اثر دور آبیاری و محلولپاشی کیتوزان بر برخی خصوصیات فیزیولوژیکی و میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدانی پنیرک معمولی (Malva sylvestris)

پنیرک معمولی (Malva sylyestris L.) گیاهی بوته‌ای از خانوادة پنیرک (Malvaceae) است که ارتفاع آن متفاوت و بین 5/00 تا 1 متر است که به شرایط محل رویش بستگی دارد. این گیاه، ریشه‌ای کم‌و‌بیش منشعب، مخروطی‌شکل و راست با ضخامت 150 تا 250 سانتی‌متر دارد (Omidbaigi, 2006; Paul, 2016). بین تنش‌ها، خشکی یکی از مهم‌ترین عوامل کاهندة رشد و عملکـرد گیاهـان دارویی و زراعی است؛ به ‌طوری‌ که بر ۴۰ تا ۶۰ درصد زمین‌های کشاورزی جهان اثر می‌گذارد (Sankar et al., 2007; Mazaraie et al., 2017). وقتی پتانسـیل آب خـاک کاهش می‌یابد، گیاهان برای حفظ قدرت جذب آب بایـد پتانسـیل آب درونی را به‌اندازه‌ای کاهش دهند تا به یک شیب مطلوب برسـد. بـرای ایجاد جریان آب از خاک به داخل ریشه‌ها مهم‌ترین سازوکار، تنظیم اسمزی است که بـا هـدف حفـظ تورژسـانس سـلولی، تـداوم جـذب از محـیط ریشـه و پایـداری غشـاها انجام می‌شود (Ma et al., 2006).

مواد تنظیم‌کنندة فشار اسمزی، بیشتر شامل یون‌های غیرآلی (مانند پتاسیم، کلسیم و کلر) و ترکیبات آلی بدون بار (مانند آمینواسیدها، کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها و هورمون‌ها) هستند. پرولین یکی از آمینواسیدهای فعـال در پدیدة تنظیم اسمزی است که در ایجـاد و حفـظ فشـار اسمزی درون گیاه نقش بسـزایی دارد (Martin et al., 1993).

تجمع پرولین آزاد، پاسـخی متـداول بـه تـنش در گیاهـان عـالی است (Vendruscolo et al., 2007). گزارش‌های متعددی مبنی بر وجـود همبسـتگی مثبـت بین تجمع پرولین و سازش به شرایط تنش اسمزی در تـنش‌هـای خشکی و شوری گیاهان وجود دارند (Bohenert and Shen, 1999; Mishra and Dubey, 2006). پرولین در شرایط تنش علاوه‌بر حفظ تعادل اسمزی گیاه؛ نوعی پایدارکنندة پروتئین‌ها، کلات‌کنندة فلزی، مهارکنندة پراکسیداسیون لیپیدی و حذف‌کنندة رادیکال‌های آزاد است (Mishra and Dubey, 2006). در ماریتیغال، لوبیا و سویا با کاهش پتانسـیل آب، افـزایش معنی‌داری در میزان پرولین مشاهده شد (Lazcano-ferrat and Lovatt, 1999; Mazaraie et al., 2017).

یکی از پیامدهای بیوشیمیایی تنش خشکی در گیاهان، تجمع گونه‌های فعال اکسیژن است که محصول اجتناب‌ناپذیر متابولیسم طبیعی سلول است. کلروپلاست و میتوکندری سلول‌های گیاهی از مهم‌ترین اندامک‌های تولید‌کنندة گونه‌های فعال اکسیژن هستند (Naderi et al., 2015). الکترون‌های نشت‌شده از زنجیرة انتقال الکترون ممکن است با اکسیژن مولکولی به‌دست‌آمده از متابولیسم طبیعی گیاه ترکیب شوند و گونه‌های فعال اکسیژن مانند سوپر اکسید، هیدروژن پراکسید و رادیکال‌ هیدروکسیل تولید کنند. این گونه‌های اکسیژن، سمی و بسیار واکنش‌پذیرند و در نبود سازوکارهای حفاظتی متابولیسم طبیعی سلول را به‌میزان زیادی مختل می‌کنند (Sharma and Dubey, 2005). این رادیکال‌ها با پراکسیداسیون لیپیدها و درنتیجه تخریب غشا، تخریب پروتئین‌ها (Moran et al., 1994)، غیرفعال‌کردن آنزیم‌ها، از بین بردن رنگیزه‌های فتوسنتزی و اختلال در عملکرد DNA تنش ثانویة اکسیداتیو ایجاد می‌کند که خسارت‌های جدی به ساختار‌های سلولی و گیاه وارد می‌کند. گیاهان در مقابله با تنش خشکی، سازوکارهای حفاظتی متفاوتی مانند سازوکارهای آنزیمی و غیرآنزیمی دربرابر تنش اکسیداتیو ناشی از خشکی دارند (Tian and Li, 2006).

آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی شامل بتاکاروتن، آسـکوربیک اسید، آلفا توکـوفرول، گلوتاتیون و آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمـی شـامل سوپراکسـید دیسـموتاز، گایـــاکول پراکســـیداز، آســـکوربات پراکســـیداز و کاتالاز هستند (Xu et al., 2006).گیاهان با افزایش فعالیت آنـزیم‌هـای آنتی‌اکسیدانی مانند کاتـالاز، سوپراکسـید دیسـموتاز، آسکوربات پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز یا تولید بیشتر این آنزیم‌هـا اکسـیژن‌هـای فعـال را خنثی مـی‌کننـد (Zhili et al., 2012). توازن بین تولید گونه‌های اکسیژن فعال و حذف آنها در شرایط تنش با آنتی‌اکسیدان‌ها انجام می‌شود (Harinasut et al., 2003). توانایی سیستم آنتی‌اکسیدانی ممکن است از آسیب ناشی از تنش جلوگیری کند که این مسئله به مقاومت گیاهان به تنش مربوط می‌شود (Malekpoor et al., 2015).

