نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکدة کشاورزی، دانشگاه ایلام، ایلام، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Black Cumin (Nigella sativa L.) is an annual plant from the buttercup family that has been used in food industry and cosmetic products in addition to its medicinal value. In this research, the effect of salinity stress and salicylic acid on some physiological and biochemical parameters including Relative Water Content (RWC), ion leakage, malondialdehyde, anthocyanin content, proline, catalase activity and ascorbate peroxides in black cumin (Nigella sativa L.( were investigated. Exprimental treatments consisted of three levels (0 as control, 25 and 75 mM NaCl) and (0 as control, 0.75 and 1.5 mM) for salinity and salicylic acid, respectively. Three to four-leaf seedlings incubated for three weeks under salt stress, during the same period twice sprayed with salicylic acid. The results showed that salinity stress significantly reduced the RWC and anthocyanin, and significantly increased ion leakage malondialdehyde, proline, catalase activity and ascorbate peroxidase activity. While in salt stress condition, salicylic acid treatment increased the RWC, malondialdehyde, anthocyanin, proline, catalase activity and ascorbate peroxidase activity, but ion leakage was decreased. Black Cumin is sensitive to salinity stress, so by applying salicylic acid may increase the antioxidant capacity that can helps to the possibility of plant to growth and survival under stress conditions.
کلیدواژهها [English]
سیاهدانه (Nigella sativa L.) گیاهی یکساله و دیپلویید (12=x2=n2) است و به راستة گلساعتیها (Passiflorales) و خانوادة آلاله ((Ranunculaceae تعلق و اهمیت دارویی دارد (Antuono et al., 2002). دانة آن سرشار از اسیدهای ﭼﺮب ﻟﯿﻨﻮﻟﺌﯿﮏ اسید، اوﻟﺌﯿﮏ اسید و پالمیتیک اسید اﺳﺖ. برای اﯾﻦ ﮔﯿﺎه ﺧﻮاص ﻣﺨﺘﻠﻒ داروﯾﯽ ازجمله ﺿﺪﺳﺮﻃﺎﻧﯽ (Gurung et al., 2010)، ﺿﺪﻣﯿﮑﺮوﺑﯽ (Salem, 2005) و ﺿﺪ دﯾﺎﺑﺖبودن (Bassim, 2003) ﮔﺰارش ﺷﺪه اﺳﺖ. اﯾﻦ ﺧﻮاص، بیشتر ﺑﻪدﻟﯿﻞ وﺟﻮد ﺗﺮﮐﯿﺒﺎت ﮐﯿﻨﻮﻧﯽ ﻣانند ﺗﯿﻤﻮﮐﯿﻨﻮن و دی ﺗﯿﻤﻮﮐﯿﻨﻮن در داﻧﻪ هستند. از اﺳﺎﻧﺲ ﺳﯿﺎهداﻧﻪ ﻣﺎدهای ﺑﻪﻧﺎم ﻧﯿﮋﻟﻮن اﺳﺘﺨﺮاج ﻣﯽﺷﻮد ﮐﻪ ﮐﺮمﮐﺶ، مسهل و زﯾﺎدﮐﻨﻨﺪة ﺗﺮﺷﺤﺎت ﺷﯿﺮ است (Antuono et al., 2002).
شوری ﯾﮑﯽ از ﺗﻨﺶﻫﺎی اﺻﻠﯽ ﻣﺤﯿﻂ ﺑﻪ ﺣﻀﻮر ﻏﻠﻈﺖ زیاد ﻧﻤﮏﻫﺎی ﻣﺤﻠﻮل در ﺧﺎک اﻃﺮاف رﯾﺸﻪ ﻣﺮﺑﻮط ﻣﯽﺷﻮد. ﻏﻠﻈﺖﻫﺎی زیاد ﻧﻤﮏﻫﺎی ﻣﺤﻠﻮل با اﻓﺰاﯾﺶ ﻓﺸﺎر اﺳﻤﺰی، سمیت ﯾﻮﻧﯽ و ﻣﺤﺪودﮐﺮدن ﺟﺬب آب از رﯾﺸﻪ بر رﺷﺪ ﮔﯿﺎﻫﺎن و درنتیجه تولید کشاورزی اثر میگذارند. ﺑﺨﺶ اﺻﻠﯽ ﺑﺎزدارﻧﺪﮔﯽ رﺷﺪ، ﺑا ﺗﺠﻤﻊ سدیم اﺿﺎﻓﯽ در ﺧﺎک اﯾﺠﺎد ﻣﯽﺷﻮد (Jouyban, 2012). ﻣﻘﺪار ﮐﺎﻫﺶ رﺷﺪ ﮔﯿﺎه در شرایط ﺷﻮری به ﺗﺮﮐﯿﺐ و ﻏﻠﻈﺖ ﻧﻤﮏ، ﻣﺮحلة ﻓﯿﺰﯾﻮﻟﻮژیک ﮔﯿﺎه و ﮔﻮنة ﮔﯿﺎﻫﯽ بستگی دارد (Jaleel et al., 2013). یکی از تغییرات بیوشیمیایی که در تنشهای محیطی ازجمله تنش شوری رخ میدهد، تولید انواع اکسیژن فعال است که تخریب عمدة غشا، چربیها، پروتئینها و نوکلئیک اسیدها را باعث میشود (Garratt et al., 2002). تنش شوری؛ کاهش سطح برگی (کاهش سطح نورساختی)، کاهش دسترسی به کربن دی اکسید بهعلت بستهشدن روزنهها، کاهش هدایت میان برگی یا مزوفیلی (بهعلت کاهش نفوذپذیری غشا به کربن دی اکسید بر اثر دهیدراتهشدن غشاهای یاختهای)، سمیت نمک، افزایش القای پیری و آسیب اکسایشی (اکسیداتیو) را باعث میشود (Orcutt and Nilsen, 2000). Hajar و همکاران (1996) با بررسی اثر تیمارهای مختلف شوری بر جوانهزنی و شاخصهای رشد N. sativa مشاهده کردند با افزایش شوری؛ وزن ساقه، وزن ریشه، و سطح برگ کاهش یافتند. تأثیر تنش ﺷﻮری ﺑﺮ صفات فیزیولوژیک مانند ﻛـﺎﻫﺶ مقدار آنتوسیانین، کلروفیل، محتوای نسبی آب برگ در بابونة آلمانی (Salimi et al., 2012) و کلزا (Chaparzadeh and Zarandi, 2011) و افزایش فعالیت آنزیمهای کاتالاز، آسکوربات پراکسیدار و سوپر اکسید دیسموتاز درگیاه دارویی پریوش (Askary et al., 2016) و زیرة سبز (Ghorbanli et al., 2012) نیز گزارش شده است.
