نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 استادیار بیوفیزیک مولکولی، دانشکده علوم زیستی ، گروه بیوشیمی سلولی ومولکولی،دانشگاه آزاد اسلامی،واحد فلاورجان٬ اصفهان،ایران
2 استادیار زیست شناسی ،دانشکده منابع طبیعی وعلوم دریایی ،گروه زیست شناسی دریا، دانشگاه تربیت مدرس ، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
The present study was conducted to evaluate the anionic SDS surfactant in various environmental conditions on Dunaliella viridis alga growth dynamics. The effect of different concentrations of 0.1, 1 and 10 mg. L-1 of SDS and pH of 7, 8, 9 and 10 on the Dunaliella were investigated. The 20% reduction in growth rate of algae in all concentrations in comparison with the control was observed in the sixth and seventh day of experiments. The growth rate was close to 92% in the culture medium at a concentration of 1 mg. L-1 SDS at pH 8 on day 7. In addition, the biodegradation process of surfactant will depend on the length of the alkylated chain as well as to cell metabolism. The short-lived alkyl chain SDS showed the highest percentage of degradation in the cell population. Therefore, the loss of cell density caused by surfactant in the culture medium results in an effect on the Dunaliella cell cycle, which is strongly dependent on ERK phosphorylation of MAPKs. In this research, to predict the structure and function of protein, the models have used the multiple sequencing alignment algorithms more. ERK sequences showed that their residues are strongly conserved in unicellular microalgae in higher plants and mammals. The degree of identity between the model sequences (Target) and ERK1 and ERK2 protein kinases (Template) has been calculated in RMSD 2.30 and 2.9 Å with highest sequence coverage.
کلیدواژه‌ها [English]
جلبک‌ها نخستین حلقة زنجیره‌های غذاییبوم‌سامانه‌های آبی به شمار می‌روند و به دو گروه جلبک های میکروسکوپی و ماکروسکوپی تقسیم می‌شوند. جلبک‌های میکروسکوپی بیشتر تک‌سلولی‌اند و ابتدایی‌ترین منبع انرژی در جهان به شمار می‌روند. این موجودات طیف وسیعی از مواد بیوشیمیایی تولید می‌کنند که اهمیت اقتصادی فراوانی دارند (Salmaninejad, 2016). ازسوی‌دیگر کشت و نگهداری این موجودات آسان است و کار با آنها به فضای نسبتاً اندکی نیاز دارد (Hadi et al., 2008). همچنین استفاده از مواد فعال زیستی این موجودات، موجب شده است در حل مشکلات زیست‌محیطی در پژوهش‌های بیوتکنولوژی نیز جایگاه بسیار بالایی داشته باشند (Hosseini Tafreshi and Shariati, 2009). Dunaliella viridis یکی از گونه‌های یوکاریوتی مقاوم به شوری به شمار می‌رود؛ زیرا در بسیاری از محیطهای حاوی نمک مانند دریاچه‌ها و مرداب‌های آب شور یافت می‌شود (Lee, 1989). برخی گونه‌های Dunaliella مقادیر زیادی بتاکاروتن را (گاهی بیش از 10 درصد وزن خشک) در شرایط شوری زیاد، شدت نور زیاد و محدودیت مواد غذایی در خود تجمع می‌دهند. Dunaliella ریزجلبک یوکاریوتی از ردة کلروفیتا و تک‌سلولی است که ازلحاظ ریخت‌شاختی به کلامیدوموناس شباهت دارد؛ با این تفاوت که Dunaliella دیوارة سلولی ندارد (Witman et al., 1972; Borowitzka and Borowitzka, 1988). نداشتن دیوارة سلولی و احاطه‌شدن پروتوپلاست با یک غشای نازک، ویژگی مهم و متمایز‌کنندة اعضای این جنس از سایر جلبک‌های سبز به شمار می‌رود (Avron and Ben-Amots, 1992)؛ زیرا نبود دیوارة سخت پلی‌ساکاریدی جلبک را وادار می‌کند به فشارهای محیطی و هر تغییری در شرایط اسمزی و مکانیکی محیط به‌سرعت واکنش نشان دهد (Ben-Amotz et al., 1989). تاکنون در جهان تقریباً 28 گونه از جنس Dunaliella گزارش شده‌اند (Guiry and Guiry, 2014). مواد فعال سطحی، مواد دوگانه‌دوست هستند که دم آب‌گریز و سر آب‌دوست دارند. مواد فعال سطحی آنیونی بر اثر یونیزه‌شدن در محیط آبی به یک یون مثبت که اغلب سدیم یا پتاسیم است و یون‌های منفی با یک زنجیرة R یک‌کربنی طولانی آلکیل تفکیک می‌شوند. یون‌های آلی با بار منفی عهده‌دار فعالیت در سطح هستند. این گروه بیشترین مصرف را بین مواد فعال سطحی دارند و بیشتر در پاک‌کننده‌ها استفاده می‌شوند. انتشار مواد فعال سطحی در محیط‌زیست خطر دارد و در عملکرد بوم‌سامانه اختلال ایجاد می‌کند؛ به‌طوری‌که حجم زیادی از آب و فاضلاب حاوی مواد فعال سطحی مشکلات زیستی را دوچندان می‌کند. یکی از پرمصرف‌ترین این مواد سدیم دودسیل سولفات است (Ostroumov, 2006). غلظت مواد فعال سطحی در آب‌ها از 1/0 تا 10 میلیگرم بر لیتر نوسان دارد و بیشتر در محیطهای قلیایی مشاهده می‌شوند (Markina, 2010)؛ بنابراین باتوجهبه رشد روز‌افزون جمعیت و ورود شوینده‌ها از پساب‌ها به آب‌های سطحی و سپس دریاچه‌ها و دریاها توانایی‌های Dunaliella viridis برای ارزیابی این بوم‌سامانه‌های آبی بررسی شدند. رویکردهای امروزی پژوهش‌ها درزمینة جلبک‌های میکروسکوپی، به‌طور گسترده از روش‌های omics (ساختار وعملکرد ژن یا پروتئین) دربارة بهره‌برداری از جلبک‌ها برای تولید سوخت‌های زیستی منشأ می‌گیرد. بر اثر تخمیر زیست‌تودة جلبکی، فراورده‌های بیوتکنولوژی تولید می‌شوند؛ به‌طوری‌که لیپید‌ها به‌ویژه تری آسیل گلیسرول‌ها (TAGs) به بیودیزل تبدیل می‌شوند که سوخت زیستی ایدئال است. شناسایی‌نشدن سازوکار دقیق فیزیولوژیک ایستا و پویای جلبک‌های میکروسکوپی، بینش کاربردی و پیدایش پروتئومیکس و متابولومیکس (omics) جلبکی را موجب شده است (Mallick, et al. 2016). جلبک Dunaliella مدلی ایدئال برای بررسی سازوکارهای تحمل به استرس به شمار می‌رود؛ بنابراین مقایسة ساختمان و عملکرد پروتئین‌های هومولوگ با ویژگی‌های مشابه در توالی