نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
گروه زیست‌شناسی، دانشکدة علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Tomato is one of the valuable crop plant that is used as a model plant. Salicylic acid leads to the synthesis and accumulation of secondary metabolites such as phenol, flavonoids, lignin and anthocyanin by changing the activity of the key enzymes involved in their biosynthesis pathway. For study of the effect of SA on secondary metabolites and its biosynthesis pathway, the current experiment carried out using 0, 000.1, 00.1, 0.01, 0.1 and 0.5 mM Salicylic acid in MS medium under in vitro culture condition. After four weeks, seedlings removed from culture container and were analyzed. Results showed that with increasing of salicylic acid concentration dry and fresh weight of roots and shoot as well as the amount of chlorophyll a and b were increased significantly compared with control plants but they were decreased significantly in some concentrations. The total phenol compounds, flavonoids and anthocyanin, as well as PAL, TAL and Peroxidase activity were also gradually increased by increasing of salicylic acid concentration. The maximum level of these parameters were observed at 0/01 mM salicylic acid. The results suggested that, salicylic acid improved plant growth in optimum levels and decreased pigments and plant weight in toxic levels. Phenolic compounds and biosynthesis enzymes were increased by inductive role of SA against ROS production and oxidative stress.
کلیدواژه‌ها [English]
گیاه گوجه‌فرنگی یکی از گیاهان زراعی است که بهصورت گیاه مدل در شرایط آزمایشگاهی استفاده می‌شود. هورمون سالیسیلیک اسید سنتز و تجمع متابولیت‌های ثانویه را مانند فنل، فلاونوئید و آنتوسیانین با تغییر در آنزیم‌های درگیر در مسیر بیوسنتزی آنها در گیاهان موجب می‌شود. پژوهش حاضر با هدف بررسی اثر سالیسیلیک اسید بر متابولیت‌های ثانویه و مسیر بیوسنتز آنها، در غلظت‌های صفر، 0001/0، 001/0، 01/0، 1/0 و 5/0 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید در محیط‌کشت MS در شرایط کشت بافت انجام شد. پس از چهار هفته رشد، گیاهچه‌ها برای بررسی و اندازهگیری شاخص‌ها از شیشه خارج شدند. نتایج نشان دادند با افزایش سالیسیلیک اسید، وزن تر و خشک ریشه و اندام هوایی و همچنین مقدار کلروفیل‌های a، b و کل گیاه تا غلظت 01/0 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید افزایش و سپس کاهش معنی‌داری نسبت به نمونة شاهد نشان دادند. ترکیبات فنل کل، فلاونوئید، آنتوسیانین، آنزیم‌های فنیل‌آلانین آمونیالیاز، تیروزین آمونیالیاز و پراکسیداز نیز با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید به‌تدریج افزایش یافتند و بیشترین مقدار آنها در غلظت 5/0 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید بود. نتایج پیشنهاد می‌کنند سالیسیلیک اسید در غلظت‌های بهینه افزایش رشد و در غلظت‌های زیاد با ایجاد تنش اکسیداتیو کاهش وزن و مقدار رنگیزه‌های گیاه را موجب می‌شود. ترکیبات فنلی و آنزیم‌های بیوسنتزی آن نیز با افزایش سالیسیلیک اسید به دو دلیل افزایش می‌یابند که عبارتند از: 1- سالیسیلیک اسید بر مقدار ترکیبات یادشده اثر مستقیم می‌گذارد و 2- این ترکیبات با داشتن خاصیت آنتی‌اکسیدانی در برابر گونه‌های اکسیژن فعال تولیدشده بر اثر تیمار سالیسیلیک اسید در گیاه افزایش می‌یابند.
