نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد فلاورجان

2 گروه بیوشیمی دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان

10.22108/ijpb.2020.117860.1158

چکیده

آلودگی خاک با فلزات سنگین یکی از مهم‌ترین مشکلات زیست‌محیطی در بسیاری از نقاط جهان است. نیکل و سرب ازجمله فلزات سنگینی هستندکه سهم عمده‌ای در آلودگی‌های محیطی دارند. ازآنجاکه شوید (Anethum graveolens)، نوعی سبزی برگی است که در نقاط مختلف و حتی در مناطق آلوده به فلزات سنگین کشت می‌شود، پژوهش حاضر به‌منظور بررسی آثار سرب و نیکل بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و ترکیبات آنتی‌اکسیدانی گیاه شوید انجام شد. در پژوهش حاضر، بذر‌های گیاه شوید درون گلدان حاوی کوکوپیت و پرلیت کاشته شدند و در معرض تیمار‌های نیترات‌سرب (صفر، ۵۰۰ و ۱۰۰۰ میکرومولار) همراه با غلظت‌های نیترات‌نیکل (صفر، ۱۰۰و ۲۰۰ میکرومولار) در سه تکرار قرار گرفتند. پس‌از اِعمال تیمارها، سنجش طول، وزن تر و وزن خشک ریشه و اندام‌های هوایی، رنگیزه‌های فتوسنتزی، میزان فنل ‌کل، فلاونوئید، آنتوسیانین، فعالیت آنزیم کاتالاز و گایاکول‌پراکسیداز، آسکوربات‌پراکسیداز، سوپراکسید‌دیسموتاز و میزان عناصر سرب و نیکل در بخش هوایی و ریشۀ گیاه انجام شد. استفادۀ توأم از سرب و نیکل روی گیاه شوید نشان داد طول گیاه، میزان کلروفیل a، کلروفیل b وکلروفیل کل با افزایش سرب و نیکل به‌ترتیب تا 32/1، 02/1 و 03/2 در مقایسه با شاهد با مقادیر 26/6، 54/4 و 32/10 میلی‌گرم‌بر‌گرم کاهش می‌یابد. میزان آنتوسیانین، فنل کل و فلاونوئید نیز به‌ترتیب به 7/4، 69/0 و 51/0میلی‌گرم‌بر‌گرم رسید که 5/23، 6/8 و 37/6 برابر نسبت به شاهد افزایش داشت. فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، آسکوربات‌پراکسیداز و سوپر‌اکسید‌دیسموتاز افزایش داشت. تیمار توأم این دو عنصر روی میزان کاروتنوئید، وزن تر و خشک ریشه و اندام هوایی، فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز تأثیری نداشت. استفادۀ هم‌زمان از سرب و نیکل به افزایش میزان عناصر سرب و نیکل در بخش هوایی و ریشه منجر شد. وجود سرب در محیط از جذب نیکل کاست؛ بر اساس این، گیاه برای مقابله با تنش اکسیداتیو حاصل از فلزات سرب و نیکل از ترکیبات آنتی‌اکسیدانی مانند فنل‌ها و برخی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی بهره می‌برد. با‌توجه‌به تأثیرنداشتن تیمار بر وزن تر و خشک و همچنین کاهش اندک طول اندام‌ها، فعال‌شدن تعدای از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی و افزایش ترکیبات آنتی‌اکسیدانی بررسی‌شده از یک سو و تجمع بیشتر عناصر در ریشه از سوی دیگر، می‌توان احتمال داد حتی اگر گیاه نسبت به این تنش‌ها مقاوم نباشد، می‌تواند بدون آسیب‌های جدی در خاک‌های آلوده به سرب و نیکل رشد کند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Lead and nickel effect on some physiological and biochemical characteristics of Anethum graveolens L.

نویسندگان [English]

  • Monireh Ranjbar 1
  • sheida esmaili 2
  • ali asghar moshtaghi 2

1 دانشگاه آزاد فلاورجان

2 department of biochemistry,islamic azad university,falavarjan branch

چکیده [English]

Soil contamination with heavy metals is one of the most important environmental problems in many parts of the world. Nickel (Ni) and lead (Pb) are heavy metals that are major contributors to environmental pollution. Since dill (Anethum graveolens L.) is cultivated as a leafy vegetable in various places, even in heavy metal-contaminated areas, this study was conducted to investigate the effects of lead and nickel on the activity of dill antioxidant enzymes and antioxidant compounds. In this study, dill seeds were planted into pots containing coco peat and perlite and treated with lead nitrate (0, 500 and 1000 μM) and nickel nitrate concentrations (0, 100 and 200 μM) in three replications. After the treatments, the length, fresh weight and dry weight of root and shoot, photosynthetic pigments content, the amount of phenolic compounds, flavonoids, anthocyanins, catalase (CAT), guaiacol peroxidase (GPX), ascorbate peroxidase (APX), superoxide dismutase (SOD) activity and the concentration of Pb and Ni in the shoot and root were evaluated. Use together of lead with nickel on the plant showed that plant length, Chlorophyll a, chlorophyll b, and total chlorophyll decreased respectively to 1.32, 1.02, and 2.03 compared to the control with values of 6.26, 4.54, and 10.32 mg / g under lead and nickel treatments. The anthocyanins, total phenols and flavonoid contents were respectively 4.7, 0.69 and 0.51 mg/g which increased by 23.5, 8.6 and 6.37 compared to the control. CAT, APX and SOD activities increased. Whereas, carotenoid content, fresh and dry weight of roots and shoots, guaiacol peroxidase activity were not affected. Simultaneous use of lead and nickel led to an increase in the amount of lead and nickel in shoot and root. The presence of lead reduces the uptake of nickel by the plant. Accordingly, it seems the plant uses antioxidant compounds such as phenols and some antioxidant enzymes to counter lead and nickel oxidative stress from. On the one hand, the treatment had no effect on fresh and dry weight and also roots and stem length decreased slightly. A number of antioxidant enzymes were activated and the antioxidant compounds increased and the more accumulation of elements in the root, it is possible that even if the plant is not resistant to these stresses, it can grow in the Pb and Ni contaminated soil without serious damage.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Anethum graveolens L
  • Anthocyanin
  • Chlorophyll
  • Catalase
  • Flavonoids
  • Lead
  • Phenol

مقدمه

آلودگی خاک با فلزات سنگین یکی از مهم‌ترین مشکلات زیست‌محیطی در بسیاری از نقاط جهان است (Nisi et al., 2014)؛ نیکل و سرب ازجمله فلزات سنگینی هستند که سهم عمده‌ای در آلودگی‌های محیطی دارند و هر دو سبب تنش اکسیداتیو می‌شوند (Amini and Amirjani, 2013). نیکل، فلزی ضروری برای گیاهان محسوب می‌شود و نقش مهمی در متابولیسم گیاهان ایفا می‌کند؛ باوجوداین، افزایش میزان آن در محیط رشد سبب آسیب به گیاه می‌شود. غلظت‌های زیاد نیکل برای بیشتر گونه‌های گیاهی سمی است و بسیاری از فرایندهای فیزیولوژیک را تحت‌تأثیر قرار می‌دهد (Pandey and Sharma, 2002). کاهش تعداد گل‌ها، میوه‌ها، کمبود برخی عناصر، کاهش محتوای کلروفیل، تخریب غشای تیلاکوئید، تأخیر در جوانه‌زنی و کاهش هدایت روزنه‌ای (Chen et al., 2009) ازجمله آثار نیکل بر گیاهان هستند. مطالعه‌ها نشان می‌دهند نیکل مازاد می‌تواند جوانه‌زنی دانه و رشد گیاه را مهار ‌کند، موجب تخریب کلروفیل ‌شود و در فعالیت سیستم نوری مداخله ‌کند (Ali et al., 2009). غلظت زیاد نیکل در سلول‌ها سبب مهار تقسیم سلولی در دایرۀ محیطیه می‌شود و درنتیجه، ایجاد ریشه‌های فرعی را ممانعت می‌کند (Sharma and Madhulika, 2005). در سطح سلولی، نیکل تولید گونه‌های اکسیژن فعال را القا می‌کند و از این طریق موجب آسیب اکسیداتیو به لیپید‌ها، پروتئین‌ها و نوکلئیک‌اسید‌های سلول‌ها می‌شود (Gardea-Torresdey et al., 2004). در پژوهش‌های انجام‌شده در زمینۀ گیاهان مختلف، نشانه‌های سمیت این عنصر شامل کاهش جوانه‌زنی دانه، کاهش رشد ریشه، القای کلروزیس برگی و کاهش زیست‌توده مشاهده شده‌اند و به کاهش زیست‌تودۀ گندم و کلم اشاره شده است (Drazkiewicz,1994)؛ احتمال داده می‌شود کاهش زیست‌توده ناشی از تغییر فرایندهای متابولیکی القاشده از طریق فلز نیکل و کاهش محتوای آب گیاه باشد (Chen et al., 2009). در غلظت‌های زیاد فلزات سنگین، میزان پراکسیداسیون و تجزیۀ لیپیدهای غشایی به‌ویژه غشای کلروپلاستی تحریک می‌شود (Gill and Tuteja, 2010). سرب یکی دیگر از فلزات سنگین و از مهم‌ترین آلاینده‌های محیط‌زیست است (Islam et al., 2007)؛ این فلز بر فعالیت ریزجانداران خاک ‌تأثیر می‌گذارد و سبب ازدست‌رفتن حاصلخیزی خاک، کاهش شاخص‌های فیزیولوژیک و رشد گیاهان می‌شود و درنهایت، کاهش عملکرد آنها را در پی دارد.

