نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانش‌‌آموخته کارشناسی ارشد مهندسی تولیدات‌گیاهی- باغبانی، گروه مهندسی فضای سبز، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ملایر
2 1- استادیار علوم‌باغبانی، گروه مهندسی فضای سبز، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ملایر
3 استادیار علوم باغبانی، گروه زراعت، دانشکده کشاورزی، دانشگاه رازی، کرمانشاه
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Salinity is one of the environmental stresses with negatively impact on growth and development process which can leads in oxidative stress induction in plants. Sodium nitroprusside (SNP) is commonly used as a nitric oxide (NO) release agent in plants. Nitric oxide is a relatively stable gas radical and at low concentrations, prevents the production of active oxygen species. The phytochemical changes were investigated in response to application of nitric oxide (0 and 100 μM) in Bidaneh Sefid grapevine plants under different concentrations of sodium chloride (0, 25, 50 and 100 mM). The experiment was done in a factorial experiment based on a completely randomized design with three replications in greenhouse conditions. Regarding the results, NO application increased the chlorophyll, proline, total soluble sugar, total phenol, total flavonoid, soluble protein concentration and likewise significantly increased the activity of antioxidant enzymes of grapevine leaves. Nitric oxide increased the tolerance of grapevine plants under salinity stress conditions with effect on compatible osmolytes, antioxidant enzymes, potassium and magnesium. Consequently, 100 µM of nitric oxide are recommended for increasing salinity stress tolerance (100 mM).
کلیدواژه‌ها [English]
شوری یکی از تنش‌های محیطی مهم است که با آسیب به غشاهای زیستی و برهم‌زدن سازوکار طبیعی سلول سبب کاهش رشد و عملکرد و درنهایت مرگ تدریجی گیاه می‌شود (Sairam and Tyagi, 2004). آثار تنش شوری در گیاه به غلظت نمک، مدت زمان قرارگیری در معرض تنش شوری، ژنوتیپ گیاه و سایر عوامل محیطی بستگی دارند (Roy et al., 2014). یکی از پیامدهای مضر تنش شوری، تجمع یون‌های سدیم و کلر در بافت گیاهان قرارگرفته در معرض خاک دارای غلظت زیاد کلریدسدیم است (Hu and Schmidhalter, 2005). ورود این یون‌ها به سلول باعث برهم‌خوردن تعادل عناصر، تجمع زیاد یون سدیم و در پی آن، اختلالات فیزیولوژیکی درخور توجه می‌شود. در این شرایط، معمولاً تنش اکسایشی به‌علت تغییر موازنه بین نور دریافت‌شده و کارایی جذب نور در برگ طی فرایند فتوسنتز رخ می‌دهد و با افزایش نشت الکترولیت‌ها، تشکیل گونه‌های واکنش‌پذیر اکسیژن ازجمله سوپراکسید (O−2)، پراکسیدهیدروژن (H2O2)، رادیکال‌های هیدروکسیل (OH−) و اکسیژن منفرد (O−) همراه است (Foyer and Noctor, 2003). تنش شوری با افزایش گونه‌های واکنش‌پذیر اکسیژن در سلول‌های گیاه سبب ایجاد تنش اکسایشی در گیاه می‌شود و با افزایش فشار اسمزی محلول خاک، تعرق، فتوسنتز و جذب عناصر غذایی توسط گیاه را مختل می‌کند (Negrao et al., 2017). گیاهان بهمنظور غلبه بر تنش شوری و کاهش آسیب‌های ناشی از گونه‌های واکنش‌پذیر اکسیژن به سامانه‌های محافظت‌کنندۀ آنزیمی ازجمله سوپراکسیددیسموتاز، کاتالاز، گایاکول‌پراکسیداز و آسکوربات‌پراکسیداز و متابولیت‌های غیرآنزیمی نظیر آسکوربیک‌اسید، ترکیبات فنولی و گلوتاتیون مجهز شده‌اند (Minazadeh et al., 2018).
استفاده از ترکیباتی که باعث هومئوستازی متابولیسم سلول و پایداری غشاهای زیستی در شرایط تنش می‌شوند، یکی از روش‌های مدیریت گیاهانِ در معرض تنش شوری است (Minazadeh et al., 2018).
اکسیدنیتریک رادیکال نسبتاً پایداریست که ابتدا به‌عنوان آلوده‌کنندۀ محیط شایان توجه قرار گرفت؛ هرچند بررسی‌های اخیر نشان داده‌اند به‌شکل مولکول در پدیدۀ انتقال پیام در گیاهان و در فرایندهای مختلف فیزیولوژیک، پاتوفیزیولوژیک و نموی مانند جوانه‌زنی بذر، بسته‌شدن روزنه، پاسخ به عوامل بیماری‌زا و نمو ریشه دخالت می‌کند (Duan et al.,2007). اکسیدنیتریک به‌عنوان واسطه در عمل تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی و متابولیسم گونه‌های واکنش‌پذیر اکسیژن شرکت می‌کند و در بسیاری از مطالعه‌ها نشان داده شده است در انتقال پیام و پاسخ به تنش‌های زیستی و غیرزیستی دخالت دارد (Del Rio et al., 2004). مقدار زیاد اکسیدنیتریک با اکسیژن ترکیب می‌شود و رادیکال پراکسی‌نیتریت را تولید می‌کند؛ بنابراین، اعتقاد بر اینست که اکسیدنیتریک نقش دوگانه (سمی یا حفاظتی) دارد و این نقش به غلظت آن در گیاه، نوع بافت، سن گیاه و نوع تنش واردشده به گیاه بستگی دارد .(Beligni and Lamattina, 1999; Del Rio et al., 2004). در برخی گیاهان، کاربرد خارجی اکسیدنیتریک باعث کاهش خسارت ناشی از برخی تنش‌ها مانند فلزات سنگین، علف‌کش‌ها، سرما، اشعه ماورا‌بنفش و تنش شوری می‌شود .(Arasimowicz and Floryszak–wieczorek, 2007).
انگور (Vitis vinifera L.) از مهم‌ترین محصولات باغی در دنیا و ایران است که به‌علت داشتن فراورده‌های جانبی متعدد در بیش از 90 کشور دنیا کشت می‌شود؛ این سطح کشت وسیع باعث روبه‌روشدن درختچه‌های انگور با تنش‌های محیطی مختلف ازجمله تنش شوری شده است. کاربرد بی‌رویۀ کودهای شیمیایی، برهم‌خوردن ساختمان خاک، گرمای هوا و کم‌آبی ازجمله دلایل افزایش غلظت نمک‌ها در آب و خاک به شمار می‌آیند؛ بنابراین، افزایش تحمل شوری ارقام انگور کشت‌شده (دست‌کم از طریق کاربرد ترکیبات محافظت‌کننده‌های بیرونی) بهمنظور داشتن تولید پایدار بیش‌از‌پیش ضروری به نظر می‌رسد. پژوهشی دربارۀ تأثیر تیمارهای اکسیدنیتریک در گیاه انگور قرارگرفته در معرض تنش شوری انجام نشده است؛ ازاین‌رو، هدف بررسی حاضر مطالعۀ سازوکارهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی اثر اکسیدنیتریک در تخفیف تنش شوری بود که روی بوته‌های انگور رقم بی‌دانۀ سفید در شرایط گلخانه ارزیابی شد.
مواد و روش‌ها.