برای اﻓﺰاﯾﺶ ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﮔﯿﺎﻫﺎن به تنش، روشهای ﻣﺨﺘﻠﻒ ازجمله ﺑﻪﻧﮋادی و اﺳﺘﻔﺎده از ﺗﻨﻈﯿﻢﮐﻨﻨﺪهﻫﺎی رﺷﺪ به کار گرفته میشوند. در ﻣﻘﺎﯾﺴﻪ ﺑﺎ روشﻫﺎی ﺑﻪﻧﮋادی ﮐﻪ اﻏﻠﺐ ﺑﻠﻨﺪﻣﺪت و پرهزینه ﻫﺴﺘﻨﺪ، اﺳﺘﻔﺎده از ﻣﻮاد ﺷﯿﻤﯿﺎﯾﯽ ﻣﺎﻧﻨﺪ ﺳﺎﻟﯿﺴﯿﻠﯿﮏ اﺳﯿﺪ و ﺟﺎﺳﻤﻮﻧﯿﮏ اﺳﯿﺪ آﺳﺎنﺗﺮ و ارزانﺗﺮ اﺳﺖ. ﺳﺎﻟﯿﺴﯿﻠﯿﮏ اﺳﯿﺪ ﻧﻘﺶ ﻣﻬﻤﯽ در ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ ﺗﻨﺶﻫﺎی زﯾﺴﺘﯽ و ﻏﯿﺮزﯾﺴﺘﯽ اﯾﻔﺎ ﻣﯽﮐﻨﺪ و ﺑﺮ رﺷﺪ ﮔﯿﺎه، ﺟﻮاﻧﻪزﻧﯽ داﻧﻪ، ﺳﺎﺧﺘﺎر ﻏﺸﺎء، ﺟﺬب و اﻧﺘﻘﺎل ﯾﻮن، ﺳﺮﻋﺖ ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰ، ﻫﺪاﯾﺖ روزﻧﻪای، ﻣﻘﺪار ﮐﻠﺮوﻓﯿﻞ و گلدهی در شرایط تنش تأثیر ﻣﯽﮔﺬارد (Belkhadi et al., 2010). سالیسیلیک اسید در کاهش آثار ناشی از تنشها نقش دارد؛ برای نمونه، کاهش تأثیر تنش ﺷﻮری ﺑﺮ صفاتی مانند مقدار آنتوسیانین، رنگیزههای فتوسنتزی و نشت یونی بر اثر تیمار سالیسیلیک اسید در گیاهان دارویی مریم گلی (Gholami et al., 2013) وشیرینبیان (Behnamnia and Shenavai Zare, 2013) گزارش شده است. اثر مثبت سالیسیلیک اسید بر رشد را بهعلت تأثیر آن بر سایر تنظیمکنندههای رشد گیاهی نیز میدانند؛ برای نمونه در گیاه گندم سالیسیلیک اسید تغییر در تعادل تنظیمکنندههای رشد گیاهی اکسین، سیتوکینین و آبسیزیک اسید را موجب شد که نتیجة آن افزایش رشد در شرایط غیرتنش، بهبود رشد و افزایش مقاومت در تنش شوری بود (Shakirova et al., 2003).
ﻫﺪف از ﭘﮋوﻫﺶ حاضر، بررسی اثر تنش شوری بر برخی از شاخصهای فیزیولوژیک گیاه سیاهدانه و کاربرد سالیسیلیک اسید برای کاهش خسارت گیاه در برابر تنش شوری و درنتیجه بررسی امکان رشد گیاه در مناطق شور بود..
مواد و روشها
بذرهای گیاه سیاهدانه از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه و با بنومیل به نسبت دو در هزار ضدعفونی شدند؛ سپس در گلدانهای پلاستیکی با ﻗﻄﺮ دهانة 20 ﺳﺎﻧﺘﻲﻣﺘﺮ حاوی ﻣﺎﺳﻪ، رس و ﻫﻮﻣـﻮس ﺑﻪ ﻧﺴﺒﺖ 1: 1: 1 کاشته شدند. بذرها پس از ﺣﺪود 12 روز ﺟﻮاﻧﻪ زدﻧﺪ و گیاهچهها در شرایط گلخانه با دمای 20 تا 25 درجة سانتیگراد و دورة ﻧﻮری 16 ﺳﺎﻋﺖ روﺷﻨﺎﻳﻲ و 8 ﺳﺎﻋﺖ ﺗﺎرﻳﻜﻲ ﻗﺮار گرفتند؛ سپس در مرحلة سه تا چهار برگی تنک شدند؛ بهطوریکه در هر گلدان 10 بوته نگه داشته شد. گیاهچههای حاصل بهمدت سه هفته در تنش شوری با نمک سدیم کلرید در غلظتهای ﺻﻔﺮ (ﺷﺎﻫﺪ یا ﺑﺪون ﺷﻮری)، 25 و 75 میلیمولار براساس پژوهشهای قبلی (Ghorbanli et al., 2012) و دو بار محلولپاشی سالیسیلیک اسید براساس مطالعات Elyasi و همکاران (2016) با فاصلة زمانی یک هفته در غلظتهای صفر (ﺷﺎﻫﺪ)، 75/0، 5/1 میلیمولار قرار گرفتند. اعمال تیمار تنش براساس روش Ghorbanli و همکاران (2012) انجام شد. درنهایت، نمونهبرداری از برگ گیاه انجام شد و نمونهها پس از انجماد با نیتروژن مایع، به فریزر 80- درجة سانتیگراد منتقل شدند. صفات فیزیولوژیک ارزیابیشده در پژوهش حاضر شامل محتوای نسبی آب برگ، نشت یونی، مالوندیآلدهید، آنتوسیانین، پرولین، کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز بودند.