گیاهان برای مقابله با تنش اکسیداتیو دارای سیستم آنتی‌اکسیدانی هستند که از آنها در برابر گونه‌های فعال اکسیژن و رادیکال‌های آزاد محافظت می‌کند و آسیب‌های ناشی از فعالیت عوامل اکسیداتیو را به حداقل می‌رساند. سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی به دو گروه آنزیمی و غیرآنزیمی تقسیم می‌شوند (Esrefoglu, 2012). آنزیم‌هایی همچون گلوتاتیون‌‌پراکسیداز (GPX) و کاتالاز (CAT) مهم‌ترین عوامل آنتی‌اکسیدانی و ویتامین E (a توکوفرول)، کاروتنوئید، فنل و فلاونوئید مهم‌ترین ترکیبات آنتی‌اکسیدانی غیرآنزیمی درون سلول‌ها هستند (Arora et al., 2002).

شوید (Anethum graveolens L.)، گیاهی است که در نواحی معتدل رشد می‌کند و منشأ آن، نواحی شرق مدیترانه گزارش شده است. این گیاه در ایران، هند، قفقاز، اتیوپی، مصر و اروپای جنوبی به‌شکل خودرو رشد می‌کند و انتشار جغرافیایی آن در ایران به‌طور طبیعی و در نواحی مختلف مانند تبریز، اصفهان، خراسان، یزد و فارس گزارش شده است (Zargari, 1997). بر اساس یافته‌های مطالعه‌ای در جنوب پالایشگاه تهران، میزان تجمع سرب و نیکل در گیاه شوید کشت‌شده به‌ترتیب ۸۱/۳۴ و ۲۶/۵ میلی‌گرم‌در‌کیلوگرم است (Kazemzadeh et al., 2012). میانگین غلظت نیکل و سرب در سبزی جعفری مزارع شهر همدان به‌ترتیب ۵۶/۲ و ۶۵/۱۶ میلی‌گرم‌در‌کیلوگرم و میانگین غلظت این فلزات در خاک به‌ترتیب ۵۱/۲۳ و ۸۵/۲۰ میلی‌گرم‌در‌کیلوگرم گزارش شده است (Cheraghi and Ghobadi, 2013). بر اساس مطالعۀ انجام‌شده در مازندران و با استفاده از نمونۀ خاک عرصه‌های طبیعی، غلظت زمینۀ طبیعی نیکل و سرب به‌ترتیب ۴۵/۷ و ۳۴/۲ میلی‌گرم‌در‌کیلوگرم برآورد شده است (Azimzadeh and Khademi, 2013).

آلودگی ناشی از فلزات سنگین ازجمله نیکل و سرب و خطرهای ناشی از این آلودگی برای گیاهان و انسان‌ها بر کسی پوشیده نیست؛ از سوی دیگر، گیاه شوید یکی از سبزیجات برگی خوراکی و دارویی است که در غذاهای مختلف استفاده می‌شود و بنابراین، در مناطق مختلف کشت می‌شود. بسیاری از مزارع کنار مراکز صنعتی قرار دارند یا با فاضلاب‌ها آلوده می‌شوند؛ ازاین‌رو، بررسی پاسخ گیاه در حالت آلودگی به دو فلز سرب و نیکل اهمیت دارد و باتوجه‌به اینکه تنها بخش هوایی این گیاه مصرف خوراکی دارد، تعیین محل تجمع این عناصر ضروری است. باتوجه‌به مطالب یادشده، در پژوهش حاضر به مطالعۀ تأثیر دو فلز سرب و نیکل بر برخی از ویژگی‌های رشدی، شیوۀ فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، تغییر محتوای رنگیزه و تعدادی از متابولیت‌های ثانویه و میزان این دو فلز در ریشه و بخش هوایی پرداخته شد.

 

مواد و روش‌ها.

آزمایش به‌شکل فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با دو عامل سرب در سه سطح صفر، ۵۰۰ و ۱۰۰۰ میکرومولار و نیکل در سه سطح صفر، ۱۰۰ و ۲۰۰ میکرومولار و در سه تکرار انجام شد. بذر گیاه شوید (Anethum graveolens L.) از شرکت پاکان‌بذر اصفهان تهیه و درون گلدان‌هایی با قطر ۱۵ سانتی‌متر و حاوی پرلیت و کوکوپیت کشت شد. تعداد بذرهای کشت‌شده، ۳۰ عدد بود که پس‌از رشد گیاه، حدود نیمی از آنها حذف شدند. پیش‌از کشت، درصد جوانه‌زنی بذرها ۲/۸۰ و سرعت جوانه‌زنی در روز ۰۸۳/۰ تعیین شد. گلدان‌ها هر روز با آب مقطر آبیاری شدند. یک هفته پس‌ازکشت بذرها و با مشاهدۀ جوانه‌ها، روزانه یک نوبت محلول‌پاشی هوگلند علاوه‌بر آبیاری با آب مقطر انجام شد. پس‌از گذشت دو هفته از زمان کشت بذرها و رسیدن گیاه به مرحلۀ دوبرگچه‌ای، تیمار به‌مدت چهار هفته به‌شکل یک روز در میان اِعمال شد. به‌منظور جلوگیری از انباشت فلزات در گلدان‌ها، زیرگلدانی‌ها ۵ تا ۶ ساعت پس‌از تیمار تخلیه و محتویات گلدان با آب مقطر شستشو می‌شدند. پس‌از پایان تیماردهی (شش هفته از زمان کشت بذرها)، گیاهان برای ارزیابی میزان رنگیزه‌های کلروفیل، کاروتنوئید، آنتوسیانین، فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و کاتالاز و میزان فنل کل و فلاونوئید برداشت شدند.

اندازه‌گیری رنگیزه‌های فتوسنتزی:تعیین محتوای کلروفیل a، b و کل و کاروتنوئیدها در برگ‌های گیاه تازه به روش Lichtenthaler (۱۹۹۴) انجام شد؛ مطابق این روش، 5/0 گرم از برگ‌های گیاه با استون ۸۰ درصد (حجمی-حجمی) ساییده و سپس حجم محلول با استون ۸۰ درصد به ۵۰ میلی‌لیتر رسانده شد. مقدار کلروفیل a، b و کل و مقدار کاروتنوئید از رابطه‌های زیر بر حسب میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر محاسبه شد (Saboora and Behjati, 2017).

 

رابطۀ 1

Ca=12.25(A663.2)-2.79(A646.8)

رابطۀ 2

Cb=21.50(A646.8)-5.1(A663.2)

رابطۀ 3

Ctotal=Ca+Cb

رابطۀ 4

Cc=(1000(A470)-1.82Ca-85.02Cb)/198

 

سنجش فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، سوپراکسیددیسموتاز و پراکسیداز: بـه‌منظور اسـتخراج آنـزیم‌هـا از روش Mac-Adam و همکـاران (۱۹۹۲) استفاده شد. اندام هوایی تازۀ گیاهان در هاون چینی دارای ازت مایع خرد و به‌شکل پـودر در‌آمد؛ سپس ۵/۰ میلی‌لیتر بافر فسفات‌سدیم با اسیدیتۀ ۶ به آن اضافه و بـا سرعت ۱۳۰۰۰ دوردردقیقه سانتریفیوژ شد. بـه‌منظور اندازه‌گیری فعالیـت آنـزیم‌هـا، نمونـه‌هـایی از محلـول رویـی برداشت شدند.

روش Chance و Maehly (۱۹۹۵) بـرای سـنجش فعالیـت آنـزیم کاتـالاز استفاده شد؛ مطابق این روش، جذب نوری بـا دسـتگاه اسـپکتروفتومتری در طـول مـوج ۲۴۰ نانومتر طی مدت ۳۰ ثانیه تعیین شد و مقدار 20 میکرولیتر بافر فسفات 20 میلی‌مولار با اسیدیتۀ ۷ و مقدار ۲۰ میکرولیتر هیدروژن‌پراکسید ۳۰ درصد (حجمی- حجمی) برای پذیرندۀ الکترون استفاده شد. میزان فعالیت کاتالاز بر حسب واحد‌در‌میلی‌گرم پروتئین بیان شد..

فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز با سنجش مهار احیای نوری تترازولیوم در طول موج ۵۶۰ نانومتر سنجیده شد. مخلوط واکنش نمونه‌ها شامل بافر فسفات ۵۰ میلی‌مولار با اسیدیتۀ ۷، تترازولیوم ۰۷۵/۰ میکرومولار، EDTA-Na 1/0 میلی مولار، ریبوفلاوین 75 میکرومولار، متیونین 13 میلی مولار و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. به‌منظور سنجش فعالیت این آنزیم، نمونۀ شاهد علاوه‌بر بلانک استفاده و میزان فعالیت آنزیم در نمونه‌ها نسبت به بلانک سنجیده شد. واکنش در نمونه‌های تهیه‌شده در دمای ۲۵ درجۀ سانتی‌گراد و با روشن‌کردن لامپ فلورسنت آغاز و پس‌از 8 دقیقه و با خاموش‌کردن لامپ متوقف شد. فعالیت آنزیم بر اساس واحد آنزیمی به‌ازای هر میلی‌گرم پروتئین برای تمام نمونه‌ها محاسبه شد (Daneshmand, 2014).

