نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه فردوسی مشهد

2 دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده علوم ، گروه زیست شناسی

3 مشهد- بلوار وکیل آباد- دانشگاه فردوسی مشهد

10.22108/ijpb.2020.118410.1164

چکیده

کلپوره (Teucrium polium L.)، گیاهی دارویی و متعلق به خانوادۀ نعناعیان است. بهره‏برداری بی‌رویۀ انسان از رویشگاه‌های طبیعی برای مصارف دارویی و پراکنش کم، این گیاه را در معرض خطر انقراض قرار داده است؛ در این راستا، استفاده از روش‏های زیست‌فناوری به‌شکل روش جایگزین در تولید متابولیت‌های دارویی مطرح است. در پژوهش حاضر، آزمایشی با هدف افزایش تولید متابولیت‏های ثانویه و ظرفیت آنتی‏اکسیدانی گیاه کلپوره با استفاده از الیسیتورهای متیل‌جاسمونات (MeJa) و سالیسیلیک‌اسید (SA) انجام شد. ریزنمونه‌های برگ از گیاهان چهارماهۀ رشد‌یافته در شرایط هیدروپونیک تهیه و در محیط‌کشت MS حاوی غلظت‏های 5/0، 1و 5/1 میلی‏گرم‌در‌لیتر هورمون‏های 2 و 4- دی‌کلروفنوکسی‌استیک‌اسید (2,4-D) و غلظت‏های 5/0، 1، 5/1 و 2 میلی‏گرم‌در‌لیتر بنزیل‌آمینوپورین (BAP) به‌طورمجزا و ترکیبی کشت شدند. کالوس‏های منتخب که دارای بیشترین درصد (100 درصد) کالوس‏زایی بودند (محیط‌کشت‌های MS حاوی غلظت‌های 5/1 و 2 میلی‏گرم‌در‌لیتر BAP) تحت‌تأثیر تیمارهای مجزای غلظت‏های صفر، 50 و 100 میکروگرم‌در‌لیتر الیسیتورهای متیل‏جاسمونات و سالیسیلیک‌اسید قرار گرفتند. پس‌از40 روز، محتوای ترکیبات فنلی، فلاونوئیدی و ظرفیت آنتی‏اکسیدانی کل آنها در قالب طرح آماری کاملاً تصادفی و در سه تکرار ارزیابی شد؛ در این آزمایش، بیشترین محتوای فنل کل و ظرفیت آنتی‏اکسیدانی نمونه‏ها در کالوس‌های تیمارشده با غلظت 100 میکروگرم‌در‌لیتر الیسیتور سالیسیلیک‌اسید و پس‌از‌آن، در غلظت 50 میکروگرم‌در‌لیتر الیسیتور متیل‌جاسمونات مشاهده شد که تفاوت معناداری نسبت با یکدیگر داشتند. در این آزمایش، مصرف 100 میکرو‏گرم‌در‌لیتر سالیسیلیک‌اسید در محیط‌کشت دارای 5/1 میلی‏گرم‌در‌لیتر BAP بیشترین تأثیر را بر محتوای فلاونوئید کل کالوس‌ها داشت؛ بنابراین، کاربرد غلظت‏های مناسب این الیسیتورها نقش مؤثری در افزایش ترکیبات مؤثرۀ دارویی گیاه کلپوره دارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effect of Methyl Jasmonate and Salicylic Acid Elicitors on the Production of Secondary Metabolites and Antioxidant Capacity of Teucrium polium L. in-vitro

نویسندگان [English]

  • Maliheh Hashemyan 1
  • Ali Ganjeali 2
  • Monireh Cheniany 3

1 Ferdowsi University of Mashhad

2 Ferdowsi University of mashhad, Faculty of science

3 مشهد- بلوار وکیل آباد- دانشگاه فردوسی مشهد

چکیده [English]

 
Teucrium polium, from Lamiaceae family, is a medicinal plant. Due to overexploitation, low distribution and habitat destruction, this plant, is facing extinction. Plant biotechnology and tissue culture is an alternative method for plant secondary metabolites production. The present study aimed to enhance the production of secondary metabolites and antioxidant capacity of Teucrium polium L. using methyl jasmonate and salicylic acid elicitors. Leaf explants from hydroponically cultured 4-month-old plants were inoculated on Murashige and Skoog medium (MS) containing 2, 4-dichlorofenoxy acetic acid (2, 4-D) in concentrations of 0, 0.5, 1, 1.5 mg/L alone or in combination with benzyl aminopurin (BAP) at, 0.5, 1, 1.5, 2 mg/L concentrations. According to the results, the best callus induction (100%) was achieved at MS medium containing 1.5 and 2 mg/L BAP. Calli obtained from this treatment were subsequently treated with Methyl Jasmonate or Salicylic Acid at 0, 50 and 100 μg/L concentrations. After 40 days, the content of phenolics, flavonoid compounds and total antioxidant capacity were evaluated in a completely randomized design with three replications. Based on biochemical assays, the greatest total phenol content, flavonoids and total antioxidant capacity belong to calli treated with 100 μg/L acid salicylic (SA) and after that to cali treated with 50 μg/L methyl jasmonate(MeJa), while the difference between them was significant. The results of means comparison showed applying 100 μg/L SA on calli in medium with 1.5 mg/L BAP had the greatest effect on total flavonoid content. Therefore, the use of appropriate concentrations of these elicitors can play an effective role in enhancing the medicinal compounds in Teucrium polium.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Teucrium polium
  • Antioxidant
  • Salicylic acid
  • Elicitor
  • Flavonoid
  • Phenole
  • methyl jasmonate

مقدمه.

گیاهان دارویی نقش بسزایی در سلامت افراد و جوامع بشری دارند. اهمیت دارویی این دسته از گیاهان در تولید ترکیبات ثانویه‌ای است که فرایندهای فیزیولوژیکی خاصی را در بدن انسان فعال می‌کنند (Padulosi and Hadj-Hassan, 1998). استفاده از متابولیت‏های گیاهی در صنعت داروسازی به درمان آسان‌تر و ارزان‌تر بیماری‎ها کمک می‌کند و مانع خروج بخشی از سرمایۀ کشورها برای واردکردن این ‌گونه ترکیبات می‌شود (Oksman-Caldentey and Inzé, 2004). برداشت مستمر گیاهان دارویی برای استخراج ترکیبات ارزشمند موجود در آنها، علاوه‌بر آسیب به گیاهان، تأثیر سوئی بر جوامع گیاهی و زیستگاه آنها دارد؛ از سویی، این ترکیبات ساختار پیچیده‏ای دارند و سنتز آنها با استفاده از روش‌های شیمیایی پرهزینه و مشکل است (Toivonen, 1993)؛ به‌همین‌علت، استفاده از روش‏های زیست‌فناوری کشت سلول و بافت گیاهی می‌تواند روش جایگزینی برای تولید این ترکیبات باشد (Rao and Ravishankar, 2002). از دیگر مزایای تولید متابولیت‌های ثانویه با استفاده از روش‌های مبتنی بر کشت بافت این است که نمونۀ گیاهی در آزمایشگاه تحت‌تأثیر عوامل محیطی نظیر اقلیم، آفت‌ها، بیماری‌های میکروبی، تنش‌های فصلی و جغرافیایی قرار نمی‌گیرد و می‌توان رشد سلول‌ها را در این شرایط کنترل و محصولات خالص‌تر و مفیدتری تولید و به بازار عرضه کرد (Bourgaud et al., 2002; Rao and Ravishankar, 2002).

