پاسخ سیستم دفاع آنتی‌اکسیدان گیاه گوجه‌فرنگی به تنش کم آبی و برهم‌کنش آن با آسکوربیک اسید

همه گیاهان و حیوانات به استثنای انسان و خوکچه هندی قادر به سنتز آسکوربیک اسید هستند. در گیاهان، آسکوربیک اسید می‌تواند در غلظت‌هایی در حد میلی‌مولار، هم در بافت‌های فتوسنتزی و هم غیرفتوسنتزی ذخیره شود. در برگ‌ها، غلظت آسکوربیک اسید از غلظت کلروفیل بیشتر است و مخزن آسکوربیک اسید بیش از 10 درصد کربوهیدرات‌های محلول را در گیاه تشکیل می‌دهد (Noctor and foyer, 1998).

آسکوربیک اسید یک آنتی‌اکسیدان اولیه است که به طور مستقیم با رادیکال هیدروکسیل، سوپراکسید و اکسیژن یکتایی واکنش می‌دهد. آسکوربیک اسید در حفاظت نوری و تنظیم فتوسنتز نیز نقش دارد. آسکوربیک اسید نقش مهمی در حفظ فعالیت آنزیم‌هایی دارد که گروه پروستتیک آنها دارای فلزات واسطه است. آسکوربیک اسید یک آنتی‌اکسیدان ثانویه قوی است که قادر به احیا کردن شکل اکسیده آلفاتوکوفرول (ویتامین E) است. آلفا توکوفرول یک آنتی‌اکسیدان مهم محلول در چربی است (Noctor and foyer, 1998). آسکوربیک اسید در چرخه آسکوربات-گلوتاتیون که در پاک‌سازی گونه‌های فعال اکسیژن در کلروپلاست و سیتوسول نقش دارد به عنوان یک ماده کلیدی عمل می‌نماید (Kuzniak, 2004؛ (Afzali et al., 2006. مشخص شده است که آسکوربیک اسید با از بین بردن گونه‌های فعال اکسیژن می‌تواند مقاومت گیاه را در برابر تنش افزایش دهد و باعث تعدیل فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان گردد. پژوهش‌ها نشان داده است که آسکوربیک اسید خارجی می‌تواند مقاومت به تنش شوری را در گیاهان افزایش داده، همچنین تنش اکسیداتیو را کاهش دهد
Shaddad et al., 1990)؛ Shalata and Neuman, 2001). بر اساس گزارش Al-qurainy (2007) میزان جوانه‌زنی گیاهان نخود و لوبیا که تحت تنش شوری کاهش یافته بود، با افزودن تیمار آسکوربیک اسید افزایش یافت.

تنش‌های مختلف محیطی شامل تنش‌های زنده و محیطی سبب تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن می‌شوند. از جمله این تنش‌ها می‌توان به تنش خشکی، نور شدید، شوری، سمّیت فلزات و عوامل بیماری‌زا اشاره نمود. تنش خشکی مانند دیگر تنش‌های محیطی باعث تجمع گونه‌های فعال اکسیژن مانند سوپراکسید، پراکسید هیدروژن و رادیکال‌های هیدروکسیل در سلول و آسیب رساندن به لیپیدهای غشا، پروتئین‌ها و نوکلئیک اسیدها و در نهایت مرگ سلولی می‌شود (Abdul Jaleel et al., 2009). در سلول‌های گیاهی، غشای پلاسمایی و اندامک‌هایی نظیر: کلروپلاست، میتوکندری و پراکسی‌زوم تولیدکننده‌های اصلی رادیکال‌های آزاد اکسیژن طی فرآیندهای فتوسنتز و تنفس هستند. زنجیره انتقال الکترون در غشای تیلاکوئید مهم‌ترین منبع تولید گونه‌های فعال اکسیژن است. تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن در کلروپلاست به وسیله انتقال مستقیم انرژی از کلروفیل به مولکول اکسیژن و برانگیخته شدن آن یا به وسیله احیای مولکول اکسیژن در فتوسیستم I صورت می‌گیرد (Bartosz, 1997). گیاهان سازوکارهای متفاوتی برای کاهش آثار مخرب رادیکال‌های آزاد اکسیژن دارند، از جمله این سازوکارها تولید ترکیبات آنزیمی و غیرآنزیمی آنتی‌اکسیدان است. بدین صورت که مقدار گونه‌های فعال اکسیژن در سلول‌های گیاهی به وسیله فعالیت آنتی‌اکسیدان ها تنظیم می‌شود. ظرفیت کاهش آثار مخرب گونه‌های فعال اکسیژن بستگی به میزان تحمل گیاه به تنش دارد (Abdul Jaleel et al., 2009).