در حال ‌حاضر، برای سیسـتم‌های کشاورزی پیشرفته، استفاده از مواد فعال زیستی و سازگار با محـیط بـرای حفظ گیاهان و همچنین افزایش رشد ضـرورت دارد. یکی از این روش‌ها کـه به‌تازگی توجه پژوهشگران به آن معطوف شده است استفاده از پلیمر زیستی کیتـوزان است. این ماده با داشتن ویژگی‌های زیستی و فیزیولوژیک منحصر‌به‌فرد، کاربردهای متعددی در صنایع متفاوت دارویی، پزشکی و کشاورزی دارد (Bautista-Baños et al., 2006).

کیتوزان‌ها پلیمرهای آلـی زیستی، غیرسمی، طبیعی و تجزیه‌پذیر هستند که در شرایط صنعتی از استیل‌زدایی (حذف گروه عاملی استیل با فرمول شیمیایی COCH₃) جزئی کیتین به‌دست‌آمده از پوستة خارجی سخت‌پوسـتانی مانند میگـو و خرچنـگ دریـایی در محیط قلیایی تولید می‌شوند (Rinaudo, 2006). گزارش شده است کیتوزان‌ها به‌دلیل تأثیر بر بیـان ژن‌هـای گیـاهی قادرند بـه برخـی عوامـل نامسـاعد محیطی، مقاومت ایجاد کنند (Demirevska et al., 2009). برای ایـن گـروه از مـواد ویژگی‌های ضد قارچی، ضد باکتریایی، ضد ویروسـی، اصـلاح و تقویـت خاک، بهبود رشد و عملکرد، افـزایش مقـدار متابولیـت‌هـای ثانویـه و فعال‌کردن سازوکارهای دفاعی در گیاهـان گـزارش شـده‌اند (Waseem et al., 2010).

نتایج بررسی‌ها نشان می‌دهند کیتوزان‌ها به‌طور چشمگیری پایداری غشا‌های سلولی را افزایش می‌دهند (Yang et al., 2009) و به‌دلیل افزایش هدایت روزنه‌ای و کاهش مقدار تعرق، افزایش مقدار فتوسنتز را موجب می‌شوند و بر ارتفاع گیاه، طول ریشه‌ها و مقدار زیست‌توده تأثیر می‌گذارند (Boonlertinirun et al., 2008). در آزمایشی محلول‌پاشی با ترکیبات کیتوزانی کاهش مقـدار تولید مالون‌دی‌آلدهید را در سلول‌های گیاهی باعث شد کـه شاخص کـاهش مقدار خسارت در شرایط تنش خشـکی به شمار می‌رود (Abdalla, 2011). افـزایش کارایی مصرف آب (Boonlertinirun et al., 2008)، کاهش صدمة ناشی از تنش خشـکی (Morello et al., 2005)، افزایش مدت مانـدگاری میـوه‌هـا (Iriti and Faoro, 2009) و گل‌ها (Uthairatanakij et al., 2007) و تغییـر فعالیـت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی (Zhili et al., 2012) با مصرف ترکیبـات کیتـوزانی گـزارش شده‌اند. تیمار گیاهان برنج با کیتوزان قبل از تنش خشکی، خسارت تنش خشکی را در این گیاه کاهش داده است. این تأثیر به بسته‌شدن روزنه‌های گیاه به‌دلیل تولید متابولیت‌های ثانویه در برنج و به‌دنبال آن کاهش تعرق نسبت داده شده است (Boonlertnirun et al., 2011). با توجه ‌به روند رو ‌به ‌افزایش کم‌آبی و وقوع خشک‌سالی‌های مداوم در سال‌های گذشته و نقش کیتوزان در کاهش آثار منفی تنش در گیاهان و همچنین اهمیت پنیرک معمولی به‌دلیل داشتن مواد موسیلاژی خلط‌آور و نرم‌کنندة سینه و مجاری تنفسی و فواید آن در درمان التهاب غشاهای مخاطی و برونشیت(Paul, 2016)، پژوهش حاضر برای بررسی اثر تنش خشکی و محلول‌پاشی کیتوزان بر برخی ویژگی‌های فیزیولوژیک و میزان فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی گیاه دارویی پنیرک معمولی انجام شد.

مواد و روش‌ها

بـرای بررسی اثر تنش خشکی و محلول‌پاشی کیتوزان بر برخی ویژگی‌های فیزیولوژیک و میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، آزمایشی به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح بلوک‌های کامل تصادفی در سه تکرار در سال ۱۳۹۴ در مزرعة تحقیقاتی دانشکدة کشاورزی زابل واقع در سد سیستان اجرا شد. قبل از کاشت از خاک مزرعه نمونه‌برداری شد (جدول 1).

جدول 1- تجزیة بستر خاکی استفاده‌شده در کشت پنیرک معمولی

تیمارها شامل دور آبیاری (آبیاری با دور 7 روز (شاهد)، آبیاری با دور 11 روز و آبیاری با دور 15 روز) و محلول‌پاشی کیتوزان در سه غلظت (کنترل (بدون محلول‌پاشی)، 5/۰ و ۱ میلی‌گرم در لیتر) بودند. پس از آماده‌کردن کرت‌های آزمایشی با طول 5/3 و عرض 5/2 متر با فاصلة ردیف کاشت ۵۰ سانتی‌متر و فاصلة بوتة روی ردیف ۳۰ سانتی‌متر، بذرکاری در تاریخ 10 اسفند انجام شد. نخستین آبیاری برای همة تیمارها بلافاصله پس ازکاشت انجام شد. پس از استقرار کامل بوته‌ها تیمار‌های تنش خشکی اعمال شد. برای اعمال تیمار‌های تنش و بدون تنشاز دور آبیاری استفاده شد. محلول‌پاشی کیتوزان در دو مرحله در فصل رشد گیاه (نخستین و دومین محلول‌پاشی با کیتوزان به‌ترتیب در روز 63 و 70) انجام شد. محلول‌پاشی در ساعت ۸ صبح در هوای ملایم و با سم‌پاش دستی اعمال شد؛ به ‌طوری ‌که برگ‌های گیاه، کاملاً خیس و برای بهبود جذب برگی کیتوزان از تریتون X 100 با غلظت ۰۱/0 درصد استفاده شد. در زمان برداشت نمونه‌ها، پس از حذف اثر حاشیه از هر کرت، سه گیاه به‌طور تصادفی برداشت و برای اندازه‌گیری صفات فیزیولوژیک و میزان فعالیت آنتی‌کسیدانی استفاده شدند.