مخلوط واکنش برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز شامل بافر فسفات‌پتاسیم ۵۰ میلی‌مولار با اسیدیتۀ ۷، آسکوربیک‌اسید ۵/۰ میلی‌مولار، آب‌اکسیژنۀ ۱۵/۰ میلی‌مولار، EDTA 1/۰ میلی‌مولار و ۵۰ میکرولیتر عصارۀ آنزیمی بود؛ به دنبال اکسیدشدن آسکوربیک‌اسید با آغاز واکنش آنزیمی، کاهش جذب در ۲۹۰ نانومتر پس‌از دو دقیقه از آغاز واکنش نسبت به زمان آغاز واکنش محاسبه شد (Esfandiari and Rostami, 2016).

به‌منظور سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز به روش Mac-Adam و همکاران (۱۹۹۲)، جذب نوری در طول موج ۴۷۵ نـانومتر در مـدت ۶۰ ثانیـه با دستگاه اسپکتروفتومتری خوانده شد. در این روش، بافر فسفات‌سدیم ۲۰ میلی‌مولار با اسیدیتۀ ۶ و گایاکول ۲۰۰ میلی‌مولار برای الکترون‌دهنده و ۱۰ میکرولیتر هیدروژن‌پراکسید ۳۰ درصد (حجمی-حجمی) برای پذیرنده (پیش‌ماده) استفاده شد و نتایج بر حسب واحد‌در‌میلی‌گرم پروتئین گزارش شدند.

اسـتخراج پروتئین‌هـای محلـول کـل بـه کمک بـافر استخراج با ترکیب بافر فسفات‌پتاسیم ۱۰۰ میلی‌مــولار با اسیدیتۀ 7، اتــیلن‌دی‌آمــین‌تتــرا‌اســتیک‌اســید (EDTA) ۱ میلی‌مولار، پتاســیم‌کلریــد ۱۰ میلی‌مولار، منیـــــزیم‌‌ســـــولفات ۱ میلی‌مولار، گلیسـرول ۱۰ درصـد، پلـی‌وینیـل‌پلـی‌پیرولیدون ۱ درصد، تریتون و بتا ۲- مرکاپتواتانول ۵۰ میلی‌مولار انجام شـد. میزان پـروتئین بـا نمـودار استاندارد آلبومین به روش Bradford تعیین شد (Azizian-Shermeh, 2018).

سنجش فنل کل، فلاونوئید و آنتوسیانین:عصارۀ اندام هوایی تازۀ گیاه با متانول ۸۰ درصد (حجمی- حجمی) تهیه و برای سنجش ترکیبات فنلی و فلاونوئید استفاده شد. کربنات‌سدیم ۷ درصد (وزنی- حجمی) و معرف فولین ۱۰ درصد (حجمی- حجمی) به عصارۀ متانولی اضافه شدند و نمونه به‌مدت ۳۰ دقیقه در دمای آزمایشگاه نگهداری شد. میزان جذب نوری نمونه در ۷۶۵ نانومتر تعیین و برای محاسبۀ محتوای فنل کل از معادلۀ خط مربوط به نمودار استاندارد گالیک‌اسید (رابطۀ ۶) استفاده شد. مقدار فنل کل بر حسب میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر گیاه تعیین شد (singh et al., 2002).

رابطۀ ۶

Y=0.05X + 0.0912

سنجش فلاونوئید به روش Chang و همکاران (۲۰۰۲) انجام شد؛ به‌این‌ترتیب که 1 میلی‌‌لیتر محلول کلریدآلومینیوم 2 درصد (وزنی- حجمی) و ۶ میلی‌لیتر محلول استات‌پتاسیم ۵ درصد (وزنی- حجمی) به عصارۀ متانولی افزوده شدند و نمونه به‌مدت ۴۰ دقیقه روی شیکر قرار داده شد و سپس جذب محلول‌ها در طول موج ۴۱۵ نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومترخوانده شد. به‌منظور محاسبۀ محتوای فلاونوئید از معادلۀ خط مربوط به نمودار استاندارد کوئرستین (رابطۀ ۷) استفاده و مقدار فلاونوئید بر حسب میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر گیاه تعیین شد.

رابطۀ 7

Y=0.0031X + 0.0159

تعیین مقدار آنتوسیانین بر اساس روش Maleki و Ehsanpour (2018) انجام شد. مقدار ۱/۰ گرم برگ تازۀ گیاه با ۱۰ میلی‌لیتر متانول اسیدی به نسبت ۹۹ به ۱ ساییده و عصاره برای ۲۴ ساعت در تاریکی قرار داده شد؛ سپس عصاره به‌مدت ۱۰ دقیقه با سرعت ۴۰۰۰ دوردردقیقه سانتریفیوژ و جذب محلول رویی در طول موج ۵۳۰ نانومتر خوانده شد. میزان آنتوسیانین از رابطۀ 8 به دست آمد.

رابطۀ 8

A= Ԑbc

اندازه‌گیری عناصر سرب و نیکل: به‌منظور اندازه‌گیری مقدار عناصر در گیاهان از روش Baker و همکاران (۲۰۰۰) استفاده شد. در ریشه، ابتدا زدودن عناصر از سـطح آن انجام شد؛ به این منظور، ریشه‌ها بلافاصله پس‌از برداشت و جـداکردن قطعه‌های جامد متصل به آنها به‌مدت ۱۰ دقیقه در محلول ۵ میلی‌مولار CaSO4 و 1 میلی‌مولار MES-KOH با اسیدیتۀ ۷/۵ که روی یخ سرد شده بود، قرار گرفتند و هر چنـد دقیقـه بـه‌آرامی هم زده شدند و سپس بـا آب مقطـر شـستشو شدند. پس‌از برداشـت و خـشک‌کـردن سـطحی ریشه‌ها با دستمال کاغذی، آنها به‌مدت ۲۴ ساعت در آون با دمـای ۷۰ درجـۀ سانتی‌گراد خشک و بـرای انـدازه‌گیـری غلظـت عناصر، هضم اسیدی شدند. بخش‌های هوایی نیز پـس‌از برداشت، چند بار با آب مقطر دوبار تقطیر شستشو، مـشابه ریـشه‌هـا خـشک و بـه‌منظور اندازه‌گیری غلظت عناصر در آنها، هضم اسیدی شدند. پـس‌از تـوزین نمونـه‌هـای خـشک‌شـده، ۵/۳ میلی‌لیتر نیتریک‌اسید ۶۰ درصد (حجمی- حجمی) به نمونه‌ها اضافه شـد (در لوله‌های شیشه‌ای شستشوشده با کلریـدریک‌اسید 2 درصد) و نمونه‌ها بـه‌مـدت ۱۲ ساعت در شرایط آزمایشگاه قرار داده شدند؛ سپس به‌مدت ۳ تا 4 ساعت در دمای ۹۰ درجۀ سانتی‌گراد حرارت داده شدند تا تمام بافـت‌هـا کاملاً متلاشی شوند؛ پس‌از سردشدن، ۱ میلـی‌لیتـر H2O2 ۳۰ درصد (حجمی- حجمی) به نمونه‌هـا اضافه شد و به‌مدت ۲۰ دقیقه یا تا زمانی که محلول کاملاً شفاف به دست آید، در دمای ۹۰ درجۀ سانتی‌گـراد قرار داده شدند. نمونه‌هـا پس‌از سردشدن صـاف شـدند و حجم آنها بـا آب مقطـر کـاملاً خالص به ۱۰ میلی‌لیتر رسانده شد. مقدار عناصر سرب و نیکل در ریشه و بخش هوایی با دستگاه طیف‌سنجی جذب اتمی مدل AAnalyst 100 perkin elmer انداز‌ه‌گیری شد.

تجزیه‌وتحلیل آماری:آزمایش ‌به‌شکل فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی و در سه تکرار طراحی شد. نتایج با نرم‌افزار آماری SPSS19 تجزیه‌وتحلیل شدند.آنالیز واریانس به روش ANOVA و مقایسۀ میانگین‌ها با آزمون دانکن انجام شد.

 

نتایج

نتایج تحلیل واریانس داده‌های مربوط به شاخص‌های اندازه‌گیری‌شده در جدول‌های ۱، ۲ و ۳ دیده می‌شوند.

تغییرات طول ریشه و بخش هوایی گیاه:بر اساس جدول آنالیز واریانس ۳، تأثیر تیمارهای استفاده‌شده روی طول ریشه و بخش هوایی شوید در سطح ۵ درصد معنادار بوده است. مطابق شکل ۱، طول ریشه در تیمارهای نیکل ۱۰۰ و ۲۰۰ میکرومولار، سرب ۵۰۰ میکرومولار همراه با نیکل ۱۰۰ میکرومولار و سرب ۱۰۰۰ میکرومولار همراه با نیکل ۱۰۰ و ۲۰۰ میکرومولار نسبت به شاهد کاهش یافته و این کاهش حدود 8 تا 49 درصد بوده است. شکل ۲ نشان می‌دهد تفاوت چندانی در طول بخش هوایی (6 تا 17 درصد) گیاهان وجود ندارد و افزایش طول در تیمار سرب ۱۰۰۰ میکرومولار بدون نیکل و سرب ۱۰۰۰ میکرومولار همراه با نیکل ۲۰۰ میکرومولار نسبت به شاهد رخ داده است.