واژه‌های کلیدی: ترکیبات فنلی، تیروزین آمونیالیاز، سالیسیلیک اسید، فنیل‌آلانین آمونیالیاز، کشت در شیشه، گوجه‌فرنگی
مقدمه
.سالیسیلیک اسید ترکیبی فنلی است که در گیاهان بهصورت اسید فنلی آزاد و در شرایطی به شکل غیرفعال وجود دارد. سالیسیلیک اسید تاثیر چشمگیری بر شاخص‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی گیاهان و مقابله با شرایط تنش‌زای زیستی و غیرزیستی دارد (Arfan et al., 2007؛ Wang et al., 2010). غلظت بهینة سالیسیلیک اسید به چهار عامل گونة گیاه، غلظت استفاده‌شده، نحوة کاربرد و مرحلة نموی بستگی داردHorváth et al., 2007) ؛ Vanacker et al., 2001). بررسی‌ها نشان داده‌اند سالیسیلیک اسید بهصورت مولکولی پیام‌رسان عمل می‌کند و این نقش با تحریک تولید گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) مانند هیدروژن پراکسید، آنیون سوپر اکسید و رادیکال‌های هیدروکسیل انجام می‌شود. سالیسیلیک اسید اثری دوجانبه دارد و در غلظت‌های کم با تولید مقادیر کم ROS پیام‌رسانی را در گیاه موجب می‌شود و برای القای پاسخ مقاومتی ضروری است؛ ولی در غلظت‌های زیاد با تولید بیش از حد ROS تنش اکسیداتیو در گیاه می‌کند(Borsani et al., 2001) . گیاهان برای مقابله با تنش‌های حاصل از تولید ROS از آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی و غیرآنزیمی استفاده می‌کنند. آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی شامل ترکیباتی با وزن مولکولی کم مانند آسکوربات، توکوفرول و ترکیبات فنلی هستند. بسیاری از متابولیت‌های ثانویة فنلی جزء مهم‌ترین آنتی‌اکسیدان‌های گیاهی مقابله‌کننده با تنش‌های اکسیداتیو هستند (Sharma et al., 2009؛ War et al., 2011). این ترکیبات با آنزیم‌های فنیل‌آلانین آمونیالیاز و تیروزین آمونیالیاز ساخته می‌شوند. آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز اصلی‌ترین و نخستین آنزیم مسیر بیوسنتز ترکیبات فنلی است که فنیل‌آلانین را به ترانس سینامیک اسید تبدیل می‌کند (Randhir et al., 2006). آنزیم تیروزین آمونیالیاز نیز در یکی دیگر از مسیرهای بیوسنتزی ترکیبات فنلی، تیروزین را به کوماریک اسید تبدیل می‌کند (Berner et al., 2006). بررسی‌های Jacobo-Velázquez و همکاران (2011) نشان داده‌اند آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز در تنش‌های زیستی و غیرزیستی افزایش می‌یابد و با بیشترشدن فعالیت ویژة این آنزیم، متابولیت‌های ثانویه افزایش می‌یابند. همچنین تجمع گونه‌های فعال اکسیژن با افزایش بیان ژن‌های کدکنندة این آنزیم افزایش می‌یابد. سالیسیلیک اسید می‌تواند با تولید ROS و القای آنزیم‌های فنیل‌آلانین آمونیالیاز و تیروزین آمونیالیاز، متابولیت‌های ثانویه را تنظیم کند (Berner et al., 2006؛ Dokhanieh et al., 2013؛ War et al, 2011). فلاونوئیدها و آنتوسیانین‌ها از بزرگ‌ترین زیرگروه‌های ترکیبات فنلی هستند که از مسیر فنیل پروپانوئیدی ساخته می‌شوند و در مقابله با تنش‌های زیستی و غیرزیستی دخالت دارند (Gill and Tuteja, 2010). پیشنهاد شده است این ترکیبات، جاروب‌کننده‌های ROS در گیاهان هستند (Agati et al., 2012). مطالعات نشان داده‌اند سالیسیلیک اسید به‌طور مستقیم و غیرمستقیم بر فلاونوئیدها و آنتوسیانین‌ها اثر می‌گذارد (Kováčik et al., 2009؛ Wang et al., 2015؛ Radwan, 2012). علاوه‌براین، میزان ترکیبات فنلی و پاسخ به تنش اکسیداتیو می‌توانند با آنزیم‌های دیگری مانند پراکسیداز نیز تنظیم شوند. آنزیم پراکسیداز در جاروب‌کردن گونه‌های فعال اکسیژن و پلیمریزاسیون پیشمادههای لیگنین نقش دارد (Cvikrová et al., 2006).
گیاه گوجه‌فرنگی (Solanum lycopersicum Mill) یکی از مهم‌ترین محصولات کشاورزی است که به خانوادة Solanaceae تعلق دارد و در معرض ویروس‌ها، بیماری‌ها و تنش‌های مختلف محیطی و زیستی است. این گیاه بهصورت الگو در بسیاری از پژوهش‌های زیست‌شناسی و کشاورزی استفاده می‌شود.
باوجود گزارش‌های زیادی که دربارة به‌کارگیری سالیسیلیک اسید در گیاهان منتشر شده است؛ ولی تاکنون بررسی کاملی از اثر تیمار سالیسیلیک اسید بر ترکیبات فنلی و آنزیم های مسیر بیوسنتز آنها در گیاه گوجه‌فرنگی ارائه نشده است. هدف از پژوهش حاضر، بررسی اثر سالیسیلیک اسیدکه هورمون تنظیم‌کنندة رشد است، بر برخی از شاخص‌های رشد، ترکیبات ثانویه و آنزیم‌های شرکت‌کننده در مسیر سنتز آنها در گیاه گوجه‌فرنگی است.