ازلحاظ شرایط محیطی مزوفیل، اکستریموفیل (اکستریموتولرانت) راهکارهای مبهم مولکولی را ازلحاظ ساختاری آشکار می‌کند؛ ازجمله پروتئین کینازها که در پاسخ سلولی به تغییرات وسیع و عوامل تنش‌زا شرکت می‌کنند. کینازهای آبشاری تنظیم‌شده با سیگنال خارج‌سلولی ERK1 و ERK2 مؤثر بر رشد در Dunaliella، شامل پروتئین‌کینازهای فعال‌شده با میتوژن (MAPKs) می‌شوند که در تمایز سلولی نقش دارند. باتوجهبه بررسی‌نشدن تأثیر زیستی مادة فعال سطحی آنیونی بر جلبک Dunaliella که جزء مهم سیستم آبی در تأمین اکسیژن حیوانات آبزی است، در پژوهش حاضر، اثر این مادة سمی در دینامیک رشد سلولی جلبک بررسی می‌شود. بررسی‌های زیستی محدود دیگری بر Dunaliella salina انجام شده‌اند؛ بنابراین با منابع اندک یا بدون بررسی آثار زیستی توکسین در جلبک روبه‌رو هستیم (Markina, 2010)؛ بااینحال بررسی‌ها تنها به تأثیر سدیم دودسیل سولفات (SDS) در غلظت‌ها و pH های متفاوت باتوجهبه محتوای مادة فعال سطحی در آب‌های دریایی در محدودة سه غلظت ماده تا اندازة 10 میلیگرم بر لیتر در شرایط قلیایی محیط‌کشت پرداخته‌اند. بررسی حاضر، تنها وضعیت فیزیولوژیک را بررسی نمی‌کند؛ بلکه آثار مادة سورفکتانت را که آلایندة بر بوم‌سامانة آبی است در شرایط in vitro و ارتباط آن را با محتوای فیزیولوژیک و تنوع گونة جلبک با روش omics مدل‌سازی می‌کند. براین‌اساس پیشگویی محاسباتی ساختار کینازهای تنظیم‌شده با سیگنال خارج‌سلولی با اطلاعات توالی، تلفیق توالی و ساختمان سه‌بعدی پروتئین مد نظر در جلبک انجام شده است.
مواد و روش‌ها
مواد شیمیایی:مواد شیمیایی استفاده‌شده در پژوهش حاضر از شرکت مرک آلمان با درصد خلوص زیاد تهیه شدند.
آماده‌کردن نمونه‌ها:برای جدا و خالص‌کردن جلبک D. viridis نمونه‌برداری از تالاب گاوخونی در شرق استان اصفهان انجام شد. نخستین نقطة نمونه‌برداری در قسمت دلتای رودخانه و دیگری در برکة کوچکی در نزدیکی دلتای رودخانة زاینده‌رود بود. همگام با نمونه‌برداری، شاخص‌های شوری، pH و دمای آب با دستگاه مولتی‌متر اندازه‌گیری شدند. هنگام نمونه‌برداری، در دلتای رودخانه؛ شوری آب، 4/12 قسمت در هزار و دما، 23 درجة سانتی‌گراد و در برکة نزدیک دلتا؛ شوری آب، 6/54 قسمت در هزار و دمای آب، 29 درجة سانتی‌گراد بود. pH آب نیز در دلتا 3/8 و در برکه 5/8 ثبت شد. آب در محل برکه به رنگ سبز نمایان بود و برداشت نمونه‌ها با بطری‌های 5/1 لیتری به‌صورت دستی انجام شد. در ایستگاه دلتای رودخانه با تور پلانکتون (شرکت Lamotte، آمریکا) مقدار 50 لیتر آب از تور پلانکتون فیلتر شد و سپس نمونه‌ها با روش آب‌شویی به قسمت استکان تور پلانکتون هدایت شدند. پس از آن به ظروف 200 میلی‌لیتری منتقل و درنهایت نمونه‌ها در ظرف با دمای تقریباً 4 درجة سانتی‌گراد به آزمایشگاه هدایت شدند. خالص‌کردن D. viridis با کشت خطی و پلیت نوترینت آگار در سه مرتبه تکرار انجام شد (Ilknur et al., 2008; Melkonian et al., 1980). برای شناسایی گونه از مونوگراف‌ها و کلیدهای شناسایی مختلف استفاده شد (Massyuk, 1973; Massyuk et al. 2010). یکی از دلایل اصلی برای استفاده‌نکردن از روش‌های مولکولی به‌ویژه در جلبک‌ها این است که استخراج پروتئینها و نوکلئیک اسیدها از آنها گران و زمان‌بر است و پلی‌سارکاریدهای مهارکنندة پروتئینها نیز در محیط مزاحمت ایجاد می‌کنند. این عوامل، پیوندهای شیمیایی پلیمرهای زیستی اجزای خارج‌سلولی را که سازگاری ساختاری ویژه‌ای دارند در غشای پلاسمایی سلول ناپایدار می‌کنند؛ از‌این‌رو روش‌های مولکولی برای بوم‌سامانه‌‌شناسان و فیزیولوژی‌دان‌ها به چالش تبدیل شده‌اند. به‌همین‌دلیل، شناسایی جلبک با روش ریخت‌شناختی، با دقت زیاد و با کمک متخصصان خارجی انجام شد. برای اعمال تیمارهای مختلف مادة فعال سطحی نمونة خالص‌شده، ابتدا ظروف و وسایل لازم با آب‌مقطر شستشو و در آون (شرکت Sarvazma، ایران) با دمای 180 درجة سانتی‌گراد به‌مدت یک ساعت خشک و استریل شدند. کشت جلبک در محیط‌کشت Trenkenshu (Salmaninejad, 2016) در شدت نور 120 میکرمول فوتون بر متر مربع بر ثانیه، درجة حرارت 5/0 ± 25 درجة سانتی‌گراد و دوره‌های نوری صفر تا 24 ساعت روشنایی و تاریکی انجام شد (Salmaninejad, 2016). برای تهیة یک لیتر محیط‌کشت Trenkenshu آب محیط نمونه‌برداری فیلتر و سپس در اتوکلاو (مدل LAC-5045SP، شرکت Lab Tech، کرة جنوبی) ضدعفونی شد و نسبت‌های معینی از عناصر شامل سدیم نیترات (NaNO3) به‌مقدار 8/1 گرم بر لیتر، سدیم دی هیدروژن فسفات یک‌آبه (NaH2PO4.H2O) به‌مقدار 3/0 گرم بر لیتر، سدیم اتیلن دی آمین تترا استات (Na2EDTA) به‌مقدار 037/0 گرم بر لیتر، فریک سیترات 7 آبه (FeC6H5O7.7H2O) به‌مقدار 062/0 گرم بر لیتر، منیزیم کلرید چهارآبه (MnCl2.4H2O) به‌مقدار 008/0 گرم بر لیتر، کبالت (ΙΙ) نیترات شش‌آبه (Co(NO3)2.6H2O) به‌مقدار 00625/0 گرم بر لیتر، آمونیوم مولیبدات چهارآبه ((NH4)6Mo7O24.4H2O) به‌مقدار 00183/0 گرم بر لیتر، کروم آلوم (K2Cr2(SO4)4.24H2O) به‌مقدار 00238/0 گرم بر لیتر، تیتانیوم دی اکسید (TiO2) به‌مقدار 00058/0 گرم بر لیتر و سدیم کلرید (NaCl) به‌مقدار 60 گرم بر لیتر به آن اضافه شد. برای شناسایی کلونی‌های جلبک Dunaliella، از میکروسکوپ نوری (مدل Upright، شرکت Taimaz، ایران) استفاده شد. ابتدا برای خالص‌کردن از محیط‌کشت جامد نوترینت آگار استفاده شد. پس از اطمینان از وجود کلونی‌ها، D. viridis جدا و به محیط‌کشت مایع منتقل شد. پس از رشد جلبک و سبز‌شدن لوله‌ها، در مرحلة رشد تصاعدی، مقدار 5 میلی‌لیتر سوسپانسیون جلبک D. viridis به هریک از ارلن‌های یک لیتری محیط‌کشت Trenkenshu اضافه شد. میزان جذب در طول‌موج 650 نانومتر با اسپکتروفتومتر (مدل 6300، شرکت Jenway، انگلستان) اندازه‌گیری شد و هنگامی‌که بیشترین میزان رقت سوسپانسیون تودة سلولی به دست آمد یعنی بین 90 تا 93 درصد ثابت شد، اضافه‌کردن سوسپانسیون جلبکی متوقف شد.