پژوهش حاضر به‌شکل آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایۀ کاملاً تصادفی اجرا شد. تنش شوری در چهار سطح (صفر، 25، 50 و 100 میلی‌مولار کلریدسدیم) و اکسیدنیتریک در دو سطح (صفر و 100 میکرومولار) در سه تکرار اعمال شد. پس‌از تهیۀ قلمه‌های یک‌سالۀ انگور در اواسط فصل زمستان (24 بهمن 1395) از باغ تحقیقاتی شمارۀ 1 پژوهشکدۀ انگور و کشمش دانشگاه ملایر، قلمه‌ها به گلخانۀ آموزشی- تحقیقاتی دانشگاه منتقل شدند. پس‌از ضدعفونی‌کردن قلمه‌ها با بنومیل (5/1 درصد وزنی)، قلمه‌ها بهمنظور تسهیل‌کردن ریشه‌زایی با هورمون ایندول 3- بوتیریک‌اسید (IBA) 1000 میلی‌گرم‌بر‌لیتر به‌مدت 5 ثانیه تیمار شدند. قلمه‌ها پس‌از ریشه‌دار‌شدن (در ماسۀ مرطوب) به گلدان‌های 10 لیتری با ترکیب کوکوپیت و پرلیت (1:1) منتقل شدند. پس‌از رسیدن گیاهان به مرحلۀ 10 برگی، تیمارهای شوری همراه با آب آبیاری اعمال و گلدان‌ها دو بار در هفته با محلول غذایی هوگلند حاوی غلظت‌های مختلف (صفر، 25، 50 و 100 میلی‌مولار کلریدسدیم) شوری آبیاری شدند؛ هم‌زمان با اعمال تیمار شوری، تیمار اکسیدنیتریک (در دو سطح صفر و 100 میکرومولار سدیمنیتروپروساید به‌عنوان ترکیب رهاکنندۀ اکسیدنیتریک) به‌شکل محلول‌پاشی برگی طی نخستین هفته از اعمال تنش شوری و در دو مرحله به فاصلۀ 3 روز انجام شد. پس‌از گذشت شش هفته از آغاز تیمار شوری، نمونه‌های برگی برداشت (Minazadeh et al., 2018) و برای سنجش شاخص‌های فیزیولوژیکی به آزمایشگاه تحقیقاتی علوم باغبانی دانشگاه ملایر منتقل شدند.
بهمنظور اندازه‌گیری غلظت رنگیزه‌های فتوسنتزی ازجمله کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئید، 125/0 گرم بافت برگ تازه با 10 میلی‌لیتر استون 80 درصد در هاون چینی ساییده شد تا به‌شکل توده‌ای یکنواخت درآمد؛ این عمل در نور کم و محیط خنک انجام شد. عصارۀ حاصل به‌مدت 10 دقیقه در 6000 دوردردقیقه سانتریفیوژ (مدل R 320 Universal، شرکت Hettich، آلمان) شد؛ سپس محلول رویی برداشته و جذب نوری آن در طول موج‌های 663 نانومتر (حداکثر جذب نوری کلروفیل a)، 645 نانومتر (حداکثر جذب نوری کلروفیل b) و 470 نانومتر (حداکثر جذب نوری کاروتنوئید) با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل Spekol 2000، شرکت Analytic Jena، آلمان) و با استفاده از استون 80 درصد (شاهد) خوانده شد. غلظت هریک از رنگیزه‌ها در عصاره بر حسب میلی‌گرم‌درلیتر محاسبه شد (Lichtenthaler, 1987):
|
رابطۀ 1 |
Chla (mg/L)=(12.7×A663)–(2.69×A645) |
|
رابطۀ 2 |
Chlb (mg/L)=(25.8×A645)–(4.68×A663) |
|
رابطۀ 3 |
Chltotal (mg/L)=(20.21×A645)+(8.02×A663) |
|
رابطۀ 4 |
Car (mg/L)=[(1000×A470-2.27×Chla–81.4Chlb)/227] |
بهمنظور استخراج پرولین، ابتدا 5/0 گرم از بافت منجمدشدۀ برگ با 5 میلی‌لیتر اتانول 95 درصد در هاون چینی ساییده و بخش بالایی محلول جدا شد. عمل استخراج یک بار دیگر با افزودن 5 میلی‌لیتر اتانول 70 درصد به رسوبات قبلی تکرار شد. عصارۀ استخراج شده به‌مدت 15 دقیقه با سرعت 6000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد. برای اندازه‌گیری پرولین هر نمونه، 1 میلی‌لیتر عصاره با 9 میلی‌لیتر آب مقطر رقیق شد و به آن، 5 میلی‌لیتر معرف نین‌هیدرین (شامل 125/0 گرم نین‌هیدرین+2 میلی‌لیتر فسفریک‌اسید 6 مولار+3 میلی‌لیتر استیک‌اسید گلایسیال) به همراه 5 میلی‌لیتر استیک‌اسید گلایسیال اضافه شد و پس‌از تکان دادن جزئی، نمونه به‌مدت 45 دقیقه درون حمام بخار (مدل WNB14، شرکت Memmert، آلمان) با دمای 100 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد. پس‌از خنک‌کردن نمونه‌ها در آب یخ، 4 میلی‌لیتر تولوئن به هر نمونه اضافه و کاملاً تکان داده شد تا پرولین وارد فاز تولوئن شود. پس‌از نیم ساعت، میزان جذب فاز تولوئن هر نمونه با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 515 نانومتر تعیین شد (Bates et al., 1973). غلظت پرولین بر اساس منحنی استاندارد پرولین خالص تعیین و بر حسب میکرومول‌در‌گرم وزن تر برگ بیان شد.
استخراج قندهای محلول مشابه با استخراج پرولین انجام شد. بهمنظور اندازه‌گیری قندهای محلول، 1/0 میلی‌لیتر از عصارۀ الکلی به‌دست‌آمده با 3 میلی‌لیتر آنترون تازه‌تهیه‌شده (150 میلیگرم آنترون+100 میلی‌لیتر سولفوریک‌اسید 72 درصد) مخلوط شد. برای شروع واکنش رنگ‌گیری، لوله‌ها به‌مدت 10 دقیقه در حمام آبگرم 90 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شدند و پس‌از سردشدن لوله‌ها، میزان جذب نمونه‌ها با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 625 نانومتر خوانده شد (Irigoyen et al., 1992). غلظت قندهای محلول بر اساس منحنی استاندارد گلوکز تعیین و بر حسب میلی‌گرم‌در‌گرم وزن تر بیان شد.
بهمنظور سنجش محتوای پروتئین‌های محلول، 5/0گرم بافت تازۀ برگ با 5 میلی‌لیتر بافر استخراج (تریس با غلظت 1 میلی مولار و اسیدیتۀ 7) درون هاون چینی کاملاً له شد و این مخلوط به‌مدت 20 دقیقه با سرعت 6000 دوردردقیقه سانتریفوژ شد؛ سپس 100 میکرولیتر از محلول شفاف رویی با 5 میلی‌لیتر معرف بیورد [(10 درصد استیک‌اسید گلایسیال+25 درصد اتانول+65 درصد آب مقطر+1/0 درصد (حجم/وزن) محلول کوماسی بریلیانت بلوجی 250)] مخلوط و جذب آن با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 595 نانومتر خوانده شد (Bradford, 1979). غلظت پروتئین‌های محلول با استفاده از منحنی استاندارد تهیه‌شده بر اساس غلظت‌های مختلف آلبومین گاوی بر حسب میلی‌گرم‌در‌گرم وزن تر محاسبه شد.
بهمنظور اندازه‌گیری محتوای فنول کل موجود در برگ‌ها، ابتدا 5/0 گرم نمونۀ تازۀ برگ بهطور کامل در 4 میلی‌لیتر اتانول کوبیده شد تا محلولی همگن حاصل شد و پس‌از 20 دقیقه سانتریفوژ در 9500 دوردردقیقه، محلول شفاف رویی جدا شد. میزان 300 میکرولیتر عصاره با 1200 میکرولیتر کربنات‌سدیم 7 درصد و 5/0 میلی‌لیتر فولین 10 درصد مخلوط و به‌مدت 20 دقیقه در محل تاریک قرار داده شد. پس‌از طی‌شدن مدت زمان یادشده، میزان جذب با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 725 نانومتر خوانده و میزان فنول با استفاده از نمودار استاندارد گالیک‌اسید بر حسب میلیگرم گالیک‌اسید بر وزن تر تعیین شد (Velioglu, et al., 1998).
