نویسندگان
1 گروه زیست فناوری مولکولی گیاهی، پژوهشکده زیست فناوری کشاورزی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
2 مؤسسه تحقیقات علوم زیستی و منابع زیستی (CNR-IBBR)، پروجا، ایتالیا
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Olive is one of the most important fruit crops throughout the Mediterranean Basin, mainly propagated by cuttings. The adventitious root development is a key stage in vegetative propagation however the low rooting capacity of some cultivars severely affects the efficiency of olive clonal propagation. Auxin Influx Carrier gene (AUX1), plays a key role in lateral root formation in many plant species promoting the export of IAA from newly developing leaves to lateral root primordia. Putative olive homologues were amplified by using degenerate primers designed on the conserved regions of AUX1 transcripts identified in other plants. Transcript and amino acid sequences in root (OeAUX1R) and base of cutting (OeAUX1B) were different causes of polymorphisms relating to possible distinct roles in these tissues. In order to investigate the gene expression patterns, Real-time PCR was performed on cuttings during the rooting stage collected from genotypes characterized by high and low rooting ability. Moreover, the gene expression was investigated on different olive tissues. Preliminary results showed that the expression of OeAUX1B and OeAUX1R in base of cuttings and roots of the high-rooting genotype were higher which suggests the hypothesis of the involvement of OeAUX1 in olive rooting. Bioinformatics analysis revealed that AUX1 gene had 8 exons in olive and the sequence of this gene in plant was conserved during evolution.
کلیدواژه‌ها [English]
زیتون (Olea europaea L.) یکی از فراوان‌ترین محصولات میوه‌دار در حوزه مدیترانه و از قدیمی‌ترین محصولات باغی است که عموماً برای استخراج روغن کشت می‌شده است (Wu et al., 2004). این گونه متعلق به تیره Oleaceae، دیپلوئید (2n=46)، هتروزیگوت و تک‌پایه است (Johnson, 1957). تکثیر زیتون با روش‌های جنسی و غیرجنسی صورت می‌گیرد. از کشت بذر برای دستیابی به تنوع ژنتیکی و از ازدیاد غیرجنسی برای تولید گیاهان مشابه با گیاه مادری استفاده می‌شود. سیستم ریشه‌دهی زیتون بسیار قوی است. با توجه به این که 70 تا 90 درصد تکثیر این گیاه به ریشه‌دهی موفق قلمه‌ها بستگی دارد (Santos Macedo et al., 2009)، شناسایی عوامل تنظیم‌کننده تولید ریشه اعم از عوامل ژنتیکی، وضعیت غذایی، مرحله فنولوژیکی، فیزیولوژی گیاه مادری و شرایط محیطی ضروری است (Santos Macedo et al., 2009). یکی از مهم‌ترین عوامل مؤثر در کارآیی گیاه، تنش‌های زیستی و غیرزیستی (شوری، خشکی و سرما) هستند که بر سرعت رشد و نمو و القای اندام‌هایی نظیر بخش‌های هوایی، ریشه و ریشه‌های مویین تأثیرگذار هستند (Santos Macedo et al., 2009). همچنین، عوامل ژنتیکی نیز تأثیر به‌سزایی بر قابلیت ریشه‌زایی زیتون دارند (Wu et al., 2004).
با توجه به اهمیت این گیاه روغنی در ایران و جهان، لازم است تا ژن‌های مهم دخیل در فرآیند ریشه‌زایی شناسایی و همسانه‌سازی شود تا بتوان در فرآیندهای به‌گزینی از آن بهره برد و به انتخاب گیاهانی با ریشه‌دهی بالا در مراحل نونهالی کمک نمود.
تاکنون مطالعات اندکی پیرامون ژن‌های دخیل در ریشه‌زایی زیتون انجام شده است و تنها Santos Macedo و همکاران (2009 و 2012) این موضوع را به صورت محدود در سطح مولکولی بررسی نموده‌اند در حالی که اغلب مطالعات بیانگر تأثیر ترکیباتی نظیر هورمون‌ها در القای ریشه‌زایی قلمه‌های زیتون است (Sebastiani and Tognetti, 2004).