انـدازه‌گیـری میـزان پـرولین: بدیـن‌منظـور، مقـدار 1/0 گـرم بافـت برگـی نگهداری‌شده در فریزر در 10 میلی‌لیتر سولفوسالیسـیلیک اسـید 3/3 درصد ساییده و محلول به‌دست‌آمده از کاغذ صـافی عبـور داده شـد و بـا سرعت 4000 دور در دقیقه در دمای چهار درجة سانتی‌گراد به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ (مدل 5810r، شرکت Eppendorf، آلمان) شد. در لوله‌ای جداگانه به دو میلی‌لیتر از عصاره، دو میلی‌لیتر معرف نین هیدرین (25/1 گرم پودر نین هیدرین اسید در 30 میلی‌لیتر استیک اسید گلاسیال حل شد و 20 میلی‌لیتر فسفریک اسید شش مولار بـه آن اضـافه شد) و دو میلی‌لیتر استیک اسید گلاسیال خالص اضافه شد. لوله‌ها به‌مـدت یک ساعت در بن‌مـاری قـرار گرفتـند و پـس از اضـافه‌کـردن چهـار میلی‌لیتر تولوئن به هرکدام از لوله‌ها، به‌مدت 15 تا 20 ثانیه ورتکس شدند. بخش بالایی رنگی، با دقت جدا و جذب آن در دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل UV/Vis -2100، شرکت Unico، آمریکا) با طول‌موج 520 نـانومتر انـدازه‌گیـری شد. میزان پرولین با نمودار اسـتاندارد و برحسـب میلی‌گـرم بـر گـرم وزن تر محاسـبه شـد (Bates et al., 1973).

محتوای نسبی آب برگ: با روش Levitt (1980) اندازه‌گیری شد. برای اندازه‌گیری محتوای نسـبی آب برگ از هر گلدان پنج عدد دیسک برگی با قطر یک سانتی‌متر تهیـه شد. دیسک‌های برگی پس از تـوزین، در لولـه‌هـای آزمایش محتوی آب مقطر قرار داده شدند. درب لوله‌هـای آزمایش بـا فویـل پوشیده شد و لوله‌ها به‌مدت 24 ساعت در دمای چهار درجة سانتی‌گراد قرارداده شدند تا به بیشترین وزن اشباع خود برسند؛ سپس با ترازوی دقیق (مدل AND GF300، ژاپن)، وزن آماس نمونه‌ها محاسبه شد. دیسک‌ها در آونی (مدل uf30، شرکت MEMMERT، آلمان) با دمای 70 درجـة سانتی‌گراد و به‌مدت 24 ساعت خشک شدند. وزن خشک دیسک هـا بـا ترازویی با دقت 0001/0 به دسـت آمـد. محتـوای نسـبی آب بـرگ درنهایت از رابطة 1 محاسبه شد.

رابطة 1     RWC= (LWF-LWD)/(LWT-LWD)

در رابطة 1؛ RWC، محتوای نسبی آب برگ؛ LWF، وزن تر؛ LWT، وزن آماس و LWD وزن خشک برگ‌ها است.

محتوای کلروفیل a برگ: با روش Prochazka و همکاران (1998) و از رابطة 2 محاسبه شد.

رابطة 2                   Chl a= 12.25A₆₆₃-2.79A₆₄₆

در رابطة 2؛ Chl a، مقدار کلروفیل a؛ A₆₆₃، جذب در طول‌موج 663 نانومتر و A₆₄₆، جذب در طول‌موج 646 نانومتر است.

سنجش میزان فنل‌ها: مقدار فنل‌ها در نمونه‌های عصارة گیاهی با روش فولین - سیوکالتیو اندازه‌گیری شد (McDonald et al., 2001). در این روش در لولة آزمایش به 1/0 میلی‌لیتر عصارة اتانولی یا محلول اتانولی استاندارد گالیک اسید (غلظت 25 تا 300 میکروگرم و 5/0 میلی‌لیتر معرف فولین - سیوکالتیو رقیق شده با آب مقطر با نسبت ۱ به ۱۰)، 4/0 میلی‌لیتر کربنات سدیم 5/7 درصد اضافه و مخلوط شد. جذب آن با اسپکتروفتومتر در طول‌موج ۷۶۰ نانومتر خوانده شد. مقدار فنل کل عصاره با نمودار استاندارد براساس میلی‌گرم گالیک اسید در گرم عصاره محاسبه شد.

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی

برای تهیة عصارة آنزیمی، 5/0 گرم از نمونة برگی در هاون چینی کاملاً سرد و نیتروژن مایع هموژن شد و سپس به آن 5 میلی‌لیتر از بافر فسفات سرد با pH برابر با 5/7 محتوی EDTA 5/0 میلی‌مولار اضافه شد. نمونه‌ها پس از انتقال به لوله‌های آزمایش با سرعت 15000 دور در دقیقه و در دمای 4 درجة سانتی‌گراد به‌مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند (Sairam andSaxena, 2002).

آنزیم کاتالاز: برای اندازه‌گیری آنزیم کاتالاز، ۵۰ میکرولیتر عصارة آنزیمی، ۶۰۰ میکرولیتــر بافر ســدیم فســفات (7=pH)، ۱۵/۰ میکرولیتر EDTA و ۸۵/۵۴۹ میکرولیتر آب‌مقطر در تیوب ریخته و ۵/۳۸۲ میکرولیتـر آب‌اکسیژنه به آن اضافه شد (۵/۳۸۲ میکرولیتر آب‌اکسیژنه در 5/2 میلی‌لیتر آب‌مقطر ریخته شد که آب‌اکسیژنة 75/0 مولار به دست آید؛ سپس ۳۰ میکرولیتر در مخلوط واکنش ریخته شد تا آب‌اکسیژنة ۱۵ میلی‌مولار به دست آید)؛ سپس جذب آن با اسپکتروفتومتر در طـول‌مـوج ۲۴۰ نـانومتر ثبـت و پــس از یک دقیقه دوباره میزان جذب یادداشت شد (Beers and Sizer, 1952).