سنجش دینامیک رشد درحضور مادة فعال سطحی: از مادة فعال سطحی آنیونی سدیم دو دسیل سولفات (SDS) دارای وزن مولکولی 4/288 گرم بر مول با غلظتهای 1/0 ، 1 و 10 میلیگرم بر لیتر استفاده شد. برای بررسی تأثیر pH بر نمودار رشد ابتدا ارلن‌های 250 میلی‌لیتری و محیط‌کشت تهیه‌شده ضدعفونی شدند؛ سپس 100 میلی‌لیتر از محیط‌کشت به آنها اضافه شد. پس از افزودن مادة فعال سطحی با غلظتهای مد نظر، pH محیط‌کشت تهیه‌شده اندازه‌گیری شد و برای تنظیم pH از محلول‌های سدیم هیدروکسید (NaOH) 1/0 نرمال و هیدروکلریک اسید (HCl) 1/0 نرمال استفاده شد (Salmaninejad, 2016). ارزیابی نمودار دینامیک رشد این جلبک با اندازه‌گیری جذب در طول‌موج 650 نانومتر، به‌مدت 7 روز و با رابطة 1 انجام شد.
|
رابطة 1 |
ECA= A/B×100 |
در این رابطه، A برابر با مقدار جذب نمونة حاوی مادة فعال سطحی در طول‌موج 650 نانومتر و B، مقدار جذب نمونة بلانک در همان طول موج است (Markina, 2010).
تحلیل فیلوژنتیک و مدل‌سازی کینازها:تحلیل فیلوژنتیک با اطلاعات توالی اولیه برای کینازهای تیپ یک و دو و اطلاعات ساختار دوم انجام شد. توالی‌های اولیه با برنامة Clustal W2 (Larkin et al., 2007) تراز شدند. این برنامه برای هماهنگی انطباق چندتایی پروتئینها و نوکلئیک اسیدها به کار می‌رود. همة ویژگی‌های توالی ازلحاظ رفتاری وزن یکسان و بدون نظم داشتند. مدل فیلوژنیهمسایگیمجاور، الگوریتم شاخص برای دو نوع کیناز تنظیم‌کنندة سیگنال خارج‌سلولی است. درخت‌های همسایگی مجاور با برنامة PHYLIP که ازلحاظ کیفی مشابه Clustal W2است با محاسبة فاصلة تکاملی ترسیم شدند.
مناسب‌ترین مدل اختصاصی پروتئین باید برای موارد ویژه صحیح باشد. ساخت مدل شامل چهار مرحلة شناسایی الگوهای ساختاری، شناسایی ترتیب وتوالی هدف و ساختمان های الگو، ساخت مدل و ارزیابی کیفی آن است که این مراحل تا به‌دست‌آمدن نتایج قانع‌کنندة مدل تکرار شد. مدل‌سازی همولوگ پروتئین در پایگاه اینترنتی کاملاً خودکار Swiss Model (Biasini et al., 2014) انجام شد.
تحلیل آماری: تحلیل داده‌های به‌دست‌آمده از پژوهش حاضر با نرم‌افزارهای Minitab نسخة 15 و SPSS نسخة 18 و رسم نمودارها با نرم‌افزار Excel نسخة 2013 انجام شد. برای تعیین نرمال‌بودن داده‌ها و تجزیة واریانس از نرم‌افزار Minitab نسخة 18 استفاده شد. داده‌های تجربی نتیجة سه تکرار هستند. ابتدا تحلیل با آزمون مقایسة میانگین چند جامعه (ANOVA) با فاصلة اطمینان 95 درصد انجام شد. باتوجهبه آزمون تحلیل واریانس، بین جوامع مطالعه‌شده اختلاف معنی‌دار مشاهده شد. برای دسته‌بندی متغیرها از آزمون Post Hoc (دانکن) و برای توصیف آنها از میانگین و انحراف معیار استفاده شد.
نتایج
تأثیر مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات و pH محیط‌کشت در رشد جلبک D. viridis: در پژوهش حاضر، تأثیر مادة فعال سطحی آنیونی سدیم دو دسیل سولفات با غلظتهای 1/0 ، 1 و 10 میلیگرم بر لیتر و pHهای 7، 8، 9 و 10 محیط‌کشت در رشد جلبک D. viridis بررسی شد. همانطورکه در شکل 1 مشاهده می‌شود جلبک D. viridis در مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات با غلظتهای 1/0 ، 1 و 10 میلیگرم بر لیتر، درصد رشد متفاوتی داشت و رشد در محیط‌کشت با غلظت 1/0 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات تا روز دوم به‌اندازة 63 درصد نسبت به شاهد کاهش یافت؛ درحالی‌که در غلظت 10 میلیگرم بر لیتر تنها 25 درصد کاهش رشد نسبت به شاهد مشاهده شد. رشد جلبک در محیط‌کشت حاوی مادة فعال سطحی با غلظت 1 میلیگرم بر لیتر نیز در روز دوم کاهش 45 درصدی و در روز هفتم نیز کاهش 85 درصدی نسبت به شاهد داشت. تحلیل داده‌ها تفاوت معنی‌داری بین رشد در محیط‌کشت با غلظتهای 1/0 ، 1 و 10 میلیگرم بر لیتر مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات در سطح 05/0P˂ در روزهای مختلف نشان نداد. باتوجهبه اهمیت کاربردی آثار زیستی سورفکتانت در جمعیت جلبک‌های تک‌سلولی محیطهای آبی و تخریب زیستی این آلاینده‌های محیطی در روزهای مختلف، میله‌های خطا (انحراف معیار) افقی در روزها و غلظتهای متفاوت سورفکتانت به‌اندازة کافی با هم هم‌پوشانی دارند و میانگین جمعیت در روزهای اول تا سوم مطمئن‌تر است.