پرسش‌های بی‌پاسخ متعددی در زمینه تنظیم ژنتیکی صفت ریشه‌زایی در زیتون وجود دارد و بر اساس بررسی‌های انجام شده، اهداف مطالعه حاضر تاکنون در طرح‌های مشابه انجام نشده است.
با توجه به طولانی بودن مرحله نونهالی زیتون (5 سال) و زمان‌بر بودن روش‌های اصلاح سنتی و ناکارآمد بودن این روش‌ها و با توجه به این که کیفیت پایین ریشه‌زایی از عوامل محدودکننده باغات زیتون به شمار می‌رود، اصلاح ضعف ریشه‌زایی و افزایش کارآیی آن موجب افزایش مزیت‌های اقتصادی قلمه‌های زیتون و کاهش مدت زمان ایجاد باغستان‌های آن می‌شود (Sebastiani and Tognetti, 2004). از دیگر مزایای ریشه‌زایی، افزایش تحمل گیاه در برابر تنش‌های غیرزیستی است (Santos Macedo et al., 2009).
هدف از مطالعه حاضر، شناسایی و بررسی ژن یا ژن‌های تأثیرگذار در فرآیند ریشه‌زایی در قلمه‌های زیتون است. از آنجا که قابلیت ریشه‌زایی از جمله مشکلات مطرح در تولید و تکثیر پایه‌های مطلوب زیتون در ایران است، با شناسایی ژن یا ژن‌های دخیل در ریشه‌زایی می‌توان درختان زیتون با توان ریشه‌دهی بالا را در مراحل نونهالی شناسایی نمود و از این ویژگی در برنامه‌های اصلاح و به‌نژادی زیتون استفاده کرد، ضمن این که تکثیر غیرجنسی ارقام ارزشمند ایرانی با درک سازوکار ژنتیکی بهبود خواهد یافت. به طور کلی، نتایج این تحقیق پاسخگوی مشکلات اساسی در مطالعات ژنومیک و برنامه‌های به‌نژادی مولکولی زیتون در جهت بهبود و ارتقای ریشه‌زایی در ارقام کنسروی و روغنی زیتون ایران خواهد بود.
مواد و روش‌ها.
مواد گیاهی: در پژوهش حاضر، از جمعیت ژنتیکی حاصل از تلاقی دو رقم زیتون (Leccino به عنوان پایه مادری با ریشه‌دهی قوی و Dolce Agogia به عنوان پایه پدری با ریشه‌دهی ضعیف) و 115 نتاج حاصله دارای تفرق برتر در صفت ریشه‌زایی نسبت به والدین استفاده شد. از هرکدام از نتاج حاصل از تلاقی، 6 قلمه با دو تکرار تهیه شد. از هورمون IBA با غلظت ppm 2000 به منظور ریشه‌دار شدن استفاده گردید. قلمه‌ها در اتاقک رشد حاوی پرلیت استریل با رطوبت 100 درصد و دمای 23 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. پس از دو ماه، صفات ریشه‌زایی از جمله: تعداد قلمه‌های ریشه‌دار شده، درصد ریشه‌زایی، طول و تعداد ریشه‌ها اندازه‌گیری شد. بر اساس این صفات، گیاهان با قابلیت ریشه‌دهی بالا و پایین انتخاب شدند. از این گیاهان در زمان‌های 0، 10، 20، 30 و 40 روز پس از قلمه‌گیری (به ترتیب T0، T1، T2، T3 و T4) قلمه تهیه شد. در فواصل زمانی یاد شده، از ناحیه پایین قلمه هر گیاه (یک سانتی‌متر انتهای قلمه زیر نخستین گره) نمونه‌برداری انجام و نمونه‌ها جهت استخراج RNA به سرعت در نیتروژن مایع فریز شد. همچنین، برای بررسی بیان ژن‌ها در اندام‌های مختلف، از گل، برگ، ریشه و انتهای قلمه یکی از نتاج با ریشه‌دهی بالا نیز نمونه‌برداری انجام گرفت.