آنزیم آسکوربات پراکسیداز: برای اندازه‌گیری آنزیم آسکوربات‌ پراکسـیداز، ۵۰ میکرولیتـر عصارة آنزیمی، ۵/۳۷ میکرولیتر آسکوربات و ۸۵/۱۱۱۸ میکرولیتـر آب در تیوب ریخته شد و ۱۵۳ میکرولیتر آب‌اکسیژنه به آن اضـافه و سپس در دستگاه اسپکتروفتومتر با طول‌موج ۲۹۰ نانومتر میـزان جذب آن یادداشت و فعالیت آنزیمی برحسـب واحـد در گـرم وزن تر بیان شد (Nakano et al., 1981).

آنزیم گایـاکول پراکسـیداز: بـرای سـنجش فعالیـت آنـزیم گایـاکول پراکسـیداز، 50 میکرولیتر عصارة آنزیمی، 800 میکرولیتر بافر سـدیم، 2/0 میکرولیتـر EDTA، 50 میکرولیتر گایاکول و 8/799 میکرولیتر آب به لولة آزمـایش اضـافه شد و 765 میکرولیتر آب‌اکسیژنه به آن اضافه و بلافاصـله، جذب آن در طول‌مـوج 470 نـانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد (Urbanek et al., 1991).

آنزیم سوپراکسید دیسموتاز: فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز براساس روش Beauchamp و Fridovich (1971) اندازه‌گیری شد. بدین‌منظور، 50 میکرولیتر عصارة آنزیمی با 5/1 میلی‌لیتر مخلوط واکنش شامل بافر فسفات (50 میلی‌مولار با 8/7 pH=)، 800 میکرولیتر بافر سـدیم فسفات، 1/0 میلی‌مولار EDTA، نیتروبلوتترازولیوم 75 میلی مولار، ریبوفلاوین (2 میلی‌مولار) و متیونین (13 میلی‌مولار) به لولة آزمـایش اضـافه شدند و سپس جذب آن در طول‌موج 470 نـانومتر با دستگاه اسپکتوفتومتر خوانده شد.

آنزیم پراکسـیداز: فعالیت آنزیم پراکسیداز براساس روش Holy (1972) انجام شد. بدین‌منظور، ابتدا 2 میلی‌لیتر استات 2/0 مولار (5 pH=)، 2/0 میلی‌لیتر آب‌اکسیژنة 3/0 درصد و 1/0 میلی‌لیتر بنزیدین 20/0 مولار محلول در متانول 50 درصد در حمام یخ مخلوط شدند؛ سپس 1/0 میلی‌لیتر از عصارة آنزیمی برگ به این مخلوط واکنش اضافه و سپس میزان جذب آن در دستگاه اسپکتوفتومتر با طول‌مـوج 530 نـانومتر خوانده شد.

تحلیل آماری: پس از اندازه‌گیری ترکیبات فنلی کل، میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، مقدار پرولین و محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی، داده‌های به‌دست‌آمده برای تحلیل آماری نرمال شدند. در مرحلة اول، تجزیة واریانس داده‌ها (ANOVA) انجام شد؛ سپس داده‌های به‌دست‌آمده از تجزیة واریانس و میانگین‌ها با آزمون چنددامنه‌ای دانکن در سطح پنج درصد مقایسه شدند. بدین‌منظور، از نرم‌افزار SAS نسخة 1/9 استفاده شد. برای رسم شکل‌ها از نرم‌افزار Excel سال 2007 استفاده شد.

نتایج و بحث

مقدار کلروفیل a: براساس نتایج به‌دست‌آمده از تجزیة واریانس داده‌ها (جدول 2) تأثیر دور آبیاری، محلول‌پاشی کیتوزان و اثر متقابل آنها بر میزان کلروفیل a در سطح احتمال 1 درصد معنی‌دار شد. نتایج آثار متقابل نشان دادند محلول‌پاشی 1 میلی‌گرم در لیتر کیتوزان در دور آبیاری کامل (7 روز) افزایش 27 درصدی کلروفیل a را نسبت به شاهد سبب شد (شکل 1).

شکل 1- اثر متقابل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر میزان کلروفیل a پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

میزان کلروفیل در گیاهان زنده یکی از عوامل مهم حفظ ظرفیـت فتوسـنتزی اسـت. تنش خشکی، پیری زودرس و شکسته‌شدن کلروپلاست و کاهش میزان کلروفیل را در گیاهان باعث می‌شود (Jiang and Huang, 2001). در بررسی حاضر، بر اثر افزایش دور آبیاری، میزان کلروفیل a نسبت به شاهد حدود 60 درصد کمتر شد.

به نظر می‌رسد ایـن کـاهش بر اثر تنش خشکی، به‌علت افزایش تولید رادیکال‌های اکسیژن باشد که این رادیکال‌های آزاد پراکسیداسیون (Wise and Naylor, 1989) و درنتیجه، تجزیة این رنگیزه را باعث می‌شود (Schutz and Fangmeir, 2001). این مسئله ممکن است به‌دلیل افزایش فعالیـت کلروفیلاز هنگام تنش خشکی باشد (Boyer, 1987)؛ در حالی که Balaguer و همکاران (2002) معتقدند کاهش مقدار کلروفیل هنگام تنش کمبود آب ممکن است به‌دلیل تحریک آنزیم بیوسنتز پرولین یعنی گلوتامیل کیناز در تغییرات میزان نسبی آب کم باشد که با نتایج همبستگی منفی بین کلروفیل و پرولین در پژوهش حاضر هم‌خوانی دارد.