اندازهگیری محتوای نسبی آب برگ: برای تعیین محتوای نسبی آب برگها، ابتدا تعداد مساوی برگ جوان از هر تیمار انتخاب و جدا شد. پس از جداشدن برگها از گیاهچهها بلافاصله در آزمایشگاه با ترازو (با دقت 0001/0 گرم) وزن شدند (FW)؛ سپس بهمدت 4 تا 5 ساعت در آب مقطر (برای آبگیری کامل) در محیط آزمایشگاهی با دمای تقریبی 22 درجة سانتیگراد قرار داده شدند. پس از این مدت، آب سطحی با کاغذ صافی خشک شد و نمونهها دوباره وزن شدند (TW). پس از آن، برای اندازهگیری وزن خشک (DW)، برگها بهمدت 48 ساعت در دمای 70 درجة سانتیگراد در آون قرار داده شدند. محتوای نسبی آب برگ از رابطة 1 محاسبه شد (Wagner, 1979).
|
رابطة 1 |
RWC=(FW–DW)/(TW–DW)100 |
اندازهگیری نشت یونی: برای سنجش میزان آسیب به غشا، میزان نشت یونی اندازهگیری شد. 2/0 گرم از بافت سالم و تازة اندام هوایی گیاه پس از شستشو با آب مقطر درون لولة آزمایش قرار داده و 10 میلیلیترآب مقطر به آن اضافه شد. لولة آزمایش بهمدت 2 ساعت درون حمام آب گرم با دمای 32 درجة سانتیگراد قرار گرفت و میزان هدایت الکتریکی نمونهها (EC1)، با EC متر (مدل 4510، شرکت Jenway، انگلستان) اندازهگیری شد؛ سپس لولة آزمایش در دمای 121 درجة سانتیگراد و فشار 1 اتمسفر بهمدت 20 دقیقه اتوکلاو شد و پس از خنکشدن لولهها تا دمای 25 درجة سانتیگراد، میزان هدایت الکتریکی نمونهها (EC2) دوباره اندازهگیری و درصد نشت یونی با رابطة 2 محاسبه شد (Hamed et al., 2007).
|
رابطة 2 |
=EC1/EC2×100 درصد نشت یونی |
سنجش غلظتمالوندیآلدهید:ابتدا 2/0 گرم از بافت تازة برگی در هاون چینی حاوی 5 میلیلیتر تری کلرواستیک اسید 1 درصد ساییده شد. عصارة حاصل با دستگاه سانتریفیوژ (مدل Z300، شرکت Hermle، آلمان) بهمدت 5 دقیقه با سرعت 10000 دور بر دقیقه سانتریفیوژ شد. به 1 میلیلیتر از روشناور حاصل از سانتریفیوژ، 5 میلیلیتر محلول تری کلرواستیک اسید 20 درصد محتوی 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید اضافه شد. مخلوط حاصل بهمدت 30 دقیقه در دمای 95 درجة سانتیگراد حمام آب گرم قرار داده شد؛ سپس بلافاصله در حمام یخ سرد شد و دوباره مخلوط بهمدت 10 دقیقه با سرعت 10000 دور بر دقیقه سانتریفیوژ شد. شدت جذب این محلول با اسپکتروفتومتر (مدل Spectrod، شرکت Jena AG، آلمان) در طولموج 532 نانومتر خوانده شد. جذب سایر رنگیزههای غیراختصاصی در طولموج 600 نانومتر تعیین و از این مقدار کسر شد. برای محاسبة غلظت مالوندیآلدهید از ضریب خاموشی 5- 10× 55/1 بر مول بر سانتیمتر استفاده شد و نتایج حاصل از اندازهگیری، برحسب میکرومول بر گرم وزن تر محاسبه شدند (Heath and Packer 1969).
مقدارآنتوسیانین: برای اندازهگیری مقدار آنتوسیانین برگ از روش Wagner (1979) استفاده شد. 1/0 گرم بافت تازة گیاه در هاون چینی با 10 میلیلیتر متانول اسیدی (متانول خالص و کلریدریک اسید خالص با نسبت 1:99) بهطور کامل ساییده و عصارة حاصل سانتریفیوژ شد. روشناور حاصل بهمدت 24 ساعت در تاریکی و در دمای 25 درجة سانتیگراد قرار گرفت؛ سپس بهمدت 10 دقیقه با سرعت4000 دور بر دقیقه سانتریفیوژ و جذب محلول رویی در طولموج 550 نانومتر اندازهگیری شد. غلظت با رابطة 3 و با در نظر گرفتن ضریب خاموشی (ε) 33000 بر مول بر سانتیمتر محاسبه شد. A، جذب؛ b، عرض کوت و c، غلظت محلول مدنظر است.