کلپوره (Teucrium polium L.)، گیاهی علفی، گل‌دار، چندساله (پایا)، خودرو و متعلق به خانوادۀ نعناعیان (Lamiaceae) است که از اواسط تیرماه تا اواسط شهریورماه در مناطق فقیر از مواد غذایی و مواد آلی، سواحل سنگلاخی و ماسه‌زار نواحی مختلف اروپا، مدیترانه، شمال آفریقا و جنوب‌غربی آسیا ازجمله ایران می‏روید (Koocheki et al., 2009; Mashreghi and Niknia, 2012). این گیاه دارای طبیعت گرم است و سرشاخه‌های گل‌دار آن به‌شکل داروی ضدتشنج با فعالیت‌های ضدانقباضی، ضدعفونی‌کنندگی و ترمیم‌کنندگی زخم در طب سنتی ایران استفاده می‌شوند (Nadimi et al., 2013)؛ همچنین ویژگی‌های ادرارآوری، تعریق‌آوری، ضد فشار خون، ضددرد و کاهندگی ‏چربی و قند خون این گیاه در پژوهش‏ها اثبات شده‌اند (Moghtader, 2009).

فنل‏ها بزرگ‏ترین گروه متابولیت‏های ثانویۀ گیاهی و ترکیبات دهندۀ هیدروژن هستند که آثار و فواید زیستی گسترده‏ای به‌شکل آنتی‌اکسیدان ایده‏آل در زمینۀ مواد غذایی، شیمی، داروسازی و پزشکی برای انسان دارند (Golluce et al., 2007; Raghavendra et al., 2010). فلاونوئیدها زیرمجموعه‏ای از فنل‏ها هستند که انتشار وسیعی در گیاهان دارند و با داشتن خاصیت آنتی‏اکسیدانی، نقش بسزایی در نمو و سیستم دفاعی گیاهان و محافظت آنها در برابر عوامل خارجی ازجمله اشعۀ ماوراءبنفش، عوامل بیماری‌زا و کرم‏های گیاهی ایفا می‏کنند (Lev-Yadun, 2001; Myung-Min et al., 2009). فنل‏ها و فلاونوئیدها سازوکار‏های متعددی برای ایفای نقش آنتی‏اکسیدانی خود دارند که ازجمله می‏توان به پاکروبی رادیکال‏های آزاد، دهندگی هیدروژن، خاموش‌کردن آنیون سوپر‌اکسید، کلات‌کردن یون‏های فلزی، همکاری با پراکسیدازها، جمع‏آوری یا حذف پراکسیدهیدروژن در جهت روبندگی گونه‌های کنشگر اکسیژن (ROS) اشاره کرد (Chu et al., 2000; Kovacik et al., 2009).

مطالعه‌ها در زمینۀ گیاه کلپوره نشان داده‌اند ترکیبات مهم عصارۀ قطبی (عصاره‌گیری با حلال‌های قطبی مانند آب یا اتانول) آن به گروه گلیکوزیدهای فنیل‏پروپانوئید تعلق دارند و فلاونوئیدها (به‌شکل مشتقات متوکسی) و ترکیبات آروماتیک به‌وفور در آن یافت می‌شوند (Alcazar et al., 1992; Bedir et al., 1999). محتوای زیاد فنل و فلاونوئید گیاه کلپوره موجب شده است عصارۀ آن به‌شکل افزودنی غذایی جایگزین آنتی‏اکسیدان‏ها استفاده ‏شود (Goulas et al., 2012).

پژوهش‏های اندکی در زمینۀ کشت بافت گیاه کلپوره به‌منظور تولید متابولیت‌های دارویی و اسانسی انجام شده‌اند. Al-Qudah و همکاران (2011) در بررسی‌های خود موفق به باززایی گیاه کلپوره در شرایط in vitro شدند؛ در این آزمایش، گیاهان باززایی‌شده در محیط MS حاوی 6- بنزیل‌آدنین و 1- نفتالین‌استات محتوای اسانسی بیشتری نسبت به گیاهان رشدیافته در محیط بدون هورمون داشتند.

عوامل بسیاری بر افزایش محتوای متابولیت‌های ثانویه تأثیر می‌گذارند که ازجملۀ آنها می‌توان به مواد تنظیم‌کنندۀ رشد، ریزنمونه، افزودن پیش‌سازها و استفاده از الیسیتورهای زیستی و غیرزیستی اشاره کرد (Sayed-Tabatabae and Omidi, 2011). اکسین‏ها و سیتوکینین‏ها ازجمله تنظیم‏کننده‏های رشد گیاهی هستند که در سنتز متابولیت‏های ثانویه در شرایط کشت سلول- بافت نقش دارند، ولی غلظت بهینه و نسبت کاربردی آنها برای قطعه‌های مختلف جداکشت یک گونه و از گونه‌ای به گونۀ دیگر متفاوت است (Bagheri and Saffari, 2008) استفاده از الیسیتورهای زیستی و غیرزیستی مانند اشعۀ ماوراءبنفش، نمک فلزات سنگین، برخی از ترکیبات شیمیایی مانند جاسمونیک‌اسید، سالیسیلیک‌اسید، نیترات و همچنین کشت ریشه‎های موئین و مهندسی متابولیت ازجمله روش‏های بهینه‏سازی شرایط کشت برای افزایش تولید متابولیت‏های گیاهی هستند (Box, 1945; Rao and Ravishankar, 2002; Matkowski, 2008). ثابت شده است متیل‏جاسمونات و سالیسیلیک‌اسید‏ از مؤثرترین الیسیتور‏های شیمیایی هستند که با مسیر علامت‏رسانی اختصاصی سبب افزایش فعالیت آنزیم فنیل‏آلانین‏آمونیالیاز (PAL) و درنتیجه، فعال‌سازی مسیر فنیل‏پروپانوئیدی می‌شوند که پیامد آن، افزایش محتوای درونی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی است .(Shabani and Ehsanpour, 2010; Mehrabani et al., 2013).Javidi Moghadam و همکاران (2016) در بررسی توان کال‌زایی و آنتی‌اکسیدانی عصارۀ متانولی حاصل از کالوس‌های کلپوره، بیشترین وزن تر کالوس را در ریزنمونۀ برگ گیاه کلپوره و در محیط‌کشت MS حاوی غلظت‌های 5/0 و 1 میلی‌گرم‌بر‌لیتر 2 و 4- دی‌کلروفنوکسی‌استیک‌اسید (2,4-D) گزارش کردند؛ در این آزمایش، ریز‌نمونۀ برگ در محیط‌کشت MS حاوی 5/1 میلی‌گرم‌برلیتر 2,4-D دارای بیشترین فعالیت آنتی‌‌اکسیدانی بود.