بهمنظور سنجش میزان فلاونوئید کل از روش رنگ‌سنجی کلریدآلومینیوم استفاده شد (Chang et al., 2002)؛ در این روش، ابتدا 1/0 میلی‌لیتر کلریدآلومینیوم 10 درصد درون لوله‌های آزمایش ریخته شد، 1/0 میلی‌لیتر استات‌پتاسیم 1 مولار به لوله‌ها اضافه و با محتویات آنها مخلوط شد، سپس 8/2 میلی‌لیتر آب مقطر به لوله‌ها اضافه شد و در مرحلۀ آخر، 5/0 میلی‌لیتر از محلول عصاره متانولی برگ به مخلوط یادشده اضافه شد. نمونه‌ها به‌مدت 30 دقیقه در محیط تاریک قرار گرفتند و سپس جذب نوری نمونه‌ها در طول موج 415 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر تعیین شد. مقدار فلاونوئید کل برای هرکدام از عصاره‌ها بر حسب میلیگرم کوئرستین بر گرم وزن تر محاسبه شد.
بهمنظور اندازه‌گیری محتوای آب نسبی برگ، ابتدا قطعه‌های برگ به شعاع 1 سانتی‌متر تهیه و وزن تر آنها تعیین شد. پس‌از قرارگیری قطعه‌های برگ درون آب مقطر (24 ساعت در یخچال)، وزن آماس برگ‌ها تعیین شد. بهمنظور اندازه‌گیری وزن خشک، قطعه‌های برگ به‌مدت 24 ساعت در آون (مدل 35 لیتری هوشمند، شرکت شیماز، ایران) با دمای 80 درجۀ سانتی‌گراد خشک و سپس وزن شدند. محتوای آب نسبی بر حسب درصد از رابطۀ 5 به دست آمد (Ritchie et al., 1990):
|
رابطۀ 5 |
100 × (وزن خشک - وزن آماس) / (وزن خشک - وزن تر)= محتوای آب نسبی (درصد) |
بهمنظور اندازه‌گیری نشت‌یونی، نمونه‌های برگ (به‌اندازۀ دایره‌ای با شعاع 1 سانتی‌متر) در قوطی‌های حاوی 30 میلی‌لیتر آب مقطر غوطه‌ور و به‌مدت 20 ساعت روی دستگاه شیکر (مدل KS260 digital، شرکت IKA، آلمان) با سرعت 120 دور در دقیقه تکان داده شدند. پس‌از این مدت، هدایت الکتریکی محلول حاوی نمونه‌ها با دستگاه هدایت‌سنج (مدل Cond 720، شرکت WTW، آلمان) خوانده شد (هدایت الکتریکی اولیه). قوطی‌های حاوی قطعه‌های برگ به‌مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجۀ سانتی‌گراد اتوکلاو (مدل 75 لیتری، شرکت ریحان طب، ایران) شدند؛ پس از سردشدن تدریجی، هدایت الکتریکی آنها دوباره خوانده (هدایت الکتریکی ثانویه) و درنهایت، درصد نشت‌یونی از رابطۀ6 محاسبه شد (Sairam and Tyagi, 2004).
|
رابطۀ 6 |
100× (هدایت الکتریکی ثانویه / هدایت الکتریکی اولیه) = درصد نشت‌یونی |
بهمنظور اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، ابتدا عصارۀ آنزیمی تهیه شد؛ به‌این‌ترتیب که ابتدا بافت منجمدشدۀ برگ در حضور ازت مایع در هاون چینی آسیاب شد و مقدار 1/0 گرم از آن به تیوب پلاستیکی حاوی 1 میلی‌لیتر بافر استخراج اضافه و هم زده شد. نمونه از صافی عبور داده شد و عصارۀ تهیه‌شده به‌مدت 15 دقیقه با سرعت 10000 دوردردقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ و محلـول شفاف رویی به‌آرامی جدا شد؛ محلول حاصل برای اندازه‌گیری فعالیت هریک از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان به شرح زیر استفاده شد:
بهمنظور تعیین میزان فعالیت آنزیم کاتالاز، ابتدا مقدار 50 میکرولیتر از عصارۀ گیاهی با 3 میلی‌لیتر بافر استخراج شامل فسفات‌سدیم 50 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7) و 2 میلی‌مولار اتیلن‌دی‌آمین‌تترا استیک‌اسید آمیخته و واکنش آنزیم کاتالاز با اضافه‌کردن 5 میکرولیتر پراکسیدهیدروژن 30 درصد به این مخلوط آغاز شد. تغییرات جذب نوری نمونه‌ها در طول موج 240 نانومتر به‌مدت 1 دقیقه ثبت شد. هر واحد از فعالیت آنزیم کاتالاز، مقداری از آنزیم در نظر گرفته شد که موجب کاهش 1 میکرومول پراکسیدهیدروژن در دقیقه می‌شود. میزان فعالیت آنزیم بر حسب واحد در میلیگرم پروتئین برگ بیان شد (Bergmeyer, 1970).
بهمنظور اندازه‌گیری فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز، ابتدا مقدار 50 میکرولیتر از عصارۀ گیاهی با 3 میلی‌لیتر بافر استخراج حاوی فسفات‌سدیم 50 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7) و 2 میلی‌مولار اتیلن‌دی‌آمین‌تترا‌استیک‌اسید آمیخته و واکنش آنزیم گایاکول‌پراکسیداز با اضافه‌کردن 5 میکرولیتر پراکسیدهیدروژن 30 درصد و مقدار 5 میکرولیتر مادۀ گایاکول به این مخلوط آغاز شد. ثبت تغییرات جذب نوری نمونه‌ها در طول موج 465 نانومتر که بیان‌کنندۀ میزان تخریب و کاهش غلظت پراکسیدهیدروژن است به‌مدت 1 دقیقه انجام شد. هر واحد از فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز، مقداری از آنزیم در نظر گرفته شد که موجب کاهش 1 میکرومول پراکسیدهیدروژن در هر دقیقه می‌شود. میزان فعالیت آنزیم بر حسب واحد در میلیگرم پروتئین برگ بیان شد (Herzog and Fahimi, 1973)..
بهمنظور اندازه‌گیری فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز، ابتدا مقدار 50 میکرولیتر از عصارۀ گیاهی با 3 میلی‌لیتر بافر استخراج حاوی فسفات‌سدیم 50 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7)، 2 میلی‌مولار اتیلن‌دی‌آمین‌تترا‌استیک‌اسید، پلی‌وینیل‌پیرولیدین-40 1 درصد (وزن به حجم)، تریتون-100 1/0 (حجم به حجم) و آسکوربات 1 میلی‌مولار آمیخته شد. واکنش آنزیم کاتالاز با اضافه‌کردن 5/4 میکرولیتر پراکسیدهیدروژن 30 درصد به مخلوط یادشده آغاز شد. تغییرات جذب نوری نمونه‌ها در طول موج 290 نانومتر که بیان‌کنندۀ میزان اکسیداسیون و کاهش غلظت آسکوربات است به‌مدت 1 دقیقه ثبت شد. هر واحد فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز، مقداری از آنزیم در نظر گرفته شد که موجب اکسیده‌شدن 1 میکرومول آسکوربات در هر دقیقه می‌شود. میزان فعالیت آنزیم بر حسب واحد در میلیگرم پروتئین برگ بیان شد (Nakano and Asada, 1981).
.بهمنظور استخراج و اندازه‌گیری غلظت عناصر، نمونه‌های برگی سالم از برگ‌های میانی شاخه‌ها جمع‌آوری و در آزمایشگاه با آب مقطر شستشو شدند. نمونه‌های برگ به‌مدت 72 ساعت در دمای 75 درجۀ سانتی‌گراد خشک و سپس آسیاب شدند. پس‌از تهیۀ عصاره به روش هضم تر با استفاده از نیتریک‌اسید غلیظ (65 درصد)، غلظت عناصر پتاسیم و سدیم به روش نشر شعله‌ای و با دستگاه فلیم فتومتر (مدل 405 G، شرکت Crouse، آلمان) و غلظت عناصر منیزیم و کلسیم با دستگاه جذب اتمی (مدل AANALYST70، شرکت Perkin Elmer، آمریکا) اندازه‌گیری شد. غلظت یون نیترات با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل Spekol 2000، شرکت Analytic Jena، آلمان) و با استفاده از 5/0 گرم پودر مخلوطی شامل 37 گرم سیتریک‌اسید، 5 گرم سولفات‌‌منگنز مونوهیدرات، 2 گرم سولفانیل‌آمید، 1 گرم ان-1- نفتیل اتیل دی آمین دی هیدروکلراید و 1 گرم پودر روی به‌عنوان شناساگر که به عصاره اضافه شد، اندازه‌گیری شد (Abdel-Shafey et al., 1994). بهمنظور اندازه‌گیری کلر، 100 میلیگرم از بافت گیاهی پودرشده درون لولۀ فالکون ریخته شد و عصاره‌گیری پس‌از افزودن 10 میلی‌لیتر نیتریک‌اسید 5/0 مولار و قرار‌دهی آن به‌مدت 1 ساعت در دمای 80 درجۀ سانتی‌گراد خشک‌کن انجام شد. مقدار 1 میلی‌لیتر از عصاره برای خواندن کلر طبق روش رنگ‌سنجی در طول موج 480 نانومتر با دستگاه اپوچ (مدل USA، LMS-1003) استفاده شد (Munns et al., 2010)..