|
رابطة 3 |
A=εbc |
اندازهگیری مقدار پرولین:ابتدا 2/0 گرم بافت تازة برگی در هاون چینی حاوی 5 میلیلیتر محلول سولفوسالسیلیک اسید 3 درصد ساییده و مخلوط یکنواختی تهیه شد. عصارة حاصل بهمدت 5 دقیقه با سرعت 10000 دور بر دقیقه سانتریفیوژ شد و مایع رویی برای اندازهگیری مقدار پرولین استفاده شد. 2 میلیلیتر از مایع رویی حاصل از سانتریفیوژ عصاره با 2 میلیلیتر معرف نینهیدرین و دو میلیلیتر استیک اسید گلاسیال مخلوط شد و 1 ساعت در دمای 100 درجة سانتیگراد حمام آب گرم قرار گرفت. پس از این مدت برای قطع انجام همة واکنشها، لولههای محتوی مخلوط در حمام آب سرد قرار داده و سپس 4 میلیلیتر تولوئن به مخلوط اضافه شد و لولهها بهخوبی ورتکس شدند. با ثابت نگهداشتن لولهها بهمدت 15 تا 20 دقیقه، دو لایة مجزا تشکیل شدند. از فاز رنگی بالایی که حاوی تولوئن و پرولین بود، برای اندازهگیری غلظت پرولین استفاده شد (Bates, 1973). جذب این مادة رنگی در طولموج 520 نانومتر تعیین و مقدار پرولین در هر نمونه با نمودار استاندارد محاسبه شد. نتایج برحسب میکرومول بر گرم وزن تر محاسبه شدند.
برای رسم نمودار استاندارد پرولین، غلظتهای 10، 20، 40، 60، 80 و 100 میکرومول بر لیتر پرولین تهیه شدند و نمودار جذب برحسب غلظت رسم و از رابطة خطی آن برای محاسبة غلظت پرولین استفاده شد.
استخراج عصارة آنزیمی و اندازهگیری فعالیت آنزیمها: 5/0 گرم از برگ منجمدشده در 5/1 میلیلیتر بافر پتاسیم فسفات 50 میلیمولار (7=pH) محتوی پلی وینیل پیرولیدون 1 درصد و EDTA، 1 میلی مولار ساییده شد. همگنهای حاصل بهمدت 20 دقیقه با سرعت10000 دور بر دقیقه سانتریفیوژ و روشناور حاصل یا عصاره برای سنجشهای آنزیمی استفاده شد.
اندازهگیری فعالیت آنزیم کاتالاز: سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز با محاسبة کاهش جذب هیدروژن پراکسید (کاهش مقدار هیدروژن پراکسید) در 240 نانومتر با اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. مخلوط واکنش شامل 2800 میکرولیتر بافر پتاسیم فسفات 10 میلیمولار (7=pH) و30 میکرولیتر هیدروژن پراکسید 33 میلیمولار بود. با اضافهکردن 100 میکرولیتر عصارة آنزیمی به مخلوط یادشده، واکنش شروع میشود. میزان هیدروژن پراکسید موجود در مخلوط واکنش پس از 1 دقیقه با ضریب خاموشی 40 بر مول بر سانتیمتر برای هیدروژن پراکسید و رابطة 4 محاسبه شد که نشاندهندة میزان فعالیت آنزیم کاتالاز است. A، معادل جذب نوری خواندهشده؛ ε، ضریب خاموشی؛ c، غلظت هیدروژن پراکسید و b، عرض کوت (برحسب سانتیمتر) است. فعالیت آنزیمی بهصورت واحد آنزیمی در مقدار پروتئین کل (میلیگرم) موجود در 100 میکرولیتر عصاره در 1 دقیقه محاسبه شد (Velikova et al., 2000).
|
رابطة 4 |
A=εbc |
اندازهگیری فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز: مخلوط واکنش شامل 5/2 میلیلیتر بافر پتاسیم فسفات 50 میلیمولار (7=pH)، 300 میکرولیتر آسکوربات 5/0 میلیمولار، 30 میکرولیتر هیدروژن پراکسید 15/0 میلیمولار، 30 میکرولیتر EDTA 10 میلیمولار و 150 میکرولیتر عصارة آنزیمی بود. با تغییرات جذب در طولموج 290 نانومتر، ضریب خاموشی آسکوربات پراکسیداز (8/2 بر مول بر سانتیمتر) و رابطة 3، میزان آسکوربات بهجامانده پس از دو دقیقه انجام واکنش آنزیمی محاسبه شد. یک واحد آنزیمی آسکوربات پراکسیداز مقدار آنزیمی است که 1 میلیمول آسکوربات پراکسیداز را در 1 دقیقه اکسید میکند (Nakano and Asado, 1981). فعالیت آنزیمی بهصورت واحد آنزیمی در مقدار پروتئین کل (میلیگرم) موجود در 50 میکرولیتر عصاره در 1 دقیقه محاسبه شد.
تحلیل آماری: آزﻣﺎیشها ﺑﻪﺻﻮرت ﻓﺎﻛﺘﻮرﻳﻞ در ﻗﺎﻟﺐ ﻃﺮح ﻛﺎﻣﻞ ﺗﺼﺎدﻓﻲ ﺑﺎ سه ﺗﻜﺮار انجام شدند. تحلیل واریانس دادهها با نرمافزار آماری SASنسخة 1/9 بررسی شد و میانگینها با آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد مقایسه شدند.
نتایج
تجزیة واریانس دادهها نشان داد غلظتهای متفاوت شوری، سالیسیلیک اسید و برهمکنش آنها در سطح 1 درصد اثر معنیداری بر محتوای نسبی آب برگ، نشت یونی، مالوندیآلدهید، پرولین و فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاه سیاهدانه داشتند. اثر غلظتهای متفاوت شوری و سالیسیلیک اسید نیز در سطح 1 درصد و برهمکنش آنها در سطح 5 درصد بر محتوای آنتوسیانین و فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز معنیدار بود.