متأسفانه بهره‏برداری‏ بی‌رویۀ انسان از گیاه کلپوره، چرای مفرط دام و تبدیل‌شدن مراتع به بوم‌نظام‌های زراعی، این گیاه را در معرض خطر انقراض قرار داده است؛ این موضوع نه‌تنها حفظ و تکثیر این گیاه در عرصه‌های طبیعی را بااهمیت می‌کند، بررسی روش‌های زراعی‌کردن آن را نیز اجتناب‌ناپذیر می‌کند (Koocheki et al., 2009). باتوجه‌به اهمیت دارویی و غذایی گیاه کلپوره و ازآنجاکه بررسی‏های اندکی در زمینۀ کشت in vitro این‏ گیاه وجود دارند، پژوهش حاضر با تکیه بر شیوۀ کشت in vitro و با هدف بررسی تأثیر الیسیتورهای متیل‏جاسمونات و سالیسلیک‌اسید بر ظرفیت افزایش تولید متابولیت‏های ثانویۀ این گیاه انجام شد.

 

مواد و روش‏ها.

آماده‏سازی مواد گیاهی و عملیات کشت:بذر گیاه کلپوره (Teucrium polium L.) در آبان‌ماه ۱۳۹۵ از منطقۀ سد طرق، ابتدای روستای عارفی، استان خراسان رضوی (ارتفاع 1344 متر، طول جغرافیایی˝711 320º 59 و عرض جغرافیایی 842´80º 36) جمع‌آوری و پس‌از اینکه متخصصان پژوهشکدۀ علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد آن را شناسایی کردند و با شمارۀ هرباریومی (FUMH) 20955 ثبت شد، به‌منظور استفاده در پژوهش حاضر نگهداری شد. به‌منظور از‌بین‌بردن خواب بذر، مناسب‏ترین تیمار شامل خراش و هورمون جیبرلیک‌اسید (غلظت ۵۰۰ میلی‏گرم‌در‌لیتر) در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت شش روز استفاده شد (Javidi Moghadam et al., 2016)؛ سپس بذرها با محلول هیپوکلریت‌سدیم ۱ درصد (حجمی/حجمی) به‌مدت ۵ دقیقه ضدعفونی شدند و پس‌از شستشو با آب مقطر استریل به‌مدت ۱۵ دقیقه، درون پتری‏دیش‌های استریل دارای کاغذ صافی شمارۀ 1 قرار گرفتند و در اتاق کشت (شرایط تاریکی با دمای 2±25 درجۀ سانتی‌گراد) نگهداری شدند. پس‌از ظاهرشدن ریشۀ‌ اولیه و محور زیرلپه، دانه‏رست‌های کلپوره به‌مدت دو روز در نور ۲۰۰۰ لوکس و دمای 2±25 درجۀ سانتی‌گراد و شرایط کاملاً مرطوب قرار گرفتند. پس‌از سبزشدن اندام هوایی و افزایش طول ریشۀ‏ اولیه، دانه‏رست‏ها به محیط هیدروپونیک حاوی محلول غذایی هوگلند (Arnon and Hoagland, 1940) منتقل و در اتاقک رشد با دمای2±25 درجۀ سانتی‌گراد و دورۀ نوری ۱۶ ساعت روشنایی/8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. گیاه رشدیافته در محیط یادشده به‌شکل گیاه مادری برای تهیۀ ریزنمونه استفاده شد.

.بررسی تأثیر الیسیتورهای متیل‏جاسمونات و .سالیسیلیک‌اسید بر محتوای ترکیبات فنلی و ظرفیت آنتی‏اکسیدانی کالوس: ازآنجاکه بررسی‏های پیش، برگ را بهترین ریزنمونۀ کالوس‏دهنده معرفی کرده‌اند (Javidi moghadam et al., 2016)، در پژوهش حاضر از ریزنمونۀ برگ (جداکشت اولیه) برای تولید کالوس استفاده شد. ریزنمونۀ برگ در محیط‏های کشت MS دارای تیمار مجزا و ترکیبی دو هورمون 2, 4-D (غلظت‏های صفر، 5/0، 1 و 5/1 میلی‏گرم‌در‌لیتر) و بنزیل‌آمینوپورین (BAP) (غلظت‏های صفر، 5/0، 1، 5/1 و 2 میلی‏گرم‌در‌لیتر) قرار گرفت؛ به این منظور، قطعه‌های برگ بخش‏های رأسی ساقه پس‌از جداسازی از گیاه مادری به‌مدت ۵ دقیقه با آب شستشو و سپس به‌مدت 30 ثانیه ‌در الکل ۷۰ درصد (حجمی/حجمی) غوطه‌ور شدند و درنهایت، 5 دقیقه با آب مقطر استریل شستشو و استریل شدند؛ در ادامه، ریزنمونه‌ها به قطعه‌های 5/0 سانتی‌متری برش داده شدند و روی محیط‌کشت MS با غلظت‏های هورمونی یادشده قرار گرفتند و در اتاقک رشد با دمای 2±25 درجۀ سانتی‌گراد و دورۀ نوری ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی نگهداری شدند. در پایان روز چهلم و با‌توجه‌به ویژگی‏های ریخت‌شناختی و میزان کال‌زایی در هر تیمار، کالوس‏های سبز حاصل از محیط‌های کشت‌ حاوی 5/1 و 2 میلی‌گرم‌در‌لیتر BAP برای بررسی‌های بعدی انتخاب شدند. کالوس‌های منتخب به محیط‏های کشت MS حاوی الیسیتورهای متیل‏جاسمونات و سالیسیلیک‌اسید (غلظت‌های 50 و 100 میکروگرم‌در‌لیتر) منتقل شدند. پس‌از پایان روز بیستم، وزن خشک کالوس‏ها (معیار رشد) اندازه‌گیری و کالوس‏ها با دستگاه فریز درایر (مدلChrist Alfa 1.2 LD Plus، آلمان) طی 24 ساعت کاملاً خشک شدند.

عصاره‏گیری ترکیبات فنلی: مقدار 1/0 گرم از پودر خشک هر نمونه با 2 میلی‏لیتر حلال متانول 80 درصد (حجمی/حجمی) مخلوط و به‌مدت 36 دقیقه در دستگاه اولتراسونیک (مدل Parsonic 2600 s، ایران) در دمای 20 درجۀ سانتی‏گراد و فرکانس 40 کیلوهرتز قرار گرفت و درنهایت، نمونه‏های با غلظت 1 میلی‏گرم‌در‌میلی‏لیتر به‏ دست آمدند؛ سپس عصاره‌ها با کاغذ واتمن شمارۀ 1 صاف شدند و محلول حاصل به‏منظور حذف حلال متانول، به‌مدت 24 ساعت زیر هود (شیمی طوس، ایران) و در شرایط کاملاً تاریک قرار گرفت و برای ارزیابی ترکیبات بیوشیمیایی استفاده شد.

بررسی محتوای فنل کل: محتوای ترکیبات فنلی کل به روش Singleton و همکاران (1999) بررسی شد؛ به این منظور، مقدار 100 میکروگرم‌در‌لیتر عصارۀ متانولی تهیه‌شده از هر نمونه با 2 میلی‏لیتر آب مقطر و 1 میلی‏لیتر محلول فولین‏سیوکالچو مخلوط و پس‌از ۳ دقیقه استراحت، مقدار 1 میلی‏لیتر محلول ۲۰ درصد Na2Co3 (وزنی/حجمی) به آن افزوده و پس‌از 45 دقیقه گرماگذاری در شرایط تاریکی، جذب نوری مخلوط در ۷۲۵ نانومتر خوانده شد. محتوای فنل کل بر حسب میلی‏گرم گالیک‌اسید بر گرم وزن خشک نمونه به کمک منحنی استاندارد حاصل از غلظت‌های مختلف (10 تا 300 میلی‏گرم‌در‌لیتر) گالیک‌اسید تعیین شد.