باتوجهبه شکل 2، در 7=pH در محیط‌کشت با غلظت 1 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات در روز چهارم، میزان رشد به 62 درصد و در روز ششم به مرز 70 درصد نسبت به شاهد رسید که به‌وضوح نشان‌دهندة بهبود جمعیت تودة جلبکی با افزایش فتوسنتز در محیط است. در روز هفتم، میزان رشد به 39 درصد رسید که بیان‌کنندة مسموم‌شدن یا تخریب زیستی در جمعیت سلولی است. علاوهبراین در محیط‌کشت با غلظت 10 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات در روز ششم، رشد به کمترین میزان یعنی به مرز 44 درصد نسبت به شاهد رسید که بیان‌کنندة مسموم‌شدن تودة سلولی با سورفکتانت است. تحلیل داده‌ها تفاوت معنی‌داری بین غلظتهای 1 و 10 میلیگرم بر لیتر مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات با 7=pH در سطح 05/0P˂ نسبت به شاهد نشان نداد.
شکل 1- تأثیر غلظتهای 1/0، 1 و 10 میلیگرم بر لیتر مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات (SDS) در درصد رشد D. viridis- مقادیر، میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0P˂ هستند.
شکل 2- تأثیر 7=pH در درصد رشد Dunaliella viridis در محیط‌کشت حاوی غلظتهای 1 و 10 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات (SDS)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0P˂ هستند.
همان‌طور که در شکل 3 مشاهده می‌شود در 8=pH رشد جلبک D. viridis در محیط‌کشت با غلظت 1 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات در روز اول به کمترین میزان یعنی 15 درصد نسبت به شاهد رسید که بیان‌کنندة مسموم‌شدن یا تخریب زیستی در جمعیت سلولی است؛ درحالی‌که در روز هفتم به بیشترین مقدار یعنی 92 درصد نسبت به شاهد رسید که نشان‌دهندة بهبود جمعیت در تودة جلبکی و افزایش فتوسنتز در محیط‌کشت سلولی است. درمحیط‌کشت با غلظت 10 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات میزان رشد کاهش یافت و به حدود 60 درصد در روز پنجم رسید و این کاهش رشد تا روز هفتم ادامه یافت و به کمترین مقدار خود در این روز یعنی 11 درصد نسبت به شاهد رسید. شواهد نشان می‌دهند در 8=pH و غلظت 10 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات تخریب تودة سلولی با سورفکتانت موجب می‌شود فتوسنتز در محیط‌کشت سلولی به کمترین مقدار برسد؛ به عبارت‌دیگر شاهد مرگ جمعیت جلبکی در محیط‌کشت باشیم؛ بنابراین 8=pH محیط‌کشت در آزمایش حاضر با پویایی رشد جمعیت جلبکی همبستگی دارد. تحلیل داده‌ها تفاوت معنی‌داری بین غلظتهای 1 و 10 میلیگرم بر لیتر مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات در 8=pH در سطح (05/0P˂) نسبت به شاهد نشان داد.
شکل 3- تأثیر 8=pH در درصد رشد Dunaliella viridisدر محیط‌کشت حاوی غلظتهای 1 و 10 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات (SDS)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0P˂ هستند.
باتوجهبه شکل 4، در 9=pH رشد جلبک D. viridis در محیط‌کشت با غلظت 1 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات از روز پنجم تا هفتم نسبت به شاهد کاهش یافت و در روز ششم به 50 درصد و در روز هفتم به حدود 7 درصد رسید. این مسئله بیان‌کنندة تخریب زیستی در جمعیت سلولی است که به بیشترین مقدار خود در روز هفتم رسید. میزان رشد در محیط‌کشت با غلظت 10 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات تا روز هفتم نسبت به شاهد کاهش یافت و به 50 درصد در روز ششم و 38 درصد در روز هفتم یعنی کمترین مقدار خود رسید. در همین غلظت تا روز چهارم، افزایش در میزان رشد رخ داد و رشد به مرز 98 درصد رسید که نشان‌دهندة بیشترین مقدار فتوسنتز در محیط‌کشت سلولی است. نتایج نشان می‌دهند در 9=pH و در هردو غلظت 1 و 10 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات، تخریب تودة سلولی با سورفکتانت افزایش یافت؛ بنابراین، کمترین مقدار فتوسنتز در محیط‌کشت سلولی یا مرگ تودة جلبکی ناشی از مسموم‌شدن را در محیط‌کشت انتظار داریم. باتوجهبه حساسیت میزان رشد تضمینی جلبک در محیط بسیار قلیایی، محدودة pH محیط‌کشت با روش غوطه‌وری، 7 تا10 تعیین شد. هرکدام از pHهای 8 یا 9 اهمیت بسزایی در تخریب زیستی جمعیت سلولی از خود نشان دادند. باتوجهبه افت وخیزهای زیاد در نمودارها تنها تحلیل داده‌های عددی مربوط به pHهای مختلف همبستگی دینامیک رشد جمعیت را در pH خاص نشان داد. تحلیل داده‌ها تفاوت معنی‌داری بین غلظتهای 1 و 10 میلیگرم بر لیتر مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات در 9=pH در سطح 05/0P˂ نسبت به شاهد نشان نداد.
شکل 4- تأثیر 9=pH در درصد رشد Dunaliella viridis در محیط‌کشت حاوی غلظتهای 1 و 10 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات (SDS)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0P˂ هستند.