جدول 1- تجزیة واریانس صفات بررسیشده در گیاه دارویی سیاهدانه
|
آنزیم آسکوربات پراکسیداز |
آنزیم کاتالاز |
پرولین
|
مالوندیآلدهید |
آنتوسیانین |
محتوای نسبی آب
|
نشت یونی
|
درجة آزادی
|
منابع تغییرات
|
|
01/5** |
**353/0 |
**9/8 |
**017/0 |
**33/5 |
**49/558 |
**7/933 |
2 |
سالیسیلیک اسید
|
|
88/1** |
**006/0 |
**1/2 |
**018/0 |
**86/3 |
**6/337 |
**1/1855 |
2 |
شوری
|
|
278/0* |
00224/0** |
**7/0 |
**008/0 |
*15/0 |
**1/44 |
**5/284 |
4 |
سالیسیلیک اسید- شوری
|
|
12/0 |
00007/0 |
02/0 |
0002/0 |
048/0 |
36/4 |
28/10 |
18 |
خطا
|
* و ** بهترتیب نشاندهندة تفاوت معنیدار در سطوح احتمال 5 و 1 درصد هستند.
محتوای نسبی آب برگ (RWC): اندازهگیری محتوای نسبی آب برگ یکی از شاخصهایی است که مقاومت گیاه را به تنش شوری تخمین میزند. محتوای نسبی آب برگ سیاهدانه در تنش شوری کاهش معنیداری نشان داد. کاربرد سالیسیلیک اسید افزایش درصد آب بافت برگ را در همة شرایط بررسیشده و غیرتنش سبب شد (شکل 1). در شرایط بدون شوری تفاوت معنیداری بین گیاهان تیمارشده با سالیسیلیک اسید و تیمارنشده با آن مشاهده شد. میانگین درصد تغییرات محتوای نسبی آب برگ در تیمار 25 و 75 میلیمولار شوری نسبت به شاهد (بدون شوری) بهترتیب در نبود سالیسیلیک اسید، 6/17 و 6/32 درصد کاهش، در 75/0 میلیمولار سالیسیلیک اسید 9/9 و 4/10 درصد کاهش و در 5/1 میلیمولار بهترتیب 2 و 5/10 درصد کاهش به دست آمد (شکل 1).
نشتیونی: نتایج مقایسة میانگینها نشان دادند تنش شوری افزایش نشتیونی را به فضای خارج سلولی باعث میشود و تیمار گیاهان با سالیسیلیک اسید مقدار نشتیونی را کاهش داد (شکل 2). در شرایط بدون شوری (غلظت صفر سدیم کلرید) تیمار با سالیسیلیک اسید اثری بر مقدار نشتیونی در برگ گیاه سیاهدانه نداشت.
میانگین درصد تغییرات نشت یونی در تیمار 25 و 75 میلیمولار شوری نسبت به شاهد (بدون شوری) در شرایط بدون سالیسیلیک اسید بهترتیب 45 و 6/50 درصد افزایش و در تیمار 75/0 میلیمولار سالیسیلیک اسید، 6/7 و 24/34 درصد افزایش و در 5/1 میلیمولار سالیسیلیک اسید، 6/24 و 7/4 درصد افزایش یافت (شکل 2).
مالوندیآلدهید:در پژوهش حاضر مقدار مالوندیآلدهید، شاخص پراکسیداسیون لیپید، اندازهگیری شد. مقایسة میانگینها نشان داد تنش شوری افزایش معنیدار میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء را ازنظر آماری سبب میشود. تیمار با سالیسیلیک اسید در شرایط بدون تنش شوری اثری بر مقدار مالوندیآلدهید نداشت (شکل 3)؛ اما در تنش شوری مالوندیآلدهید را کاهش داد. میانگین درصد تغییرات مالوندیآلدهید در تیمار 25 و 75 میلیمولار شوری نسبت به شاهد (بدون شوری) بهترتیب در رایط بدون کاربرد سالیسیلیک اسید، 50 و 5/55 درصد افزایش ، در تیمار 75/0 میلیمولار سالیسیلیک اسید، 6/3 و 11/17 درصد افزایش و در 5/1 سالیسیلیک اسید، 2/19 و 2/5 درصد افزایش نشان داد (شکل 3).
شکل1- اثر سالیسیلیک اسید بر محتوای نسبی آب برگ در گیاه سیاهدانه در شرایط شوری (NaCl) و بدون شوری: S1 (75/0) و S2 (5/1 میلیمولار سالیسیلیک اسید)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت، بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 05/0>P هستند.
شکل2- اثر سالیسیلیک اسید بر مقدار نشت یونی در گیاه سیاهدانه در شرایط شوری (NaCl) و بدون شوری: S1 (75/0) و S2 (5/1 میلیمولار سالیسیلیک اسید)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت، بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 05/0>P هستند.
شکل3- اثر سالیسیلیک اسید بر مقدار مالوندیآلدهید (MDA) در گیاه سیاهدانه در شرایط شوری (NaCl) و بدون شوری: S1 (75/0) و S2 (5/1 میلیمولار سالیسیلیک اسید)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت، بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 05/0>P هستند.
آنتوسیانین: نتایج نشان دادند تنش شوری کاهش مقدار آنتوسیانین را در گیاه سیاهدانه باعث شد. استفاده از سالیسیلیک اسید مقدار آنتوسیانین را در شرایط تنش و غیر تنش (بدون کاربرد نمک) افزایش داد (شکل 4). میانگین درصد تغییرات آنتوسیانین در تیمار 25 و 75 میلیمولار شوری نسبت به شاهد (بدون شوری) بهترتیب در حالت بدون سالیسیلیک اسید، 8/10 و 6/57 درصد کاهش؛ در تیمار 75/0 میلیمولار سالیسیلیک اسید، 23 و 4/71 درصد کاهش و در 5/1 میلیمولار سالیسیلیک اسید، 1/34 و 6/48 درصد کاهش یافت (شکل4).