انتخاب و جداسازی ژن کاندید.
بر اساس پژوهش‌های Shen و همکاران (2010) و Corinne و همکاران (2012) چندین ژن دخیل در ریشه‌زایی انتخاب شد و از میان آنها ژن ناقل برون شارش اکسین 1 (AUX1) انتخاب گردید. با توجه به این که این ژن تاکنون در زیتون گزارش نشده بود، با نرم‌افزار .primer 3-0.40 (http://bioinfo.ut.ee/primer 3-0.4.0) از مناطق حفاظت شده در سایر گونه‌های زیتون یک آغازگر چندحالتی برای این ژن طراحی گردید. از ریشه و انتهای قلمه یکی از نتاج با ریشه‌دهی بالا RNA استخراج شد (QIAGEN, Cat No: 74904) پس از تیمار با DNase (Ambion, Cat No: 1011015) جهت حذف آلودگی DNA، سنتز cDNA (Invitrogen, Cat No: 18080-093) صورت گرفت. همسانه‌سازی ژن در حامل pGEM T-easy vector 2.1 و توالی‌یابی توسط دستگاه Genetic Analyzer (مدل ABI PRISM 3130، شرکت Life Technologies، آمریکا) انجام شد.
بررسی کمّی بیان ژن: PCR در زمان واقعی
(real-Time PCR) با سایبرگرین (Power SYBR® .Green, Applied Biosystem (AB) Lot: 1208368) به صورت تک مرحله‌ای و در حجم نهایی 10 میکرولیتر انجام شد. مخلوط واکنش شامل 5 میکرولیتر از سایبرگرین و 1 میکرومولار از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده از توالی ژن AUX1 در انتهای قلمه و ریشه، با غلظت 2 پیکومول بود. واکنش در دستگاه ABI طبق این شرایط انجام شد: یک چرخه با 95 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه و 40 چرخه با دمای 95 درجه سانتیگراد، 10 ثانیه و 60 درجه سانتیگراد، 1 دقیقه. منحنی ذوب در دمای 95 درجه سانتیگراد، 15 ثانیه؛ 60 درجه سانتیگراد، 1 دقیقه و 95 درجه سانتیگراد، 15 ثانیه رسم شد. داده‌ها بر اساس دو تکرار زیستی و سه تکرار تکنیکی بودند. تحلیل نتایج با روش Livak و Schmittgen (2001) (2-ΔΔCt) انجام شد و با آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح معنی‌داری P<0.01 بررسی شد.
بررسی‌های بیوانفورماتیک: با استفاده از داده‌های توالی‌یابی ژنوم والد مادری (Leccino)، توالی‌هایی با تشابه بیش از 90 درصد با توالی ژن AUX1 گزارش شده در سایر گیاهان انتخاب شد. سپس با نرم‌افزار برخط Softberry (http://linux1.softberry.com) توالی mRNAهایی به دست آمد، هر کدام از توالی‌ها به طور جداگانه در پایگاه اطلاعاتی NCBI بلاست شدند تا توالی منطبق با ژن AUX1 مشخص شود. با هم‌ردیفی توالی پیش‌گویی شده، ژن AUX1 و توالی نوکلئوتیدی ژنوم والد مادری، تعداد اگزون و اینترون‌های این ژن مشخص شد. سپس با نرم‌افزار برخط ExPASy (http://web.expasy.org/translate) توالی پروتئینی این ژن مشخص و برای توالی مذکور در پایگاه اطلاعاتی NCBI بلاست انجام شد.
تحلیل آماری: آنالیز واریانس داده‌ها و مقایسه میانگین بیان ژن در زمان‌های مختلف برای نتایج به دست آمده از PCR با آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح خطای 01/0 با نرم‌افزار R Console نسخه 2/0/3 انجام شد.
نتایج و بحث.