تجزیه‌وتحلیل داده‌ها با نرم‌افزار SAS نسخۀ 1/9 انجام و برای مقایسۀ میانگین داده‌ها از آزمون چند‌دامنه‌ای دانکن (P≤0.01) استفاده شد. پیش‌از انجام تجزیه‌وتحلیل آماری، آزمون نرمالیته برای همۀ داده‌ها انجام شد.
نتایج و بحث.
اثر شوری و اکسیدنیتریک بر رنگیزه‌های برگ انگور:در هر دو سطح اکسیدنیتریک، میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئید با افزایش غلظت کلریدسدیم کاهش یافت (جدول 1). نتایج نشان دادند تنش شوری باعث کاهش غلظت کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل برگ انگور می‌شود؛ به‌طوری‌که این اثر به غلظت وابسته است و غلظت این رنگیزۀ فتوسنتزی در شوری 100 میلی‌مولار کلریدسدیم به حداقل می‌رسد (جدول 1). با افزایش شوری، از میزان کلروفیل کل نیز کاسته شد و شیب کاهش آن در تیمار صفر میکرومولار اکسیدنیتریک بیشتر از 100 میکرومولار بود (جدول 1)؛ این یافته با گزارش‌های پیشین دربارۀ اثر شوری بر محتوای کلروفیل انگور مطابقت دارد (Ahmed et al., 2015; Doulati Baneh, 2016; Azizi et al., 2017). کاهش کلروفیل در شرایط تنش شوری از تخریب کلروپلاست، تغییر نسبت لیپید به پروتئین، افزایش فعالیت آنزیم‌های کلروفیلاز و روبیسکو ناشی می‌شود. اثر سمیت برخی یون‌ها در شرایط تنش شوری مانع فعالیت آنزیمی و سنتز کلروفیل در سلول می‌شود (Cuin and Shabala, 2007)؛ به عبارتی، اخـتلال ضمنی در جـذب عناصر دخیل در ساختار کلروفیل مانند منیزیم و آهن یکی از دلایل کاهش کلروفیـل در برگ بوته‌های در معرض تـنش شـوری است (Munns and Tester, 2008) کـه این نقصان با کاربرد خارجی اکسیدنیتریک رفع می‌شود. در مطالعۀ حاضر، کاربرد اکسیدنیتریک باعث پایداری بیشتر کلروفیل در برگ بوته‌های انگور در معرض تنش شوری شد که گویای نقش این ترکیب در راه‌اندازی مسیرهای متابولیکی است و نشان می‌دهد این ترکیب با تأثیر بر سیستم فتوسنتزی گیاه موجب تداوم فعالیت فیزیولوژیکی کلروفیل و پایداری گیاه می‌شود (Garcı́a López-Carrión et al., 2008).
جدول 1- مقایسۀ میانگین اثر ترکیبی تیمارهای شوری و اکسیدنیتریک بر میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئید برگ انگور بی‌دانۀ سفید
|
اکسیدنیتریک |
شوری |
کلروفیل a |
کلروفیل b |
کلروفیل کل |
کاروتنوئید |
|
میلیگرمبرگرم وزن تر |
|||||
|
0 |
0 |
a618/1 |
a636/0 |
a551/2 |
953/0b |
|
0 |
25 |
b516/1 |
a630/0 |
b413/2 |
780/0cd |
|
0 |
50 |
c426/1 |
b555/0 |
c250/2 |
690/0d |
|
0 |
100 |
d156/1 |
d446/0 |
e805/1 |
560/0f |
|
100 |
0 |
a708/1 |
a646/0 |
a591/2 |
a031/1 |
|
100 |
25 |
b566/1 |
a640/0 |
b513/2 |
c810/0 |
|
100 |
50 |
c477/1 |
b575/0 |
c350/2 |
d723/0 |
|
100 |
100 |
d256/1 |
c496/0 |
d075/2 |
e611/0 |
*حرف‌های یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال P
بیشترین میزان کاروتنوئید (031/1 میلیگرمبرگرم وزن تر) در برگ انگور بی‌دانۀ سفید تیمارشده با صفر میکرومولار اکسیدنیتریک بدون تنش شوری مشاهده شد (جدول 1). میزان این ترکیب با افزایش شوری کاهش یافت و در شوری 100 میلی‌مولار کلریدسدیم بدون تیمار اکسیدنیتریک به کمترین مقدار خود (560/0 میلیگرمبرگرم وزن تر) رسید که گویای اثر منفی و معنادار سدیم بر این ترکیب است. کاروتنوئیدها یکی از رنگیزه‌های فتوسنتزی‌اند که میزان آنها تحت‌تأثیر تنش شوری به‌شدت و بهطور معنادار کاهش می‌یابد (Parida and Das, 2005; Alavi Matin et al., 2016). مقایسۀ دو سطح تیمار اکسیدنیتریک نشان داد این ماده بر میزان کاروتنوئید اثر معناداری دارد و موجب افزایش این ترکیب در همۀ سطوح شوری می‌شود (جدول 1). بیشترین اثر اکسیدنیتریک بر میزان کاروتنوئید (افزایش 21 درصدی) در شوری 25 میلی‌مولار کلریدسدیم (810/0 میلیگرمبرگرم وزن‌تر) مشاهده شد؛ نقش تعدیل‌کنندگی اکسیدنیتریک با افزایش شوری کم‌رنگ‌تر شد و در شوری 100 میلی‌مولار کلریدسدیم، مقدار کاروتنوئید به کمترین مقدار خود (611/0 میلیگرمبرگرم وزن تر) رسید.
اثر شوری و اکسیدنیتریک بر برخی ویژگی‌های فیزیولوژیکی برگ انگور
پرولین:نتایج مقایسۀ میانگین‌ها (جدول 2) نشان دادند در سطح صفر میکرومولار اکسیدنیتریک، میزان پرولین برگ با افزایش غلظت کلریدسدیم افزایش می‌یابد و در سطح 100 میکرومولار اکسیدنیتریک، میزان پرولین برگ با افزایش غلظت نمک تا 50 میکرومولار افزایش می‌یابد و در غلظت 100 میلی‌مولار کلریدسدیم کاهش نشان می‌دهد. بیشترین میزان پرولین برگ (90/22 میکرومول‌بر‌گرم وزن تر) در تیمار صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم و کمترین میزان پرولین برگ (61/10 میکرومول‌بر‌گرم وزن تر) در تیمار صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم مشاهده شد (البته اختلاف معناداری با مقدار پرولین برگ بوته‌های تیمارشده با 100 میکرومولار اکسیدنیتریک در ترکیب با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم نداشت) (جدول 2). پژوهش‌ها نشان می‌دهند اعمال تنش شوری در توت‌فرنگی (Turhan and Eris, 2004)، انگور (Fozouni et al., 2012; Doulati Baneh et al., 2013) و گوجه‌فرنگی (Zarei et al., 2018) نیز محتوای پرولین را در برگ نهال‌ها افزایش می‌دهد که تأییدی بر نتایج مطالعۀ حاضر است. افزایش غلظت پرولین ممکن است به‌علت وجود پیش‌مادۀ مشترک با کلروفیل (گلوتامین) باشد؛ درنتیجه، طی شرایط تنش و به‌علت ساخت پرولین برای تعدیل اثر اسمزی شوری، میزان کلروفیل کمتری ساخته می‌شود (Fozouni et al., 2012). مشاهده شده است کاربرد برگی اکسیدنیتریک در دانهال‌های برنج در معرض تنش شوری باعث افزایش معنادار غلظت پرولین برگ دانهال‌ها می‌شود که با افزایش رونویسی ژن کلیدی بیوسنتز پرولین یعنی دلتا پیرولین 5 کربوکسیلات سنتاز همراه است (Uchida et al., 2002). پرولین داخل سلول که طی تنش انباشته شده است، امکان تحمل به تنش را فراهم می‌کند و به‌شکل نیتروژن آلی طی دوران بهبود از تنش ذخیره می‌شود (Strizhov et al., 1997;Fozouni et al., 2012).