بررسی محتوای فلاونوئید کل: محتوای ترکیبات فلاونوئیدی کل بر اساس اندازه‌گیری کالریمتری آلومینیوم‌کلرید (Zhishen et al., 1999) بررسی شد؛ به این منظور، مقدار 1 میلی‏لیتر عصارۀ متانولی تهیه‌شده از هر نمونه با 4 میلی‏لیتر آب مقطر و 300 میکرولیتر محلول 5 درصد NaNo2 (وزنی/حجمی) مخلوط شد و پس‌از 5 دقیقه‏ استراحت، مقدار 300 میکرولیتر محلول 10 درصد AlCl3 (وزنی/حجمی)، 2 میکرولیتر محلول 1 مولار NaOH و 10 میلی‏لیتر آب مقطر به آن اضافه و پس از 30 دقیقه گرماگذاری در تاریکی، جذب آن در 510 نانومتر خوانده شد. محتوای فلاونوئید کل نمونه‌ها بر حسب میلی‏گرم کاتچین در گرم وزن خشک نمونه به کمک منحنی استاندارد حاصل از غلظت‌های مختلف (10 تا 400 میلی‏گرم‌در‌لیتر) کاتچین محاسبه شد.

بررسی ظرفیت آنتی‏اکسیدانی کل به روش احیای یون آهن (FRAP) III:به‌منظور اندازه‏گیری توان آنتی‏اکسیدانی عصاره‏ها از روش Benzie و Strain (1996) استفاده شد که مبتنی بر کاهش کمپلکس فریک‏تری‏پیریدیل‏تری‏آزین (TPTZ) به‌‌شکل فروس در مجاورت آنتی‏اکسیدان‏هاست (Shahwar et al., 2012; Chaouche et al., 2013)؛ به این منظور، پس‌از تهیۀ محلول‏های 300 میلی‏مولار بافر استات‌سدیم، 10 میلی‏مولار TPTZ در 40 میلی‏مولار HCl و 20 میلی‏مولار کلرید‌آهن سه‌آبه، عمل مخلوط‌کردن آنها برای تهیۀ محلول FRAP به نسبت‏های حجمی1:1:10 انجام شد. به‌منظور سنجش، مقدار 50 میکرولیتر عصارۀ متانولی با 5/1 میلی‏لیتر محلول FRAP تازه‌تهیه‌شده ترکیب و پس‌از 4 دقیقه استراحت، جذب محلول در 593 نانومتر خوانده شد. محتوای آنتی‏اکسیدانی کل نمونه‌ها برحسب میلی‏گرم محلول سولفات‌آهن ɪɪ در گرم وزن خشک نمونه به کمک منحنی استاندارد حاصل از غلظت‌های مختلف (10 تا 400 میکروگرم‌در‌میلی‌لیتر) محلول سولفات‌آهن II رسم شد.

تجزیه‌و‌تحلیل آماری داده‏ها: تجزیه‌وتحلیل آماری داده‏ها با نرم‏افزار SPSS، نسخۀ 16 انجام و برای مقایسۀ میانگین داده‏ها از آزمون چنددامنه‌ای دانکن استفاده شد. نمودارهای مربوطه با نرم‏افزار Excel (Office 2013) رسم شدند.

 

نتایج

ارزیابی سنجش سطوح مختلف هورمون‌های 2,4-D و BAPدر میزان کال‌زایی: تحلیل واریانس داده‏ها نشان داد کاربرد هورمون‏های 2,4-D و BAP بر درصد کال‌زایی ریزنمونۀ برگ گیاه کلپوره معنا‏دار (01/0P≤) است (جدول 1). بر اساس نتایج، بیشترین درصد کال‌زایی (100 درصد) به محیط‌کشت بدون هورمون 2,4-D و دارای غلظت‏های‏ 5/1 و 2 میلی‏گرم‌در‌لیتر BAP تعلق دارد (شکل 1) و کمترین درصد کال‌زایی (3/8 درصد) به ترکیب تیماری 5/1 میلی‏گرم‌در‌لیتر هورمون 2,4-D و 2 میلی‏گرم‌در‌لیتر هورمون BAP مربوط است (شکل 2).

 

 

جدول 1- نتایج تجزیه واریانس درصد کال‌زایی ریزنمونۀ برگ گیاه کلپوره در محیط‌کشت MS در سطوح مختلف هورمون‌های 2,4-D و BAP

F

میانگین مربعات (MS)

درجۀ آزادی  (df)

مجموع مربعات (SS)

منبع تغییرات (S.O.V)

**83/13

43/2862

3

29/8587

2,4-D

**99/4

86/1031

4

42/4127

BAP

**98/9

491/2066

12

89/24797

BAP × 2, 4-D

-

206/88

40

8275/1

خطا

-

-

59

70/45787

کل

** بیان‌کنندۀ معنا‏داری در سطح احتمال خطای 1 درصد (P≤0.01) است.

 

شکل 1- نمایی از کالوس‌های حاصل از ریزنمونۀ برگ گیاه کلپوره در محیط‌کشت MS حاوی 5/1 میلی‌گرم‌در‌لیتر BAP (الف) و 2 میلی‌گرم‌در‌لیتر BAP (ب) چهل روز پس‌از کشت

 

 

شکل 2- مقایسۀ میانگین درصد کال‌زایی ریزنمونۀ برگ گیاه کلپوره در محیط‌کشت MS در کاربرد هم‌زمان سطوح مختلف هورمون‏های BAP و 2,4-D. مقادیر، میانگین سه تکرار± انحراف معیار است. حروف یکسان نبود اختلاف معنا‏دار در سطح01/0P≤ را نشان می‌دهند.

 


نتایج بررسی تغییرات ترکیبات بیوشیمیایی متأثر از .سطوح مختلف متیل‏جاسمونات و سالیسیلیک‌اسید:تجزیه واریانس داده‏های فنل کل نشان داد تنها اثر عامل الیسیتور (متیل‏جاسمونات و سالیسیلیک‌اسید) بر محتوای این دسته از ترکیبات‏ معنا‏دار (01/0≥P) است. مقایسۀ میانگین داده‏ها نشان داد کاربرد غلظت 100 میکرو‏گرم‌در‌لیتر سالیسیلیک‌اسید سبب تولید بیشترین محتوای فنل کل (80/86 میلی‏گرم در 100 گرم وزن خشک کالوس) در کالوس‏های حاصل می‌شود که 5/2 برابر نمونۀ شاهد (بدون الیسیتور) (52/33 میلی‏گرم در 100 گرم وزن خشک کالوس) است. در کاربرد الیسیتور متیل‏جاسمونات، تیمار 50 میکروگرم‌در‌لیتر سبب افزایش حدود 9/1 برابری محتوای فنل کل کالوس (91/61 میلی‏گرم در 100 گرم وزن خشک کالوس) نسبت به نمونۀ بدون الیسیتور (52/33 میلی‏گرم در 100 گرم وزن خشک کالوس) شد و پس‌از‌آن، محتوای فنل کل کالوس کاهش یافت (شکل3).