پرولین: مقایسة میانگین حاصل از اندازهگیری پرولین در شکل 5 نشان داده شده است. همانطورکه در شکل مشاهده میشود، تنش شوری مقدار پرولین را در برگهای سیاهدانه بهطور معنیداری افزایش میدهد. تیمار سالیسیلیک اسید در شرایط بدون تنش شوری اثری بر مقدار پرولین برگ نداشت؛ ولی در شرایط تنش شوری، غلظت 5/1 میلیمولار سالیسیلیک اسید افزایش مقدار پرولین را در مقایسه با گیاهانی باعث شد که با سالیسیلیک اسید تیمار نشده بودند. میانگین پرولین در تیمار 25 و 75 میلیمولار شوری نسبت به شاهد (بدون تیمار شوری) در نبود سالیسیلیک اسید بهترتیب، 4/60 و 3/68 درصد افزایش؛ در 75/0 میلیمولار سالیسیلیک اسید، 2/58 و 5/76 درصد افزایش و در 5/1 میلیمولار سالیسیلیک اسید بهترتیب 4/80 و 4/80 درصد افزایش به دست آمد (شکل 5).
شکل4- اثر سالیسیلیک اسید بر مقدار آنتوسیانین در گیاه سیاهدانه در شرایط شوری (NaCl) و بدون شوری: S1 (75/0) و S2 (5/1 میلیمولار سالیسیلیک اسید)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت، بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 05/0>P هستند.
شکل5- اثر سالیسیلیک اسید بر مقدار پرولین در گیاه سیاهدانه در شرایط شوری (NaCl) و بدون شوری: S1 (75/0) و S2 (5/1 میلیمولار سالیسیلیک اسید)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت، بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 05/0>P هستند.
فعالیت آنزیم کاتالاز: مقایسة میانگین فعالیت آنزیم کاتالاز بیانکنندة افزایش فعالیت این آنزیم در شرایط تنش شوری بود (شکل 6). در همة غلظتهای شوری، غلظت سالیسیلیک اسید فعالیت این آنزیم را افزایش داد؛ هرچند این افزایش، بین غلظتهای بررسیشدة سالیسیلیک اسید در همة غلظتهای شوری معنیدار نبود؛ اما میانگین درصد تغییرات فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار25 و 75 میلیمولار شوری نسبت به شاهد (بدون شوری) در شرایط بدون سالیسیلیک اسید بهترتیب 6/84 و 5/87 درصد افزایش، در تیمار 75/0 میلیمولار سالیسیلیک اسید، 8/92 و 7/93 درصد افزایش و در 5/1 میلیمولار سالیسیلیک اسید، 8/85 و 3/92 درصد افزایش نشان داد (شکل 6).
فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز:براساس نتایج، غلظتهای 25 و 75 میلیمولار شوری افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز را باعث شد (شکل 7). به کار بردن سالیسیلیک اسید، فعالیت این آنزیم را در تنش شوری افزایش داد و بین غلظتهای متفاوت سالیسیلیک اسید در شاهد (بدون شوری) اختلاف معنیداری وجود نداشت؛ اما در سایر غلظتهای شوری اختلاف معنی دار مشاهده شد. میانگین درصد تغییرات فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در تیمار 25 و 75 میلیمولار شوری نسبت به شاهد در شرایط کاربرد سالیسیلیک اسید، 1/57 و 9/76 درصد افزایش، در تیمار 75/0 میلیمولار سالیسیلیک اسید، 9/78 و 80 درصد افزایش و در 5/1 میلیمولار سالیسیلیک اسید، 75 و 76 درصد افزایش یافت (شکل 7). شکل6- اثر سالیسیلیک اسید بر فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاه سیاهدانه در شرایط شوری (NaCl) و بدون شوری: S1 (75/0) و S2 (5/1 میلیمولار سالیسیلیک اسید)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت، بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 05/0>P هستند.
شکل7- اثر سالیسیلیک اسید برآسکوربات پراکسیداز در گیاه سیاهدانه در شرایط شوری (NaCl) و بدون شوری: S1 (75/0) و S2 (5/1 میلیمولار سالیسیلیک اسید)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت، بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 05/0>P هستند.
بحث
ﻧﺘﺎﻳﺞ ﺣﺎﺻﻞ از پژوهش حاضر بیانکنندة رابطة ﻣﺴﺘﻘﻴﻢ ﺑﻴﻦ اﻓﺰاﻳﺶ ﻏﻠﻈﺖ شوری و ﻛﺎﻫﺶ شاخصهای فیزیولوژیک در گیاه سیاهدانه است. ﻳﻜﻲ از ﺗﻐﻴﻴﺮات ﺑﻴﻮﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ ﻛﻪ در ﺗﻨشهای ﻣﺤﻴﻄﻲ ازﺟﻤﻠﻪ ﺗﻨﺶ ﺷﻮری رخ ﻣﻲدﻫﺪ، ﺗﻮﻟﻴﺪ انواع ROS است (Garratt et al., 2002). گیاهان برای مقاومت دربرابر تنش اکسیداتیو ایجادشده باید از سیستم آنتیاکسیدانی آنزیمی یا غیرآنزیمی استفاده کنند. گزارشهای ﻣﺘﻌﺪد نشان میدهند ﺗﻨﺶ ﺷﻮری کاهش شاخصهای فیزیولوژیک مانند محتوای نسبی آب برگ و آنتوسیانین و افزایش معنیدار نشت یونی و فعالیت آنزیم کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز را موجب شده است (Momeni et al., 2013; Jaleel et al., 2013).