با افزایش تبدیل گلوتامات به پرولین در تنش خشکی، درواقع گلوتامات که پیش‌ساز کلروفیل نیز است از دسترس خارج و سنتز کلروفیل‌ها نقصان پیدا می‌کند. کاهش میزان کلروفیل در پنیرک معمولی بـا نتـایج به‌دست‌آمده از سیاه‌دانه (Ariafar and Sirousmehr, 2015)، کتان (Movahhedi Dehnavi et al., 2017)، رزماری (Sanchez-Blanco et al., 2006) و آویشن باغی (Askary et al., 2017) در تنش خشکی مطابقت دارد.

Agrawal و همکاران (2002) بیان کردند کیتوزان با فعال‌کردن تعدادی از آنزیم‌ها مانند فیتواکسـین‌هـا و کیتینازها، مقاومت گیاه را دربرابـر شـرایط نامسـاعد محیطـی و تنش‌ها افزایش می‌دهد. در پژوهشی که اثر کیتوزان را بر گیاه بادرنجبویه بررسی و گزارش کردند، میزان رنگیزه‌های کلروفیل و کاروتنوئید بر اثر کیتوزان افزایش یافت (Khajeh and Naderi, 2014). نتایج بررسی حاضر نشان دادند محلول‌پاشی با کیتوزان افزایش میزان کلروفیل را سبب شد که با نتایج Gornik و همکاران (2008) مطابقت دارد . آنها بیان کردند کاربرد کیتوزان کاهش اثر تنش خشکی را بر کلروفیل و افزایش رنگیزه‌های فتوسنتزی را باعث می‌شود. ازسویی نتایج آزمایش بر باقلا (Sheikha and AL-Malki, 2009)، ماریتیغال (Aghighi Shahverdi et al., 2017) و بادرنجبویه (Khajeh and Naderi, 2014) نشان دادند مصرف کیتوزان افزایش کلروفیل را در باقلا و بادرنجبویه باعث می‌شود که تأییدی بر نتایج بررسی حاضر است. همچنین نتایج پژوهش حاضر، در راستای نتایج به‌دست‌آمده از بررسی‌های Khan و همکاران (2002) و El-Tantawy (2009) هستند که با به کار بردن کیتوزان، افزایش چشمگیری در میزان کلروفیل سویا و گندم مشاهده کردند. با توجه به وجود عنصر نیتروژن در محرک کیتوزان و نقش ساختاری این عنصر در حلقه‌های تتراپیرولی کلروفیل، چنین افزایشی توجیه‌پذیر است. از سوی دیگر، مصرف کیتوزان احتمالاً با تأثیر بر ژن‌های مسئول سازندة کلروفیل، تولید آن را افزایش داده است (Emami bastegani et al., 2016; Malekpoor et al., 2015)؛ بنابراین کیتـوزان با افـزایش محتـوای کلروفیل و افزایش فتوسنتز و تأثیر بر بیان ژن در کلروپلاسـت، تغییراتی در اندازه و توسعة کلروپلاست برگ گیاهان را باعث می‌شود و این تغییرات ممکن است تحریک‌کنندة رشد گیاهان باشند (Limpanavech et al., 2008).

مقدار پرولین: با توجه به نتایج تجزیة واریانس داده‌ها اثر دور آبیاری‌های مختلف، محلول‌پاشی کیتـوزان و اثـر متقابل تنش خشکی و کیتوزان بر مقدار پرولین برگ در سطح 1 درصد معنی دار شد ( جدول 2). مقایسة میانگین آثار متقابل نشان داد با افزایش مقادیر آبیاری و غلظت محلول‌پاشی بر میزان پرولین افزوده شد؛ به طوری که محلول‌پاشی با غلظت 1 میلی‌گرم در لیتر کیتوزان در دور آبیاری 15 روز، میزان پرولین را نسبت به شاهد، 68 درصد افزایش داد (شکل 2).

شکل 2- اثر متقابل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر میزان پرولین پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

پرولین، مـاده‌ای محلـول است که تنظیم فشار اسمزی، کـاهش از دسـت دادن آب از سلول و نگهداری آماس را سبب می‌شود. یکی از خواص فیزیکـی پرولین، زیاد حلال‌بودن آن است. مولکول پرولین شامل قسمت‌هـای آب‌دوسـت و آب‌گریـز است. پـرولین محلول بر حلالیت پـروتئین‌هـای مختلـف اثر بگذارد و از غیرطبیعی‌شدن آلبومین جلوگیری کند. این ویژگی پرولین به این دلیل است که رابطة متقابـل بین پرولین و سطح پروتئین‌های آب‌گریز برقرار می‌شود و به‌علت افزایش سطح کل مولکول‌های پروتئین آب‌دوسـت، پایداری آن‌ها افزایش می‌یابد و از تغییر ماهیت آنها جلوگیری می‌شود. این سازوکار پرولین بر آنزیم‌ها نیز به‌دلیل ساختمان پروتئینی‌شان اثر می‌گذارد و از ساختار آنها محافظت می‌کند (Kuznetsov and Shevykova, 1999).

در پژوهش حاضر، افزایش 11/32 درصـدی پـرولین بر اثر دور آبیاری 15 روز، در تطابق با افزایش تولید پـرولین در گیاه ماریتیغال در مواجهه با تنش خشکی است (Mazaraie et al., 2017) که نتیجة تجزیة پروتئین‌ها و همچنین کاهش استفاده از آنها به‌دلیل کاهش رشد گیاه است (Movahhedi Dehnavi et al., 2011).

براساس نتایج بررسی حاضر، همبستگی مثبت و معنی‌داری بین میزان پرولین و محتوای نسبی آب برگ مشاهده شد (جدول 3) و براساس نتایج پژوهش Kaphi و همکاران (2010) پرولین، ماده‌ای محلول است که تنظیم فشار اسمزی، کاهش هدررفتن آب از سلول، حفظ آماس سلولی، جلوگیری از تجزیة پروتئین‌ها، افزایش پایداری برخی از آنزیم‌های سیتوپلاسمی و میتوکندری و پایداری شکل طبیعی پروتئین را سبب می‌شود.