 

جدول ۱- آنالیز واریانس اثر تیمار سرب و نیکل روی کلروفیل a، b و کل، کاروتنوئید، آنتوسیانین، فعالیت کاتالاز و گایاکول‌پراکسیداز شوید

منابع تغییر

درجۀ آزادی

کلروفیل a

(میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر)

کلروفیل b

 (میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر)

کلروفیل کل

(میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر)

کاروتنوئید

 ( میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر)

آنتوسیانین

 (میکرومول‌بر‌گرم وزن تر)

فعالیت کاتالاز

(واحد آنزیم بر میلی‌گرم پروتئین)

فعالیت گایاکول‌پراکسیداز

 (واحد آنزیم بر میلی‌گرم پروتئین)

سرب

۲

*۷۹۸/۱۰

* ۲۲۰/۹

* ۸۳۹/۳۹

ns ۳۵۰/۶۵۷

** ۰۰۴/۰

** ۰۰۱/۰

ns ۰۰۱/۰

نیکل

۲

* ۵۳۴/۱۳

* ۱۶۰/۷

* ۳۸۱/۴۰

ns۳۸۴/۱۷۹

** ۰۱۰/۰

** ۰۰۱/۰

ns ۰۰۲/۰

سرب * نیکل

۴

*۴۰۴/۱

* ۵۰۶/۰

**۶۵۳/۲

ns ۷۵۰/۲۹۳

** ۰۰۶/۰

** ۰۰۱/۰

ns ۰۰۱/۰

ضریب تغییرات

 

۰۶/۵

۷۶/۱

۳۷/۱۲

۳۵/۲

۰۵/۴

۰۱/۹

۰۰/۰

** و * به ترتیب وجود تفاوت معنادار در سطح ۰۱/۰ و ۰۵/۰ و ns وجودنداشتن تفاوت معنادار را نشان می‌دهند.

 

جدول ۲- آنالیز واریانس اثر تیمار غلظت‌های سرب و نیکل روی فنل کل، فلاونوئید، میزان عناصر سرب و نیکل شوید

منابع تغییر

درجۀ آزادی

فنل

 (میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر)

فلاونوئید

 (میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر)

میزان نیکل در بخش هوایی

 (میلی‌گرم‌بر‌کیلو‌گرم)

میزان سرب در بخش هوایی

 (میلی‌گرم‌بر‌کیلو‌گرم)

میزان نیکل در ریشه

 (میلی‌گرم‌بر‌کیلو‌گرم)

میزان سرب در ریشه

(میلی‌گرم‌بر‌کیلو‌گرم)

سرب

۲

* ۸۴۳/۱۳۷۷

** ۹۶۴/۸۶

* ۱۶۵/۳۹۲۷

* ۱۷۲/۲۷۴۲

* ۱۵۱/۳۵۹۹

* ۴۲۷/۴۲۵۱

نیکل

۲

* ۴۸۳/۵۲۷۹

** ۵۱۲/۵۰۹

* ۸۱۴/۱۴۳۹

* ۱۸۴/۱۳۳۴

* ۱۲۵/۸۳۶۷

* ۴۴۹/۶۳۹۵

سرب* نیکل

۴

**۶۸۳/۷۴۰

** ۱۴۴/۵۲۹

* ۹۶۵/۱۰۷۵

* ۱۶۵/۲۲۰۱

* ۴۷۵/۱۱۰۰

* ۶۳۰/۵۲۱۷

ضریب تغییرات

 

۵۹/۶

۴۳/۷

۴۷/۲

۳۹/۲

۵۳/۳

۰۹/۳

** و * به‌ترتیب وجود تفاوت معنادار در سطح ۰۱/۰ و ۰۵/۰ و ns وجودنداشتن تفاوت معنادار را نشان می‌دهند.

 

جدول ۳- آنالیز واریانس اثر تیمار سرب و نیکل روی طول ریشه و بخش هوایی، وزن تر و خشک ریشه و بخش هوایی، فعالیت آنزیم آسکوربات‌‌پراکسیداز و سوپراکسیددیسموتاز شوید

منابع تغییر

درجۀ آزادی

طول ریشه

(سانتی‌متر)

طول بخش هوایی

(سانتی‌متر)

وزن تر ریشه

(گرم)

وزن تر بخش هوایی

(گرم)

وزن خشک ریشه

(گرم)

وزن خشک بخش هوایی

(گرم)

فعالیت آسکوربات‌پراکسیداز

(واحد آنزیم بر میلی‌گرم پروتئین)

فعالیت سوپراکسیددیسموتاز

(واحد آنزیم بر میلی‌گرم پروتئین)

سرب

۲

*.۰۰۹/۱۷

* ۳۴/۱۸

ns۳۳۹/۱۹

ns ۴۵۰/۲۳

ns۴۰۴/۱۴

ns ۸۰۱/۳۲

**۲۳۱/۱

**۸۷۱/۳

نیکل

۲

* ۳۴/۱۵

* ۵۶۶۰/۲۴

ns۳۲۴/۵۱

ns۱۲۴/۵۲

ns ۷۶۰/۲۶

ns ۷۴۱/۲۷

**۵۰۲/۳

**۶۳/۶

سرب * نیکل

۴

*۶۶/۵

* ۳۴۶/۹

ns ۷۶/۱

ns ۸۵۰/۶

ns۲۱/۵

ns ۴۰۱/۶

**۵۴۱/۱

**۷۵۴/۲

ضریب تغییرات

 

۰۶/۶

۷۶/۵

۱۷/۰

۳۸/۰

۰۵/۰

۰۱/۰

۶۵/۸

۸۶/۹

** و * به‌ترتیب وجود تفاوت معنادار در سطح ۰۱/۰ و ۰۵/۰ و ns وجودنداشتن تفاوت معنادار را نشان می‌دهند.


 

شکل ۱- مقایسۀ برهم‌کنش سرب و نیکل روی طول ریشۀ Anethum graveolens L.. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 

 

شکل ۲- مقایسۀ برهم‌کنش سرب و نیکل روی طول بخش هوایی Anethum graveolens L. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 


.تغییرات وزن تر و خشک ریشه و بخش هوایی گیاه: بر اساس جدول آنالیز واریانس ۳، تفاوت وزن تر ریشه و بخش هوایی و وزن خشک آنها ازنظر آماری معنا‌دار نیست.

تغییر رنگیزه‌های فتوسنتزی گیاه:بر اساس جدول آنالیز واریانس ۱، تأثیر تیمارها بر محتوای کلروفیل a و کلروفیل b گیاهان معنادار بوده است (P<0.05). باتوجه‌به شکل ۳، استفاده از تیمار توأم سرب و نیکل سبب کاهش (۱۷ تا ۵۴ درصد) محتوای کلروفیل a شده است؛ به‌طوری‌که کاهش درخور توجهی در غلظت ۱۰۰۰ میکرومولار سرب همراه با ۲۰۰ میکرومولار نیکل رخ داده است. شکل نشان می‌دهد در سطح صفر و ۵۰۰ میکرومولار سرب، افزودن نیکل به محیط رشد در دو غلظت ۱۰۰ و ۲۰۰ میکرومولار سبب کاهش معنادار مقدار کلروفیل a شده است؛ باوجوداین، افزودن ۱۰۰ میکرومولار نیکل در سطح ۱۰۰۰ میکرومولار سرب سبب تفاوت معنادار نسبت به تیمار بدون نیکل نشده، اما کاهش در نیکل ۲۰۰ میکرومولار نسبت به سرب ۱۰۰۰ میکرومولار بدون نیکل معنا‌دار بوده است.

شکل ۴ نشان می‌دهد محتوای کلروفیل b گیاه شوید در تیمار ۲۰۰ میکرومولار نیکل همراه با غلظت‌های ۵۰۰ و ۱۰۰۰ میکرومولار سرب کاهش (۲۲ تا 56 درصد) یافته و در هر سه غلظت سرب، افزودن نیکل با دو غلظت سبب کاهش میزان کلروفیل b شده است. فلزات سنگین سنتز کلروفیل را مختل می‌کنند و سبب کاهش محتوای آن در گیاه می‌شوند. مطابق شکل، تأثیر نیکل و سرب روی محتوای کلروفیل کل معنا‌دار بوده است (P<0.01)؛ به‌طوری‌که محتوای کلروفیل کل گیاه در اثر غلظت‌های مختلف نیکل و سرب و با افزایش غلظت، کاهش یافته و کمترین محتوا به تیمار سرب ۱۰۰۰ میکرو‌مولار و نیکل ۲۰۰ میکرو‌مولار تعلق یافته است (شکل ۵). روند کاهش کلروفیل کل مشابه با کلروفیل b است. بر اساس جدول آنالیز واریانس ۱، تیمار غلظت‌های سرب و سرب همراه با نیکل روی مقدار کاروتنوئید معنادار نبوده است.