تنش خشکی از طریق بسته شدن روزنه و در نتیجه کمبود CO₂ باعث مهار فتوسنتز شده، به تشکیل گونه‌های فعال اکسیژن در کلروپلاست منجر می‌شود که باعث آسیب دیدن غشا در اثر پراکسیداسیون لیپیدها می‌گردد Bartosz, 1997)؛ (Turkan et al., 2005. همان طور که اشاره شد، گیاهان برای مقابله با تنش‌های محیطی و زنده مجهز به سیستم‌های دفاعی آنتی‌اکسیدان آنزیمی و غیرآنزیمی هستند تا بتوانند گونه‌های فعال اکسیژن تولید شده را مهار نمایند، با این حال، با تشکیل گونه‌های فعال اکسیژن ممکن است آسیب اکسیداتیو رخ دهد و دفاع آنتی‌اکسیدانی ناتوان باشد (Abdul Jaleel et al., 2009). بنابراین، طی دوره تنش خشکی لازم است هماهنگی در سازوکارهای حفاظت‌کننده در مقابل گونه‌های فعال اکسیژن صورت گیرد تا ساختار ماکرومولکول‌ها پایدار بماند (Hoekstra et al., 2001).

مقاومت به تنش‌های مختلف به توانایی آنتی‌اکسیدانی بستگی دارد و تغییر در سطوح آنتی‌اکسیدانی می‌تواند از آسیب ناشی از تنش جلوگیری نماید. در پژوهش حاضر، آثار تنش کم آبی در گیاه گوجه‌فرنگی بررسی شد تا تغییر در شاخص‌های رشد، مقدار پراکسیداسیون لیپیدها، مقدار آسکوربات و گلوتاتیون و فعالیت آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، گلوتاتیون ردوکتاز و گایاکول پراکسیداز در تنش کم آبی و تنش‌های ناشی از آن مشخص شود و نقش آسکوربیک اسید خارجی در حفاظت از گیاهان گوجه‌فرنگی تحت تنش کم آبی مشخص گردد.

مواد و روش‌ها

گیاه مورد بررسی در این پژوهش، گوجه‌فرنگی (Lycopersicun esculentum Mill.) رقم Falcato بود. بذرها در گلدان‌هایی به قطر 11 سانتی‌متر حاوی خاک: ماسه: پیت ماس (2:1:1) کاشته شد. گلدان‌ها روزانه آبیاری و در شرایط گلخانه‌ای نگهداری شدند. در آغاز مرحله چهار برگی، برای اعمال پیش‌تیمار، غلظت‌های
0 و 10 میلی‌مولار آسکوربیک اسید در سه نوبت به صورت یک روز در میان روی همه برگ‌های گیاهان افشانه شد (طی یک آزمایش مقدماتی غلظت و زمان استفاده از آسکوربیک اسید بهینه گردید). سپس، تنش کم آبی در سه سطح (آبیاری در سطح ظرفیت مزرعه‌ای، آبیاری تا 60 درصد ظرفیت مزرعه‌ای و آبیاری تا 30 درصد ظرفیت مزرعه‌ای) به مدت یک هفته اعمال گردید. پس از اعمال تیمارها، شاخص‌های رشد اندازه‌گیری شد و برای سنجش‌های بیوشیمیایی، برگ سوم بعد از قراردادن در نیتروژن مایع در فریزر 80- درجه سانتیگراد نگهداری و همه سنجش‌های بیوشیمیایی روی برگ سوم انجام گرفت.

.شاخص‌های رشد: وزن تر و سطح برگ سوم در گروه‌های تیماری مختلف اندازه‌گیری گردید.

.پراکسیداسیون لیپیدها: برای سنجش مقدار پراکسیداسیون لیپیدهای غشا، غلظت مالون‌دی‌آلدئید و سایر آلدئیدها که محصول پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع هستند، اندازه‌گیری گردید. اندازه‌گیری مالون‌دی‌آلدئید (MDA) با روش Heath و Packer (1969) انجام شد. بر اساس این روش، 2/0 گرم از بافت فریزشده گیاه (برگ) با 5 میلی‌لیتر تری کلرو استیک اسید (TCA) 1/0 درصد ساییده شد. عصاره حاصل به مدت 5 دقیقه با نیروی g10000 سانتریفیوژ شد. به یک میلی‌لیتر از محلول رویی حاصل از سانتریفیوژ، 4 میلی‌لیتر TCA 20 درصد حاوی 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید (TBA) اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد در حمام آب گرم حرارت داده شد و بلافاصله در یخ سرد شد و دوباره مخلوط به مدت 10 دقیقه در g10000 سانتریفیوژ گردید. شدت جذب این محلول توسط اسپکتروفتومتر (مدل Cary50 Varian، شرکت Varian، آمریکا) در طول موج 532 نانومتر خوانده شد. ماده‌ مورد نظر برای جذب در این طول موج، کمپلکس قرمز MDA-TBA است. جذب سایر رنگیزه‌های غیراختصاصی در 600 نانومتر تعیین و از این مقدار کسر گردید. برای محاسبه غلظت MDA از ضریب خاموشی معادل mM^-1cm^-1155 استفاده شد و نتایج حاصل از اندازه‌گیری بر حسب نانو‌مول بر گرم وزن‌تر محاسبه گردید.