مواد و روش‌ها
ابتدا بذرهای گیاه گوجه‌فرنگی با هیپوکلریت سدیم 1/0 درصد ضدعفونی و سپس با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. بذرهای ضدعفونی‌شده به‌مدت یک ساعت در آب مقطر استریل قرار داده شدند. تعداد 5 بذر روی محیط‌کشت MS در شیشه کشت قرار داده شدند و گیاهچه‌های حاصل روی همین محیط‌کشت تکثیر شدند. پس از یک هفته گیاهچه‌های با رشد یکنواخت روی محیط‌کشت جدید MS حاوی سالیسیلیک اسید با غلظت‌های 0001/0، 001/0، 01/0، 1/0 و 5/0 میلی مولار واکشت شدند. در هر شیشه تعداد سه گیاه تقریبا یکسان کشت داده شدند. شیشه‌ها در اتاق رشد در شرایط نوری 16 ساعت، نور و 8 ساعت، تاریکی، دمای 25 درجة سانتی‌گراد و شدت نور حدود 44 میکرو مول فوتون بر مترمربع بر ثانیه قرار گرفتند. گیاهان رشد‌یافته پس از چهار هفته از شیشه خارج و وزن گیاه، محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی، فنل کل، فلاونوئید، محتوای آنتوسیانین و فعالیت ویژة آنزیم‌های فنیل‌آلانین آمونیالیاز، تیروزین آمونیالیاز و پراکسیداز اندازهگیری شدند.
اندازهگیری کلروفیل: برای سنجش محتوای کلروفیل و کاروتنوئید از روش Arnon (1949) استفاده شد. 1/0 گرم از بافت تازة گیاه در استون 80 درصد (v:v ) در محیط تاریک روی یخ ساییده شد. مخلوط حاصل به‌مدت 15 دقیقه با سرعت 10000 دور بر دقیقه در دمای 4 درجة سانتی‌گراد سانتریفیوژ (مدل 5810، شرکت Eppendorf، آلمان) شد. محلول رویی برای اندازهگیری محتوای کلروفیل و کاروتنوئید استفاده شد. جذب نوری محلول رویی برای کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئید به‌ترتیب در طول‌موج‌های 470، 645 و 663 نانومتر با اسپکتروفتومتر (مدل UV-110، شرکت Shimadzu، ژاپن) خوانده شد. غلظت رنگیزه‌ها با رابطه‌های 1، 2، 3 و 4 محاسبه و برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر گیاه گزارش شد.
|
رابطة 1 |
Chla = 12.25 A663.2 – 2.79 A646.8 |
|
رابطة 2 |
Chlb= 21.21 A646.8 – 5.1 A663.2 |
|
رابطة 3 |
ChlT= Chla + chlb |
|
رابطة 4 |
Car = (1000A470 - 1.8 chla - 85.02 Chlb) / 198 |
Chla، Chlb، ChlT، Car و A به‌ترتیب نشان‌دهندة کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل، کاروتنوئید و طول‌موج هستند.
.اندازهگیری فعالیت ویژة آنزیم‌های .فنیل‌آلانین آمونیالیاز و تیروزین آمونیالیاز:فعالیت ویژة آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز و تیروزین آمونیالیاز با روش Beaudoin-Eagan و Thorpe (1985) اندازهگیری شد. ابتدا 1/0 گرم از بافت تازة برگ گیاه در 2 میلی‌لیتر بافر هیدروکلریک اسید Tris (05/0 مولار و pH برابر با 4/8) حاوی 2-مرکاپتواتانول 15 میلی‌مولار ساییده و همگن شد؛ سپس به‌مدت 15 دقیقه با سرعت 10000 دور بر دقیقه و در دمای 4 درجة سانتی‌گراد سانتریفیوژ و محلول رویی یا همان عصارة آنزیمی استفاده شد. محلول واکنش حاوی فنیل‌آلانین 6 میکرومولار برای اندازهگیری آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز، تیروزین 5/5 میکرومولار برای اندازهگیری آنزیم تیروزین آمونیالیاز، 500 میکرولیتر هیدروکلریک اسید-Tris و 100 میکرولیتر عصارة آنزیمی بود و حجم نهایی آن به 1 میلی‌لیتر رسانده شد. پس از گذشت 70 دقیقه در دمای 37 درجة سانتی‌گراد، واکنش‌های تبدیل تیروزین به کوماریک اسید و تبدیل فنیل‌آلانین به سینامیک اسید با اضافه‌کردن 50 میکرولیتر کلریدریک اسید 5 نرمال متوقف شد. فعالیت ویژة آنزیم در طول‌موج 290 نانومتر براساس تولید ترانس سینامیک اسید برای آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز و در طول‌موج 333 نانومتر با تولید کوماریک اسید برای آنزیم تیروزین آمونیالیاز با اسپکتروفتومتر خوانده شد. فعالیت ویژة آنزیم‌ها برحسب میکرومول فراوردة تولیدشده به‌ازای یک میلی‌گرم پروتئین در یک دقیقه بیان شد.