کیتوزان تقریباً بر بیشتر واکنش‌های متابولیسمی گیاه تأثیر دارد و تغییراتی در آنها موجب می‌شود. این تغییرات، تحمل و سازگاری گیاهان را دربرابر عوامل محیطی افزایش می‌دهند (Yang et al., 2009). Naderi و همکاران (2015) گزارش کردند کیتوزان ممکن است تنظیم‌کنندة کلیدی پاسخ‌های گیاه به تنش‌های محیطی باشد و با افزایش میزان پرولین که به‌نوعی در گیاه تنظیم اسمزی ایجاد می‌کند، آثار منفی تنش خشکی را کمتر کند. براساس نتایج پژوهش Mahdavi و Safari (2016) به نظر می‌رسد کیتوزان با افزایش محتوای تنظیم کننده‌های اسمزی مانند پرولین، پایداری ساختار سلول را دربرابر تنش خشکی سبب می‌شود و با این روش، کاهش آثار سوء تنش را سبب می‌شود که با نتایج Malekpoor و همکاران (2015) مطابقت دارد.

محتوای نسبی آب برگ: نتایج تجزیة واریانس داده‌ها نشان دادند اثر دور آبیاری، محلول‌پاشی کیتوزان و اثـر متقابل آنها بر محتوای نسبی آب برگ در سطح یک درصد معنی‌دار شدند ( جدول 2). مقایسة میانگین آثار متقابل غلظت‌های کیتوزان در هر مقدار آبیاری نشان داد بیشترین محتوای نسبی آب برگ مربوط به دور آبیاری کامل با محلول‌پاشی 1 میلی‌گرم بر لیتر کیتوزان بود (شکل 3).

کاهش محتوای رطوبت نسبی (RWC) برگ‌ها از بارزترین علائم فیزیولوژیک کمبـود رطوبـت خاک است (Nautical et al., 2002).محتوای نسبی آب زیاد، توانایی گیاهان را برای تنظیم اسمزی و حفظ رشدشان نشان می‌دهد. کاهش محتوای آب نسبی در شرایط تنش در بسیاری از گیاهان گزارش شده است (Kerepesi and Galiba, 2000). نتایج پژوهش حاضر نشان دادند دور آبیاری 15 روز کاهش 60/57 درصدی محتوای نسبی آب برگ را سبب شد که با نتایج Babaei (2011) در ریحان و ماریتیغال (Mazarie et al., 2017) هم‌خوانی دارد. Khan و همکاران (2007) بیان کردند آبسیزیک اسید تولیدشده در ریشه در تنش خشکی با تجمع در سلول‌های روزنه‌ای، بسته‌شدن سلول‌های روزنه‌ای را سبب می‌شود که این پدیده، کاهش محتوای رطوبت نسبی آب برگ را سبب می‌شود.

نتایج بررسی حاضر نشان دادند با افزایش محلول‌پاشی، محتوای نسبی آب برگ افزایش 15/38 درصدی یافت که با نتایج پژوهش Mahdavi و Rahimi (2013) مبنی بر افـزایش محتـوای نسـبی آب بـرگ گیــاه زنیــان بر اثر محلول‌پاشی کیتــوزان هم‌خوانی دارد.

شکل 3- اثر متقایل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر محتوای نسبی آب برگ پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

افزایش محتوای نسبی آب برگ در پنیرک معمولی بـا نتـایج به‌دست‌آمده در خیار (Gu et al., 2010)، نخود (Mahdavi and Safari, 2016) و گلرنگ (Modrres Sanavi et al., 2014) مطابقت دارد و بیان کردند محلول‌پاشی با کیتوزان در گیاهان قرارگرفته در معرض تنش خشکی، محتـوای آب نسـبی برگ را افزایش داد.کیتوزان با بهبود سیستم ریشـه‌ای کارآمد، افـزایش جـذب آب و ذخـایر آبـی گیـاه را باعث شـد و همچنین با کاهش تعرق در گیاه، حفظ محتوای نسبی آب برگ را در شرایط تنش باعث می‌شود (Asgharipor et al., 2015)؛ بنـابراین بـا توجـه بـه نتـایج به‌دست‌آمده از آزمـایش حاضر و گزارش‌های سایر پژوهشگران استنباط می‌شود کیتـوزان احتمالاً با کاهش تعرق و همچنین حفظ محتوای نسبی آب، تحمل به خشکی ایجـاد می‌کند (Mahdavi and Rahimi, 2013). نتایج پژوهش Modrres Sanavi و همکاران (2014) نشان دادند کیتوزان با حفظ تعادل آبی سلول از کاهش شدید محتوای نسبی آب برگ جلوگیری کرد که سبب پایداری ساختار سلول را دربرابر تنش کم‌آبی باعث شد و ازسویی مصرف کیتوزان کـاهش آثار سوء تنش را باعث شد.

ترکیبات آنتی‌اکسیدانی

فنل: نتایج به‌دست‌آمده از تجزیة واریانس داده‌های جدول 2 نشان دادند تأثیر دور آبیاری، محلول‌پاشی کیتوزان و اثر متقابل آنها بر میزان فنل کل در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار شد. نتایج آثار متقابل (شکل 4) نشان دادند محلول‌پاشی با غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر کیتوزان در دور آبیاری 15 روز، افزایش 79 درصدی میزان فنل کل را نسبت به شاهد سبب شد.

شکل 4- اثر متقایل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15) بر میزان فنل پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی: نتایج به‌دست‌آمده از جدول تجزیة واریانس (جدول 2) نشان دادند تیمار دور آبیاری و محلول‌پاشی کیتوزان و اثر متقابل دور آبیاری در کیتوزان بر فعالیت برخی از ترکیبات آنتی‌اکسیدانی مانند پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز تأثیر گذاشتند و تفاوت آماری در سطح یک درصد معنی‌دار شد. مقایسة میانگین آثار متقابل نشان داد در تنش خشکی و کیتوزان، میزان فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز را افزایش داد؛ به ‌‌طوری ‌که محلول‌پاشی با غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر کیتوزان در دور آبیاری 15 روز، به‌ترتیب افزایش 51، 72، 70، 54 و 80 درصدی فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز را نسبت به شاهد سبب شد (شکل‌های 5 تا 9).