اندازه‌گیری غلظت سایر آلدئیدها (پروپانال، بوتانال، هگزانال، هپتانال و پروپانال دی متیل استال) با روش Meirs و همکاران (1992) دقیقاً مانند روش ذکر شده برای مالون‌دی‌آلدئید انجام شد با این تفاوت که جذب نمونه‌ها در طول موج 455 نانومتر خوانده شد. جذب سایر رنگیزه‌های غیراختصاصی در 600 نانومتر خوانده شد و از این مقدار کسر گردید. برای محاسبه غلظت این آلدئیدها از ضریب خاموشی معادل
mM^-1cm^-1 10⁵ 458/0 استفاده شد. و نتایج بر حسب نانومول بر گرم وزن تر محاسبه گردید.

.آسکوربیک اسید کل: برای سنجش مقدار آسکوربیک اسید کل از روش De Pinto و همکاران (1999) استفاده شد. 5/0 گرم بافت فریز شده گیاه (برگ) در 10 میلی‌لیتر متافسفریک‌اسید 5 درصد ساییده شد و به مدت 15 دقیقه در g10000 سانتریفیوژ گردید. سپس، 300 میکرولیتر از عصاره‌ سانتریفیوژ شده در لوله‌ آزمایش ریخته شد و محلول‌های زیر به‌ترتیب به آن اضافه گردید: ابتدا 750 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم 100 میلی‌مولار، سپس 150 میکرولیتر دی تیو ترایتول 10 میلی‌مولار و مخلوط حاصل 10 دقیقه در درجه حرارت اتاق قرار داده شد. سپس، 150 میکرولیتر N- اتیل مال آمید 5/0 درصد اضافه و مخلوط حاصل ورتکس شد و به مدت 10 دقیقه در درجه حرارت اتاق قرار گرفت. پس از آن، 600 میکرولیتر تری کلرو استیک اسید 10 درصد، 600 میکرولیتر اورتو فسفریک اسید 44 درصد، 600 میکرولیتر آلفا آلفا دی پیریدیل 4 درصد و 10 میکرولیتر FeCl₃ (475 میلی گرم در 5/0 میلی‌لیتر آب) اضافه گردید. مخلوط حاصل با ورتکس به‌هم زده شده و به مدت 20 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 40 درجه سانتیگراد قرار گرفت سپس مجدداً ورتکس شد و برای بار دوم به مدت 20 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 40 درجه سانتیگراد قرار گرفت و شدت جذب در 525 نانومتر خوانده شد. برای محاسبه‌ مقدار آسکوربیک اسید کل با استفاده از آسکوربیک اسید منحنی استاندارد رسم گردید و نتایج بر حسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر محاسبه شد.

.گلوتاتیون کل: برای اندازه‌گیری مقدار گلوتاتیون از روش Griffith (1980) استفاده گردید. برای اندازه‌گیری مقدار گلوتاتیون کل، ابتدا 5/0 گرم از برگ گیاه در یک هاون چینی محتوی 2 میلی‌لیتر متافسفریک اسید 2 درصد به طور کامل ساییده شد. محلول همگن به دست آمده به لوله سانتریفیوژ منتقل و پس از 10 دقیقه در g10000 و دمای 4 درجه سانتیگراد، توسط سانتریفیوژ یخچال‌دار سانتریفیوژ گردید. سپس، 100 میکرولیتر محلول رویی به لوله آزمایش حاوی 700 میکرولیتر NADPH (3/0میلی‌مولار)، 100 میکرولیتر دی تیوبیس DTNB (6 میلی‌مولار) و 100 میکرولیتر آب مقطر اضافه گردید و پس از 3-4 دقیقه، 10 میکرولیتر آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز افزوده شد و جذب در 412 نانومتر خوانده شد. محاسبه گوتاتیون کل از طریق منحنی استاندارد انجام و بر حسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر ارایه گردید.

.تهیه عصاره آنزیمی: برای تهیه عصاره آنزیمی 1 گرم بافت تر برگ در یک ‌ها‌ون چینی محتوی 3 میلی‌لیتر بافر فسفات 50 میلی‌مولار با اسیدیته= 2/7 که شامل اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) 1 میلی‌مولار، فنیل متان سولفونیل فلورید (PMSF) 1 میلی‌مولار و پلی وینیل پیرولیدون (PVP) 1 درصد بود، ساییده شد. عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه در سانتریفیوژ یخچال‌دار در g14000 و دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفت. از محلول رویی برای مطالعه فعالیت آنزیم‌ها و نیز سنجش پروتئین استفاده گردید (این محلول در اپندورف و در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری گردید).

.فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز
(EC 1.15.1.1) (SOD): سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز با استفاده از سنجش مهار احیای نوری نیترو بلو تترازولیوم (NBT) در طول موج 560 نانومتر انجام گرفت. مخلوط واکنش نمونه‌ها شامل: بافر فسفات 50 میلی‌مولار با اسیدیته=7، NBT 075/0 میکرومولار، 1/0 میلی‌مولار Na-EDTA، 75 میکرومولار ریبوفلاوین 13 میلی‌مولار متیونین و 50 میکرولیتر عصاره‌ آنزیمی بود. برای سنجش فعالیـت این آنزیم علاوه بر بلانک (برای صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر)، نیاز به نمونه شاهد نیز است. میزان فعالیت آنزیم SOD در نمونه‌ها در مقایسه با بلانک سنجیده شد. واکنش در عصاره‌های تهیه شده در دمای 25 درجه‌ سانتیگراد با روشن شدن لامپ فلورسنت (w40) آغاز شد و پس از 8 دقیقه با خاموش کردن لامپ، واکنش متوقف گردید. لوله بلانک شامل مواد ذکر شده بود با این تفاوت که در آن، عصاره آنزیمی اضافه نگردید و در روشنایی نیز قرار نگرفت. در لوله بلانک نیز مخلوط واکنش ذکر شده وجود داشت با این تفاوت که به آن عصاره آنزیمی اضافه نشد ولی در نور قرار گرفت. بنابراین، به دلیل عدم وجود آنزیم در بلانک، احیای NBT در حضور نور (احیای نوری) به طور 100 درصد در شاهد انجام و تمام نیترو بلو تترازولیوم موجود در مخلوط واکنش در حضور نور به فورمازون تبدیل می‌شود. میزان جذب بلانک در 560 نانومتر نشان‌دهنده 100 درصد احیای نوری NBT است و نیمی از آن معادل یک واحد آنزیمی است. بنابراین، یک واحد آنزیمی سوپراکسید دیسموتاز مقدار آنزیمی است که موجب 50 درصد ممانعت از احیای نوری احیای نیترو بلو تترازولیوم (با جلوگیری از تبدیل آن به فورمازان) می‌گردد. اختلاف جذب نمونه‌ها و شاهد در 560 نانومتر نشان‌دهنده مهار احیای نوری NBT در حضور آنزیم SOD موجود در نمونه است. با محاسبه اختلاف جذب، واحد آنزیمی نمونه‌ها محاسبه و فعالیت آنزیمی بر حسب واحد آنزیم در مقدار پروتئین کل (میلی‌گرم) در 50 میکرولیتر عصاره (به دست آمده از روش Bradford (1976)) بیان شد (Giannopolitis and Ries, 1977).

.فعالیت آنزیم کاتالاز (EC 1.11.1.6) (CAT): سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز با محاسبه‌ کاهش جذب H₂O₂ (کاهش مقدار H₂O₂) در 240 نانومتر و با روش Dhindsa و Motowe (1981) انجام شد. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات پتاسیم 50 میلی‌مولار با اسیدیته= 7 و پراکسید هیدروژن 15 میلی‌مولار است. با اضافه کردن 100 میکرولیتر عصاره‌ آنزیمی به مخلوط ذکر شده، واکنش آغاز می‌شود. بلانک برای صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر شامل مخلوط واکنش اما فاقد عصاره آنزیمی بود. تغییرات جذب (یعنی تفاوت جذب در زمان آغاز واکنش از جذب در زمان یک دقیقه) پس از آغاز واکنش محاسبه گردید. میزان H₂O₂ موجود در مخلوط واکنش پس از 1 دقیقه با استفاده از ضریب خاموشی (mMol^-1cm^-1 28/0ε=) و رابطه A=εbc محاسبه شد که نشان‌دهنده میزان فعالیت آنزیم کاتالاز است. A: معادل جذب خوانده شده، ε: ضریب خاموشی، c: غلظت H₂O₂ و b: طول کووت (1 سانتی‌متر) است. فعالیت آنزیم به صورت واحد آنزیمی بر حسب مقدار پروتئین کل (میلی‌گرم) موجود در 100 میکرولیـتر عصاره (به دست آمده از روش Bradford (1976)) در یک دقیقه محاسبه گردید. یک واحد آنزیمی کاتالاز مقدار آنزیمی است که 1 میلی‌مول H₂O₂ را در یک دقیقه تجزیه می‌کند.

.فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (EC1.11.1.1) (APX): مخلوط واکنش شامل بافر فسفات پتاسیم 50 میلی مول با اسیدیته= 7، آسکوربیک اسید 5/0 میلی‌مولار، H₂O₂ 15/0 میلی‌مولار، EDTA 1/0 میلی‌مولار و 50 میکرولیتر عصاره‌ آنزیمی بود. به دنبال اکسید شدن آسکوربیک اسید با آغاز واکنش آنزیمی، کاهش جذب در 290 نانومتر، 2 دقیقه پس از آغاز واکنش نسبت به زمان آغاز واکنش محاسبه شد. با استفاده از تغییرات جذب در طول موج 290 نانومتر، ضریب خاموشی آسکوربیک اسید (mMol^-1cm^-1 8/2) و رابطه A=εbc، میزان آسکوربیک اسید بر جای مانده پس از 2 دقیقه انجام واکنش آنزیمی محاسبه شد. یک واحد آنزیمی آسکوربات ‌پراکسیداز مقدار آنزیمی است که یک میلی‌مول آسکوربیک اسید را در یک دقیقه اکسید می‌کند (Nakano and Asada, 1981). فعالیت آنزیم بر حسب واحد آنزیم در مقدار پروتئین کل (میلی‌گرم) موجود در 50 میکرولیتر عصاره (به دست آمده از روش Bradford (1976)) گزارش شد.

.فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز (GR)
(EC 1.6.4.2): فعالیت آنزیم GR به وسیله اکسیداسیون NADPH با روش Foyer و Halliwell (1976) تعیین می‌شود. در این روش از مخلوط واکنش حاوی بافر فسفات سدیم 100 میلی مولار (اسیدیته=8/7)، گلوتاتیون اکسید شده (GSSG) 5/0 میلی مولار، NADPH 1/0 میلی مولار و50 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. واکنش با اضافه کردن NADPH آغاز شد. جذب نمونه‌ها به مدت 3 دقیقه در طول موج 340 نانومتر خوانده شد. یک واحد فعالیت آنزیمی مقدار آنزیمی است که برای اکسیداسیون یک نانومول NADPH در یک دقیقه لازم است. برای محاسبه مقدار NADPH اکسید شده از ضریب خاموشی معادل mMol^-1cm^-1 2/6 استفاده شد.

.فعالیت آنزیم پراکسیداز (GPOD)
(EC 1.11.1.7): سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز با استفاده از گایاکول و اندازه‌گیری میزان جذب تتراگایاکول تشکیل شده از گایاکول در نتیجه فعالیت پراکسیداز، در 470 نانومترانجام شد. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی‌مولار با اسیدیته=7، پراکسید هیدروژن (3/0 درصد) و گایاکول (1 درصد) است. واکنش با افزودن 20 میکرولیتر عصاره‌ آنزیمی به مخلوط واکنش در 25 درجه‌ سانتیگراد آغاز گردید. میزان جذب تتراگایاکول (حاصل از اکسید شدن گایاکول) در 470 نانومتر در لحظه آغاز واکنش پس از افزودن عصاره آنزیمی و پس از یک دقیقه خوانده شد. با استفاده از تغییرات جذب در یک دقیقه در 470 نانومتر، ضریب خاموشی تتراگایاکول
(mMol^-1cm^-1 5/25ε=) و رابطه A=εbc، مقدار تتراگایاکول تشکیل شده محاسبه شد. این مقدار از تتراگایاکول معادل فعالیت یک واحد آنزیم پراکسیداز است (Plewa et al., 1991). فعالیت آنزیم بر حسب واحد آنزیم در مقدار پروتئین کل (میلی‌گرم) موجود در 20 میکرولیتر عصاره (به دست آمده از روش Bradford (1976)) گزارش شد.

تحلیل آماری: تحلیل‌های آماری با آزمایش فاکتوریل و طبق طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد و داده‌ها توسط نرم‌افزار SPSS نسخه 16 تحت آنالیز واریانس قرار گرفته، اختلاف میانگین‌ها با استفاده از آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح اطمینان 95 درصد مقایسه شدند.

نتایج

نتایج این آزمایش نشان داد که تنش کم آبی در هر دو سطح در گیاهان گوجه‌فرنگی موجب کاهش معنی‌دار شاخص‌های رشد شامل: وزن تر برگ سوم (شکل 1) و سطح برگ سوم (شکل 2) شد. همچنین، سبب کاهش معنی‌دار مقدار آسکوربات (شکل 5) و گلوتاتیون (شکل 6) شد. تنش کم آبی همچنین در هر دو سطح، میزان پراکسیداسیون لیپیدها (مالون‌دی‌آلدئید) (شکل 3) و سایر آلدئیدها (شکل 4)، و فعالیت آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز (شکل 7)، کاتالاز (شکل 8)، گایاکول پراکسیداز (شکل 9)، آسکوربات پراکسیداز (شکل 10) و گلوتاتیون ردوکتاز (شکل 11) را به صورت معنی‌دار افزایش داد.

استفاده از آسکوربیک اسید موجب بهبود شاخص‌های رشد شامل وزن تر برگ سوم (شکل 1) و سطح برگ سوم (شکل 2) و افزایش مقدار آسکوربات (شکل 5) و گلوتاتیون (شکل 6) در شرایط تنش و غیرتنش شد و مقدار پراکسیداسیون لیپیدها (مالون‌دی‌آلدئید) (شکل 3) و سایر آلدئیدها (شکل 4)، و فعالیت آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز (شکل 7)، کاتالاز (شکل 8)، گایاکول پراکسیداز (شکل 9)، آسکوربات پراکسیداز (شکل 10) و گلوتاتیون ردوکتاز (شکل 11) را در شرایط تنش کاهش داد، ولی مقدار سایر آلدئیدها (شکل 4) و فعالیت گایاکول پراکسیداز (شکل 9) در شرایط غیرتنش نیز توسط آسکوربیک اسید کاهش یافت.

شکل 1- اثر تنش کم آبی و آسکوربیک اسید (AsA) بر وزن تر برگ سوم در گوجه‌فرنگی (داده‌ها میانگین سه تکرار و علایم روی ستون‌ها خطای معیار (SE) را نشان می‌دهد. حروف غیریکسان نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن است).

شکل 2- اثر تنش کم آبی و آسکوربیک اسید (AsA) بر سطح برگ سوم در گوجه‌فرنگی (داده‌ها میانگین سه تکرار و علایم روی ستون‌ها خطای معیار (SE) را نشان می‌دهد. حروف غیریکسان نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن است).