همانطورکه در شکل 5 مشاهده می‌شود در 10=pH در محیط‌کشت با غلظت 1 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات به‌دلیل مسموم‌شدن یا تخریب زیستی در جمعیت سلولی، رشد جلبک D. viridis کاهش یافت و تا روز سوم به کمترین مقدار یعنی به حدود 32 درصد رسید و سپس تا روز چهارم افزایش یافت و به بیشترین مقدار یعنی 102 درصد نسبت به شاهد رسید. این دلیلی بر بهبود جمعیت در تودة جلبکی و افزایش فتوسنتز در محیط‌کشت سلولی است. در محیط‌کشت با غلظت 10 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات، کاهش میزان رشد ناشی از مسموم‌شدن تا روز چهارم ادامه یافت و به مرز 42 درصد رسید؛ سپس رشد افزایش یافت و در روز ششم به بیشترین مقدار خود یعنی 95 درصد نسبت به شاهد رسید که درواقع با کاهش‌نیافتن مسموم‌شدگی و افزایش متابولیسم سلولی روبه‌رو شدیم؛ البته در فرایند تخریب زیستی، بیشتر تجزیة آنزیمی در مراحل اولیه انجام می‌شود و در مراحل بعدی، تغییر در متابولیسم سلولی رخ می‌دهد. علاوهبراین، تخریب به طول زنجیرة آلکیل سورفکتانت نیز بستگی دارد. زنجیرة آلکیل با طول کوتاه‌تر، مانند سدیم دو دسیل سولفات بیشترین درصد تخریب توده را نشان می‌دهد. سورفکتانت با زنجیرة آلکیل بلند تمایل به جذب روی سطح دارد وتغییرات در پدیده‌های سطحی را موجب می‌شود. تحلیل داده‌ها تفاوت معنی‌داری بین غلظتهای 1 و 10 میلیگرم بر لیتر مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات با 10=pH در سطح 05/0P˂ نسبت به شاهد نداشت.
شکل 5- تأثیر10=pH در درصد رشد Dunaliella viridis در محیط‌کشت حاوی غلظتهای 1 و 10 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات (SDS)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0P˂ هستند.
تحلیل محاسباتی کینازهای تنظیم‌شده با سیگنال خارج‌سلولی:انواع مختلفی از تنش‌های زیست‌محیطی مانند تنش هایپراسموتیک تقسیم سلولی موقتی را در Dunaliella ممانعت می‌کنند. در پژوهش حاضر، تأثیر تنش مادة فعال سطحی، احتمال پیامدهای فیزیولوژیک حضور غلظت مادة فعال سطحی آنیونی که مهارکنندة رشد سلول‌های D. viridis است و نیز فسفریلاسیون کینازهای تنظیم‌شده با سیگنال خارج سلولی ارزیابی شدند. توالی‌های بررسی‌شده برای کینازهای تنظیم‌شده با سیگنال خارج‌سلولی تیپ یک و دو (ERK1 و ERK2) به‌ترتیب شامل 446 و 395 جفت باز
شکل 6- انطباق (همردیفی) توالی‌های چندگانه با الگوریتم Clustal W2 بین ده پروتئین کیناز تنظیم‌شده با سیگنال خارج‌سلولی با شباهت زیاد ازجمله پروتئین کینازهای Dunaliella viridis با نام ورودی ERK1 (Q6GWG4) (A) و ERK2 (Q6IT23) (B)- توالی‌های آمینواسیدی ده پروتئین از موجودات‌زندة مختلف، درجه‌های همانندی (درصد آمینواسیدهای یکسان) زیاد 72 و 74 درصد را به‌ترتیب با ERK1 و ERK2 نشان می‌دهند که بیان‌کنندة وجود آمینواسیدهای حفاظت‌شده در این پروتئینها در مدت تکامل است. شمارة دسترسی هر موجودزنده و جزئیات کامل آن شامل نام ورودی، پروتئین و موجودزنده و فاصلة تکاملی برای خوشه‌های ERK1 و ERK2 به‌ترتیب در جداول 1 و 2 تنظیم شده‌اند.
بودندکه هرکدام 149 و 131 آمینواسید در توالی پلی‌پپتیدی خود دارند. این توالی‌ها همولوژی زیادی با کینازهای تنظیم‌شده با سیگنال خارج‌سلولی موجودات زندة دیگر دارند (شکل 6). این توالی‌ها به‌ترتیب برای کینازهای ERK1 و ERK2 در Dunaliella با شمارة دسترسی AY628422 و AY630341 در بانک ژن در NCBI ارجاع داده شده‌اند.
همانطورکه در شکل 7 نشان داده شده است چند آمینواسید متعارف مانند سرین و ترئونین یا دمین‌های تیروزین پروتئین کیناز شناسایی شده‌اند که ویژگی‌های موتیف فسفریلاسیون دوگانه در همة کینازهای فعال‌شده با میتوژن هستند. این موتیف فسفریلاسیون دوگانه در کینازهای آبشاری تنظیم‌شده با سیگنال خارج‌سلولی D. viridis به‌صورت TDY نشان داده شده است.
شکل 7- تحلیل توالی‌های ERK1 (AAT46290) و ERK2 (AAT40419) که حضور چندین موتیف را ازجمله موتیف فسفریلاسیون دوگانة TDY در پروتئین کیناز نشان می‌دهد.
در شکل 8، کلادوگرام ERK1 و ERK2 از D. viridis با ترسیم درخت فیلوژنتیک در Clustal W2 نشان داده شده است. نتایج به دست آمده از آنها و فواصل تکاملی با پروتئین‌های دیگر در جداول 1 و 2 فهرست‌بندی شده‌اند. داده‌ها نشان می‌دهند تیپ‌های یک و دو پروتئین کیناز D. viridis متفاوت از سایر گونه‌ها هستند و تنها شباهت 72 تا 74 درصدی را بین توالی‌های چندتایی دارند. تیپ‌های یک و دو Dunaliella viridis به‌طور دور از انتظاری بیشترین نزدیکی را به گونه‌های مختلف از تیپ‌های کینازهای فعال‌شده با میتوژن ازلحاظ فاصله با ریشه دارند. نزدیک‌ترین موجودزنده به ERK1 و ERK2 با محاسبة فاصله ژن از ریشه به‌ترتیب برای تیپ 1کیناز Brassica napus (Rape) و تیپ 2 کیناز Volvox carteri f. nagariensis ، Selaginella moellendorffii است. کینازهای آبشاری تنظیم‌شده با سیگنال خارج‌سلولی در Dunaliella همانندی زیادی در طیف گسترده‌ای از پروتوزآ تا انسان دارند. توالی ERK1 D. viridis نشان می‌دهد موتیف TEY بین همة موجودات‌زنده فراگیر نیست. درحقیقت موتیف TEY در همة حیوانات ،پروتوزآها، قارچ‌ها و بیشتر گیاهان دارای کینازهای فعال‌شده با میتوژن یافت می‌شود؛ بااینحال، گروهی از گیاهان، موتیف TDY را نشان می‌دهند؛ ازجمله: Dunaliella، Zea mays، Selaginella، Arabidopsis، Triticum و Oryza است. درحالحاضر داده‌های کلادوگرام پیشنهاد می‌کنند توالی ERK1 دو شاخة متفاوت دارد. یکی برای گیاهانی که موتیف TEYدارند مانند ریزجلبک Chlamydomonas و همچنین حیوانات، قارچ‌ها و پروتوزآها و دیگری برای گیاهانی که موتیف TDY دارند مانند Dunaliella را شامل می‌شوند. واگرایی تکاملی بین جلبک سبز Chlamydomonas و Dunaliella شگفت‌انگیز است.