اندازهگیری فنل کل: سنجش محتوای فنل کل با معرف فولین - سیوکالتو و روش Singleton و همکاران (1999) انجام شد. به‌طور خلاصه، 05/0 گرم از بافت تازة برگ گیاه در 2 میلی‌لیتر متانول 80 درصد ساییده و همگن شد و در بن ماری در دمای 70 درجة سانتی‌گراد به‌مدت 15 دقیقه قرار گرفت؛ سپس با سرعت 5000 دور بر دقیقه به‌مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. به 1 میلی‌لیتر از محلول متانولی رویی، 8/1 میلی‌لیتر آب مقطر و 2/0 میلی‌لیتر معرف فولین اضافه و محلول به‌مدت 5 دقیقه در دمای 25 درجة سانتی‌گراد نگهداری شد؛ سپس 1 میلی‌لیتر سدیم کربنات 12 درصد به محلول بالا اضافه شد. پس از 2 ساعت قرارگرفتن در دمای آزمایشگاه، جذب محلول حاصل در طول‌موج 765 نانومتر با اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. غلظت فنل براساس میلی‌گرم گالیک اسید بر گرم وزن تر بیان شد و از گالیک اسید برای رسم نمودار استاندارد استفاده شد.
اندازهگیری فلاونوئیدکل: از روش Pękal و Pyrzynska (2014) برای اندازهگیری فلاونوئید کل استفاده شد. دراین روش با آلومینیوم کلرید و روش رنگ‌سنجی، مقدار فلاونوئید اندازهگیری شد. 05/0 گرم برگ تازة گیاه با 5 میلی‌لیتر متانول 80 درصد در هاون به‌خوبی ساییده شد؛ سپس عصارة حاصل با سرعت 8000 دور بر دقیقه به‌مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ و 1 میلی‌لیتر از محلول رویی با 4/4 میلی‌لیتر آب مقطر رقیق شد. در مرحلة بعد، 300 میکرولیتر سدیم نیتریت 10 درصد، 300 میکرولیتر آلومینیوم کلرید 5 درصد و 4 میلی‌لیتر سدیم هیدروکسید 1 نرمال به محلول اضافه و شدت جذب در طول‌موج 510 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. برای محاسبه غلظت فلاونوئید از کوئرسیتین برای رسم نمودار استاندارد استفاده شد. محتوای فنل کل برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر بیان شد.
اندازهگیری آنتوسیانین کل: محتوای آنتوسیانین کل از روش Wagner (1979) اندازهگیری شد. در این روش 05/0 گرم از بافت تازة برگ گیاه در 10 میلی‌لیتر متانول اسیدی (متانول: هیدروکلریک اسید، 1: 99؛ حجمی - حجمی) درون هاون چینی ساییده شد. مخلوط حاصل درون فالکون ریخته و به‌مدت 24 ساعت در دمای اتاق در محیط تاریک قرار داده شد؛ سپس عصارة حاصل با سرعت 10000 دور بر دقیقه به‌مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ و جذب محلول رویی در طول‌موج 550 نانومتر با اسپکتروفتومتر خوانده شد. آنتوسیانین کل با ضریب خاموشی (ε) معادل 33000 بر میلی‌مولار بر سانتی‌متر با رابطة 5 محاسبه شد.
|
رابطۀ 5 |
A= εbc |
A، b و c به‌ترتیب نشان‌دهندة جذب نوری محلول، عرض کووت (سانتی‌متر) و غلظت محلول مدنظر (میلی‌گرم بر گرم) هستند.
اندازهگیری میزان فعالیت ویژة پراکسیداز: برای اندازهگیری میزان فعالیت ویژة آنزیم پراکسیداز از روش Maehly و Chance (1955) استفاده شد. ابتدا 1/0 گرم از بافت تازة گیاه در 1 میلی‌لیتر از بافر فسفات 200 میلی‌مولار حاوی اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) 1 میلی‌مولار، PVP (پلی وینیل پیرولیدین) 2 درصد، DTT (دی تیو تریتول) 4 میلی‌مولار و گلیسرول 10 درصد ساییده و با سرعت 13000 دور بر دقیقه در مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد؛ سپس محلول رویی یا همان عصارة آنزیمی استفاده شد. مخلوط واکنش شامل 900 میکرولیتر بافر فسفات 25 میلی‌مولار، گایاکول 05/0 درصد، هیدروژن پراکسید 1/0 میلی‌مولار، EDTA 1/0 میلی‌مولار و 100 میکرولیتر عصارة آنزیمی بود. افزایش جذب ناشی از اکسیداسیون گایاکول، در طول‌موج 470 نانومتر با اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد و ضریب خاموشی 6/26 بر میلی‌مولار بر سانتی‌متر محاسبه و برحسب واحد بر میلی‌گرم پروتئین بیان شد. هر واحد فعالیت ویژة آنزیمی، مقدار فعالیت آنزیمی است که موجب 01/0 تغییر در جذب می‌شود.