جدول 2- مقایسۀ میانگین اثر ترکیبی تیمارهای شوری و اکسیدنیتریک بر برخی ویژگی‌های فیزیولوژیکی برگ انگور بی‌دانۀ سفید
|
فلاونوئید |
فنل کل |
پروتئین محلول کل |
قند محلول کل |
پرولین |
شوری |
اکسیدنیتریک |
|
میلیگرم کوئرستین بر گرم وزن تر |
میلیگرم گالیک‌اسید بر گرم وزن تر |
میلیگرمبرگرم وزن تر |
میلیگرمبرگرم وزن تر |
میکرومول‌بر‌گرم وزن تر |
||
|
c63/0 |
g25/16 |
c13/3 |
c36/17 |
e61/10 |
0 |
0 |
|
c61/0 |
e17/19 |
b96/3 |
c91/17 |
d53/15 |
25 |
0 |
|
b29/1 |
d14/23 |
bc46/3 |
bc62/20 |
c00/18 |
50 |
0 |
|
b14/1 |
c10/25 |
d23/2 |
ab61/24 |
b30/21 |
100 |
|
|
d52/0 |
f65/17 |
b96/3 |
c41/18 |
e23/11 |
0 |
100 |
|
b11/1 |
d73/22 |
a20/5 |
abc66/22 |
d03/16 |
25 |
100 |
|
b13/1 |
b92/26 |
a10/5 |
ab70/25 |
b60/20 |
50 |
100 |
|
a53/1 |
a71/28 |
a16/5 |
a14/28 |
a90/22 |
100 |
100 |
*حرف‌های یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال P
قند محلول کل: نتایج مقایسۀ میانگین‌ها (جدول 2) نشان دادند در سطح صفر میکرومولار اکسیدنیتریک، میزان قند محلول کل برگ با افزایش غلظت نمک افزایش می‌یابد؛ از سویی در سطح 100 میکرومولار اکسیدنیتریک، میزان قند محلول کل برگ با افزایش غلظت نمک تا سطح 100 میلی‌مولار کلریدسدیم به بیشترین مقدار (14/28 میلیگرمبرگرم وزن تر) می‌رسد (جدول 2). در بررسی تحمل شوری چهار رقم انگور یاقوتی، عسگری، رشه و سرقوله مشخص شده است تجمع قندهای محلول در برگ با افزایش شوری افزایش می‌یابد و رابطۀ مستقیمی بین تحمل شوری و میزان تجمع قند محلول کل مشاهده می‌شود (Doulati Baneh et al., 2013). همچنین در بررسی تغییرات عناصر غذایی، ویژگی‌های رشدی و فیزیولوژیکی چندرقم و دورگۀ بین‌گونه‌ای انگور مشاهده شده است میزان رشد، وزن خشک ریشه و ساقه و محتوای نسبی آب با افزایش تنش شوری ناشی از کلریدسدیم کاهش ولی میزان پرولین و قندهای محلول افزایش می‌یابد (Doulati Baneh, 2016). بیوسنتز و تجمع محلول‌های سازگاری ازجمله قندها یکی از واکنش‌های تنظیمی مهم گیاهان در پاسخ به تنش شوری است (Gupta and Huang, 2014). به‌این‌ترتیب که گیاه محلول‌های سازگار ازجمله قندهای محلول را در واکوئل و سیتوپلاسم انباشته می‌کند تا با حفاظت و تعدیل اسمزی بتواند ادامۀ جذب آب، ذخیرۀ کربن و نیتروژن و پالایندگی رادیکال‌های آزاد اکسیژن را انجام دهد؛ اما این امر با افزایش شوری و آثار تخریبی آن متوقف و گیاه متحمل آسیب‌های جبران‌ناپذیر می‌شود (Sivritepe and Eriş, 1999; Parida and Das, 2005).
پروتئین محلول کل: نتایج مقایسۀ میانگین‌ها (جدول 2) نشان دادند در سطح صفر میکرومولار اکسیدنیتریک، میزان پروتئین برگ با افزایش غلظت نمک تا سطح 50 میلی‌مولار کلریدسدیم افزایش و در غلظت 100 میلی‌مولار کلریدسدیم کاهش می‌یابد. کمترین میزان پروتئین برگ (23/2 میلیگرمبرگرم وزن تر) در تیمار صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم مشاهده شد. در سطح 100 میکرومولار اکسیدنیتریک، میزان پروتئین برگ با افزایش غلظت نمک افزایش یافت؛ هرچند تفاوت معناداری بین سطوح بالای نمک ازنظر میزان پروتئین برگ وجود نداشت. محتوای پروتئین‌های محلول یکی از شاخص‌های مهم نشان‌دهندۀ وضعیت فیزیولوژیکی در سلول‌های گیاهی است. در مطالعۀ حاضر، محتوای پروتئین‌های محلول پس‌از اعمال تنش شوری افزایش یافت؛ این افزایش یکی از معمول‌ترین تغییرات بیوشیمیایی است که باعث محافظت گیاه در برابر آسیب‌های کشندۀ آب‌کشیدگی می‌شود (Koç et al., 2010). پروتئین محلول همانند پرولین ازجمله محلول‌های سازگاریست و از عوامل ارتقای مقاومت گیاه در برابر تنش شوری محسوب می‌شود؛ بنابراین با افزایش شوری، گیاه از طریق تولید پروتئین محلول تا حدی بر شرایط تنش فائق می‌آید. محتوای پروتئین‌های محلول برگ در انگورهای تیمارشده با اکسیدنیتریک 100 میکرومولار به همراه سطوح شوری 25، 50 و 100 میلی‌مولار (بدون اختلاف معنادار باهم) در مقایسه با بوته‌های محلول‌پاشی‌شده با اکسیدنیتریک 100 میکرومولار بدون شوری بهطور معناداری افزایش داشت (جدول 2). در مطالعۀ Uchida و همکاران (2002) روی دانهال‌های برنج، کاربرد اکسیدنیتریک باعث بیان بیشتر ژن پروتئین‌های مرتبط با تنش ازجمله پروتئین‌های شوک حرارتی شد. در مطالعۀ یادشده، سازگاری به تنش شوری با تولید کمتر پراکسیدهیدروژن درون‌زاد در دانهال‌های تیمارشده با اکسیدنیتریک همراه بود که تأییدی بر یافته‌های مطالعۀ حاضر است.
فنول کل: نتایج نشان دادند (جدول 2) میزان فنول کل برگ با افزایش غلظت نمک در هر دو سطح صفر و 100 میکرومولار اکسیدنیتریک افزایش می‌یابد. بیشترین (71/28 میلیگرم گالیک‌اسید بر گرم وزن تر) و کمترین (25/16 میلیگرم گالیک‌اسید بر گرم وزن تر) میزان فنول کل به‌ترتیب در تیمارهای 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم و شاهد (صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم) مشاهده شد. کاربرد برگی اکسیدنیتریک 100 میکرومولار بهطور چشمگیری محتوای فنول کل را در انگورهای تیمارشده افزایش داد؛ به‌طوری‌که میزان فنول کل در مقایسه با انگورهای تیمارنشده (صفر میکرومولار اکسیدنیتریک) حدود 40 درصد افزایش داشت (جدول 2).