شکل 8- کلادوگرام پروتئین کینازهای D. viridis به‌ترتیب با نام ورودی ERK1 (Q6GWG4) (A) و ERK2 (Q6IT23) (B) رسم‌شده با الگوریتم Clustal W2- کلادوگرام مربوط به پروتئین کیناز ERK1 با شمارة دسترسی Q6GWG4 ارتباط تکاملی خیلی نزدیکی با MAPK9 از Brassica napus (Rape) نشان می‌دهد که در کادرهای مستطیلی قرمز در حد 03/0 نشان داده شده است و در جدول 1 با ستاره مشخص شده است. همچنین اطلاعات ارتباط تکاملی بین سایر پروتئینها با شمارة دسترسی هر موجودزنده در جدول 1 ارائه شده‌اند. کلادوگرام مربوط به پروتئین کیناز ERK2 با شمارة ورودی Q6IT23 نیز شباهت تکاملی نزدیکی با MAPK5 از Volvox carteri f. nagariensis در حد 01/0 نشان می‌دهد که در جدول 2 با ستاره مشخص شده است. همچنین جزئیات کامل آن در جدول 2 مشاهده می‌شوند.
توصیف خوشه‌های ERK1 مربوط به موجودات‌زندة مختلف روی کلادوگرام و همچنین فاصلة تکاملی از منشاء در جدول 1 نشان داده شده‌اند.
توصیف خوشه‌های ERK2 مربوط به موجودات‌زندة مختلف روی کلادوگرام و همچنین فاصلة تکاملی از منشاء در جدول 2 نشان داده شده‌اند. برای ایجاد ساختمان سه‌بعدی ERK1 و ERK2 ازتوالی‌های ارائه‌شده، در Swiss-Model با مدل‌سازی همولوگ، بخش‌هایی ازمناطق همگرایی الگو هم‌زمان و به‌صورت جدا مدل‌ها ساخته شدند و نواحی غیرمحافظتی از توالی‌ها برای تشکیل چارچوب اصلی مدل ظاهر شدند. ساختار قالب مناسب برای توالی‌های مشابه با ERK1 و ERK2 با الگوریتم BLAST (Boratyn et al., 2012) از Swiss-Model، ساختمان مناسبی از قالب کتابخانة ExPDB (Rose et al., 2017) به‌صورت مدل 1ERKA و 3COIA به‌ترتیب برای توالی ERK1 و ERK2 شناسایی شد (شکل 9). با ریشة میانگین انحرافاتمربعی(RMSD)برحسبآنگسترومو
جدول 1- خوشه‌های ERK1 روی کلادوگرام
|
فاصلة تکاملی |
موجودزنده |
پروتئین |
نام ورودی |
شناسة ورودی |
شماره |
|
12359/0 |
Volvox carteri f. nagariensis |
Mitogen-activated protein kinase 4
|
D8U607_VOLCA |
D8U607 |
1 |
|
10942/0 |
Chlamydomonas reinhardtii |
Mitogen-activatedprotein kinase 4 (2.7.1.) |
A8JI35_CHLRE |
2 |
|
|
* 03230/0 |
Dunaliella viridis |
ERK1-like protein kinase |
Q6GWG4_9CHLO |
3 |
|
|
01487/0 |
Arabidopsis thaliana(Mouse-ear cress) |
Mitogen-activated protein kinase 9 (AtMPK9) (MAP kinase 9) (EC 2.7.11.24)
|
MPK9_ARATH |
4 |
|
|
01454/0 |
Arabidopsis lyrata subsp. lyrata |
Putative uncharacterized protein |
D7L7Z0_ARALY |
5 |
|
|
* 03753/0 |
Brassica napus (Rape) |
Mitogen-activated protein kinase 9 |
Q5XU40_BRANA |
6 |
|
|
15379/0 |
Zea mays (Maize) |
Putative mitogen-activated protein kinase 17-3 Putative uncharacterized protein
|
B7ZZV1_MAIZE |
7 |
|
|
15504/0 |
Oryza sativa subsp. japonica (Rice) |
Os05g0576800 proteincDNA clone: J023062F11, full insert sequence
|
Q0DFQ5_ORYSJ |
8 |
|
|
12359/0 |
Volvox carteri f. nagariensis |
Mitogen-activated protein kinase 2 |
D8U6Y1_VOLCA |
9 |
|
|
15109/0 |
Chlorella variabilis |
Putative uncharacterized protein |
E1ZNH5_9CHLO |
10 |
جدول 2- خوشه‌های ERK2 روی کلادوگرام
|
فاصلة تکاملی |
موجودزنده |
پروتئین |
نام ورودی |
شناسة ورودی |
شماره |
|
09852/0 |
Micromonas sp. (strain RCC299 / NOUM17)(Picoplanktonic green alga) |
Predicted protein |
C1FE89_MICSR |
1 |
|
|
13013/0 |
Micromonas pusilla (strain CCMP1545 (Picoplanktonic green alga) |
Predicted protein |
C1ML96_MICPC |
2 |
|
|
* 01812/0 |
Volvox carteri f. nagariensis |
Mitogen-activated protein kinase 5 |
D8TXI3_VOLCA |
3 |
|
|
03842/0 |
Chlamydomonas reinhardtii |
Mitogen-activated protein kinase 5(2.7.1.-) |
A8JB11_CHLRE |
4 |
|
|
* 01136/0 |
Dunaliella viridis |
ERK2-like protein |
Q6IT23_9CHLO |
5 |
|
|
01786/0 |
Selaginella moellendorffii (Spikemoss) |
Putative uncharacterized protein |
D8S135_SELML |
6 |
|
|
03214/0 |
Selaginella moellendorffii (Spikemoss) |
Putative uncharacterized protein |
D8R0V8_SELML |
7 |
|
|
11345/0 |
Physcomitrella patens subsp. patens (Moss) |
Predicted protein |
A9SKF6_PHYPA |
8 |
|
|
09342/0 |
Toxoplasma gondii |
Mitogen-activated protein kinase 2 Serine/threonine-protein kinase / mitogen- activated protein kinase, putative (2.7.11.24) |
Q2QDG8_TOXGO |
9 |
|
|
09342/0 |
Toxoplasma gondii |
Mitogen-activated protein kinase 2 (2.7.11.24) |
B6KJY7_TOXGO |
10 |
شکل 9– محاسبة همانندی توالی‌های مدل‌شده (TARGET) به‌ترتیب با پروتئین کیناز الگو ERK1 (1ERKA) در محدودة 1تا 149 آمینواسید با ریشة میانگین انحرافات مربعی (RMSD) برحسب 30/2 آنگستروم و E-value 1.5E-43 (A) و با پروتئین کیناز الگو ERK2 (3COIA) در محدودة 2 تا 110 آمینواسید با ریشة میانگین انحرافات مربعی برحسب 09/2 آنگستروم و E-value 2.2E-34 (B) ازکتابخانة ExPDB
براساس موقعیت‌های جفت‌شدة اتم‌های کربن آلفا (Cα) مدل یا ساختمان با بیشترین پوشش‌دهی توالی به دست آمد. ساختار فضایی برای ERK1 براساس قالب 1ERKA و ریشة میانگین انحرافات مربعی (RMSD) معادل 30/2 درجة آنگستروم و همانندی 9/48 درصدی توالی با هدف شکل گرفت. ساختار دیگری براساس ERK2 و قالب 3COIA و ریشة میانگین انحرافات مربعی معادل 09/2 درجة آنگستروم و همانندی 4/42 درصدی توالی با توالی هدف پیشگویی شد (شکل 10).