همة آزمایش‌ها برای هر تیمار در سه تکرار انجام شد. در هریک از تکرارها 3 گیاه درون شیشة کشت و بهصورت طرح کاملا تصادفی آزمایش شد. میانگین داده‌های به‌دست‌آمده از سنجش شاخص‌ها با تجزیة واریانس با ضریب اطمینان 95 درصد با آزمون دانکن (05/0P≤) و نرم‌افزار SPSS ازنظر آماری تحلیل و نمودارها با نرم‌افزار Excel رسم شدند.
نتایج
.اثر سالیسیلیک اسید بر فعالیت ویژة آنزیم‌های فنیل‌آلانین آمونیالیاز، تیروزین آمونیالیاز و پراکسیداز: باتوجهبه نتایج به‌دست‌آمده از جدول 1 میزان فعالیت ویژة سه آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز، تیروزین آمونیالیاز و پراکسیداز با افزایش غلظت تیمار سالیسیلیک اسید به‌طور تدریجی افزایش معنی‌داری را نسبت به نمونه‌های شاهد نشان داد و بیشترین میزان فعالیت ویژة هر سه آنزیم در غلظت 5/0 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید مشاهده شد.
جدول 1- اثر سالیسیلیک اسید بر میزان فعالیت ویژة آنزیم‌های فنیل‌آلانین آمونیالیاز، تیروزین آمونیالیاز و پراکسیداز
|
تیمار |
غلظت (میلی‌مولار) |
فعالیت ویژة آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز (میکرو مول سینامیک اسید بر میلی‌گرم پروتئین در یک دقیقه) |
فعالیت ویژة آنزیم تیروزین آمونیالیاز (میکرو مول کوماریک اسید بر میلی‌گرم پروتئین در یک دقیقه) |
فعالیت ویژة آنزیم پراکسیداز (واحد آنزیمی بر میلی‌گرم پروتئین) |
|
سالیسیلیک اسید |
0 |
173/4f |
456/2e |
325/15d |
|
0001/0 |
426/5e |
680/2e |
318/15d |
|
|
001/0 |
746/5d |
976/2d |
657/17c |
|
|
01/0 |
956/5c |
370/4c |
752/20c |
|
|
1/0 |
263/6b |
970/4b |
145/25b |
|
|
5/0 |
0433/7a |
850/5a |
349/27a |
مقادیر، میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار با آزمون دانکن در سطح 05/0P≤ هستند.
.اثر سالیسیلیک اسید بر وزن اندام هوایی و ریشه: نتایج نشان دادند مقدار وزن تر و خشک اندام هوایی و ریشه با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید در غلظت‌های 0001/0، 001/0 و 01/0 میلی‌مولار به‌طور معنی‌داری افزایش یافت و در غلظت‌های 1/0 و 5/0 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید، مقدار وزن خشک و تر با کاهش نسبتا شدید و معنی‌داری ازنظر آماری در مقایسه با نمونه‌های شاهد همراه بود (جدول 2).
جدول 2- اثر سالیسیلیک اسید بر مقدار وزن تر ساقه و ریشه و وزن خشک ساقه و ریشه
|
تیمار |
غلظت (میلی‌مولار) |
وزن تر اندام هوایی (گرم) |
وزن تر ریشه (گرم) |
وزن خشک اندام هوایی (گرم) |
وزن خشک ریشه (گرم) |
|
سالیسیلیک اسید |
0 |
24/0c,d |
15/0d |
023/0d |
014/0d |
|
0001/0 |
28/0c |
21/0c |
029/0c |
019/0c |
|
|
001/0 |
39/0b |
28/0b |
039/0b |
027/0b |
|
|
01/0 |
48/0a |
36/0a |
047/0a |
036/0a |
|
|
1/0 |
20/0 |
11/0d,e |
02/0d |
011/0e |
|
|
5/0 |
09/0e |
09/0e |
009/0e |
008/0e |
مقادیر، میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار با آزمون دانکن در سطح 05/0P≤ هستند.