 

 

شکل 3- مقایسۀ میانگین محتوای فنل کل در کالوس حاصل از ریزنمونۀ برگ گیاه کلپوره در محیط MS در سطوح مختلف الیسیتورهای سالیسیلیک‌اسید و متیل‏جاسمونات (میکروگرم‌در‌لیتر).‏ مقادیر، میانگین سه تکرار± انحراف معیار است. حروف یکسان نبود اختلاف معنا‏دار در سطح01/0P≤ را نشان می‌دهند.

 

 

تجزیه واریانس داده‏ها در ارزیابی محتوای فلاونوئید کل نشان داد اثر متقابل BAP و الیسیتور بر محتوای فلاونوئید کل کالوس معنا‏دار (05/0≥ P) است. نتایج مقایسۀ میانگین داده‏ها نشان دادند غلظت 100 میکرو‏گرم‌در‌لیتر سالیسیلیک‌اسید دارای بیشترین تأثیر (75/133 میلی‏گرم در 100 گرم وزن خشک کالوس) بر محتوای فلاونوئید کل کالوس‏های رشدیافته در محیط دارای 5/1 میلی‏گرم‌در‌لیتر BAP است و تفاوت آن با تیمار شاهد (55/48 میلی‏گرم در 100 گرم وزن خشک کالوس) معنادار است ( افزایش حدود 7/2 برابری نسبت به تیمار شاهد) (شکل 4). مقایسۀ تأثیر دو الیسیتور بر کالوس‌های تولید‌شده روی محیط BAP نشان داد اثر القایی الیسیتور سالیسیلیک‌اسید بر محتوای فلاونوئید کل کالوس‏ها بیشتر از اثر القایی متیل‏جاسمونات در محیط‏های یادشده است (شکل 4).

ظرفیت آنتی‏اکسیدان کل: نتایج تجزیه واریانس داده‏ها در ارزیابی ظرفیت آنتی‏اکسیدانی کل نشان دادند تنها آثار سادۀ هورمون BAP و الیسیتور بر ظرفیت آنتی‏اکسیدان کل کالوس معنا‏دار (01/0≥P) است. بر اساس نتایج، غلظت 5/1 میلی‏گرم‌در‌لیتر BAP به‏طور معنا‏داری سبب افزایش ظرفیت آنتی‏اکسیدانی کل (85/13 میکرو‏گرم در 100 گرم وزن خشک) در مقایسه با غلظت 2 میلی‏گرم‌در‌لیتر BAP (75/10 میکرو‏گرم در 100 گرم وزن خشک) می‌شود (شکل 5). کاربرد غلظت 100 میکرو‏گرم‌در‌لیتر سالیسیلیک‌اسید (46/25 میکرو‏گرم در 100 گرم وزن خشک کالوس) به‏طور معنا‏داری ظرفیت آنتی‏اکسیدانی کل را نسبت به تیمار بدون الیسیتور (85/5 میکرو‏گرم در 100 گرم وزن خشک) افزایش داد (افزایش 3/4 برابری نسبت به تیمار شاهد). در کاربرد متیل‏جاسمونات، بیشترین ظرفیت آنتی‏اکسیدانی کل کالوس (94/13 میکرو‏گرم در 100 گرم وزن خشک) در تیمار با غلظت 50 میکرو‏گرم‌در‌لیتر این الیسیتور مشاهده شد (شکل 6).

 

 

 

شکل 4- مقایسۀ میانگین محتوای فلاونوئید کل کالوس حاصل از برگ گیاه کلپوره در محیط MS حاصل از تأثیر متقابل هورمون BAP و الیسیتورها.‏ مقادیر، میانگین سه تکرار± انحراف معیار است. حروف یکسان نبود اختلاف معنا‏دار در سطح01/0P≤ را نشان می‌دهند.

 

 

شکل 5- مقایسه میانگین ظرفیت آنتی‏اکسیدانی کل کالوس حاصل از برگ گیاه کلپوره در محیط MS در سطوح مختلف هورمون BAP.‏‏ مقادیر، میانگین سه تکرار± انحراف معیار است. حروف یکسان نبود اختلاف معنا‏دار در سطح01/0P≤ را نشان می‌دهند.

 

 

شکل 6- مقایسه میانگین آثار سادۀ الیسیتورهای سالیسیلیک‌اسید و متیل‏جاسمونات برظرفیت آنتی‏اکسیدانی کل کالوس حاصل از برگ گیاه کلپوره در محیط MS.‏ مقادیر، میانگین سه تکرار± انحراف معیار است. حروف یکسان نبود اختلاف معنا‏دار در سطح01/0P≤ را نشان می‌دهند.


بحث.

نتایج بررسی درصد کال‌زایی نشان دادند در محیط‏های کشت بدون هورمون 2,4-D و دارای روند افزایشی غلظت هورمون BAP، درصد کال‌زایی ریزنمونه‌ها افزایش می‌یابد؛ به‏طوری‏که بیشترین غلظت‌های به‌کار‌رفتۀ BAP (5/1 و 2 میلی‌گرم‌در‌لیتر)، مؤثرترین نتیجه را بر درصد کال‌زایی دارند. سیتوکینین‏ها تشدیدکنندۀ تقسیم‌های سلولی و ترغیب‌کنندۀ فرایند نمو سلول‏های حاصل هستند که فرایند اول از طریق افزایش بیان ژن‏های متعلق به سیکلین‌های نوع D (Ikeuchi et al., 2013) و فرایند دوم با افزایش و تجمع پورین‌های ضروری برای تقسیم‌های سلولی و سنتز پروتئین‌ها انجام می‌شود (Kumar Verma et al., 2016). کاربرد هم‏زمان دو هورمون نه‌تنها تأثیر مثبتی بر میزان کال‌زایی ریزنمونه‌ها نداشت، محیط‏های کشت دارای غلظت‏های زیاد این دو هورمون (2 میلی‌گرم‌در‌لیتر BAP و 5/1 میلی‌گرم‌در‌لیتر 2,4-D) سبب کاهش درصد کال‌زایی شدند؛ این یافته با نتایج پژوهش Mirshekar و همکاران (2014) در زمینۀ گیاه آویشن (Thymus daenensis) مطابقت دارد. اگرچه مطالعه‌های بسیاری به القای کالوس در تیمار هم‌زمان دو هورمون اکسین و سیتوکینین اشاره دارند (Dronne et al., 1999; Soltanipool et al., 2011; Fan et al., 2012; Sahraroo et al., 2014)، نتایج متفاوت و حتی کاهشی کاربرد هم‌زمان تنظیم‌کننده‏های رشد اکسین و سیتوکینین بر تولید کالوس ممکن است به‌علت تفاوت در تعداد و نوع گیرنده‏های هورمونی یا محتوای متفاوت هریک از تنظیم‏کننده‏های رشد گیاهی موجود در بافت‏های مختلف کشت‌شده (ریزنمونه) باشد (Sarkheill et al., 2009)؛ به‌طوری‌که افزایش غلظت هورمون‏ها بیشتر از میزان بهینه در محیط‌کشت دارای اثر ممانعت‌کننده بر هورمون‏های داخلی ریزنمونه است و کاهش میزان تولید کالوس را در پی دارد (Dixon and Gonzales, 1996; Afshari poor, 1993).