ﺑﺎﺗﻮﺟﻪﺑﻪ ﻧﺘﺎﻳﺞ پژوهش حاضر، محلولپاشی سالیسیلیک اسید اﺛﺮ ﺟﺒﺮانﻛﻨﻨﺪهای ﺑﺮ شاخصهای فیزیولوژیک ﮔﻴﺎه ﺳﻴﺎهداﻧﻪ در شرایط تنش شوری داشت. محتوای نسبی آب برگ، شاخصی برای سنجش میزان تنش گزارش شده است (Gholami et al., 2013). کاهش میزان محتوای نسبی آب برگ مربوط به کاهش جذب آب به گیاه است؛ زیرا پتانسیل اسمزی بسیار منفی محلولهای شور خاک مانع از جذب آب به گیاه میشود و درنتیجه به پدیدهای بهنام خشکی فیزیولوژیک منجر میشود. نمک کاهش پتانسیل آب خاک را باعث میشود و گیاه به کمآبی دچار میشود که بستهشدن روزنهها را سبب میشود (Salimi et al., 2012). کاربرد سالیسیلیک اسید در گیاه سیاهدانه در تنش شوری، افزایش محتوای رطوبت نسبی برگ را باعث میشود و به نظر میرسد دلیل احتمالی آن افزایش محلولهای سازگار و درنتیجه کاهش پتانسیل اسمزی گیاهان باشد که افزایش جذب آب را در محیطهای نامساعد سبب میشود (Levent Tuna et al., 2007). همچنین Daneshmand و همکاران (2014) گزارش کردند محتوای نسبی آب برگ در گیاه گلرنگ، بر اثر تیمار سالیسیلیک اسید در شرایط تنش شوری افزایش یافت که با نتایج ما مطابقت دارد. تیمار سالیسیلیک اسید به تولید اسمولیتها برای حفظ فشار اسمزی گیاه در تنش شوری کمک میکند. تولید اسمولیتها فشار اسمزی داخل سلول را کاهش میدهد که هم به حفظ آب داخل سلول کمک میکند و مانع از خشکی سلول میشود و هم با کمک به جذب آب از محلول خاک افزایش فشار آماس و میزان محتوای نسبی آب برگ را باعث میشود (Levent Tuna et al., 2007).
غشای سلولی یکی از هدفهای اولیه در بسیاری از تنشهای محیطی ازجمله شوری به شمار میرود و ثبات غشا در شرایط تنش، یکی از نشانههای تحمل است؛ بنابراین اندازهگیری مالوندیآلدهید تولیدشده در پراکسیداسیون لیپیدها و اندازهگیری میزان نشت یونی، شاخصهای خوبی برای اندازهگیری میزان آسیب اکسیداتیو واردشده به غشا هستند (Bandeoglu et al., 2004). بر اثر آسیبپذیری غشای سیتوپلاسمی، محتویات سلول به بیرون تراوش میکند که مقدار این خسارت با اندازهگیری نشت یونی تعیین میشود (Jouyban, 2012). گزارش شده است تنش شوری یا خشکی افزایش مقدار پراکسیداسیون لیپیدها و نشت یونی را در گیاهان حساس به این تنشها موجب میشوند (Juan et al., 2005)؛ بنابراین به نظر میرسد افزایش پراکسیداسیون لیپیدها یا نشت یونی در گیاه بررسیشده در شرایط تنش، از افزایش تولید انواع ROS در شرایط تنش اکسیداتیو ناشی شود که حذف یا خاموشکردن آنها خارج از توان گیاه بوده است و نشاندهندة این است که سازوکارهای دفاعی ایجادشده در گیاه درمقابل تنش اکسیداتیو کافی نبودهاند (Jouyban, 2012). همچنین Daneshmand و همکاران (2014) گزارش کردند نشت یونی در گیاه گلرنگ، در شرایط تنش شوری افزایش یافته است که با نتایج ما مطابقت دارد.
تنش شوری، تنش اکسیداتیو را سبب میشود. گیاهان برای مقابله با این اکسیدانها، سازوکارهای حفاظتی دارند که شامل مولکولها و آنزیمهای آنتیاکسیدان هستند. آنتیاکسیدانها به سه گروه تقسیمبندی میشوند که عبارتند از: 1- ترکیبات غشایی و محلول در چربی مانند کارتنوئیدها؛ 2- ترکیبات محلول در آب مانند فلاونوئیدها و آنتوسیانینها و 3- آنزیمهایی مانند کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز. آنزیمها در افزایش دفاع آنتیاکسیدانی نقش دارند (Agarwal and Pandey, 2004). نتایج ما نشان دادند تنش شوری کاهش مقدار آنتوسیانین را در گیاه سیاهدانه باعث شد. استفاده از سالیسیلیک اسید مقدار آنتوسیانین را در شرایط تنش و غیرتنش (عدم کاربرد نمک) افزایش داد. فلاونوئیدها و آنتوسیانینهای سنتزشونده از مسیر فنیل پروپانوئید با عملکرد آنتیاکسیدانی خود، خاموشکننده یا جاروبکنندة انواع ROS در گیاهان هستند (Syvacyand Sokmen, 2004). این ترکیبات با سازوکارهای متعددی مانند قطعکردن واکنشهای زنجیرهوار اکسیداسیون، اهدای هیدروژن، کلاتکردن یونهای فلزی یا قرارگرفتن بهصورت سوبسترای آنزیمهای پراکسیداز نقش آنتیاکسیدانی خود را ایفا میکنند (Chu et al., 2000). کاربرد سالیسیلیک اسید افزایش ترکیبات فنلی و کاتچین و درنتیجه افزایش ظرفیت آنتیاکسیدانی را در کالوسهای در معرض تنش گیاه Lepidium meyenni موجب شده است (Wagner, 1979). علاوه بر این، گزارش شده است تیمار سالیسیلیک اسید مقدار آنتوسیانین را در هویج (Eraslan et al., 2007) و اسفناج (Eraslan et al., 2008) در شرایط تنش شوری افزایش داده است. افزایش ترکیبات مختلف فنلی مانند آنتوسیانین و آنتیاکسیدان غیرآنزیمی کاهشدهندة آثار تنش است (Syvacyand Sokmen, 2004).