 

 

شکل ۳- مقایسۀ برهم‌کنش سرب و نیکل روی کلروفیل a گیاه Anethum graveolens L.. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 

 

شکل ۴- مقایسۀ برهم‌کنش سرب و نیکل روی کلروفیل b Anethum graveolens L.. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 

شکل ۵- مقایسۀ برهم‌کنش سرب و نیکل روی کلروفیل کل Anethum graveolens L.. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 


.تغییر فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، .سوپراکسیددیسموتاز، گایاکول‌پراکسیداز و آسکوربات‌پراکسیداز گیاه: بر اساس جدول آنالیز واریانس 1، تفاوت فعالیت آنزیم کاتالاز گیاه شوید در معرض تیمار نیکل و سرب ازنظر آماری معنادار بوده است (P<0.01). شکل ۶ نشان می‌دهد با افزایش غلظت سرب، میزان فعالیت آنزیم کاتالاز ۱۶ تا ۲۷ درصد در مقایسه با شاهد افزایش یافته است؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان فعالیت در تیمار ۱۰۰۰ میکرومولار سرب و غلظت‌های ۱۰۰ و ۲۰۰ میکرومولار نیکل رخ داده است. مطابق شکل، میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار توأم سرب و نیکل نسبت به تیمارهای سرب بیشتر شده است. شکل نشان می‌دهد در سطح غلظت صفر سرب، افزودن نیکل به محیط در هر دو سطح سبب افزایش فعالیت آنزیم شده، ولی فعالیت آنزیم در دو سطح نیکل بدون حضور سرب تفاوت معناداری با یکدیگر نداشته است. در سطح سرب ۵۰۰ و ۱۰۰۰ میکرومولار، وجود نیکل در دو سطح سبب افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز شده است؛ درحالی‌که دو غلظت نیکل تفاوت معناداری با یکدیگر نداشته‌اند.

بر اساس جدول ۳، تفاوت فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز شوید در معرض تیمار نیکلو سربازنظر آماریمعنادار بوده است (P<0.01). بر اساس شکل ۷، بیشترین فعالیت این آنزیم در تیمار سرب ۱۰۰۰ میکرومولار همراه با ۲۰۰ میکرومولار نیکل رخ داده است. مطابق شکل، فعالیت این آنزیم در گیاهان شاهد بسیار اندک و در گیاهان تیمارشده با دو غلظت نیکل بدون حضور سرب بیشتر بوده است. در هر سه سطح سرب، افزودن نیکل در دو غلظت سبب افزایش فعالیت آنزیم شده است. در سطح صفر سرب، اختلاف فعالیت آنزیم در دو سطح نیکل معنادار نبوده، ولی در سطوح ۵۰۰ و ۱۰۰۰ میکرومولار سرب، تفاوت در دو سطح نیکل معنادار بوده است. بر اساس یافته‌ها، فعالیت این آنزیم ۲۷ تا ۷۰ درصد نسبت به گیاهان شاهد افزایش یافته است.

بر اساس جدول آنالیز واریانس 1، اختلاف داده‌های مربوط به فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز گیاه شوید در معرض تیمار غلظت‌های مختلف سرب و نیکل معنا‌دار نبوده است.

بر اساس جدول ۳، تفاوت فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز شوید در معرض تیمار نیکلو سربازنظر آماریمعنادار بوده است (P<0.01). بر اساس شکل ۸، بیشترین فعالیت این آنزیم در تیمار سرب ۱۰۰۰ میکرومولار همراه با ۲۰۰ میکرومولار نیکل رخ داده و این افزایش ۵ تا ۲۸ درصد نسبت به گیاهان شاهد بوده است. فعالیت این آنزیم در گیاهان شاهد نسبت به تمام تیمارها کمتر بوده است. شکل نشان می‌دهد آنزیم در گیاهان تیمارشده با دو غلظت نیکل بدون حضور سرب نسبت به شاهد افزایش یافته و استفاده از سرب در دو غلظت سبب افزایش فعالیت این آنزیم نسبت به گیاهان شاهد شده است. در هر سه سطح سرب، افزودن نیکل در دو غلظت سبب افزایش فعالیت آنزیم شده است. در سطح صفر سرب، اختلاف فعالیت آنزیم در دو سطح نیکل معنادار نبوده، ولی در سطوح ۵۰۰ و ۱۰۰۰ میکرومولار سرب، تفاوت در دو سطح نیکل معنادار بوده است.

 

 

 

شکل ۶- مقایسۀ برهم‌کنش سرب و نیکل روی آنزیم کاتالاز Anethum graveolens L.. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 

 

شکل ۷- مقایسۀ برهم‌کنش سرب و نیکل روی آنزیم سوپراکسیددیسموتاز Anethum graveolens L.. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 

شکل ۸- مقایسۀ برهم‌کنش سرب و نیکل روی آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز Anethum graveolens L.. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 


تغییرات آنتوسیانین، فنل کل و فلاونوئید گیاه: بر اساس جدول آنالیز واریانس 1، تفاوت میزان آنتوسیانین در گیاهان شوید در معرض تیمار نیکل و سرب ازنظر آماری معنادار بوده است (P<0.01). شکل 9 نشان می‌دهد نیکل سبب افزایش میزان آنتوسیانین در گیاه شوید شده است؛ به‌طوری‌که با افزایش غلظت سرب در گیاه، میزان آنتوسیانین ۶ تا ۴۲ درصد افزایش یافته است. مطابق شکل، به‌کار‌گیری سرب و نیکل در گیاه شوید به افزایش میزان آنتوسیانین منجر شده است؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان آنتوسیانین در غلظت‌های ۲۰۰ میکرومولار نیکل همراه با سرب ۱۰۰۰ میکرومولار تولید شده است. در غلظت ۱۰۰۰ میکرومولار سرب همراه با ۱۰۰ میکرومولار نیکل و۵۰۰ میکرومولار سرب همراه با ۱۰۰ میکرومولار نیکل، میزان آنتوسیانین در گیاه شوید تفاوتی نشان نداده است. در هر سه سطح سرب، افزودن نیکل در دو غلظت سبب افزایش محتوای آنتوسیانین شده است؛ به‌طوری‌که در هر سه سطح سرب، وجود نیکل در محیط سبب تفاوت معنادار در سطح دو غلظت نیکل شده است.

 

 

 

شکل ۹- مقایسۀ برهم‌کنش سرب و نیکل روی آنتوسیانین Anethum graveolens L.. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 

بر اساس جدول آنالیز واریانس ۲، اختلاف داده‌های مربوط به میزان فنل کل معنا‌دار بوده است. شکل ۱۰ نشان می‌دهد با افزایش غلظت سرب و نیکل، میزان فنل کل گیاه شوید از ۹ تا ۶۱ درصد افزایش یافته است؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان فنل کل در غلظت ۱۰۰۰ میکرومولار سرب همراه با ۲۰۰ میکرومولار نیکل تولید شده است. شکل نشان می‌دهد تیمار سرب یا نیکل سبب افزایش میزان فنل کل گیاه شوید شده است و تیمارهای توأم سرب و نیکل سبب افزایش میزان فنل کل نسبت به تیمار سرب یا نیکل به‌تنهایی شده‌اند. در هر سه سطح سرب، افزودن نیکل در دو غلظت سبب افزایش محتوای فنل کل شده است. همان‌طور که در شکل دیده می‌شود در سطح صفر و ۵۰۰ میکرومولار سرب، اختلاف محتوای فنل کل در دو سطح نیکل معنادار نبوده، ولی در سطح ۱۰۰۰ میکرومولار سرب، تفاوت در دو سطح نیکل معنا‌دار بوده است.

 

 

 

شکل ۱۰- مقایسۀ برهم‌کنش سرب و نیکل روی فنل کل Anethum graveolens L.. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 

 

جدول آنالیز واریانس ۲ نشان می‌دهد تفاوت میزان فلاونوئید در گیاه شوید در معرض تنش سرب و نیکل ازنظر آماری معنا‌دار بوده است (P<0.01). شکل ۱۱ نشان می‌دهد استفاده از سرب یا نیکل سبب افزایش ۸ تا ۴۳ درصدی میزان فلاونوئید شده است. به‌کارگیری توأم سرب و نیکل، افزایش بیشتری را در میزان فلاونوئید در پی داشته است؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان فلاونوئید در تیمار۱۰۰۰ میکرومولار سرب همراه با ۲۰۰ میکرومولار نیکل تولید شده است. در هر سه سطح سرب، افزودن نیکل به محیط سبب افزایش معنادار محتوای فلاونوئید در گیاهان شده است (شکل ۱۱).

 

 

شکل ۱۱- مقایسۀ برهم‌کنش سرب و نیکل روی فلاونوئید Anethum graveolens L.. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 


تجمع سرب و نیکل در ریشه و بخش هوایی: بر اساس جدول آنالیز واریانس ۲، اختلاف داده‌های مربوط به تیمار سرب و نیکل در‌رابطه‌با میزان سرب بخش هوایی در سطح ۵ درصد معنادار بوده و با افزایش غلظت سرب، تجمع این یون در بخش هوایی گیاه افزایش یافته است. در هر سه سطح سرب، وجود نیکل در محیط تأثیری بر میزان سرب تجمع‌‌یافته در بخش هوایی نداشته است (شکل ۱۲).

 

 

 

شکل ۱۲- مقایسه برهم‌کنش سرب و نیکل روی میزان سرب بخش هوایی Anethum graveolens L.. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 

 

بر اساس جدول آنالیز واریانس 2، اختلاف داده‌های مربوط به تیمار سرب و نیکل در‌رابطه‌با میزان سرب ریشه در سطح ۵ درصد معنادار بوده است (شکل ۱۳). شکل نشان می‌دهد در سطح صفر و ۵۰۰ میکرومولار سرب، افزودن نیکل به محیط در دو غلظت تأثیری بر میزان تجمع سرب ریشه نداشته است. در غلظت ۱۰۰۰ میکرومولار سرب، زمانی بیشترین مقدار تجمع سرب در ریشه اتفاق می‌افتاد که نیکل در محیط وجود نداشته باشد. در دو غلظت دیگر نیکل، تفاوتی در تجمع سرب در ریشه دیده نشد؛ بنابراین در غلظت زیاد سرب، افزایش غلظت نیکل از تجمع سرب در ریشه جلوگیری کرده است. مقایسۀ تجمع سرب در ریشه و ساقه نشان می‌دهد در شرایط یکسان، میزان زیادی از سرب در ریشه تجمع یافته است.