بحث
نتایج نشان دادند غلظتهای مختلف مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات در دمای 25 درجة سانتی‌گراد و دورة نوری صفر تا 24 ساعت و شدت نور 6000 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه بر رشد جلبک D. viridis تأثیر می‌گذارند و تعداد سلول‌های آن را در دورة کشت افزایش یا کاهش می‌دهند. نوسان‌های pH در محیطهای کشت با غلظتهای مختلف مادة فعال سطحی نیز ممکن است بر رشد سلول‌ها آثار چشمگیری بگذارد.
شکل 10– پیشگویی ساختار سه‌بعدی باقیمانده‌های مدل‌شده (TARGET) از ERK1 (1ERKA) (A) و ERK2 (3COIA) (B)
در بررسی حاضر، اعمال غلظتهای 1/0، 1 و 10 میلیگرم بر لیتر مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات در محیط‌کشت نشان داد رشد سلول‌های D. viridis در محیط‌کشت با غلظت 1/0 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات کاهش یافت که در روز دوم این کاهش، 63 درصد نسبت به شاهد بود. در غلظت 10 میلیگرم بر لیتر نیز 25 درصد کاهش رشد نسبت به شاهد در روز دوم رخ داد. رشد در محیط‌کشت حاوی مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات با غلظت 1 میلیگرم بر لیتر نیز در روز دوم 45 درصد و در روز هفتم 85 درصد نسبت به شاهد کاهش یافت؛ بنابراین در مدت هفت روز، رشد در محیط‌کشت حاوی این مادة فعال سطحی حالت نزولی داشت؛ اما این نتایج با یافته‌های Markina (2010) مطابقت ندارند.
نتایج به‌دست‌آمده از اثر pH در محیط‌کشت نشان دادند غلظتهای مختلف مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات در محیطهای کشت و pH های مختلف بر رشد گونة Dunaliella تأثیر می‌گذارند. در محیط‌کشت با 7=pH و حاوی مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات با غلظت 10 میلیگرم بر لیتر در روز هفتم کمترین کاهش رشد جلبک نسبت به شاهد مشاهده می‌شود. بررسی‌های انجام‌شده بر D. salina، بیشترین رشد این گونه را نسبت به شاهد به‌اندازة 60 درصد گزارش کردند (Markina, 2010). نتایج به‌دست‌آمده از تأثیر pH محیط‌کشت در محدودة 8 نشان دادند رشد در محیط‌کشت با 8=pH و حاوی غلظتهای 1 میلیگرم بر لیتر مادة فعال سطحی پس از روز اول، افزایش رشد با شیب کم ( سرعت کم) تا روز چهارم رخ داد و سپس از روز چهارم تا روز نهایی، رشد با شیب زیاد (سرعت زیاد) مشاهده شد. گفتنی است افزایش غلظت مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات در محیط‌کشت Dunaliella به 10 میلیگرم بر لیتر کاهش چشمگیر رشد را نسبت به شاهد باعث شد و به مرز 11 درصد رسید؛ بنابراین با کنترل محیط‌کشت حاوی مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات در محدودة 8=pH، بیشترین تراکم سلولی در غلظت 1 میلیگرم بر لیتر به دست آمد. در پژوهش حاضر بین 8=pH و غلظت 1 میلیگرم بر لیتر همبستگی مثبت و معنی‌داری (835/0 r =) در سطح 05/0P˂ مشاهده شد؛ درنتیجه ممکن است در غلظت و pH یادشده بهترین دینامیک رشد سلولی را در محیط آبی داشته باشیم. محیط‌کشت‌ها با 9=pH همگی کاهش تودة سلولی را تا روز نهایی نشان دادند. کمترین رشد در محیط‌کشت با غلظت 1 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات مشاهده شد که برابر با 7 درصد بود؛ بنابراین نتایج به‌دست‌آمده با یافته‌های Markina (2010) مطابقت ندارند؛ زیرا در بررسی او رشد جلبک D. salina در غلظت 1 میلیگرم بر لیتر سدیم دو دسیل سولفات و 9=pH محیط‌کشت برابر با 105 درصد نسبت به شاهد گزارش شده است (Markina, 2010). در 10=pH، رشد سلول‌های D. viridis در محیط‌کشت حاوی سدیم دو دسیل سولفات با غلظت 1 میلیگرم بر لیتر در روز چهارم با شاهد برابر شد که تأییدی بر یافته‌های قبلی است (Markina, 2010). بدین‌ترتیب مشخص شد مواد فعال سطحی تأثیر چشمگیری در رشد D. viridis گذاشته‌اند و رشد آنها را در مراحل مختلف رشد کاهش یا افزایش داده‌اند. سایر pH ها و غلظت‌ها همبستگی معنی‌داری با رشد سلولی در سطح 05/0P˂ نداشتند و افت‌وخیزهایی در روزهای مختلف نشان دادند. اتصال سورفکتانت به پروتئینها در کشت سلولی ممکن است تحریک یا مهار فعالیت آنزیم‌های سوپر اکسید دیسموتاز و کاتالاز را باعث شود. نیروهای آب‌دوست وآب‌گریز به‌طور هم‌زمان در محل اتصال درگیر هستند و درنتیجه تعاملات نیروهای مختلف به آثار زیستی قوی وابسته به ساختمان مادة فعال سطحی منجر می‌شوند. مادة فعال سطحی آنیونی، ماده‌ای تنش‌زا است و حضور آن ممکن است پیامدهای فیزیولوژیک متعدد مانند مهار رشد سلول‌های D. viridis، فسفریلاسیون کینازهای تنظیم‌شده با سیگنال خارج‌سلولی و درنتیجه، خوب انجام‌نشدن تقسیم سلول‌های D. viridis را داشته باشد. حضور مادة فعال سطحی آنیونی در محیط‌کشت، نوعی تنش به شمار می‌رود که کاهش رشد و درنتیجه، کاهش تراکم سلولی را موجب می‌شود. یافته‌ها با تحقیقات Jiménez و همکاران (2007) هماهنگی دارند. علاوهبراین، فرایند تخریب زیستی سورفکتانت به طول زنجیرة آلکیل آن نیز بستگی دارد. زنجیرة آلکیل با طول