یکـی از سازوکارهای دفـاع غیـرآنزیمی برای مقابله با تنش اکسـیداتیو القـاء‌شـده با خشـکی در گیاهان، تجمع ترکیبات فنلی است. ترکیبات فنلی به‌صورت گیرنـدة رادیکـال‌هـای آزاد عمـل می‌کنند و مقاومـت گیاهـان را دربرابـر تنش‌های اکسیداتیو سـبب می‌شوند (Sharafati chaleshtori et al., 2008). نتایج بررسی حاضر نشان دادند بین میزان فنل و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان همبستگی وجود دارد که در تطابق با نتایج پژوهش Ghasemzadeh و همکاران (2010) است که بیان کردند رابطة مثبتی بین محتوای فنل کل و فعالیت آنتی‌اکسیدانی آنها وجود دارد.

شکل 5- اثر متقایل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر آنزیم کاتالاز پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

شکل 6- اثر متقایل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر آنزیم گایاگول پراکسیداز پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

شکل 7- اثر متقایل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر آنزیم پراکسیداز پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

شکل 8- اثر متقایل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر آنزیم آسکوربات پراکسیداز پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

شکل 9- اثر متقایل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

این ترکیبات با سازوکار‌های متعددی مانند پاک‌روبی رادیکال‌های آزاد، دادن هیدروژن، کلات‌کردن یون‌های فلزی یا در همکاری با پراکسیدازها در جمع‌آوری یا حذف هیدروژن پراکسید، نقش آنتی‌اکسیدانی خود را ایفا می‌کنند (Kovacik et al., 2009) و درنتیجه، ثبات غشاهای سلولی و ممانعت از پراکسیداسیون لیپیدها را سبب می‌شوند (Chang et al., 2002). Malekpoor و همکاران (2015) گزارش کردند در تنش‌ خشکی ترکیبات فنلی در گیاهان تجمع می‌یابند. در پژوهش حاضر، با افزایش تنش خشکی میزان فنل افزایش یافت که با نتایج Habibi و همکاران (2004) مطابقت دارد. آنها بیان کردند در بادام‌زمینی (Arachis hypogaea) با افزایش شدت تنش، میزان مواد فنلی و آنزیم‌هـای دفـاعی افزایش می‌یابد. وقتی فنل‌ها در این واکنش‌ها به‌صورت آنتی‌اکسیدان شرکت می‌کنند، به رادیکال فنوکسیل اکسید تبدیل می‌شوند و سپس با واکنش با آسکوربات به حالت اولیه برمی‌گردند (Makkar et al., 1988). Tian و Li (2006) در بررسی اثر تنش خشکی در گیـاه گنـدم دریافتند علت افزایش ترکیبات فنلـی، از افـزایش فعالیـت و میزان آنزیم‌های بیوسنتزی ترکیبات فنلی مانند فنیل آلانین آمونیالیاز ناشی می‌شود.

به فعالیت آنتی‌اکسیدانی کیتوزان بسیار توجه شده است (Park et al., 2004). کیتین و کیتوزان افزایش میزان ترکیبات فنلی را باعث می‌شوند که در سازوکارهای دفاعی گیاه نقش دارند (Pu et al., 2009). نتایج Emami Bastegani و همکاران (2016) نشان دادند با افزایش غلظت کیتوزان، محتوای فنل افزایش می‌یابد که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. Taheri (2015) و Coqueiro و همکاران (2011) در نتایج خود بیان کردند کیتوزان با افزایش تولید ترکیبات فنلی به‌صورت سد دفاعی دربرابر تنش‌های محیطی عمل می‌کند. Malekpoor و همکاران (2015) بیان کردند محرک‌هایی مانند کیتوزان ممکن است با فعال‌کردن ژن‌ها و مسیرهای بیوسنتزی مختلف وآنزیم‌ها تشکیل متابولیت‌های ثانویه‌ای مانند ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی را موجب شود که با نتایج بررسی حاضر مبنی بر افزایش ترکیبات فنلی هم‌خوانی دارد.

افزایش دفاع آنتی‌اکسیدانی نقـش بسـیار مهمی در غیرفعال‌کردن رادیکـال‌هـای آزاد اکسـیژن در سـلول گیـاه دارد و میزان فعالیت سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی  به گونة گیاهی و شدت تنش در گیـاه بستگی دارد (Apel and Hirt, 2004). مهم‌ترین نقش رادیکـال‌هـای آزاد اکسـیژن، اکسید‌کردن اسیدهای چرب غیراشباع است که به پراکسیداسیون لیپید و تخریب غشا منجر می‌شوند (Sharma and Dubey, 2005). گزارش شده است آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در افزایش تحمل گیاهان دربرابر تنش‌های محیطی شرکت دارند. افزایش این آنزیم‌ها در شرایط تنش در بسیاری از گونه‌ها گزارش شده است (Yahubyan et al., 2009). زمانی‌که گیاهان در معرض تنش کم‌آبی قرار می‌گیرند برای مقابله با صدمه‌های اکسیژن فعال، همة سازوکارهای دفاعی باید فعال شوند. در بسیاری از گیاهان مشخص شده است تنش خشکی بر فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز اثر می‌گذارد (Blokhina et al., 2003).

افزایش 51، 72، 70، 54 و 80 درصدی فعالیت آنزیم پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز، نشان‌دهندة بـروز تنش اکسیدانی در شرایط تنش خشکی در گیاه پنیرک معمولی اسـت؛ از این ‌رو به نظر می‌رسد آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در افزایش تحمل گیاهان به تنش خشکی نقش مهمی دارند (Mittler, 2002). مقایسة فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، نشان می‌دهد بیشترین فعالیت مربوط به آنزیم سوپراکسید دیسموتاز است. آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز نخستین خط دفاعی را دربرابر رادیکال‌های فعال اکسیژن در سلول تشکیل می‌دهند (Yong et al., 2009). سوپراکسید دیسموتاز، رادیکـال سوپراکـسید را به هیدروژن پراکسید تبـدیل مـی‌کنـد. کاهش فعالیــت این آنــزیم، تجمع رادیکال سوپراکسید را موجب می‌شود. ایـن رادیکـال با هیدروژن پراکسید ترکیب می‌شود و با انجام واکـنش هابر ـ ویز رادیکال بسیار خطرنـاک هیدروکـسیل را به وجود می‌آورد (Mittler et al, 2004).