در مطالعۀ حاضر، کاربرد اکسیدنیتریک به تجمع فنول کل بیشتر در شرایط تنش شوری نسبت به انگورهای تیمارنشده منجر شد. افزایش ترکیبات فنولی در این انگور‌ها نوعی سازوکار سازگاریست که برای غلبه بر تنش اکسایشی ناشی از شوری عمل می‌کند. کاربرد برگی اکسیدنیتریک در انگور، تحمل به تنش سرما را از طریق افزایش ترکیبات فنولی افزایش می‌دهد (Siddiqui et al., 2010) که گویای دخالت این ماده در مسیرهای ساخت ترکیبات فنولی به‌ویژه در گیاهان در معرض تنش است. در پژوهش Peng و Zhou (2009) نیز ترکیبات فنولی موجب افزایش توانایی گیاه سویا در جاروب‌کردن رادیکال‌های آزاد طی شرایط تنش شدند.
فلاونوئید کل: نتایج مقایسۀ میانگین‌ها (جدول 2) نشان دادند با افزایش غلظت نمک در هر دو سطح اکسیدنیتریک، میزان فلاونوئید از نظم خاصی پیروی نمی‌کند و بیشترین میزان فلاونوئید برگ (53/1 میلیگرم کوئرستین بر گرم وزن تر) در تیمار 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم و کمترین میزان فلاونوئید (52/0 میلیگرم کوئرستین بر گرم وزن تر) در تیمار 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم مشاهده می‌شود. اهمیت فلاونوئید‌ها به‌علت نقشی است که در سیستم‌های دفاع غیرآنزیمی دارند (Apel and Hirt, 2004). عوامل محیطی تأثیر بسزایی در فعالیت فلاونوئید‌ها دارند و هنگامی که گیاه وجود تنش را احساس کند، سیستم دفاعی گیاه ازجمله فلاونوئید‌ها برای مقابله با تنش فعال می‌شوند و افزایش می‌یابند (Munns and Tester, 2008).
محتوای نسبی آب: نتایج مقایسۀ میانگین‌ها (شکل 1، الف) نشان دادند محتوای نسبی آب برگ با افزایش غلظت نمک در هر دو سطح اکسیدنیتریک کاهش می‌یابد و کمترین محتوای نسبی آب (98/69 درصد) در تیمار 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم و بیشترین محتوای نسبی آب (99/83 درصد) در تیمارهای 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم و 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 25 میلی‌مولار کلریدسدیم مشاهده می‌شود. نتایج حاضر با پژوهش‌های انجام‌شده در زمینۀ انگور (Azizi et al., 2017) و پسته (Ranjbar et al., 2017) در شرایط تنش شوری مطابقت دارند؛ البته محتوای نسبی آب در تاک‌های تیمارشده با اکسیدنیتریک در سطح بالاتری حفظ می‌شود. شوری موجب کاهش پتانسیل آب بستر کشت می‌شود، میزان جذب آب توسط ریشه‌های انگور را تحت‌تأثیر قرار می‌دهد و درنهایت موجب کاهش محتوای نسبی آب می‌شود. یکی از نقش‌های احتمالی اکسیدنیتریک، القای بسته‌شدن روزنه‌هاست که با کنترل آبسیزیک‌اسید انجام می‌شود (Neill et al., 2003)؛ بسته‌شدن روزنه‌هاباعث حفظ محتوای آب بیشتر در شرایط تنش شوری می‌شود.
نشت یونی: نتایج نشان دادند (شکل 1، ب) میزان نشت یونی برگ با افزایش غلظت نمک در هر دو سطح اکسیدنیتریک افزایش می‌یابد و بیشترین میزان نشت یونی برگ (80/53 درصد) در تیمار صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم و کمترین میزان نشت یونی برگ (25/17 درصد) در تیمار 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم مشاهده می‌شود. پژوهش‌ها نشان می‌دهند در بوته‌های توت‌فرنگی (Turhan and Eris, 2004) و انگور (Ahmed et al., 2015; Bybordi, 2012) نیز نشت یونی با افزایش شوری افزایش می‌یابد. افزایش نشت یونی طی تنش شوری از تنش اکسایشی ناشی و به ایجاد تغییرات در نفوذپذیری انتخابی غشاهای زیستی، نشت مواد از غشا و تغییر فعالیت آنزیم‌های متصل به غشا منجر می‌شود؛ بنابراین، اندازه‌گیری نشت یونی شاخصی از اندازه‌گیری میزان آسیب اکسایشی واردشده به غشا و سلول است (Campos et al., 2003; Karimi, 2017). شکل 1، ب نشان می‌دهد با افزایش غلظت نمک در هر دو سطح اکسیدنیتریک، میزان نشت یونی برگ افزایش می‌یابد. بیشترین میزان نشت یونی برگ در تیمار صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم و کمترین میزان نشت یونی برگ در تیمار 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم مشاهده شد (شکل 1، ب). هم‌راستا با مطالعۀ حاضر، پژوهش‌ها نشان می‌دهند کاربرد سدیمنیتروپروساید (دهندۀ اکسیدنیتریک) به کاهش نشت یونی برگ در گیاه جو (Li et al., 2008) و خردل (Khan et al., 2012) طی تنش شوری منجر می‌شود. افزایش پایداری غشا و ممانعت از تنش اکسایشی ناشی از نمک بر غشا علت کاهش نشت یونی با مصرف اکسیدنیتریک است. ظرفیت گیاهان برای حذف رادیکال‌های آزاد اکسیژن یکی از سازوکارهای مهم گیاهان برای پایداری غشا، حفظ فعالیت فیزیولوژیکی آن و درنتیجه دوام در شرایط شوری است (Khan et al., 2012).
شکل 1- اثر غلظت‌های مختلف (صفر و 100 میکرومولار) اکسیدنیتریک بر محتوای نسبی آب (الف) و نشت یونی (ب) برگ انگور بی‌دانۀ سفید در شرایط تنش شوری (1S. کلریدسدیم صفر میلی‌مولار، 2S. کلریدسدیم 25 میلی‌مولار، 3S. کلریدسدیم 50 میلی‌مولار، 4S. کلریدسدیم 100 میلی‌مولار). میانگین‌های دارای حرف‌های مشترک در هر نمودار اختلاف معناداری (در سطح 5 دصد) باهم ندارند.
.اثر شوری و اکسیدنیتریک بر میزان برخی از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی.
کاتالاز:نتایج مقایسۀ میانگین‌ها (جدول 3) نشان دادند در سطح صفر میکرومولار اکسید نیتریک، میزان فعالیت آنزیم کاتالاز برگ با افزایش غلظت نمک تا 50 میلی‌مولار کلریدسدیم افزایش می‌یابد و در غلظت 100 میلی‌مولار کلریدسدیم کاهش نشان می‌دهد. در سطح 100 میکرومولار اکسیدنیتریک مشاهده شد میزان فعالیت آنزیم کاتالاز با افزایش غلظت نمک افزایش می‌یابد. بیشترین (36/8 واحد در میلیگرم پروتئین) و کمترین (12/2 واحد در میلیگرم پروتئین) میزان فعالیت آنزیم کاتالاز به‌ترتیب در تیمارهای 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم و تیمار شاهد (صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم) مشاهده شد.
گایاکول‌پراکسیداز: نتایج نشان دادند (جدول 3) میزان فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز برگ با افزایش غلظت نمک در هر دو سطح اکسیدنیتریک افزایش می‌یابد و بیشترین (23/15 واحد در میلیگرم پروتئین) و کمترین (31/4 واحد در میلیگرم پروتئین) میزان فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز به‌ترتیب در تیمارهای 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم و تیمار شاهد (صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم) مشاهده می‌شود. این واکنش، پاسخ انطباقی و تنظیم محافظتی گیاه را در برابر تنش شوری نشان می‌دهد. فعالیت اندک آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان نشان‌دهندۀ شرایط طبیعی محیط برای رشد گیاه است؛ بنابراین افزایش آنها در این جهت است که به‌شکل اسمولیت سازگاری و آنزیم ضدرادیکال‌های آزاد اکسیژن، ضمن محافظت از ماکرومولکول‌ها و غشاهای سلول، آسیب‌های ناشی از رادیکال‌های آزاد اکسیژن را که در اثر ازدیاد یون سدیم به وجود آمده‌اند خنثی کنند (Gupta and Huang, 2014). افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، سازوکار حفاظت‌کنندۀ دستگاه فتوسنتزی در رویارویی با تنش اکسایشی است (Bornman et al., 1997)..