کوتاه سدیم دو دسیل سولفات بیشترین درصد تخریب را در جمعیت سلولی موجب می‌شود. به نظر می‌رسد این مادة تنش‌زا به‌صورت انتخابی و نفوذپذیر از مسیر ERK استفاده می‌کند و بر مسیرهای سیگنال جایگزین اثر ندارد. درحالحاضر با نتایج آزمایش‌ها در شرایط in vitro و به‌دست‌آوردن یک یا چند عامل تجربی با مدل‌سازی بیوفیزیک سلولی به شرایط بهینة سلول و پیشگویی مسیرهای متابولیسمی دخیل در آن با دقت زیاد دسترسی می‌یابیم. پروتئین کینازهای D. viridis با نام ورودی ERK1 (Q6GWG4) و ERK2 (Q6IT23) با توالی‌های آمینواسیدی ده پروتئین از موجودات‌زندة مختلف همولوژی زیادی به‌ترتیب 72 و 74 درصد نشان می‌دهند. کلادوگرام مربوط به پروتئین کیناز ERK1 ارتباط تکاملی خیلی نزدیکی با MAPK9 از Brassica napus (Rape) به‌اندازة 03/0 و پروتئین کیناز ERK2 نیز این شباهت زیاد با MAPK5 از Volvox carteri f. nagariensis به‌اندازة 01/0 دارد. در پایگاه داده‌های زیستی، موتیف TEY در Arabidopsis و موتیف TDY در Chlamydomonas یافت نشده‌اند. ازآنجاکه ژنوم کامل این موجودات موجود نیست، امکان ندارد از مجموعة دیگری از ژن‌های ERK با موتیف‌های TEY و TDY استفاده شود. شاید استنباط شود جابه‌جایی از TEY به TDY رخ داده است که این ممکن است به‌دلیل جایگزینی تک‌نوکلئوتیدی در موقعیت سوم کدون مربوطه در تکامل گیاه باشد؛ بنابراین نتیجه‌گیری می‌شود تقسیم سلولی در Dunaliella به‌شدت به فسفریلاسیون کینازهای تنظیم‌شده با سیگنال‌های خارج‌سلولی با کینازهای فعال‌شده با میتوژن وابسته است و به نظر می‌رسد کنترل تقسیم سلولی از الگوهای مشابه انتقال سیگنال در موجودات تک‌سلولی وچندسلولی پیروی می‌کند. تحلیل ژن‌های کینازهای تنظیم‌شده با سیگنال‌های خارج‌سلولی نشان می‌دهد توالی آنها به‌شدت از جلبک‌های تک‌سلولی به گیاهان و پستانداران عالی‌تر محافظت می‌شود و منشاء مسیر ERK پیش از شروع تفاوت‌های سلسلة گیاه و قارچ - جانوران به دست آمده است.
جمع‌بندی
باتوجه‌به‌اینکه تأثیر مستقیم مادة فعال سطحی آنیونی بر گونه‌های مختلف جلبک کمتر مطالعه شده است، در پژوهش حاضر اثر مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات در رشد جلبک D. viridis بررسی شد. براساس نتایج، استنباط می‌شود غلظت محدودة 10 میلیگرم بر لیتر مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات مهار رشد، مسموم‌شدگی تودة جلبکی و درنتیجه کاهش کلروفیل a، کاروتنوئید و بهره‌وری اکسیژن را موجب می‌شود و درنهایت، آثار منفی در محیط‌زیست دریایی می‌گذارد. بررسی حاضر، روش مفیدی برای سنجش توانایی زنده‌مانی جلبک پس از قرارگرفتن در معرض مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات است. وقتی مادة فعال سطحی وارد آب می‌شود مانند سایر مواد سمی در جوامع جلبکی آشفتگی ایجاد می‌کند. به نظر می‌رسد در غلظتهای زیاد مواد شوینده، نزدیک غلظت بحرانی، تجمع زنجیرهای آلکیل مادة فعال سطحی به‌صورت میسل با کاهش انرژی آزاد در سطح سلول، محیطی هیدروفوب ایجاد می‌کند و چسبندگی سلولی در محیط‌کشت کاهش می‌یابد. مواد فعال سطحی آنیونی در غلظت‌هایی که به نوع گونه و مادة فعال سطحی (10 میلیگرم بر لیتر) وابسته هستند رشد را متوقف می‌کنند و به مرگ سلولی منجر می‌شوند؛ به‌طوری‌که بیشتر گونه‌ها به عوامل کاتیونی نسبت به عوامل آنیونی و غیریونی حساسیت بیشتری نشان می‌دهند. تحمل گونه‌ها در هر خانواده، مشابه است و از الگوی ویژه‌ای برای توقف رشد پیروی می‌کند؛ بنابراین برای توصیف مفصل‌تر عملکرد مواد شوینده در ریزجلبک‌ها از روش‌های بیوشیمیایی و میکروسکوپ الکترونی تکمیلی استفاده می‌شود. غلظت 1 میلیگرم بر لیتر و 8=pH مادة فعال سطحی سدیم دو دسیل سولفات ممکن است ارتباط مثبت و معنی‌داری با رنگدانه‌ها و شدت فتوسنتز در جمعیت جلبکی داشته باشد؛ بنابراین، pH محیط با پویایی دینامیک رشد ارتباط دارد؛ به‌طوری‌که در pHهای اسیدی و همین غلظت از آلاینده با تخریب توده‌های جلبکی مواجه می‌شویم. باتوجه‌به‌اینکه مواد فعال سطحی از آلاینده‌های آب‌های سطحی به شمار می‌روند و D. viridis در محیطهای قلیایی رشد چشمگیرتری نسبت به شاهد دارد، این گونه، نشانگر و پالایش‌کنندة زیستی در محیطهای آبی در نظر گرفته می‌شود. پژوهش حاضر، آثار مادة سورفکتانت را که آلاینده است در شرایط in vitro در بوم‌سامانة آبی و ارتباط آن را با فرایندهای فیزیولوژیک و تنوع گونة جلبک با روش omics مدل‌سازی می‌کند. براین‌اساس، پیشگویی محاسباتی ساختار کینازهای تنظیم‌شده با سیگنال خارج‌سلولی با اطلاعات توالی، تلفیق توالی و ساختمان سه‌بعدی پروتئین مد نظر در جلبک انجام شده است.
سپاسگزاری
نگارندگان از دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان بابت در اختیار قرار دادن امکانات لازم همچنین از گروه زیست شناسی دریا دانشگاه تربیت مدرس، کارشناسان آزمایشگاه دانشگاه و سرکارخانم مهندس معصومه سلمانی نژاد بابت همکاری در انجام پژوهش حاضر سپاسگزاری می‌کنند.
)