نتایج بررسی متابولیت‏های ثانویۀ فنل و فلاونوئید کل نشان دادند اگرچه تیمار غلظت 50 میکروگرم‌در‌لیتر متیل‏جاسمونات تأثیر افزایشی بر محتوای این ترکیبات شیمیایی کالوس‏ها دارد، تیمار با غلظت 100 میکروگرم‌در‌لیتر این الیسیتور سبب کاهش محتوای فنل و فلاونوئید کل می‌شود؛ در تأیید این یافته، Goyal و Ramawat (2008) نتیجه گرفته‌اند تیمار با غلظت‌های کمتر متیل‏جاسمونات (40 میکرومولار) در مقایسه با سایر تیمارها (50، 100، 200 و 400 میکرومولار) در کشت سوسپانسیون سلول گونۀ Tuberosa pueraria تأثیر بیشتری بر افزایش تولید ایزوفلاونوئیدها دارد. بر اساس پژوهش Thiem و Krawczyk (2010)، تیمار با غلظت‌های 50 و 100 میکرومولار متیل‏جاسمونات در مقایسه با غلظت 200 میکرومولار آن دارای اثر افزایشی بر محتوای ایزوفلاونوئیدهای کشت سوسپانسیون سلول گیاه کودزو (Pueraria tuberosa) است.

پژوهش‏های Samadi و همکاران (2014) در زمینۀ گیاه کنگر فرنگی (ynara scolymus L.) نشان‏ داده‌اند کاربرد مقادیر زیاد متیل‏جاسمونات نه‌تنها افزایش محتوای فنل و فلاونوئید کل کالوس را در پی ندارد، تولید این ترکیبات را کم یا متوقف می‏کند. پژوهش‏ها نشان داده‏اند استفاده از الیسیتورها سبب افزایش تولید و تجمع متابولیت‏های ثانویه در شرایط in vitro می‌شود که اغلب از طریق فعال‏سازی سازوکار دفاعی در برابر آن الیسیتور است (Mewis et al., 2011). متیل‏جاسمونات ازجمله الیسیتورهای زیستی است و می‌تواند تولید ROS را القا کند (Zhang and Xing, 2008) و اگرچه این ترکیبات در نقش پیامبر ثانویه در پاسخ‏های سلولی شرکت دارند، مقادیر زیاد آنها سبب آسیب شدید به سلول می‏شود (Mittler et al., 2011)؛ به‌این‌ترتیب که رادیکال‏های آزاد تولید‌شده در غلظت‌های زیاد الیسیتور در واکنش با پروتئین‏ها، لیپیدها و DNA سبب تغییر فعالیت یا غیرفعال‌شدن آنها می‌شوند و درنهایت، مرگ سلولی را القا می‌کنند (Chen et al., 2008).

محتوای فنل و فلاونوئید کل در کالوس‏های تیمارشده با غلظت 100 میلی‏گرم‌درلیتر سالیسیلیک‌اسید افزایش یافت؛ به‌طوری‌که رابطۀ مستقیمی بین افزایش محتوای این دسته از ترکیبات و روند افزایشی غلظت الیسیتور یادشده مشاهده شد. در پژوهش Samadi و همکاران (2014) روی گیاه کنگر فرنگی (Cynara scolymus) مشخص شد با افزایش غلظت سالیسیلیک‌اسید تا 100 میکروگرم‌در‌لیتر، تجمع ترکیبات فنیل‏پروپانوئیدی مشاهده می‏شود. مشخص شده است سالیسیلیک‌اسید با ایجاد تنش کاذب سبب افزایش فعالیت آنزیم فنیل‏آلانین‏آمونیالیاز (PAL) می‏شود که در مسیر تولید ترکیبات محافظتی قوی مانند فلاونوئیدها، فیتوآلکسین‏ها و دیگر ترکیبات فنلی نقش دارد. ازآنجاکه مسیر سنتز سالیسیلیک‌اسید (ترکیب فنلی طبیعی) با سایر ترکیبات فنلی مشترک است و این ترکیب نقش مهمی در بیوسنتز سایر ترکیبات فنلی دارد، افزایش آن در محیط‌کشت یکی از دلایل مقدماتی افزایش سنتز ترکیبات مسیر فنیل‏پروپانوئیدی در کالوس تلقی می‌شود (Dixon and Paiva, 1995; Mahdavian et al., 2008; Shabani and Ehsanpour, 2010)؛ باوجوداین، پژوهش‏ها نشان داده‌اند سالیسیلیک‌اسید همانند متیل‏جاسمونات می‏تواند در غلظت‌های زیاد وضعیت اکسایشی گیاه را بیش از حد توان آن تحت‌تأثیر قرار دهد و سبب مرگ گیاه شود؛ اما این تأثیر به عواملی نظیر گونۀ گیاهی، مرحلۀ نموی گیاه، شیوۀ اعمال تیمار و درنهایت، غلظت و مدت زمان اعمال تیمار سالسیلیک‌اسید وابسته است (Kovacik et al., 2009). به موازات تغییرات بیشینۀ محتوای فنل و فلاونوئید کل کالوس‌ها، بیشترین ظرفیت آنتی‏اکسیدانی کل درنتیجۀ کاربرد غلظت‌های مختلف متیل‌جاسمونات به غلظت50 میکروگرم‌در‌لیتر متیل‌جاسمونات و درنتیجه کاربرد غلظت‌های مختلف سالیسیلیک‌اسید به غلظت 100 میکروگرم‌در‌لیتر سالیسیلیک‌اسید تعلق داشت که ارتباط تنگاتنگ تغییرات ظرفیت آنتی‏اکسیدانی کل با تجمع ترکیبات فنلی را نشان می‌دهد. گزارش‌های متعددی مبنی بر رابطۀ مستقیم محتوای فنلی عصاره‏های گیاهان رزماری (Rosmarinasofficinalis) (Elmasta et al., 2006)، نعناع (Mentha Spicata L.) (Swetie et al., 2007)، زنجبیل (Zingiberofficinale) (Ghasemzadeh et al., 2010) و مریم گلی (Salvia miltorhiza) (Dong et al., 2010) با توان آنتی‏اکسیدانی آنها وجود دارند. Siddharthan و همکاران (2007) در بررسی محتویات فنلی کل و ظرفیت آنتی‏اکسیدانی 133 گونه گیاه دارویی (از 64 خانواده در هند) به رابطۀ مستقیم بین فعالیت آنتی‏اکسیدانی و محتوای فنلی کل این گیاهان اذعان داشته‌اند. پژوهش‏های Swetie و همکاران (2007) نشان داده‌اند فعالیت آنتی‏اکسیدانی با محتوای ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی گیاهان رابطۀ مستقیم دارد. بررسی Kimو همکاران (2006) نشان داده است افزایش خاصیت آنتی‏اکسیدانی عصاره‏های فنلی گیاه ریحان (Ocimum basilicum L.) در پی تیمار با متیل‏جاسمونات رخ می‌دهد؛ دلیل این ارتباط به ویژگی الکترون‏دهی فنل‏ها و تمایل به خنثی‌سازی ROSها نسبت داده می‌شود (Sadeghi et al., 2015).