شکل 3- اثر تنش کم آبی و آسکوربیک اسید (AsA) بر میزان مالون‌دی‌آلدئید (MDA) در گوجه‌فرنگی (داده‌ها میانگین سه تکرار و علایم روی ستون‌ها خطای معیار (SE) را نشان می‌دهد. حروف غیریکسان نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن است).

شکل 4- اثر تنش کم آبی و آسکوربیک اسید (AsA) بر مقدار سایر آلدئیدها در گوجه‌فرنگی (داده‌ها میانگین سه تکرار و علایم روی ستون‌ها خطای معیار (SE) را نشان می‌دهد. حروف غیریکسان نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن است).

شکل 5- اثر تنش کم آبی و تیمار آسکوربیک اسید (AsA) بر مقدار آسکوربیک اسید در گوجه‌فرنگی (داده‌ها میانگین سه تکرار و علایم روی ستون‌ها خطای معیار (SE) را نشان می‌دهد. حروف غیریکسان نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن است).

شکل 6- اثر تنش کم آبی و آسکوربیک اسید (AsA) بر مقدار گلوتاتیون در گوجه‌فرنگی (داده‌ها میانگین سه تکرار و علایم روی ستون‌ها خطای معیار (SE) را نشان می‌دهد. حروف غیریکسان نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن است).

شکل 7- اثر تنش کم آبی و آسکوربیک اسید (AsA) بر فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (SOD) در گوجه‌فرنگی (داده‌ها میانگین سه تکرار و علایم روی ستون‌ها خطای معیار (SE) را نشان می‌دهد. حروف غیریکسان نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن است).

شکل 8- اثر تنش کم آبی و آسکوربیک اسید (AsA) بر فعالیت کاتالاز (CAT) در گوجه‌فرنگی (داده‌ها میانگین سه تکرار و علایم روی ستون‌ها خطای معیار (SE) را نشان می‌دهد. حروف غیریکسان نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن است).

شکل 9- اثر تنش کم آبی و آسکوربیک اسید (AsA) بر فعالیت گایاکول پراکسیداز (GPOD) در گوجه‌فرنگی (داده‌ها میانگین سه تکرار و علایم روی ستون‌ها خطای معیار (SE) را نشان می‌دهد. حروف غیریکسان نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن است).

شکل 10- اثر تنش کم آبی و آسکوربیک اسید (AsA) بر فعالیت آسکوربات پراکسیداز (APX) در گوجه‌فرنگی (داده‌ها میانگین سه تکرار و علایم روی ستون‌ها خطای معیار (SE) را نشان می‌دهد. حروف غیریکسان نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن است).

شکل 11- اثر تنش کم آبی و آسکوربیک اسید (AsA) بر فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز (GR) در گوجه‌فرنگی (داده‌ها میانگین سه تکرار و علایم روی ستون‌ها خطای معیار (SE) را نشان می‌دهد. حروف غیریکسان نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن است).

بحث و نتیجه‌گیری

در پژوهش حاضر، تنش کم آبی در هر دو سطح بر تمام آنزیم‌های مورد بررسی تأثیر معنی‌دار داشت. در گیاهان، تغییر در فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان از سازوکارهایی است که برای افزایش مقاومت در برابر تنش‌ها رخ می‌دهد. در پژوهش حاضر، فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در گیاهان تحت تنش نسبت به گیاهان شاهد افزایش یافت. مشابه با نتایج این مطالعه در گیاهان آرابیدوبسیس تحت تنش کم آبی نیز افزایش فعالیت این آنزیم گزارش شده است (Jung, 2004). افزایش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز زمانی رخ می‌دهد که مقدار یون سوپراکسید درون سلول افزایش یابد (Smirnoff, 1996). سوپراکسید دیسموتاز آنیون سوپراکسید را به پراکسید هیدروژن تبدیل می‌کند. نتایج این مطالعه نشان داد که آسکوربیک اسید سبب کاهش فعالیت این آنزیم می‌شود. این کاهش فعالیت آنزیم در گیاهان تنش دیده را می‌توان به اثر آنتی‌اکسیدانی آسکوربیک اسید در خنثی‌سازی مستقیم یون سوپراکسید نسبت داد (Noctor and Foyer, 1998).

چنین به نظر می‌رسد که در شرایط کم آبی، افزایش غلظت پراکسید هیدروژن حاصل از فعالیت سوپراکسید دیسموتاز سبب تحریک فعالیت آنزیم کاتالاز برای تجزیه پراکسید هیدروژن می‌گردد. کاتالاز، پراکسید هیدروژن را که برای سلول سمّی است به آب و اکسیژن تجزیه می‌نماید. کاهش فعالیت این آنزیم را در گیاهان تحت تنش که با آسکوربیک اسید پیش‌تیمار شده بودند، می‌توان این گونه توجیه نمود که آسکوربیک اسید به دلیل خنثی‌سازی و از بین بردن یون سوپراکسید در پاک‌سازی این یون مخرب نقش داشته، در نتیجه سبب کاهش تولید پراکسید هیدروژن و در پی آن کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز می‌شود (Noctor and Foyer, 1998).

