‌های دفاعی از طریق شناسایی محرک توسط گیرنده‌های مستقر در غشا پلاسمایی فعال می‌شوند و پیام‌آوران ثانویه را تشکیل می‌دهند که در نتیجه بیان ژن‌ها یا فعالیت آنزیم‌هایی که در سنتز متابولیت‌های ثانویه دخالت دارند را افزایش می‌دهند. می‌توان احتمال داد که در پژوهش حاضر نیز فلز مس و روی به عنوان محرک، بیان ژن یا فعالیت آنزیم β-آمیرین سنتاز را افزایش داده که پس از آن به افزایش تولید گلیسیریزین در گیاهچه شیرینبیان منجر شده است.
میزان ترکیبات فنلی کل گیاهچه‌ها در غلظت 10 میکرومولار اکسید مس نسبت به گیاه شاهد افزایش معنی‌داری نشان داد. در گیاهچههای تیمار شده با اکسید روی با افزایش محتوای ترکیبات فنلی کل میزان فلاونوئیدها نیز افزایش می‌یابد. افزایش متابولیسم فنیل پروپانوئید و میزان ترکیبات فنلی می‌تواند در اثر عوامل محیطی متفاوت و شرایط تنش باشد (Sakihama et al., 2002). همچنین، گزارش شده است که افزایش میزان ترکیبات فنلی می‌تواند به علت عملکرد حفاظتی این ترکیبات در مقابل تنش فلزات سنگین توسط کلاته کردن فلزات و جاروب کردن گونه‌های فعال اکسیژن (Lavid et al., 2002) یا به علت افزایش فعالیت آنزیم‌هایی باشد که در متابولیسم این ترکیبات دخالت دارند (Michalak, 2006). تحریک بیوسنتز ترکیبات فنلی در گندم در پاسخ به نیکل و در پاسخ به آلومینیوم نیز مشاهده شده است (Diaz et al., 2001). در پژوهش حاضر چنان که Winkel-Shirley (2002) نیز در گیاه ذرت گزارش نمودند می‌توان احتمال داد که فلز مس با تحریک بیان ژن‌های درگیر در تولید متابولیت‌های ثانویه به افزایش تولید ترکیبات فنلی در گیاهچه شیرینبیان منجر شده است.
فلاونوئیدها گروه بزرگی از ترکیبات فنلی موجود در گیاهان هستند که تولید آنها در تنش‌های محیطی با افزایش فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز (PAL) افزایش می‌یابد (Myung-Min et al., 2009). فلاونوئیدها به عنوان جاروب کننده‌های رادیکال آزاد هستند و همچنین قادرند بسته به ساختار مولکولی خود به عنوان کلاتورهای فلزی عمل کنند (Soczynska-Kordala et al., 2001). در این پژوهش، میزان فلاونوئیدها در طول موج 300 نانومتر در غلظت‌های 1 و 10 میکرومولار اکسید مس افزایش معنی‌داری داشت. افزایش مقدار فلاونوئیدها توسط فلزات نقره و کروم در گیاهOnonis arvensis (Tumova and Polivkova, 2006) و نیز توسط فلز مس در گیاه Digitalis lanata گزارش شده است (Bota and Deliu, 2011). فلاونوئیدها دارای گروه‌های هیدروکسیل و کربوکسیل هستند که قادرند به طور اختصاصی به عناصر سنگین پیوند بر قرار کنند (Jung et al., 2003).
آنتوسیانینها از مهم‌ترین ترکیبات آنتی‌اکسیدانی در گیاهان هستند. این ترکیبات نه تنها رادیکال‌های آزاد را از بین می‌برند، بلکه از تولید بیشتر آنها در گیاه جلوگیری می‌کنند. آنتوسیانینها به احتمال زیاد باعث تسهیل ورود فلزات سنگین به واکوئل سلول‌ها و در نتیجه جمع‌آوری آنها از سایر بخش‌ها می‌شوند (Tripathi et al., 2006). در پژوهش حاضر، میزان آنتوسیانینها در غلظت‌های 1 و 10 میکرومولار اکسید مس افزایش یافت. در گیاهچههای تیمار شده با اکسید روی، علاوه بر افزایش محتوای آنتوسیانینها میزان فلاونوئیدها در طول موج 270 نانومتر افزایش یافت. همچنین، میزان تاننها در تیمار 1 میکرومولار اکسید روی افزایش یافت. بیشتر مطالعات اخیر نشان داده است که آنتوسیانینها در پاسخ به انواع تنش، از جمله تنش فلزات سنگین، سنتز شده‌اند (Hale et al., 2001). Kalantari و Oloumi (2005) گزارش کردند که کادمیوم در غلظت‌های بالا باعث افزایش آنتوسیانین در گیاه کلزا شده است. Marrs و Walbot (1997) بیان کردند که کادمیوم می‌تواند سنتز آنزیم گلوتاتیون-S-ترانسفراز (GST) را تحریک و به تولید آنتوسیانین منجر شود. GST، آنزیم کلیدی در مرحله نهایی بیوسنتز آنتوسیانین است (Schreder et al., 2003). همچنین، گزارش شده است که مولیبدن باعث افزایش میزان آنتوسیانین در گیاه کلزا می‌شود (Kutchan, 1995). با توجه به مطالعات یاد شده می‌توان احتمال داد که در پژوهش حاضر نیز فلز مس با تحریک بیان ژن‌های درگیر در تولید متابولیت ثانویه از جمله GST به افزایش تولید آنتوسیانین منجر شده باشد. شایان ذکر است که برای نتیجه‌گیری دقیق‌تر نیاز به مطالعات دقیق از جمله بررسی تأثیر فلزات مس و روی بر میزان بیان ژن‌های آنزیم‌های کلیدی در مسیر بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه در گیاه شیرینبیان است. تاننها از جمله ترکیبات فنلی موجود در گیاه هستند که دارای عمل آنتی‌اکسیدانی نیز هست. گیاهان غنی از تانن نظیر چای که به زیادی منگنز مقاوم هستند، توسط کلاته شدن مستقیم فلز منگنز با ترکیبات فنلی در برابر مقدار زیاد آن محافظت می‌شوند. کلاته شدن مستقیم یا اتصال با پلی‌فنل‌ها در گیاهان تیره Nympheace که در تنش با فلزات سنگین کادمیوم، سرب و جیوه قرار گرفتند نیز گزارش شده است (Lavid et al.,2002).
جمع‌بندی
در مجموع، نتایج این پژوهش نشان داد که تیماردهی گیاهچههای شیرینبیان با غلظت‌های 1 و 10 میکرومولار اکسید مس می‌تواند میزان گلیسیریزین، ترکیبات فنلی کل، فلاونوئیدها و آنتوسیانینها را در این گیاهان افزایش دهد.
)