اثر سالیسیلیک اسید بر فنل کل، فلاونوئید و آنتوسیانین: باتوجهبه جدول 3، در بررسی حاضر با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید، مقدار فنل کل، فلاونوئید و آنتوسیانین با الگویی یکسان افزایش معنی‌داری نسبت به نمونه‌های شاهد نشان داد و بیشترین مقدار این سه ترکیب در غلظت 5/0 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید مشاهده شد.
جدول 3- اثر سالیسیلیک اسید بر مقدار فنل کل، فلاونوئید کل و آنتوسیانین کل
|
تیمار |
غلظت (میلی‌مولار) |
فنل کل (میلی‌گرم گالیک اسید بر گرم وزن تر) |
فلاونوئید (میلی‌گرم کوئرسیتین بر گرم وزن تر) |
آنتوسیانین (میلی‌گرم بر گرم وزن تر) |
|
سالیسیلیک اسید |
0 |
91/53e |
439/4f |
915/10f |
|
0001/0 |
47/55d.e |
832/4e |
983/11e |
|
|
001/0 |
16/57d |
811/5d |
063/14d |
|
|
01/0 |
18/64c |
681/6c |
266/17c |
|
|
1/0 |
12/69b |
888/7b |
798/19b |
|
|
5/0 |
47/74a |
779/8a |
914/22a |
مقادیر، میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار با آزمون دانکن در سطح 05/0P≤ هستند.
اثر سالیسیلیک اسید بر محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی: نتایج پژوهش حاضر نشان دادند محتوای کلروفیل a،کلروفیل b، کلروفیل کل و همچنین کاروتنوئید در گیاهچه‌ها با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید تا غلظت 1/0 میلی‌مولار افزایش معنی‌داری یافت و بیشترین مقدار در غلظت 01/0 میلی‌مولار گزارش شد؛ ولی در غلظت 5/0 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید، این رنگیزه‌ها کاهش معنی‌داری در مقایسه با نمونة شاهد نشان دادند (جدول 4).
جدول 4- اثر سالیسیلیک اسید بر محتوای رنگیزه‌های کلروفیل و کاروتنوئید
|
تیمار |
غلظت (میلی‌مولار) |
کلروفیل a (میلی‌گرم کلروفیل a بر گرم وزن تر)
|
کلروفیل b (میلی‌گرم کلروفیل b بر گرم وزن تر) |
کلروفیل کل (میلی‌گرم کلروفیل کل بر گرم وزن تر)
|
کاروتنوئید (میلی‌گرم کاروتنوئید بر گرم وزن تر)
|
|
سالیسیلیک اسید |
0 |
410/0d.e |
230/0d.e |
673/0d.e |
205/0c.d |
|
0001/0 |
469/0d |
256/0c |
753/0d |
226/0c |
|
|
001/0 |
786/0b |
383/0b |
170/1b |
290/0b |
|
|
01/0 |
193/1a |
516/0a |
171/0a |
366/0a |
|
|
1/0 |
623/0c |
281/0c |
903/0c |
263/0b |
|
|
5/0 |
403/0e |
189/0e |
593/0e |
190/0d |
مقادیر، میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار با آزمون دانکن در سطح 05/0P≤ هستند.
.بحث
یکی از شاخص‌های مهم جهت تحلیل چگونگی پاسخ و عکس‌العمل گیاه نسبت به تنش‌ها ازجمله تنش شوری میزان رشد گیاه می‌باشد که با اندازهگیری وزن تر و خشک به‌عنوان شاخص‌های مطلوب پاسخ‌های گیاه ارزیابی می‌شود.
در پژوهش حاضر، وزن تر و خشک اندام هوایی شامل ساقه و برگ و همچنین ریشه با نشان‌دادن الگویی کم‌وبیش مشابه، در ابتدا در غلظت‌های کم سالیسیلیک اسید افزایش و سپس در غلظت‌های زیاد، کاهش معنی‌داری نشان دادند. باتوجهبه آثار سالیسیلیک اسید پیش‌بینی می‌شود این افزایش وزن به‌دلیل بیشترشدن تعداد ریشه‌ها، شاخه‌های جانبی و برگ‌های ایجادشده یا افزایش طول ساقه و ریشه در گیاهان تیمارشده با سالیسیلیک اسید باشد. گزارش‌هایی مبنی بر افزایش مقدار وزن تر و خشک گیاه در تنش در غلظت‌های بهینة سالیسیلیک اسید وجود دارند که نتایج پژوهش حاضر را تأیید می‌کنند (Hayat et al., 2005؛ Hussein et al., 2007؛ Khan et al., 2003). کاهش مقدار وزن تر و خشک در دو غلظت 1/0 و 5/0 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید در پژوهش حاضر می‌تواند به دلیل تولید بیش‌ازحد گونه‌های فعال اکسیژن در گیاه و احتمالا القای تنش اکسیداتیو و اثر منفی آن بر روند رشدونمو گیاه باشد.