 

 

 

شکل ۱۳- مقایسۀ برهم‌کنش سرب و نیکل روی میزان سرب ریشۀ Anethum graveolens L.. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 

 

نتایج نشان دادند تفاوت میزان نیکل در بخش هوایی گیاهان در معرض تنش ازنظر آماری در سطح ۵ درصد معنادار است. باتوجه‌به شکل ۱۴، میزان نیکل بخش هوایی در مقایسه با شاهد افزایش یافته است. چنانچه سرب در محیط وجود نداشته باشد، افزایش نیکل سبب تجمع این عنصر در بخش هوایی می‌شود. شکل نشان می‌دهد در تمام غلظت‌های سرب، افزایش غلظت نیکل سبب افزایش‌ تجمع این عنصر در بخش هوایی شده و غلظت ۱۰۰۰ میکرومولار سرب، تجمع نیکل در بخش هوایی گیاه را نسبت به غلظت ۵۰۰ میکرومولار سرب کاهش داده است. در سطح ۵۰۰ میکرومولار سرب، افزودن نیکل به محیط سبب افزایش تجمع این عنصر شده است، ولی تفاوت معناداری بین دو غلظت نیکل دیده نمی‌شود (شکل ۱۴).

بر اساس جدول آنالیز واریانس ۲، اختلاف داده‌ها برای میزان نیکل ریشه در سطح ۵ درصد معنادار بوده است. در تمام تیمارها، میزان نیکل ریشه در مقایسه با شاهد افزایش یافته است. مطابق شکل 15، افزایش غلظت سرب در محیط سبب کاهش تجمع نیکل در ریشه شده است؛ به‌طوری که در ۱۰۰۰ میکرومولار سرب، میزان نیکل ریشه نسبت به غلظت ۵۰۰ میکرومولار سرب و وجودنداشتن سرب در محیط کمتر شده است (شکل ۱۵). افزایش غلظت نیکل در حضور سرب، تأثیری بر تجمع نیکل در ریشه نداشته است. در هر سه سطح سرب، افزودن نیکل به محیط سبب افزایش تجمع نیکل در ریشه شده است. تفاوت بین دو غلظت نیکل تنها در سطح سرب صفر معنادار بوده است.

 

 

شکل ۱۴- مقایسۀ برهم‌کنش سرب و نیکل روی میزان نیکل بخش هوایی Anethum graveolens L.. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 

 

شکل ۱۵- مقایسۀ برهم‌کنش سرب و نیکل روی میزان نیکل ریشۀ Anethum graveolens L.. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های یکسان وجودنداشتن اختلاف معنا‌دار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.

 


بحث

بر اساس نتایج، مقادیر سرب و نیکل به‌کاررفته در آزمایش حاضر سبب کاهش ناچیز طول گیاهان شدند و تأثیری بر وزن و مقدار کاروتنوئید آنها نداشتند. محتوای کلروفیل‌ها با کاربرد نیکل و سرب به‌طور معناداری کاهش و مقدار ترکیبات فعال زیستی ازجمله آنتوسیانین، فنل کل و فلاونوئید افزایش یافت و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی مانند کاتالاز، سوپراکسیددیسموتاز و آسکوربات‌پراکسیداز بیشتر شد. اگرچه ریشه محل عمدۀ تجمع عناصر است، سرب از تجمع نیکل در گیاه جلوگیری می‌کند. وجود فلزات سنگین در محیط سبب کاهش توان رشد گیاه و در حالت شدید‌تر موجب ازبین‌رفتن گیاه می‌شود (Baker et al., 2000). نتایج پژوهش حاضر نشان دادند تیمار سرب و نیکل سبب کاهش محتوای کلروفیل a، b و کل می‌شود و علت این کاهش را می‌توان ممانعت از آنزیم‌های مسئول بیوسنتز کلروفیل در اثر تنش فلزات سنگین دانست (Zengin and Munzuroglu, 2005). فلزات سنگین ازجمله سرب، نیکل و کادمیوم با اختلال در جذب عناصر ضروری همانند منیزیم و آهن، سنتز کلروفیل در گیاه را بر هم می‌زنند؛ همچنین افزایش تجزیۀ کلروفیل در گیاهان در اثر تیمار سرب از افزایش فعالیت کلروفیلاز ناشی می‌شود. بررسی اثر فلزات سنگین شامل نیکل، سرب و روی در ذرت نشان داده است در شرایط تنش، فتوسنتز کاهش می‌یابد و در غلظت‌های بیشتر و مدت زمان بیشتر تیمار، کاهش درخور توجه است (Tripathi et al., 2016). Amini و همکاران (۲۰۱۲) نشان داده‌اند میزان کلروفیل کل در یونجۀ تیمارشده با سرب و نیکل به‌طور معنا‌داری نسبت به گیاه شاهد کاهش می‌یابد؛ نتایج یادشده با یافته‌های پژوهش حاضر همخوانی دارند. پژوهش‌ها نشان داده‌اند در برگ‌های گیاهچه‌های ده‌روزۀ لوبیا، محتوای کلروفیل کل با افزایش غلظت فلزات سنگین (سرب، مس، کادمیوم و جیوه) به‌تدریج کاهش می‌یابد (Zengin and Munzuroglu, 2005). Pour Akbar و Ebrahim Zadeh (۲۰۱۴) گزارش کرده‌اند با تیمار مس و نیکل در ذرت، محتوای رنگیزه‌ای کلروفیل a به مقدار ۱۴ تا ۶۷ درصد و کلروفیل b به مقدار ۳۲ تا ۷۹ درصد نسبت به شاهد کاهش می‌یابد. کاهش کلروفیل به دو علت رخ می‌دهد: ۱) ورود فلزات سنگین به درون کلروپلاست،تجمع آنها و تداخل در بیوسنتز کلروفیل؛ ۲) اثر مهارکنندگی روی آنزیم‌ها که به پراکسیداسیون رنگیزه‌ها و کاهش آنها منجر می‌شود (Heckathorn et al., 2004). یکی از آسیب‌های بافتی مهم که در اثر قرارگرفتن گیاهان در معرض فلزات سنگین رخ می‌دهد، افزایش تولید گونه‌های اکسیژن فعال است (Callahan et al., 2005). سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی با کارایی زیاد شامل آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز در گیاهان وجود دارد که رادیکال‌های آزاد را از بین می‌برد و خنثی یا جاروب می‌کند (Shahid et al., 2014). میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی بسته به مدت و نوع تنش، گونۀ گیاهی و بخش‌های گیاه متفاوت است (Dinakar et al., 2009). در پژوهش حاضر، فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، آسکوربات‌پراکسیداز و سوپراکسیددیسموتاز در گیاه شوید در معرض تیمار توأم سرب و نیکل افزایش یافت که بیان‌کنندۀ فعال‌شدن سیستم آنتی‌اکسیدان آنزیمی در گیاه به‌منظور جلوگیری از انباشت رادیکال‌های آزاد اکسیژن در شرایط تنش فلزات سنگین است؛ به نظر می‌رسد فعالیت این آنزیم‌ها احتمالاً به‌واسطۀ تجمع رادیکال سوپراکسید، سنتز از نو پروتئین آنزیمی و القای بیان ژن‌های کدکنندۀ آنزیم‌ها باشد (Verma and Dubey, 2003) و احتمالاً افزایش فعالیت این آنزیم‌ها نشان‌دهندۀ سازوکار مقابلۀ گیاه با تنش است. در پژوهشی نشان داده شده است فعالیت کاتالاز طی تیمار گیاه کلم با کادمیوم افزایش می‌یابد .(Burjian et al., 2017) یکی از سازوکارهای حفاظتی غیر‌آنزیمی که در شرایط تنش‌های غیرزیستی تحریک می‌شود، بیوسنتز ترکیبات فنلی ازجمله فلاونوئیدهاست؛ این ترکیبات در شرایط مطلوب محیطی نیز در سلول‌های گیاهی سنتز می‌شوند، اما تنش‌های محیطی مقدار آنها را در سلول تغییر می‌دهند (Hou et al., 2003). در پژوهش حاضر، میزان ترکیبات فنلی در گیاه شوید در معرض تنش فلزات سنگین افزایش یافت که احتمالاً به این علت است که ترکیبات فنلی طی تنش فلزات سنگین به‌شکل شلاتورهای فلزات عمل می‌کنند و از سوی دیگر، گونه‌های مولکولی اکسیژن فعال را به‌طور مستقیم پاکسازی می‌کنند. افزایش ترکیبات فنلی به افزایش فعالیت آنزیم‌های درگیر در متابولیسم ترکیبات فنلی وابسته است که سنتز ترکیبات فنلی جدید را در شرایط تنش فلزات سنگین نشان می‌دهد (Michalak., 2006). در پژوهش حاضر، سرب و نیکل باعث افزایش میزان آنتوسیانین در گیاه شوید شدند. آنتوسیانین‌ها از ترکیبات فنلی حاصل از مسیر فنیل‌پروپانوئید هستند که در بافت‌های گیاهی به‌وفور یافت می‌شوند. آنزیم فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز (PAL) آغازگر مسیر فنیل‌پروپانوئید است و افزایش فعالیت آن که نخستین آنزیم مسیر بیوسنتز فنل‌هاست، در پاسخ به برخی تنش‌های زیستی و غیرزیستی گزارش شده است (Tian and Li., 2007). آنتوسیانین در سمیت‌زدایی فلزات سنگین از طریق تشکیل کمپلکس‌های فلز- آنتوسیانین ایفای نقش می‌کند (Boulton, 2001). Kumar و همکاران (۲۰۱۲) پیشنهاد کرده‌اند سنتز آنتوسیانین در گیاهان، راهبرد مؤثری علیه تولید ROS طی مقابله با تنش سرب است. در پژوهش حاضر، افزایش میزان آنتوسیانین در شوید به‌علت مقابله با تنش اکسیداتیو حاصل از فلزات سنگین و نقش حفاظتی آن در برابر گونه‌های اکسیژن فعال اتفاق افتاد. زیادشدن مقدار ترکیبات فنلی گندم در پاسخ به سمیت نیکل، در پاسخ به سمیت آلومینیوم در ذرت (Malekzadeh et al., 2015)، در پاسخ به سمیت کادمیوم در لوبیا (Kovacik et al., 2011) و همچنین در برگ‌های فیلانتوس که روی آنها سولفات‌مس پاشیده بود (Santiago et al., 2000)، گزارش شده است. مطالعه‌های Steyn و همکاران (۲۰۰۲) نشان داده‌اند آنتوسیانین در پاسخ به تنش عناصر سنگین افزایش می‌یابد و احتمالاً این ترکیب به‌شکل ناقل فلز سنگین به واکوئل عمل می‌کند. فلزات سنگین سنتز آنزیم گلوتاتیون-s-ترانسفراز (GST) را که آنزیمی کلیدی در آخرین مرحلۀ بیوسنتز آنتوسیانین است، تحریک می‌کنند و از این طریق سبب افزایش سنتز آنتوسیانین می‌شوند؛ افزایش میزان آنتوسیانین در پژوهش حاضر ممکن است به این علت باشد. در پژوهش حاضر با افزایش غلظت سرب محیط‌کشت، تجمع سرب در ریشه و برگ‌های شوید افزایش یافت. تفاوت مشاهده‌شده در انباشت سرب در ریشه و بخش هوایی ممکن است به این علت باشد که سمیت‌زدایی سرب ابتدا از بخش ریشه‌‌ای آغاز می‌شود و در پی آن، میزان سرب انتقال‌یافته به بخش هوایی به کمترین مقدار می‌رسد (Soltani et al., 2006). تجمع سرب در گیاه شوید به غلظت آن در محیط‌کشت بستگی دارد، ولی درکل میزان سرب در ریشه بیشتر از برگ است. عمدتاً سرب از مسیر آپوپلاستی یاکانال یونی کلسیم وارد ریشه می‌شود. انتقال سرب از مسیر آپوپلاستی به‌سهولت از طریق انحلال سرب در آب انجام می‌شود و نوار کاسپاری در آندودرم مانع از انتقال آن به استوانۀ مرکزی می‌شود؛ به‌همین‌علت، تجمع در ریشه بیشتر اتفاق می‌افتد (Sharma and Madhulika, 2005). بر اساس مطالعۀ Akinci و همکاران (۲۰۱۰)، بیشترین میزان سرب از طریق سیستم‌های ریشه‌ای جذب گیاهان می‌شود و مقادیر ناچیزی از طریق برگ و به‌ویژه برگ‌های کرک‌دار جذب می‌شود. Kosobrukhov(۲۰۰۴)گزارش کرده است سرب در اندام‌های گیاهی به‌ویژه در ریشه تجمع می‌یابد. در پژوهش Zheljazkov و همکاران (۲۰۰۶) مشخص شده است با افزایش میزان سرب در محیط رشد گیاه، انتقال آن از ریشه‌ها به اندام هوایی افزایش می‌یابد؛ این افزایش ممکن است به‌علت اختلال در ساختار غشای پلاسمایی در اثر وجود غلظت‌های زیاد سرب در محیط و کاهش ممانعت انتقال سرب از خاک به گیاه باشد. میزان انباشت سرب در ریشه بیشتر از ساقه و برگ‌هاست (Zhao et al., 2012). نتایج پژوهش حاضر نشان دادند تجمع نیکل در ریشه بیش از بخش هوایی گیاه شوید است و با افزایش غلظت نیکل در محیط رشد، غلظت آن در ریشه افزایش بیشتری در مقایسه با بخش هوایی دارد. بر اساس انباشتگی بیشتر نیکل در ریشه نسبت به اندام‌های هوایی شوید، به نظر می‌رسد کده‌بندی یون‌های نیکل در ریشه نوعی سازوکار مقاومتی است که گیاه شوید در برابر تنش فلز سنگین نیکل در پیش می‌گیرد. غلظت نیکل موجود در گیاه با غلظت آن درخاک و محیط ارتباط مستقیم دارد. مطالعۀ Parida و همکاران (۲۰۰۳) روی گیاه ارزن نشان داده است افزایش غلظت نیکل در بافت‌های گیاهی به‌علت افزایش غلظت این عنصر در محیط رشد این گیاهان است. تجمع فلزات سنگین در ریشه بسیار بیشتر از بخش هوایی است؛ به‌همین‌علت، ریشۀ شوید و بسیاری از گیاهان زراعی می‌توانند مقدار زیادی نیکل را ذخیره کنند (Fuentes et al., 2006).