آسکوربات‌پراکسیداز: نتایج مقایسۀ میانگین‌ها (جدول 3) نشان دادند در سطح صفر میکرومولار اکسیدنیتریک، میزان فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز برگ با افزایش غلظت نمک تا سطح 50 میلی‌مولار کلریدسدیم افزایش و در سطح 100 میلی‌مولار کلریدسدیم کاهش می‌یابد. همنین مشاهده شد در سطح 100 میکرومولار اکسیدنیتریک، میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز برگ با افزایش غلظت نمک افزایش می‌یابد. بیشترین میزان فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز برگ (37/18 واحد در میلیگرم پروتئین) در تیمارهای 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم و 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 50 میلی‌مولار کلریدسدیم و کمترین میزان فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز برگ (39/5 واحد در میلیگرم پروتئین) در تیمار شاهد (صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم) مشاهده شد. درحقیقت، روند تغییرات آسکوربات‌پراکسیداز با تیمارهای شوری و اکسیدنیتریک بسیار شبیه کاتالاز است؛ زیرا این ترکیب همانند کاتالاز یکی از آنتی‌اکسیدان‌های اصلی و مهم گیاهی محسوب می‌شود. این ترکیب نقش سیســتم جاروب‌کنندۀ رادیکال‌های آزاد را دارد و سلول‌های گیاهی آن را در شرایط تنش برای حفاظـت در برابر آســیب‌هــای اکســیداتیو تولید می‌کنند.
نتایج پژوهش حاضر نشان دادند اکسیدنیتریک فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، گایاکول‌پراکسیداز و آسکوربات‌پراکسیداز را در انگورهای در معرض تنش شوری بهطور چشمگیری افزایش می‌دهد. در پژوهش Uchida و همکاران (2002) کاربرد اکسیدنیتریک در دانهال‌های برنج در معرض تنش شوری به افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی منجر شد و این افزایش با کاهش تولید نشانگرهای تخریب غشا ازجمله تولید مالون‌دآلدئید، پراکسیداکسیژن و درنهایت نشت یونی کمتر همراه بود؛ یافته‌های یادشده با نتایج مطالعۀ حاضر همخوانی دارند. تغییرات متابولیکی ایجادشده در اثر اکسیدنیتریک به تغییر سطوح رادیکال‌های آزاد اکسیژن منجر می‌شود و این تغییرات زمینه‌ساز القای سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی است (Tanou et al., 2009). به نظر می‌رسد اکسیدنیتریک و گونه‌های واکنش‌پذیر اکسیژن به‌ویژه پراکسیدهیدروژن در سیستم پیام‌رسانی سلولی دخالت دارند و به‌شکل پیام‌رسان ثانویه باعث القای دفاع آنتی‌اکسیدانی در شرایط تنش می‌شوند (Zheng et al., 2009).
پژوهش‌ها نشان می‌دهند کاربرد خارجی اکسیدنیتریک در جو (Li et al., 2008) و برنج (Uchida et al., 2002) باعث کاهش تولید پراکسیداکسیژن می‌شود که با نتایج مطالعۀ حاضر مطابقت دارد. تجمع گونه‌های واکنش‌پذیر اکسیژن در غشا‌ها و ایجاد پراکسیداسیون لیپیدهای غشا یکی از آثار سوء تنش شوری است و همان‌طور که در نتایج مطالعۀ حاضر مشخص شد میزان پراکسیدهیدروژن در بوته‌های انگور در معرض تنش شوری افزایش می‌یابد. در مطالعۀ Abdelgawad و همکاران (2016) اعمال تیمار شوری از صفر تا 140 میلی‌مولار کلریدسدیم ضمن ایجاد تنش اکسایشی در دانهال‌های ذرت به افزایش تدریجی غلظت پراکسیدهیدروژن در برگ گیاهان در معرض تنش منجر شد. فعال‌سازی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان ازجمله پراکسیداز، کاتالاز و آسکوربات‌پراکسیداز یکی از نقش‌های مهم اکسیدنیتریک است (Uchida et al.,2002) که در مطالعۀ حاضر اثبات شد. یافته‌ها نشان می‌دهند تجمع سدیم در بافت‌های گیاهان در معرض تنش شوری به افزایش شاخص‌های تنش اکسایشی ازجمله نشت یونی، پراکسیداسیون لیپیدهای غشا و تولید گونه‌های واکنش‌پذیر اکسیژن منجر می‌شود (Abdelgawad et al., 2016) که با نتایج مطالعۀ حاضر همخوانی دارد.
جدول 3- مقایسۀ میانگین اثر ترکیبی تیمارهای شوری و اکسیدنیتریک بر میزان برخی از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی برگ انگور بی‌دانۀ سفید
|
آسکوربات پراکسیداز |
گایاکول‌پراکسیداز |
کاتالاز |
شوری |
اکسیدنیتریک Nitric oxide |
|
واحد در میلیگرم پروتئین |
||||
|
f39/5 |
g31/4 |
f12/2 |
0 |
0 |
|
de67/9 |
e96/8 |
e18/3 |
25 |
0 |
|
c02/12 |
d57/11 |
d07/4 |
50 |
0 |
|
d51/10 |
c45/12 |
e20/3 |
100 |
0 |
|
e67/8 |
f72/6 |
d86/3 |
0 |
100 |
|
b90/15 |
e74/8 |
c90/5 |
25 |
100 |
|
a37/18 |
b07/14 |
b59/7 |
50 |
100 |
|
a73/18 |
a23/15 |
a36/8 |
100 |
100 |
* حرف‌های یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال P
محتوای عناصر غذایی در برگ: نتایج مقایسۀ میانگین‌ها (جدول 4) نشان دادند با افزایش غلظت نمک در هر دو سطح اکسیدنیتریک، میزان نیترات برگ کاهش می‌یابد. بیشترین میزان نیترات برگ (069/0 میلیگرمبرگرم وزن خشک) در تیمار 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 25 میلی‌مولار کلریدسدیم مشاهده شد (اختلاف معناداری با غلظت 50 میلی‌مولار کلریدسدیم نداشت) و کمترین میزان نیترات (036/0 میلیگرمبرگرم وزن خشک) در تیمار صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم دیده شد. نتایج نشان دادند شوری موجب کاهش غلظت نیترات برگ انگور بی‌دانۀ سفید می‌شود و کمترین غلظت نیترات (036/0 و 045/0 درصد به‌ترتیب برای صفر و 100 میکرومولار اکسیدنیتریک) به شوری 100 میلی‌مولار کلریدسدیم مربوط است (جدول 4). علت این امر به رقابت یون کلر با نیترات موجود در محلول خاک برای جذب توسط ریشۀ گیاه نسبت داده می‌شود؛ به‌این‌ترتیب که با افزایش شوری و غلظت یون کلر، گیاه برای جذب نیترات با مشکل روبه‌رو می‌شود و قادر نیست این یون را به میزان کافی و بهینه از خاک جذب کند. گسترش ریشه‌ها نیز با افزایش شوری کاهش می‌یابد و بنابراین، از میزان جذب آب و به‌تبع آن، جذب عناصر غذایی به‌ویژه عناصر پرمصرف به‌شدت کاسته می‌شود (Grattana and Grieve, 1999). در تاک‌های تیمارشده با غلظت‌های مختلف کلریدسدیم، غلظت نیترات برگ روند کاهشی نشان داد؛ ولی با کاربرد اکسیدنیتریک، غلظت این یون تا تیمار 50 میلی‌مولار کلریدسدیم افزایش و سپس در غلظت 100 میلی‌مولار کلریدسدیم کاهش یافت و به حد غلظت نیترات برگ در تاک‌های تیمارشده با اکسیدنیتریک بدون تنش شوری رسید.