آسکوربیک اسید در چرخه آسکوربات-گلوتاتیون در میتوکندری، پراکسی‌زوم، کلروپلاست و سیتوپلاسم نقشی کلیدی را برابر گونه‌های فعال اکسیژن حاصل از تنش‌های زنده و غیرزنده ایفا می‌کند. همچنین، این ویتامین برای آنزیم‌هایی نظیر آسکوربات پراکسیداز که در تجزیه پراکسید هیدروژن نقش دارند به عنوان کوفاکتور عمل می‌کند Noctor and Foyer, 1998)؛ .Upadhyaya et al., 2010)

آسکوربات پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز نیز از آنزیم‌های مهم در چرخه آسکوربات –گلوتاتیون هستند. در پژوهش حاضر، فعالیت این دو آنزیم در تنش کم آبی افزایش و با کاربرد آسکوربیک اسید کاهش یافت (شکل‌های 10 و 11). مشابه با این نتایج، افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در گیاهان لوبیای مقاوم به تنش خشکی (Turkan et al., 2005)، کنجد (Fazeli et al., 2007) و تنباکو(Gupta et al., 1993) نیز گزارش شده است. در گونه‌های مقاوم لوبیا نیز افزایش فعالیت GR در تنش خشکی گزارش شده است (Turkan et al., 2005).

اما نتایجی عکس نتایج مطالعه حاضر در گیاهان سیب‌زمینی تحت تنش شوری (Zahoor and Faheem, 2009) و گیاهان لوبیای تحت تنش شوری و خشکی (Younis et al., 2010) گزارش شده است. در این گیاهان کاربرد آسکوربیک اسید موجب افزایش فعالیت آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز گردید.

بیشترین فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در گیاهان تحت تنش و بدون مصرف آسکوربیک اسید مشاهده شد (شکل 9). تیمار آسکوربیک اسید سبب کاهش فعالیت این آنزیم نسبت به گیاهان شاهد گردید. پراکسیدازها در پاک‌سازی مولکول پراکسید هیدروژن نقش دارند. به نظر می‌رسد که کاهش یون سوپراکسید توسط آسکوربیک اسید تولید پراکسید هیدروژن توسط سوپراکسید دیسموتاز کاهش را داده، در نتیجه فعالیت آنزیم پراکسیداز برای تجزیه پراکسید هیدروژن کاهش می‌یابد. مشابه با نتایج پژوهش حاضر، کاربرد آسکوربیک اسید در گیاهان سیب‌زمینی تحت تنش شوری موجب کاهش فعالیت پراکسیداز گردید (Zahoor and Faheem, 2009).

به طور کلی، می‌توان نتیجه گرفت که کاهش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در نتیجه مصرف آسکوربیک اسید، به تأثیر غیرمستقیم آسکوربیک اسید بر روی آنزیم‌ها بر می‌گردد. بدین ترتیب که آسکوربیک اسید با کاهش اثر مخرب تنش (خنثی‌سازی مستقیم رادیکال‌های آزاد) از افزایش بیشتر فعالیت آنزیم‌ها جلوگیری کرده است.

گونه‌های فعال اکسیژن عامل اصلی پراکسیداسیون لیپیدها هستند (Upadhyaya and Panda, 2004). پراکسیداسیون لیپیدها و تولید مالون‌دی‌آلدئید و سایر آلدئیدها به عنوان شاخصی برای میزان خسارت تنش‌های اکسیداتیو به کار می‌رود (Upadhyaya and Panda, 2004). بیشترین پراکسیداسیون لیپید در گیاهان تحت تنش کم آبی و بدون مصرف آسکوربیک اسید مشاهده شد. مصرف آسکوربیک اسید، سبب کاهش غلظت مالون‌دی‌آلدئید و سایر آلدئیدها شد (شکل‌های 3 و 4). اسیدهای چرب و لیپیدها حساسیت زیادی به اکسیژن دارند و به سرعت اکسید می‌شوند، از آنجایی که غشای سلول، یک غشای فسفولیپیدی است، واکنش آن با اکسیژن سبب تخریب غشای سلولی و نشت یون‌ها به بیرون از سلول می‌شود. آسکوربیک اسید با از بین بردن گونه‌های اکسیژن فعال به طور مستقیم، سبب کاهش پراکسیداسیون لیپیدهای غشای سلولی و کاهش مقدار مالون‌دی‌آلدئید و سایر آلدئیدها می‌گردد. این نتایج با نتایج Shalata و Neuman (2001) مطابقت دارد.