نتاج با ریشه‌دهی بالا (100 درصد) و ریشه‌دهی پایین (0 درصد) بر مبنای صفات ریشه‌زایی از جمله: تعداد قلمه‌های ریشه‌دار شده، درصد ریشه‌زایی، طول و تعداد ریشه‌ها شناسایی شدند. به دنبال آن، ژن AUX1 در انتهای قلمه و ریشه در یکی از نتاج حاصل از تلاقی با ریشه‌دهی بالا همسانه‌سازی شد و نتایج نشان داد که توالی ژن در این دو منطقه دارای چندشکلی است به طوری که توالی ژن AUX1 جداسازی شده از انتهای قلمه و ریشه در سطح رونوشت و آمینو اسید به ترتیب 84 و 85 درصد با یکدیگر تشابه داشتند. بر این اساس، ژن جداسازی شده از ریشه و انتهای قلمه به ترتیب OeAUX1R و OeAUX1B نام‌گذاری شد. احتمالاً این چندشکلی نشان دهنده وجود دو آلل برای این ژن است که بر مبنای تفاوت بافت عمل می‌نمایند. با توجه نقش عمده اکسین‌ها در تشکیل ریشه‌های نابجا به ویژه در آغاز تشکیل و نمو پریموردیای ریشه‌های نابجا، افزایش تعداد ریشه‌های نابجا در اثر استفاده از اکسین خارجی و کاهش تعداد ریشه‌های نابجا در اثر ممانعت از انتقال اکسین (Fukaki and Tasaka, 2009)، بررسی الگوی بیان نسبی این ژن‌ها در بافت‌ها در زمان‌های مختلف ضروری به نظر می‌رسد. به این منظور از آزمون کمّی PCR در زمان واقعی با دقت بسیار بالا جهت بررسی بیان استفاده گردید.
نتایج در زمان واقعی PCR با آغازگرهای اختصاصی ژن‌های OeAUX1R و OeAUX1B در زمان‌های 0، 10، 20، 30 و 40 روز پس از قلمه‌گیری برای نتاج با ریشه‌دهی بالا و پایین نشان داد که در نتاج با ریشه‌دهی بالا بیان هر دو ژن در زمان 0 افزایش و سپس کاهش معنی‌داری داشت و در زمان‌های بعد میزان بیان تقریباً ثابت بود (شکل 1-A و B). از سوی دیگر، بیان ژن OeAUX1B در نتاج با ریشه‌دهی پایین در زمان‌های 0 و 40 روز پس از قلمه‌گیری اختلاف معنی‌داری با بیان همین ژن در سه زمان دیگر داشت، اما در مقایسه با نتاج با ریشه‌دهی بالا بیان این ژن در زمان 0 تقریباً 6 برابر بیشتر از بیان در نتاج با ریشه‌دهی پایین بود ضمن این که تفاوتی در میزان بیان ژن OeAUX1R طی مدت زمانی معین در نتاج با ریشه‌دهی پایین مشاهده نشد. این نتایج نشان داد که با توجه به این که قلمه‌ها از شاخه‌های جدید گرفته شدند و بر اساس این که سطوح اکسینی که به صورت طبیعی در بافت‌های قلمه‌زده وجود دارد به گیاه مادری بستگی دارد (George et al., 2008)، بنابراین سطوح بالای بیان ژن در زمان 0 می‌تواند به علت توان بالای گیاه مادری در ایجاد ریشه باشد. Costa و همکاران در سال 2013 نشان داده‌اند که طی ساعات اولیه پس از جداسازی قلمه گیاه جاسمونات، ترکیبات فنلی و اکسین در انتهای قلمه به صورت محلی افزایش می‌یابند و بلافاصله پس از جداسازی قلمه‌ها از گیاه مادری، محتوای بالایی از اکسین را مشاهده کردند که می‌تواند در بهبود ریشه‌زایی مؤثر باشد. همچنین گزارش شده است که محتوای اولیه و ترکیبات فنلی منتقل شده از گیاه مادری به قلمه‌ها، ممانعت از تجزیه اکسین در انتهای قلمه توسط ترکیبات فنلی و نیز میان‌کنش بین این متابولیت‌ها، اکسین‌ها و پراکسیدها می‌تواند تشکیل ریشه‌های نابجا را تحت تأثیر قرار دهد (De Klerk et al., 1999). با توجه به این شواهد می‌توان احتمال داد که ژن AUX1 در گیاهان با توان ریشه‌دهی بالا از ابتدا بیان بالایی داشته است به همین دلیل می‌تواند پس از قلمه‌گیری، اکسین بیشتری به انتهای قلمه منتقل کند و به ایجاد ریشه در این منطقه منجر شود.