فعالیـت کـم آنـزیم سوپراکـسید دیـسموتاز کارایی چرخة مهلر را در کلروپلاست کـاهش خواهـد داد. کاهش کارایی ایـن چرخـه، افـزایش شدت آسیب‌ها را به مولکول‌های زیستی حیاتی موجب می‌شود که آسـیب به غشاها یکی از مهم‌ترین آنهاست. همچنین تجمع رادیکال سوپراکسید، فعالیت آنزیم‌های کاتـالاز و پراکـسیداز را کاهش می‌دهد (Asada, 2000). این آنزیم‌ها نقـش ویـژه‌ای در جمع‌آوری هیدروژن پراکسید موجود در سلول دارنـد (Shao et al., 2005).

آنزیم کاتالاز از دستة پروتئین‌های آهـن‌دار به شمار می‌رود و هنگامی در سلول‌های گیاهی و جانوری وارد عمل می‌شود کـه مقـدار مادة هیدروژن پراکسید در محیط زیاد باشد. کاتالاز، فرایند تبدیل هیدروژن پراکسید را به آب و اکسیژن بـدون نیـاز بـه گهرمایة کمکی انجام می‌دهد و از فعالیت هیـدروژن پراکسـید در سلول ممانعت می‌کند (Habibi et al., 2004). آنــزیم پراکســیداز که گهرمایه‌های دهنـدة الکتـرون مختلف دارد و آنـزیم آسکوربات پراکسیداز با مولکـول آسـکوربات که دهندة الکترون است، هیـدروژن پراکسید را بـه آب و اکسیژن احیا می‌کند (Mittler et al, 2004). کاهش فعالیت کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز ممکن است تجمع هیدروژن پراکسید را موجب شود و به کاهش فعالیت برخی از آنزیم‌های چرخة کالوین مانند ریبولوز مونو فسفات، کیناز و بی‌فسفاتازها منجر شود (Asada, 2000). کاهش فعالیت ایـن آنزیم‌هـا در چرخـة کـالوین بـا کـاهش نـسبت NADP⁺/NADPH، H⁺ در کلروپلاســت افــزایش آســیب بــه مولکول‌های زیستی مانند لیپیـدها و تولیــد شکل‌هــای فعــال اکــسیژن را سبب می‌شود (Mittler, 2002).

آسکوربات پراکسـیداز چنـد نقـش اساسـی در فرایندهای فیزیولوژیک گیاه مانند رشـدونمـو و متابولیسـم دارد و همچنین به‌صورت احیاکنندة بسیاری از رادیکـال‌هـای آزاد و به‌ویژه هیدروژن پراکسید عمل می‌کند؛ بنابراین خسارت ناشـی از تنش اکسیداتیو را به کمترین مقدار می‌رساند (Yong et al., 2006).

بررسی‌های متعدد نشان داده‌اند ترکیبات اصلی دیوارة سلولی بسیاری از گونه‌های قارچی مانند کیتین و کیتوزان که الیسیتور زیستی هستند ممکن است توانایی از بین بردن رادیکال‌های آزاد (Yen et al., 2008; Harish Prashanth et al., 2007) و تحریک سازوکارهای دفاعی گیاه و متابولیت‌های ثانویه را داشته باشند (Pu et al., 2009).

کیتوزان در غلظت‌های کم، با از بین بردن رادیکال‌های آزاد به‌طور مستقیم یا با آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان از اکسیدشدن چربی‌ها جلوگیری می‌کند (Mahdavi and Safari, 2016). اثر تحریـک‌کننـدگی کیتوزان‌ها بر میزان فعالیت آنـزیم‌هـای آنتـی‌اکسـیدانی در تـنش خشکی در گیاه گلرنگ گزارش شده است (Abdalla, 2011; Mahdavi et al., 2011) که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد.

به نظر می‌رسد افـزایش فعالیـت آنـزیم‌هـای آنتی‌اکسیدانی در گیاه پنیرک معمولی به‌دلیل اثـر تحریـک‌کننـدگی کیتوزان‌ها بر ژن‌های درگیر در بیوسنتز آنزیم‌های دفاع آنتی‌اکسیدانی باشد که با نتایج Taheri (2015) در گیاه کمای بینالودی (Ferula flabelliloba) مطابقت دارد. این ترکیبات با تعیین مسیرهای بیوسنتزی به تشکیل و تنظیم متابولیت‌های ثانویه برای مقابله با شرایط تنش منجر می‌شوند (Waseem et al., 2010). کیتوزان، رادیکال‌های آزاد هیدروکسیل (OH^-) و سوپراکسید (O₂^-) را خنثی می‌کند (Harish Prashanth et al., 2007). سازوکار خنثی‌کردن رادیکال‌های آزاد کیتوزان ممکن است به ساختار ویژة آن مربوط شود که از تعداد زیادی گروه آمین و هیدروکسیل در دسترس تشکیل شده است که با رادیکال‌های آزاد (ROS) واکنش می‌دهند (Sun et al., 2004).

نتایج همبستگی: نتایج ارزیابی همبستگی بین صفات بررسی‌شده در پژوهش حاضر با ضریب پیرسون در جدول 3 نشان داده شده‌اند. تحلیل همبستگی، نشان‌دهندة ارتباط مثبت و منفی (معنی‌داری یا معنی‌دارنبودن) صفات با یکدیگر است. نتایج نشان دادند آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی، بیشترین میزان همبستگی را با هم دارند. ازسویی بین میزان پرولین با محتوای نسبی آب برگ رابطة مستقیم اما بین پرولین و کلرفیل رابطة عکس وجود دارد.