در شرایط تنش اکسیداتیو، آسکوربیک اسید به عنوان یک ماده مصرفی در پاک‌سازی گونه‌های فعال اکسیژن عمل کرده و در گیاه کاهش می‌یابد. بیشترین مقدار آسکوربیک اسید در گیاهان شاهد همراه با مصرف آسکوربیک اسید بود و کمترین مقدار آسکوربیک اسید در گیاهان تحت تنش بدون مصرف آسکوربیک اسید بود. در گیاهان مقاوم به تنش، مقدار آسکوربیک اسید درون سلول افزایش می‌یابد ولی در گیاهان حساس کاهش می‌یابد. کاهش مواد آنتی‌اکسیدان نظیر آسکوربیک اسید در نخود
(Iturbe-Ormaexte et al., 1998)، Cajanus caja (Jain et al., 2006) و Cammellia sinensis (Upadhaya and Panda, 2004) در شرایط تنش اسمزی گزارش شده است و علت آن تأثیر کم آبی بر ژن‌های کدکننده آنتی‌اکسیدان‌ها است (Bartoli et al., 1999). در گزارش Iturbe-Ormaexte و همکاران (1998) علت کاهش مقدار آسکوربیک اسید در تنش کم آبی در گیاه نخود را به علت تخریب مستقیم آسکوربیک اسید به وسیله ^-·O₂ یا سایر رادیکال‌های آزاد اکسیژن و همچنین مصرف آسکوربیک اسید برای سنتز زآگزانتین و تولید مجدد آلفا توکوفرول ذکر شده است (Iturbe-Ormaexte et al., 1998).

گلوتاتیون یک تری پپتید (آلفا گلوتامیل سسیستئینیل گلیسین) است که در تمام قسمت‌های سلول مانند: سیتوسول، کلروپلاست، شبکه آندوپلاسمی، واکوئل و میتوکندری وجود دارد (Abdul Jaleel et al., 2009). گلوتاتیون در تنظیم مقدار H₂O₂ از طریق چرخه آسکوربات-گلوتاتیون و چرخه گلوتاتیون مؤثر است. علاوه بر این، گلوتاتیون در بازسازی آسکوربیک اسید (آنتی‌اکسیدان غیرآنزیمی) طی چرخه آسکوربات-گلوتاتیون نیز دارای نقش اساسی است (Abdul Jaleel et al., 2009). گلوتاتیون به عنوان یک آنتی‌اکسیدان می‌تواند با اکسیژن یکتایی، رادیکال‌های سوپراکسید و هیدروکسیل واکنش دهد و به عنوان جاروب‌کننده گونه‌های فعال اکسیژن عمل نماید. گلوتاتیون می‌تواند بسیاری از اجزای سلولی از جمله گروه‌های تیول پروتئین‌ها را در برابر تنش اکسیداتیو محافظت نماید. گلوتاتیون در ثبات بخشیدن به لیپیدها در غشاهای سلولی و قطع زنجیره پراکسیداسیون لیپیدها نیز نقش دارد (Noctor and foyer, 1998).

کاهش محتوای گلوتاتیون در نخود
(Iturbe-Ormaexte et al., 1998) و Camellia sinensis (Upadhaya and Panda 2004) در تنش اسمزی گزارش شده است. Iturbe-Ormaexte و همکاران (1998) در مطالعه‌ روی گیاه نخود، علت کاهش مقدار گلوتاتیون در تنش اسمزی را ناشی از مهار سنتز گلوتاتیون می‌دانند که با مهار سنتز پروتئین در تنش اسمزی مرتبط است. در مطالعه Vasquez-Robinet و همکاران (2008) دلایل افزایش مقاومت به تنش‌هایی نظیر کم آبی و تنش اکسیداتیو، فعال شدن ژن‌های دفاع آنتی‌اکسیدان کلروپلاستی درگیر در سنتز و انتقال گلوتاتیون ذکر شده است.

در پژوهش حاضر، تیمار آسکوربیک اسید موجب افزایش مقدار آسکوربات و گلوتاتیون کل در گیاهان تحت تنش گردید (شکل‌های 5 و 6). مشابه با این نتیجه، کاربرد آسکوربیک اسید در گیاهان لوبیای تحت تنش شوری و کم آبی موجب افزایش مقدار این دو آنتی‌اکسیدان گردید (Younis et al., 2010). علاوه بر نقش آسکوربیک اسید در افزایش قدرت سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی سلول، گزارش شده است که آسکوربیک اسید کوفاکتوری مهم برای برخی از آنزیم‌های دخیل در بیوسنتز هورمونیهایی نظیر جیبرلین است Kuzniak, 2004)؛ Zahoor and Faheem, 2009) که این مطلب می‌تواند توضیحی برای بهبود شاخص‌های رشد در گیاهان مورد مطالعه باشد.

به طور کلی، نتایج بررسی حاضر نشان داد که تنش کم آبی موجب تنش اکسیداتیو و افزایش فعالیت سیستم دفاع آنتی‌اکسیدان آنزیمی گیاه می‌شود. کاربرد آسکوربیک اسید به عنوان یک آنتی‌اکسیدان قوی آثار مضر تنش کم آبی و تنش اکسیداتیو حاصل از آن را کاهش داد به طوری که فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان کاهش یافت اما شاخص‌های رشد بهبود پیدا کرد.

سپاسگزاری

نگارنده از دانشگاه پیام نور به خاطر حمایت مالی برای انجام این طرح پژوهشی، کمال تشکر را دارد.