یکی از راههای مقابله با تنشهای محیطی مانند شوری و خشکی، سنتز ترکیبات اسموتیک و محافظ اسمزی است که پرولین یکی از این ترکیبات است. اﻓﺰاﻳﺶ ﭘﺮوﻟﻴﻦ در ﮔﻴﺎﻫﺎن ﻫﻨﮕﺎم ﺗﻨﺶ، ﻧﻮﻋﻲ ﺳﺎزوﻛﺎر دﻓﺎﻋﻲ اﺳﺖ. ﭘﺮوﻟﻴﻦ ﺑﺎ ﭼﻨﺪﻳﻦ ﺳﺎزوﻛﺎر ﻣﺎﻧﻨﺪ ﺗﻨﻈﻴﻢ اﺳﻤﺰی و ﺟﻠﻮﮔﻴﺮی از ﺗﺨﺮﻳﺐ آﻧﺰﻳﻢ، تحمل ﮔﻴﺎه را درﺑﺮاﺑﺮ ﺗﻨﺶﻫﺎ افزایش میدهد. ﻛﺎرﺑﺮد سالیسیلیک اسید درﻣﻘﺎﺑﻞ ﺗﻨﺶ ﻣﻲﺗﻮاﻧﺪ اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻴﺰان ﭘﺮوﻟﻴﻦ را ﺑﺎﻋﺚ شود. گزارش شده است پرولین درﮔﻴﺎه Salvia officinalis و توتون (Celik and Atak, 2012) در ﺗﻨﺶ ﺷﻮری ﺑﻪطور ﻣﻌﻨﻲداری اﻓﺰاﻳﺶ ﻳﺎﻓﺖ ﻛﻪ ﻧﺸﺎندﻫﻨﺪة ﺑﻪ ﻛﺎر اﻓﺘﺎدن ﺳﺎﻣﺎنة ﻣﻘﺎوﻣﺘﻲ ﮔﻴﺎه و ﺗﻮﻟﻴﺪ اﺳﻤﻮﻟﻴﺖ درﺑﺮاﺑﺮ آﺳﻴﺐﻫﺎی ﻧﺎﺷﻲ از ﺗﻨﺶ ﺷﻮری در ﮔﻴﺎه اﺳﺖ. گیاه Salvia officinalis ﺑﺎ تیمار سالیسیلیک اسید، ﻣﻴﺰان ﭘﺮوﻟﻴﻦ را اﻓﺰاﻳﺶ داد (Khosravi et al., 2011). پرولین علاوهبراینکه مادهای اسمززا و محافظ اسمزی است، در حفظ تعادل آب، حفظ ثبات پروتئینها، حفظ ساختار سهبعدی پروتئینها، تثبیتکردن غشاها و دستگاه سنتز پروتئین، کاهش خطرهای ناشی از تولید ROS، جاروبکردن رادیکالهای هیدروکسیل و تنظیم pH سلولی نقش دارد (Verbruggen and Hermans 2008). گزارش شده است پرولین با جاروبکردن یا کاهش تولید اکسیژن یکتایی در کاهش آسیب نوری غشای تیلاکوئیدها مؤثر بوده است (Chaitanya et al., 2009).
در شرایط تنش، میزان تولید انواع ROSها بیشتر میشود و درنتیجه تنش اکسیداتیو رخ میدهد. آنزیمهایی مانند آسکوربات پراکسیداز و کاتالاز از آنزیمهای مهم سیستم آنتیاکسیدانی در گیاهان هستند (Abdul Jaleel et al., 2009). با افزایش فعالیت آسکوربات پراکسیداز و درنتیجه فعالشدن چرخة آسکوربات - گلوتاتیون و افزایش فعالیت جاروب کنندههای هیدروژن پراکسید مانند کاتالاز و سایر پراکسیدازها، با تنش اکسیداتیو مقابله میشود. افزایش فعالیت این آنزیمها با کاهش مقدار پراکسیداسیون لیپید، هیدروژن پراکسید و نشت یونی (He and Zhu, 2008) همراه است.
افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی بر اثر تیمار سالیسیلیک اسید در تنش شوری در سایر گیاهان ازجمله اسفناج (Eraslan et al., 2008)، گندم (Multu et al., 2009)، ذرت (Momeni et al., 2013) و درمنه (Eskandari Zanjani, 2013)، گزارش شده است. سالیسیلیک اسید با فعالکردن سیستم دفاع آنتیاکسیدان آنزیمی، افزایش مقاومت گیاه سیاهدانه را به تنش اکسیداتیو ناشی از تنش شوری موجب میشود.
جمعبندی
تنش شوری در گیاه سیاهدانه کاهش محتوای نسبی آب برگ و محتوای آنتوسیانین و نیز افزایش نشت یونی، مالوندیآلدهید، پرولین، فعالیت آنزیمهای کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز را موجب شد.
تیمار سالیسیلیک اسید ویژگیهای بررسیشده را بهبود میدهد و با افزایش سیستم آنتیاکسیدانی آنزیمی (کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز) و غیرآنزیمی (آنتوسیانین) تنش اکسیداتیو را کاهش میدهد که افزایش مقاومت گیاه را به تنش موجب میشود. باتوجهبه وجود زمینهای شور در بیشتر مناطق ایران، توجه بیشتر به کاربرد هورمون گیاهی سالیسیلیک اسید در مناطق شور پیشنهاد میشود.
سپاسگزاری
نگارندگان از همة اساتید ارجمند و آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشگاه ایلام برای همکاری در انجام مراحل گوناگون پژوهش حاضر سپاسگزاری میکنند
)