 

نتیجه‏گیری

کلپوره، گیاهی ارزشمند ازنظر ویژگی‌های دارویی است و هر روشی که با ایجاد کمترین آسیب و تغییر سبب تولید ترکیبات مفید دارویی آن شود، کارآمد و درخور توجه است. پژوهش حاضر نشان داد الیسیتورهای متیل‏جاسمونات و سالیسیلیک‌اسید می‏توانند موجب افزایش تولید متابولیت‏های ثانویۀ این گیاه در محیط‌کشت شوند؛ باوجوداین، افزایش غلظت این الیسیتورها تا غلظت بهینه می‏تواند تولید ترکیبات ثانویه را تحریک کند و کاربرد غلظت‏های بیشتر آن به دلایل مختلف ازجمله کاهش توانایی سلول‏ها در پاسخ به افزایش غلظت الیسیتور‏ و اثر تخریبی ناشی از آن، نه‌تنها سبب افزایش این ترکیبات نمی‌شود، کاهش آنها را نیز در پی دارد؛ بنابراین، گذشته از نقش مفیدی که الیسیتورهای یادشده در تولید ترکیبات مؤثر دارویی این ‌گونه گیاهان دارند، توجه به غلظت آنها مهم و ضروری است و کاربرد مقادیر بهینۀ ترکیبات یادشده در راستای بیش‌تولید متابولیت‏های دارویی اجتناب‌ناپذیر است و بایستی به آن توجه شود.

 

سپاسگزاری

نگارندگان از معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد برای تأمین هزینه‌های پژوهش حاضر از محل اعتبارات متمرکز این معاونت (با شماره کد طرح 40430/3) سپاسگزاری می‌کنند.

References

Afshari poor, S. (1993) Principles of plant tissue culture. Isfahan University of Medical Sciences Press, Isfahan (in Persian).

Alcazar, R., Delatorre, M., Rodriguez, B., Bruno, M. and Arnold, N. A. )1992( Neo-clerodane diterpenoids from three species of Teucrium. Phytochemistry 31(11): 3957-3960.

Al-Qudah, T. S., Shibli, R. A., and Alali, F. Q. )2011( In vitro propagation and secondary metabolites production in wild germander (Teucrium polium L.). In vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 47: 496-505.

Arnon, D. and Hoagland, D. (1940) Crop production in artificial culture solutions and in soils with special reference to factors influencing yields and absorption of inorganic nutrients. Journal of Soil Science 50: 463-485.

Bagheri, A. and Saffari, M. (2008) Basis of plant tissue culture. Fourth edition. Ferdowsi University of Mashhad Press, Mashhad (in Persian).

 

Bedir, A., Arık, N., Adam, B., Kılınc, K., Gumus, T. and Guner, E. (1999) Angiotensin converting enzyme gene polymorphism and activity in Turkish patients with essential hypertension. Ace Genotype in Turkish Hypertensives 12(10): 1038-1043.

Benzie, I. F. F. and Strain, J. J. (1996) The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: The FRAP assay. Analytical Biochemistry 239: 70-76.

Bourgaud, F., Gravot, A. and Goniter, E. (2002) Production of plant secondary metabolites. Plant Science161: 839-851.

Box, G. E. P. (1945) The exploration and exploitation of response surfaces: Some general considerations and examples. Biometrics 10: 16-60.

Chaouche, T. M., Haddouchi, F. and Ksouri, R. (2013) Antioxidant activity profiling by spectrophotometric methods of phenolic extract of Prasium Majus L. Free Radical Antioxidant Journal 3: 43-46.

Chen, B., Huang, J., Wang, J. and Huang, L. )2008( Ultrasound effects on the antioxidative defense systems of Porphyridium cruentum. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 16: 88- 92.

Chu, Y. H., Chang, C. L. and Hsu, H. F. (2000) Flavonoid content of several vegetable and their antioxidant activity. Journal of the Science of Food and Agriculture 80: 561-566.

Dixon, R. A. and Paiva, N. L. (1995) Stress-induced phenylpropanoid metabolism. Plant Cell 7(7): 1085-1097.

Dixon, R. N. and Gonzales, R. A. (1996) Plant cell culture: A practical approach. Oxford University Press. Oxford.

Dong, J., Wan, G. and Liang, Z. )2010( Accumulation of salicylic acid induced phenolic compounds and raised activities of secondary metabolic and antioxidant enzymes in Salvia miltorrhiza cell culture. Journal of Biotechnology 148: 99-104.

Dronne, S., Jullien, F., Caissard, J. C. and Faure, O. (1999) A simple and efficient method for in vitro shoot regeneration from leaves of lavandin (Lavandula ×intermedia Emeric ex Loiseleur). Plant Cell Reports 18: 429-433.

Elmasta, M., Drirtas, I., Isildak, O. and Aboul-Enein, H. Y. (2006) Antioxidant activity of S-Carone isolated from Spearmint (Mentha spicata L.). Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies 29(10): 1465-1475.

Fan, M., Xu, C., Xu, K. and Hu, Y. (2012) Lateral organ boundaries domain transcription factors direct callus formation in Arabidopsis regeneration. Cellular Research 22: 1169-1180.

Ghasemzadeh, A., Jaafar, H. Z. and Rahmat, A. (2010) Antioxidant activities, total phenolics and flavonoids content in two varieties of Malaysia young ginger (Zingiber officinale Roscoe). Molecules 15(6): 4324-4333.

Golluce, M., Sahin, F., Sokmen, M., Ozer, H., Daferera, D., Sokmen, A., Polissiou, M., Adiguzel, A. and Ozken, H. (2007) Antimicrobial and antioxidant properties of the essential oils and methanol extract from Mentha longifolia L. ssp, longifolia. Food Chemistry 103: 1449-1456.

Goulas, V., Gomez-Caravaca, A. M., Exarchou, V., Gerothanassis, I. P., Segura-Carretero, A. and Gutiérrez, A. F. (2012) Exploring the antioxidant potential of Teucrium polium extracts by HPLC-SPE-NMR and on-line radical-scavenging activity detection. Food Science and Technology 46: 104-109.

Goyal, S. H. and Ramawat, (2008) Ethrel treatment enhanced isoflavonoids accumulation in cell suspension cultures of Pueraria tuberosa, a woody legume. Acta Physiologiae Plantarum 30(6): 849-853.

Ikeuchi, M., Sugimoto, K., and Iwase, A. (2013) Plant callus: Mechanisms of induction and repression. The Plant Cell 25: 3159-3173.

Javidi Moghadam, M., Cheniany, M., Ganjeali, A. and Lahouti, M. (2016) An investigation on callogenesis and antioxidant capacity of different explants of Teucrium polium. Iranian Journal of Plant Biology 8(29): 37-52 (in Persian).

Kim, H. J., Chen, F., Wang, X. and Rajapakse, N. C. )2006( Effect of methyl jasmonate on secondary metabolites of sweet basil (Ocimum basilicum L.). Journal of Agriculture and Food Chemistry 54(6): 2327-2332.