رنگیزه‌های فتوسنتزی مانند کلروفیل و کاروتنوئید در مجموعة فتوسنتزی نقش دارند و شاخصی مهم برای رشد گیاه معرفی شده‌اند (Bekheta et al., 2008). در پژوهش حاضر محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی در غلظت‌های کم سالیسیلیک اسید افزایش یافت؛ ولی در ادامه در غلظت‌های تنش‌زای این تیمار، محتوای این رنگدانه‌ها کاهش معنی‌داری نشان داد. سالیسیلیک اسید در غلظت‌های کم با مهار تجزیة کلروفیل با آنزیم کلروفیلاز افزایش این رنگدانه را در گیاه موجب می‌شود (Belkhadi et al., 2010). به نظر می‌رسد افزایش کلروفیل در غلظت کم سالیسیلیک اسید می‌تواند به همین دلیل باشد. برخی از پژوهشگران نیز نتایج مشابهی در تیمار سالیسیلیک اسید به دست آورده‌اند (Fariduddin et al., 2003؛ Ghai et al., 2002؛ Gharib, 2006). در غلظت‌های زیاد سالیسیلیک اسید با تجمع بیش از حد گونه‌های فعال اکسیژن که نقش مولکول‌های پیام‌رسان را دارند، رشد گیاه متوقف می‌شود. این تنش، تجزیة کلروفیل و کاهش سنتز این رنگدانه‌ها را موجب می‌شود. مطالعات Rao و همکاران (1997) در گیاه گندم (Triticum aestivum) و آرابیدوپسیس و همچنین مطالعات Moharekar و همکاران (2003) در گیاه لوبیاچیتی نشان داده‌اند در غلظت‌های سمی سالیسیلیک اسید، کلروفیل کاهش می‌یابد؛ بنابراین شاید بتوان کاهش کلروفیل را در پژوهش حاضر با نتایج گزارش‌شدة سایر پژوهش‌ها تفسیر و نتایج مشابه با آنها را تأیید کرد. کاروتنوئید‌ها نقش محافظتی در مجموعة فتوسنتزی و آثار مهاری بر پراکسیداسیون لیپیدها دارند و تنش اکسیداتیو را در گیاه کاهش می‌دهند (Koyro, 2006).
گزارش‌ها نشان داده‌اند سالیسیلیک اسید مقدار کاروتنوئید را در گیاه گندم افزایش می‌دهد (Moharekar et al., 2003). پژوهش حاضر نشان می‌دهد کاهش محتوای کاروتنوئید در غلظت‌های زیاد سالیسیلیک اسید می‌تواند به‌دلیل تنش اکسیداتیو و استفادة گیاه از سازوکارهای دفاعی دیگر باشد. باتوجهبهاینکه کاروتنوئید‌ها آنتی‌اکسیدان‌های ضعیفی هستند، پیش‌بینی می‌شود در پژوهش حاضر، گیاه گوجه‌فرنگی در تنش شوری شدیدتر، از سازوکارهای کمکی دیگری مانند تجمع پرولین، قند، آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و آبسیزیک اسید برای مقابله با تنش استفاده می‌کند. سایر پژوهشگران نیز در بررسی‌های مشابه این سازوکارها را گزارش کرده‌اند Sairam and Srivastava, 2002)). ترکیبات فنلی نقش مهمی در پاک‌کردن گونه‌های اکسیژن آزاد ایفا می‌کنند و در تنش‌های زیستی و غیرزیستی در گیاه تجمع می‌یابند.
در پژوهش حاضر، ترکیبات فنلی مانند فنل کل، فلاونوئید و آنتوسیانین تیمارشده با سالیسیلیک اسید نسبت به نمونه‌های شاهد افزایش معنی‌داری نشان دادند. این افزایش می‌تواند به‌دلیل تولید ROS توسط سالیسیلیک اسید باتوجهبه نقش آن در پیام‌رسانی در گیاه باشد. مطالعات قبلی نیز افزایش فنل کل را در تیمار سالیسیلیک اسید گزارش کرده‌اند Guleria et al., 2005)).گیاهان برای مقابله با تنش‌ها از سازوکارهای مختلفی مانند افزایش متابولیت‌های ثانویه شامل فلاونوئید و آنتوسیانین استفاده می‌کنند. این ترکیبات نقش آنتی‌اکسیدانی دارند و جاروب‌کنندة گونه‌های فعال اکسیژن هستند (Ali et al., 2006). افزایش این ترکیبات در تیمار با سالیسیلیک اسید در بررسی‌های سایر پژوهشگران نیز گزارش شده است (Pérez-Balibrea et al., 2011; Kumar et al., 2013).