|
شکل 1- الگوی بیان نسبی ژن‌های OeAUX1B و OeAUX1R. A و B: بیان ژن‌ها در زمان‌های 0، 10، 20، 30 و 40 روز پس از قلمه‌گیری (به ترتیب T0، T1، T2، T3 و T4) در یکی از نتاج با ریشه‌دهی بالا (سیاه) و یکی از نتاج با ریشه‌دهی پایین (سفید)؛ C و D: نحوه بیان ژن‌ها در بافت‌های گوناگون یکی از نتاج با ریشه‌دهی بالا. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح 01/0 است. |
|
مطالعات نشان داده است که نیمه عمر پروتئین کد شده توسط ژن AUX1 بسیار کوتاه است (Corinne et al., 2012) و احتمالاً طی ساعات اولیه پس از قلمه‌گیری بیان این ژن تغییر خواهد یافت. بر اساس مطالعات موجود اکسین می‌تواند در مراحل اولیه ایجاد پریموردیای ریشه پس از قلمه‌گیری افزایش یابد که می‌تواند بر بیان ژن‌های وابسته هم اثر بگذارد (Costa et al., 2013). به منظور درک بیشتر لازم است بیان ژن طی ساعات مختلف پس از قلمه‌گیری در نتاج با ریشه‌دهی بالا و پایین بررسی گردد، همچنین اثر اکسین خارجی بر بیان ژن AUX1 در آزمایشی با حضور اکسین و بدون آن در زمان‌های 0، 10، 20، 30 و 40 روز پس از قلمه‌گیری در حال بررسی است.
نتایج بررسی بیان این ژن‌ها در بافت‌های مختلف از جمله: برگ، گل، ریشه و انتهای قلمه در نتاج با ریشه‌دهی بالا نشان داد که بیشترین بیان ژن‌ها در ناحیه انتهای قلمه و ریشه است (شکل 1-C و D).
تحلیل بیوانفورماتیک نشان داد که ژن AUX1 در زیتون دارای 8 اگزون و طول کامل ژن حدود 4000 جفت باز است. توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی این ژن با تشابه بالای 80 درصد با توالی نوکلئوتید و پروتئین همین ژن در گیاهان دیگر هم‌ردیف شدند و مشخص شد که توالی ژن AUX1 در بین گیاهان، طی تکامل حفاظت شده است.
با توجه به این که خانواده ژنی AUX/LAX از انتقال‌دهنده‌های اکسین برون شارش برای استقرار و سازماندهی سلول‌های ریشه جنینی آرابیدوپسیس هستند (Shen et al., 2010) و پژوهش‌های دیگر نشان داد که معمولاً انتقال اکسین از برگ و تجمع آن در انتهای قلمه برای ایجاد ریشه‌های نابجا در ارقام سهل‌ریشه‌زا کافی است (Costa et al., 2013) و این امر می‌تواند توسط ژن‌های ناقل اکسین نظیر AUX1 صورت گیرد، بنابراین انتظار می‌رود این ژن در زیتون نیز به عنوان یکی از ژن‌های کاندید دخیل در ریشه‌زایی باشد.
سپاسگزاری.
نگارندگان از پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری بابت تأمین هزینه‌ها (طرح پژوهشی شماره 437) و فراهم نمودن امکانات و همچنین مؤسسه تحقیقات علوم زیستی و منابع زیستی پروجا در ایتالیا در ایتالیا سپاسگزاری می‌نمایند.
)