Koocheki, A., Nassiri Mahallati, M., Azizi, G. and Khazaei, H. R. (2009) Feasibility study for domestication of Teucrium polium L. based on ecological agriculture. Iranian Journal of Field Crops Research 2(6): 395-404 (in Persian).

Kovacik, J., Backor, M., Strnad, M. and Repcak, M. (2009) Salicylic acid induced changes to growth and phenolic metabolism in Matricaria chamomilla plants. Plant Cell Report 28: 135-143.

Kumar Verma, S., Kumar Das, A., Cingoz, G. S. and Usla, E. (2016) Influence of nutrient media on callus in duction, somatic embryogenesis and plant regeneration in selected Turkish crocus species. Biotechnology Reports 10: 66-74.

Lev-Yadun, S. (2001) Aposematic (warning) coloration associated with thorns in higher plants. Journal of Theoretical Biology 210(3): 385-388.

Mahdavian, K., Kalantari, K. M., Ghorbanli, M. and Torkzade, M. (2008) The effects of salicylic acid on pigment contents in ultraviolet radiation stressed pepper plants. Biologia Plantarum 52(1): 170-172.

Mashreghi, M. and Niknia, S. (2012) The effect of Peganum harmala and Teucrium polium alcoholic extracts on growth of Escherichia coli O157. Jundishapur Journal of Microbiology 5(3): 511-515.

Matkowski, A. (2008) Plant in vitro culture for the production of antioxidants. A review. Biotechnology Advances 26: 548-560.

Mehrabani, B., Nazeri, S. and Piri, K. (2013) Evaluation of total produced phenol in Chaei Koohi (Stachys lavandulifolia Vahi) callus culture and possibility of its enhancement using Elicitors. Journal of Agricultural Biotechnology 4(2): 77-88 (in Persian).

Mewis, I., Smetanska, I. M., Müller, C. T. and Ulrichs, C. (2011) Specific poly-phenolic compounds in cell culture of Vitis vinifera L. Cv. Gamay Fréaux. App. Biochemistry and Biotechology 164, 148-161.

Mirshekar, A., Honarvar, M., Mohammadi, F. and Alizadeh, A. (2014) Optimization of tissue culture of Thymus daenensis Celak. American-Eurasian Journal Agricultural and Environmental Science 14(9): 949-953.

Mittler, R., Vanderauwera, S., Suzuki, N., Miller, G., Tognetti, V. B., Vandepoele, K., Gollery, M., Shulaev, V. and Van Breusegem, F. (2011) ROS signaling: The new wave? Trends Plant Science 16: 300-309.

Moghtader, M. (2009) Chemical composition of the essential oil of Teucrium polium L. from Iran. American-Eurasian Journal of Agricultural and Environmental Science 5(6): 843-846.

Myung-Min, H., Trick, H. N. and Rajasheka, E. B. (2009) Secondary metabolism and antioxidant are involved in environmental adaptation and stress tolerance in lettuce. Journal of Plant Physiology 166: 180-191.

Nadimi, M., Zia, M. and Madani, M. (2013) The effect of aqueous and ethanolic extracts of Tuecrium polium on Candida albicans and two species of Malassezia. Zahedan Journal of Research in Medical Science 15(8): 34-38.

Oksman-Caldentey, K. M. and Inzé, D. (2004) Plant cell factories in the post-genomic era: New ways to produce designer secondary metabolites. Trends Plant Science 9(9): 433-440.

Padulosi, S. and Hadj-Hassan, A. (1998) Towards a comprehensive documentation of distribution and use of Pistacia: genetic diversity in Central and West Asia, North Africa and Mediterranean Europe. In Report of the IPGRI Workshop, 14-17 December, Irbid, Jordan.

Raghavendra, H., Vijayananda, B., Madhumathi, G. and Hiremath, A. (2010) In vitro antioxidant activity of Vitex negundo L. Leaf extracts. Chiang Mai Journal of Science 37(3): 489-497.

Rao, S. R. and Ravishankar, G. A. (2002) Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances 20: 101-153.

Sadeghi, Z., Valizadeh, J. and Azizian Sharme, O. (2015) Evaluation of total phenol, flavonoid and antioxidant activity of Pistacia atlantica Gum from Saravan, Sistan and Baluchestan Province. Eco-phytochemical Journal of Medicinal Plants 10(3): 18-26 (in Persian).

Sahraroo, A., Babalar, M. and Hessein, M. (2014) In vitro callus induction and rosmarinic acid quatification in callus culture of Satureja khuzistanica Jamzad (Lamiaceae). Iran Journal Pharamaceutical Research 13(2): 1447-1456.

Samadi, S., Ghasemnezhad, A. and Alizadeh, M. (2014) Investigation on phenylalanine ammonia-lyase activity of artichoke (Cynara scolymus L.) affected by methyl jasmonate and salicylic acid in in-vitro conditions. Plant Products Research Journal 21(4): 135-148 (in Persian).

Sarkheill, P., Omidi, M., Peyghambari, S. A. and Davazdahemami, S. (2009) The effects of plant growth regualators and explants on callogenesis, regeneration and suspension culture in Foeniculum vulgare Mill. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants 25: 364-375.

Sayed-Tabatabae, B. E. and Omidi, M. (2011) Plant cell and tissue culture. Tehran University Press, Tehran.

Shabani, L. and Ehsanpour, A. A. (2010) Induction of antioxidant enzymes, phenolic and flavonoid compounds in in vitro culture of licorice (Glycyrrhiza glabra L.) using methyl jasmonate and salicylic acid. Iranian Journal of Biology 22(4): 691-703 (in Persian).

Shahwar, D., Asam Raza, M., Bukhari, S. and Bukhari, G. (2012) Ferric reducing antioxidant power of essential oils extracted from Eucalyptus and Curcuma species. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2(3): 1633-1636.

Siddharthan, S., Yi-Zhong, C., Harold, C. and Mei, S. (2007) Systematic evaluation of natural phenolic antioxidants from 133 Indian medicinal plants. Food Chemistry 102: 938-953.

Singleton, V. L., Orthofer, R. and Lamuela-Raventos, R. M. (1999) Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin Ciocalteu reagent. Methods in Enzymology 299: 152-178.

Soltanipool, M. M., Mohamadi, A., Rahnama, H. and AbbasZadeh, B. (2011) Callusogenesis investigation of lemon balm (Melissa officinalis L.). Journal of Agronomy and Plant Breeding 7(1): 45-54.

Swetie, R., Raesh, Ch. and Arun, S. (2007) Antioxidant potential of mint (Mentha Spicata L.) in radiation processed lamb meat. Food Chemistry 100(2): 451-458.

Thiem, B. and Krawczyk, A. (2010) Enhanced isoflavones accumulation in methyl jasmonate-treated in vitro cultures of kudzu (Pueraria lobata Ohwi). Herba Polonica 56(1): 48-56.

Toivonen, L. (1993) Utilization of hairy root culture for production of secondary metabolites. Biotechnology Progress 9: 12-29.

Zhang, L. and Xing, D. (2008) Methyl jasmonate induces production of reactive oxygen species and alterations in mitochondrial dynamics that precede photosynthetic dysfunction and subsequent cell death. Plant Cell Physiology 49(7): 1092-1111.

Zhishen, J., Mengcheng, T. and Jianming, W. (1999) The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chemistry 64: 555-559.