جدول 4- مقایسۀ میانگین اثر ترکیبی تیمارهای شوری و اکسیدنیتریک بر غلظت عناصر غذایی برگ انگور بی‌دانۀ سفید
|
اکسیدنیتریک |
شوری |
نیترات |
کلسیم |
منیزیم |
پتاسیم |
سدیم |
کلر |
|
(میلیگرم بر گرم وزن خشک) |
|||||||
|
0 |
0 |
c050/0 |
a840/1 |
a943/1 |
a102/2 |
e540/0 |
g140/1 |
|
0 |
25 |
c048/0 |
c550/1 |
d473/1 |
c813/1 |
d636/0 |
e343/1 |
|
0 |
50 |
c047/0 |
d353/1 |
f156/1 |
e543/1 |
c713/0 |
b613/1 |
|
0 |
100 |
g036/0 |
e966/0 |
g970/0 |
f306/1 |
a910/0 |
a902/1 |
|
100 |
0 |
b066/0 |
a856/1 |
b870/1 |
a045/2 |
f383/0 |
g145/1 |
|
100 |
25 |
a072/0 |
b743/1 |
c810/1 |
b920/1 |
e466/0 |
f220/1 |
|
100 |
50 |
a069/0 |
c503/1 |
d426/1 |
d670/1 |
cd606/0 |
d470/1 |
|
100 |
100 |
b065/0 |
d376/1 |
e360/1 |
e510/1 |
b760/0 |
c543/1 |
* حرف‌های یکسان عدم اختلاف معنادار در سطح احتمال P
نتایج نشان دادند (جدول 4) میزان کلسیم برگ با افزایش غلظت نمک در هر دو سطح اکسیدنیتریک کاهش می‌یابد. بیشترین میزان کلسیم برگ (8/1 میلیگرمبرگرم وزن خشک) در تیمارهای صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم و 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم و کمترین میزان کلسیم برگ (966/0 میلیگرمبرگرم وزن خشک) در تیمار صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم مشاهده شد (جدول 4). در توت‌فرنگی نیز غلظت کلسیم اندام هوایی با افزایش شوری کاهش می‌یابد (Turhan and Eris, 2004). کمترین غلظت کلسیم موجود در برگ (96/0 درصد) به شوری 100 میلی‌مولار و اکسیدنیتریک صفر میکرومولار مربوط بود؛ این در حالیست که در همین سطح شوری و تیمار 100 میکرومولار اکسیدنیتریک، غلظت کلسیم برابر 32/1 درصد بود و افزایش 27 درصدی داشت.
نتایج (جدول 4) نشان دادند روند تغییرات غلظت منیزیم در پاسخ به اکسیدنیتریک بسیار شبیه کلسیم است؛ به‌این‌ترتیب که با افزایش سطح شوری از صفر به 100 میلی‌مولار- هم در بوته‌های تیمارشده با اکسیدنیتریک 100 میکرومولار و هم در بوته‌های تیمارنشده با این تنظیم‌کنندۀ رشد- غلظت منیزیم برگ روند کاهشی نشان می‌دهد؛ با این تفاوت که در بوته‌هایی که تیمار اکسیدنیتریک 100 میکرومولار را دریافت کرده بودند، غلظت این عنصر در سطح بالاتری بود (جدول 4). بیشترین (94/1 میلیگرمبرگرم وزن خشک) و کمترین (970/0 میلیگرمبرگرم وزن خشک) میزان منیزیم به‌ترتیب در تیمارهای صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم و صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم مشاهده شد. در شوری‌های زیاد به‌ویژه غلظت زیاد یون سدیم و متعادل‌نبودن غلظت عناصر در خاک، جایگاه‌های اتصال به‌علت تشابه حامل‌های جذب منیزیم و سدیم در ریشه عمدتاً توسط سدیم اشغال می‌شوند و درنتیجه، منیزیم کمتری به داخل سلول‌های ریشه انتقال می‌یابد (Yildirim et al., 2009). این موضوع ممکن است با افزایش توان تحمل گیاهان تیمارشده با اکسیدنیتریک در شرایط تنش شوری نیز مرتبط باشد که ضمن افزایش پتانسیل اسمزی بافت‌های گیاه از طریق تجمع بیشتر محلول‌های سازگاری در این شرایط تا حدی به بهبود جذب آب و عناصر غذایی ازجمله نیترات، منیزیم و دیگر عناصر منجر می‌شود (Cakmak, 2005;Gupta and Huang, 2014).
نتایج مقایسۀ میانگین‌ها (جدول 4) نشان دادند میزان پتاسیم برگ با افزایش غلظت نمک در هر دو سطح اکسیدنیتریک کاهش می‌یابد. بیشترین میزان پتاسیم برگ (1/2 میلیگرمبرگرم وزن خشک) در تیمارهای صفر و 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم و کمترین میزان پتاسیم برگ (3/1 میلیگرمبرگرم وزن خشک) در تیمارهای صفر و 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم مشاهده شد. غلظت پتاسیم برگ طی تنش شوری روند کاهشی داشت و با افزایش غلظت کلریدسدیم تا 100 میلی‌مولار به حداقل رسید (جدول 4). محتوای یون پتاسیم در بافت‌های گیاهی بیان‌کنندۀ وجود کاتیون مهمی است که یکی از اجزای مهم تنظیم اسمزی سلول‌ها و حفظ آماس سلولی به شمار می‌رود (Mengel, 2007). پتاسیم یکی از مهم‌ترین عناصری است که در تعادل آنیون و کاتیون درون سلول نقش دارد؛ همچنین این عنصر اثر معناداری بر جذب سایر عناصر توسط ریشه دارد و به رفع آثار سوء بی‌تعادلی برخی عناصر غذایی در خاک کمک می‌کند (Karimi, 2017).
نتایج مقایسۀ میانگین‌ها (جدول 4) نشان دادند میزان سدیم برگ با افزایش غلظت نمک در هر دو سطح اکسیدنیتریک افزایش می‌یابد؛ هرچند تفاوت معناداری بین سطوح پایین نمک ازنظر میزان سدیم برگ مشاهده نمی‌شود. بیشترین میزان سدیم برگ (91/0 میلیگرمبرگرم وزن خشک) در تیمار صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم و کمترین میزان سدیم برگ (383/0 میلیگرمبرگرم وزن خشک) در تیمارهای 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر و 25 میلی‌مولار کلریدسدیم مشاهده شد. همان‌طور که انتظار می‌رود با افزایش سطح شوری از صفر به 100 میلی‌مولار کلریدسدیم، غلظت سدیم برگ روند افزایشی نشان می‌دهد و در غلظت 100 میلی‌مولار کلریدسدیم به حداکثر می‌رسد (جدول 4). محتمل است اکسیدنیتریک با تأثیر بر جذب یون پتاسیم، جذب سدیم را کاهش دهد؛ بنابراین، کاربرد اکسید نیتریک تا حدی می‌تواند از غلظت زیاد و سمیت یون سدیم بکاهد. بهبود وضعیت جذب عناصر ماکرو و کاهش جذب سدیم در اثر کاربرد اکسیدنیتریک در کاهو نیز مشاهده شده است (Garcı́a López-Carrión et al., 2008) که با نتایج پژوهش حاضر همخوانی دارد.
نتایج مقایسۀ میانگین‌ها (جدول 4) نشان دادند با افزایش غلظت نمک در هر دو سطح اکسیدنیتریک، میزان کلر برگ افزایش می‌یابد. بیشترین میزان کلر (90/1 میلیگرمبرگرم وزن خشک) در تیمار صفر میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با 100 میلی‌مولار کلریدسدیم و کمترین میزان کلر (14/1 میلیگرمبرگرم وزن خشک) در تیمارهای صفر و 100 میکرومولار اکسیدنیتریک همراه با صفر میلی‌مولار کلریدسدیم مشاهده شد.
نتیجه‌گیری کلی
بر اساس نتایج، اکسیدنیتریک میزان تحمل بوته‌های انگور در معرض تنش شوری را با تأثیر بر محلول‌های سازگاری، آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، میزان پتاسیم و منیزیم افزایش می‌دهد؛ درنتیجه، سطح 100 میکرومولار اکسیدنیتریک برای افزایش تحمل به تنش شوری (100 میلی‌مولار کلریدسدیم) انگور رقم بی‌دانۀ سفید پیشنهاد می‌شود.
)