در پژوهش حاضر، به‌کار‌گیری نیکل و سرب در محیط‌‌کشت گیاه شوید سبب اثر کاهشی بر طول ریشه و بخش هوایی و محتوای کلروفیل a، b و کل و اثر افزایشی بر محتوای آنتوسیانین، فنل کل، فلاونوئید، فعالیت آنزیم کاتالاز، آسکوربات‌پراکسیداز و سوپراکسیددیسموتاز شد. افزایش غلظت سرب در محیط از جذب نیکل جلوگیری کرد، ولی نیکل چنین تأثیری بر جذب سرب نداشت. تیمار‌های به‌کاررفته تأثیری بر وزن تر و خشک ریشه و بخش هوایی، محتوای کاروتنوئید، فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز نداشتند؛ درنتیجه، گیاه شوید تحت‌تأثیر وجود سرب و نیکل در محیط رشد، سیستم‌های آنزیمی و ترکیبات آنتی‌اکسیدانی خاصی را فعال می‌کند و باوجود کاهش رنگیزه‌ها، تغییر چندانی در وزن تر و خشک ریشه و بخش هوایی ایجاد نمی‌شود و از سویی، مقادیر زیادی از عناصر را در ریشه ذخیره می‌کند.

Akinci, I. E., Akinci, S. and Yilmaz, K. (2010) Response of tomato (Solanum lycopersicum L.) to lead toxicity: Growth, element uptake, chlorophyll and water content. African Journal of Agricultural Research 5(6): 416-423.

Ali, M. A., Ashraf, M. and Athar, H. R. (2009) Influence of nickel stress on growth and some important some physiological/ biochemical attributes in some diverse canola (Brassica napus L.) cultivars. Materials Hazardous 172: 969-964.

Amini, F., Noori, M., Askari, M., Foroughi, M. and Abbaspour, J. (2012) Ni induction changes to some biochemical traits and protein electrophoresis pattern of Corronilla varia under hydroponic culture. Journal of Crop Production and Processing 2(5): 143-152 (in Persian).

 

 

Amini, F. and Amirjani, M. R. (2013) Effect of Ni and Pb on chlorophyll content and metals accumulation in Medicago sativa. Journal of Crop Production and Processing 2(6): 11-20 (in Persian).

Arora, A., Sairam, R. K. and Srivastava, G. C. (2002) Oxidative stress and antioxidative system in plants. Current Science 22: 1227-1238.

Azimzadeh, B. and Khademi, H. (2013) Estimation of background concentration of selected heavy metals for pollution assessment of surface soils of Mazandaran province, Iran. Journal of Water and Soil 548-559 (in Persian).

Azizian-Shermeh, O., Einali, A. and Valizadeh, J. (2018) Physiological and biochemical responses of basil (Ocimum basilicum) seedlings to different concentrations of zinc. Iranian Journal of Plant Biology 10(2): 35-56 (in Persian).

Baker, A. J. M., Mc Grath, S. P., Reeves, R. D. and Smith, J. A. C. (2000) Metal hyper accumulator plants: A review of the ecology and physiology of a biological resource for phytoremediation of metal-polluted soils. In: Phytoremediation of contaminated soil and water (Eds. Terry, N. and Banuelos, G.) 85-107. CRC Press, Boca Raton, Florida

Boulton, R. (2001) The pigmentation of anthocyanins and its role in the color of red wine: A critical review. American Journal of Enology and Viticulture 52(2): 67-87.

Burjian, M., Khoshsokhan Mozafar, M. and Khosravi Rina, M. (2017) Antioxidant changes in Brassica oleracea1 cv. under cadmium stress in hydroponic culture. Journal of Alzahra University (Applied Biology) 4(13): 84-69 (in Persian).