افزایش ترکیبات فنلی با القای فعالیت ویژة آنزیم‌های فنیل‌آلانین آمونیالیاز و تیروزین آمونیالیاز که آنزیم‌های کلیدی در تولید این ترکیبات هستند با تیمار سالیسیلیک اسید رخ می‌دهد (Beaudoin-Eaga and Thorpe 1985). سنتز ترکیبات فنلی با دآمیناسیون فنیل‌آلانین و تیروزین در مسیر فنیل پروپانوئید انجام می‌شود و ترانس سینامیک اسید از فنیل‌آلانین و کوماریک اسید از تیروزین تولید می‌شود (Dixon and Paiva, 1995). این آنزیم‌ها با ROS حاصل از تنش‌ها القا می‌شوند (Solecka and Kacperska, 2003). در پژوهش حاضر میزان فعالیت ویژة این دو آنزیم و ترکیبات فنلی با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید افزایش یافت. گزارش‌های قبلی نشان داده‌اند فعالیت ویژة آنزیم‌های فنیل‌آلانین آمونیالیاز و تیروزین آمونیالیاز در میوه‌جات و سبزی‌ها افزایش می‌یابد Chen et al., 2006)؛ Thulke and Conrath, 1998). در گزارش‌های دیگر، همبستگی مثبت بین فعالیت این آنزیم‌ها و ترکیبات فنلی اثبات شده است Koushesh et al., 2012)). ارتباط بین فعالیت این آنزیم‌ها، سالیسیلیک اسید و فنل بیان‌کنندة نقش تنظیمی سالیسیلیک اسید در سنتز فنل‌ها است Chen et al., 2006)).
آنزیم پراکسیداز در اکسیداسیون پیشمادههای ترکیبات فنلی، ساخت لیگنین و همچنین در مقابله و حذف رادیکال‌های آزاد نقش دارد (Ali et al., 2006؛ Kováčik et al., 2008؛.Rice-Evans et al., 1996). در پژوهش حاضر میزان فعالیت ویژة این آنزیم در تیمار سالیسیلیک اسید افزایش معنی‌داری نسبت به نمونه‌های شاهد نشان داد. پژوهش‌های قبلی، تجمع ترکیبات فنلی توسط سالیسیلیک اسید و افزایش میزان فعالیت ویژة آنزیم پراکسیداز را اثبات کرده‌اند و ارتباط مستقیم را بین آنزیم پراکسیداز و ترکیبات فنلی نشان داده‌اند (Mutlu et al., 2009؛ Shi and Zhu, 2008). باتوجهبهاینکه آنزیم پراکسیداز در حذف ROS حاصل از تنش و در سنتز فنل‌ها و لیگنین در سلول‌های گیاهی نقش دارد، چنین استنباط می‌شود که فعالیت پراکسیداز می‌تواند از این روش به افزایش مقاومت گیاه به تنش منجر شود.
جمع‌بندی
باتوجهبه نتایج به‌دست‌آمده نتیجه‌گیری می‌شود سالیسیلیک اسید در غلظت‌های کم، مقدار وزن تر و خشک ریشه و اندام هوایی و همچنین محتوای کلروفیل a، b و کل را افزایش می‌دهد که بیشترین افزایش در غلظت 01/0 میلی‌مولار بود؛ سپس با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید به 1/0 و 5/0 میلی‌مولار، این شاخص‌ها کاهش معنی‌داری نسبت به نمونة شاهد نشان دادند که بیان‌کنندة وابستگی سالیسیلیک اسید به غلظت است و احتمالا سالیسیلیک اسید درغلظت‌های سمی با ایجاد تنش اکسیداتیو، کاهش رشد را موجب می‌شود. ترکیبات فنلی و آنزیم‌های بیوسنتزی آنها نیز با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید به‌تدریج افزایش یافتند. این افزایش می‌تواند به‌دلیل اثر مستقیم سالیسیلیک اسید بر این ترکیبات و آنزیم‌ها و مسیرهای بیوسنتزی آنها و همچنین نقش غیرمستقیم و آنتی‌اکسیدانی متابولیت‌های ثانویه و آنزیم‌ها دربرابر تنش اکسیداتیو ناشی از تولید بیش از حد ROS به‌وسیلة سالیسیلیک اسید باشد. اگرچه بیشترین مقدار ترکیبات فنلی در غلظت های زیاد سالیسیلیک اسید به دست آمد، باتوجهبهاینکه بیشترین مقدار وزن تر و خشک ریشه و اندام هوایی و محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی که شاخص‌های مهم و حیاتی گیاه هستند در غلظت 01/0 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید به دست آمدند، این غلظت در پژوهش حاضر، غلظت بهینة سالیسیلیک اسید انتخاب شد.
)