Callahan, D. L., Baker, A. J. M., Kolev, S. D. and Wedd, A. G. (2005) Metal ion ligands in hyper accumulating plants. Journal of Biological Inorganic Chemistry 11(1): 2-12.

Chance, B. and Maehly, A. C. (1995) Assay of catalases and peroxidase. Methods of Biochemical Analysis 11(1): 755-764.

Chang, C., Yang, M., Wen, H. and Chern, J. (2002) Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods. Journal of Food and Drug Analysis 10(3): 78-82.

Chen, C., Huang, D. and Liu, J. (2009) Functions and toxicity of nickel in plants: recent advances and future prospects. Clean–Soil, Air, Water 37(5): 304-313.

Cheraghi, M. and Ghobadi, A. (2013) Health risk assessment of heavy metals (cadmium, nickel, lead and zinc) in withdrawed parsley vegetable from some farms in Hamedan city. Sunrise Health 4(13): 129-143 (in Persian).

Daneshmand, F. (2014) Response of antioxidant system of tomato to water deficit stress and its interaction with ascorbic acid. Iranian Journal of Plant Biology 6(19): 57-72. (in Persian).

Dinakar, N., Nagajyoth, P.C., Suresh, S., Damodharam, T. and Suresh, C. (2009) Cadmium induced changes on proline, antioxidant enzymes, nitrate and nitrite reductases in Arachis hypogaea L. Journal of Environmental Biology 30(2): 289-294.

Drazkiewicz, M. (1994) Chlorophyllase: Occurrence, functions, mechanism of action, effects of external and internal factors (Review). Photosynthetica 30(1): 321-331.

Esfandiari, E. and Rostami, N. (2016) Evaluation of Cd effects on growth and some oxidative stress parameters of wheat cultivars during seedling stage. Iranian Journal of Plant Biology 8(27): 1-16 (in Persian).

Esrefoglu, M. (2012) Experimental and clinical evidence of antioxidant therapy in acute pancreatitis. World Journal of Gastroenterology 18(39): 5533-5541.

Fuentes, F., Montes, J. and Fernandez, L. M. (2006) Total quality management, strategic orientation and organizational performance: the case of Spanish companies. Total Quality Management 17(3): 303-323.

Gardea-Torresdey, J.L., Peralta-Videa, G. R., Montes, M., Rose, G. D. and Corral-Diaz, B. (2004) Bioaccumulation of cadmium, chromium and copper by (Convolvulus arvensis L.): Impact on plant growth and uptake of nutritional elements. Bioresource Technology 92: 229-235.

Gill, S. S. and Tuteja, N. (2010) Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry 48(12): 909-930. 

Heckathorn, S. A., Mueller, J. K., LaGuidice, S., Zhu, B., Barrett, T., Blair, B. and Dong, Y. (2004) Chloroplast small heat-shock proteins protect photosynthesis during heavy metal stress. American Journal of Botany 91(9): 1312-1318.

Hou, W. C., Lin, R. D., Cheng, K. T., Hung, Y. T., Cho, C. H., Chen, C. H., Hwang, S. Y. and Lee, M. H. (2003) Free radical scavenging activity of Taiwanese native plants. Phytomedicine 10: 170-175.

Islam, E., Yang, X., Li, T., Liu, D., Jin, X. and Meng, F. (2007) Effect of Pb toxicity on root morphology, physiology and ultrastructure in the two ecotypes of Elsholtzia argyi. Journal of Hazardous Materials 147(3): 806-816.

Kazemzadeh, J., Nouriee, A., Pourang, N., Alizadeh, M., Qureshi, H. and Reward, A. (2012) Investigation and measurement of heavy metals nickel, lead, copper, manganese, zinc, cadmium andVanadium in edible vegetables south of Tehran refinery. Environmental Research 3(6): 65-74 (in Persian).

Kosobrukhov, A., Knyazeva, I. and Mudrik, V. (2004) Plantago major plants responses to increase content of lead in soil: growth and photosynthesis. Plant Growth Regulation 42(2): 145-151.

Kovacik, J., Klejdus, B., Hedbavny, J. and Zon, J. (2011) Significance of phenols in cadmium and nickel uptake. Journal of Plant Physiology 168(6): 576-584.

Kumar, A., Prasad, M. N. V. and Sytar, O. (2012) Lead toxicity, defense strategies and associated indicative biomarkers in Talinum triangulare grown hydroponically. Chemosphere 89(9): 1056-1065.

Lichtenthaler, H. K. and Welburn, W. R. (1994) Determination of total carotenoids and chlorophyill a and b of leaf extracts in different solvents. Biochemical of Transport 11(5): 591-592.

Mac-Adam, J. W., Nelson, C. J. and Sharp, R. E. (1992) Peroxidase activity in the leaf elongation zone of tall fescue. Plant Physiology 99: 872-878.

Maleki, M. S. and Ehsanpour, A. A. (2018) Effect of salicylic acid on total phenol, flavonoid, anthocyanin and PAL and TAL enzymes in tomato (Solanum lycopersicum Mill) plants. Iranian Journal of Plant Biology 9(34): 55-67 (in Persian).

Malekzadeh, P., Shikhakbari Mehr, R. and Hatamnia, A. A. (2015) Effects of aluminum toxicity on maze seedlings. Iranian Journal of Plant Physiology 5(2): 1289-1296.

Michalak, A. (2006) Phenolic compounds and their antioxidant activity in plants growing under heavy metal Stress. Polish Journal of Environmental Studies 15(4): 523-530.

Nisi, A., Vosoughi, M., Mohammadi, B., Mohammadi, M. J., Naimabadi, A. and Hashemzadeh, B. (2014) Phytoremediation of by Helianthus plant: a review study. Journal of Torbat-e-Heydarieh University of Medical Sciences 2(2): 65-55 (In Persian).

Pandey, N. and Sharma, C. P. (2002) Effect of heavy metals Co2+, Ni2+ and Cd2+ on growth and metabolism of cabbage. Plant Science 163(4): 753-758.

Parida, B. K., Chhibba, I. M. and Nayyar, V. K. (2003) Influence of nickel-contaminated soils on fenugreek (Trigonella corniculata L.) growth and mineral composition. Science. Horticulture. 98: 113-119.

Pour Akbar, L. and Ebrahim Zadeh, N. (2014) Growth and physiological answer of Zea mays L. to Cu and Ni. Agriculture Journal 103: 147-157 (in Persian).

Saboora, A. and Behjati, R. (2017) The effect of boron and iron deficiency on the contents of photosynthetic pigments, carbohydrates and phenolic compounds in two cultivars of Sorghum bicolor L. Iranian Journal of Plant Biology 9(33): 19-38 (in Persian).

Santiago, L. J. M., Louro, R. P. and De Oliveira, D. E. (2000) Compartmentation of Phenolic Compounds and Phenylalanine Ammonia-Lyase in Leaves of Phyllanthus tenellus Roxb. and their Induction by Copper Sulphate. Annals of Botany 86(5): 1023-1032.

Shahid, M., Pourrut, B., Dumat, C., Nadeem, M., Aslam, M. and Pinelli, E. (2014) Heavy-metal induced reactive oxygen species: phytotoxicity and physicochemical changes in plants. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology 232(1): 1-44.

Sharma, R. K. and Madhulika, A. (2005) Biological effects of heavy metals: An overview. Environmental Biology. 26: 301-313.

Singh, R. P., Murthy, K. N. and Jayaprakasha, G. K. (2002) Studies on the antioxidant activity of Pomegranate peel and seed extracts using in vitro models. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50: 81-86.

Soltani, F., Ghorbanli, M. and Manouchehri-kalantari, K. H. (2006) Effect of cadmium on photosynthetic pigments, sugars and malondealdehyde content in Brassica napus L. Iranian Journal Biology 19(2): 136-145.

Steyn, W.J., Wand, S.J. E., Holcroft, D.M. and Jacobs, G. (2002) Anthocyanins in vegetative tissues: a proposed unified function in photoprotection. New Phytologist 155(3): 349-361.

Tian, X., and Li, Y. (2007) Nitric oxide treatment alleviates drought stress in wheat seedlings. Biologia Plantarum 50(4): 775-778.

Tripathi, A. K, Gupta, M. K., Verma, N., Sinha, S. and Bhushan, A. (2016) Antioxidative and biochemical responses in Dalbergia sissoo Roxb seedlings growing under cobalt and lead stress. Indian Journal of Forestry 39(3): 1-4.

Verma, S. and Dubey, R. S. (2003) Lead toxicity induces lipid peroxidation and alters the activities of antioxidant enzymes in growing rice plants. Plant Science 164(4): 645-655.

Zargari, A. S. (1997) Medicinal Plants. 5th edition, Tehran University Press, Tehran (in Persian Zhao, Y. D., Pan, Y. Z., Liu, B. Y. and Cai, L. (2012) Pilea cadierei Gagnep. guill's growth and accumulation under single and combined pollution of Cd and Pb. Journal of Agro-Environment Science 31(1): 48-53.

Zheljazkov, D., Craker, L. E. and Xing, B. (2006) Effects of Cd, Pb, and Cu on growth and essential oil contents in dill, peppermint, and basil. Environmental and Experimental Botany 58(1): 9-16.

Zengin, F. K. and Munzuroglu, O. (2005) Effects of some heavy metals on content of chlorophyll, proline and some antioxidant chemicals in bean (Phaseolus vulgaris L.) seedlings. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 47(2): 157-164.