نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ملایر، ملایر، ایران
2 گروه تغذیه گیاهی، مرکز نوآوری جهانی رولیر، سینت‌مالو، فرانسه
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Drought is one of the major constraints to crop plant growth and development. The endophytic fungus, Piriformospora indica increases plant growth and development and enhances abiotic stress tolerance. To better understand the effect of P. indica inoculation on some morphophysiological traits and yield of Barley (Hordeum Vulgare L.) under drought stress condition, we designed a factorial experiment in a completely randomized design with three replications. The experimental factors included two fungal levels (inoculated and non-inoculated) and three drought levels (F.C., 50% F.C., 25% F.C.). The results showed that inoculation of barley plants with P. indica enhances dry weight of colonized plants under both well-watered (7%) and water-deficit conditions (43%). Based on experiment data, P. indica increased carbon (4%), potassium (20%), proline (2.03 times) and GABA (20%) content in inoculated plants compared with control plant under drought stress; Besides, endophyte fungus P. indica promoted the photosynthetic capacity of inoculated plants by increasing K/Na and C/N ratios, hence improve drought stress tolerance. The results also showed that P. indica increases the most of the measured yield parameters like as seed (86%) and spike number (66%), TGW (26%) and seed yield (1.9 times) in inoculated plants compared with control plants under ambient and stress condition. As, P. indica can be easily propagated in the absence of a host plant, it can be concluded that treatment with this endophytic fungus as bio-fertilizer can enhance the growth and yield of barley plants, which may act as an alternative to conventional chemical-based strategies.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
گیاهان در طول زندگی خود به‌طور مداوم در معرض تنش‌های غیرزیستی مانند خشکی قرار می‌گیرند. خشکی معمولی‌ترین تنش محیطی است که می‌تواند بر رشد و نمو گیاهان در سرتاسر جهان و به‌ویژه مناطق خشک و نیمه‌خشک تأثیرگذار باشد؛ بنابراین خشکسالی و کمبود آب به عمده‌ترین محدودیت تولید محصولات زراعی مانند جو تبدیل شده است (Fang and Xiong, 2015). همچنین، تنش خشکی باعث تغییرات ساختاری، فیزیولوژیک و بیوشیمیایی در گیاهان گردیده است (Ghosh et al., 2017). باتوجهبه تغییرات جهانی آب‌و‌هوا و به مخاطره افتادن امنیت غذایی در نتیجه روند رو به افزایش خشکی، مطالعات در زمینه خشکی مورد توجه قرار گرفته است.
ارتباطات بین قارچ‌های اندوفیت و گیاهان میزبان ممکن است بر آثار تنش‌های غیرزیستی در تنظیم و تغییر فعالیت‌های متابولیک، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک گیاهان تأثیر گذاشته و مقاومت به تنش‌های مختلف را افزایش دهند. همزیـستی میـکوریـزی یکی از مهمترین روابط همزیستی است که در آن قارچ‌های میکوریزی با تسهیل انتقال عناصر غذایی، سبب بهبود رشد گیاه می‌شوند. به‌علاوه این همزیستی به تولید هورمون‌های محرک رشد، افزایش عملکرد، کاهش آثار تنش‌های محیطی و همچنین، کاهش مصرف کودهای شیمیایی کمک شایانی می‌نماید (Kirch, et al., 2000). باوجوداین مزایا، عدم امکان رشد و تکثیر قارچ‌های میکوریزی در محیط‌کشت‌های مصنوعی به ناتوانی در تولید انبوه این قارچ‌ها به‌منظور مطالعه گسترده آثار آنها منجر شده است.
قارچ Piriformospora indica، قارچی شبه‌میکوریزی است که در سال 1998 توسط وارما و همکاران (Varma et al., 1999) در ایالت راجستان کشور هندوستان شناسایی و جـداسازی شد. این قارچ توانایی برقراری رابطه همزیستی با دامنه وسیـعی از گیاهان میزبان شامل انواع خشکی‌پسند، بوته‌های یک‌ساله و چندساله و درختان چوبی را دارد (Rai, et al., 2005; Khalvandi et al., 2017). قـارچ P. indica برخلاف قارچ‌های میکوریزی، همزیست اختیاری است و قادر به رشد در محیط‌های کشت مصنوعی است. تأثیر قارچ بر افزایش رشد، عمـلکرد و مقاومت به تنش‌های غیرزیستی مانند شوری و خشکی در گیاهان مختلف گزارش شده است (Rai, et al., 2005; Varma et al., 2012). جو (Hordeum vulgare L.) گیاه زراعی مهم در سرتاسر جهان است و کاربردهای گسترده‌ای دارد. نتایج بررسی تأثیر تلقیح گیاه جو با قارچ P. indica نشان داده است که قارچ باعث بهبود صفات مورفولوژیک و فیزیولوژیک می‌شود و همچنین مقاومت گیاهان تلقیح‌شده به تنش شوری و خشکی را افزایش می‌دهد (Ghabooli et al., 2014; Waller et al., 2005). تنظیم اسمزی از جمله سازوکارهای پاسخ به تنش‌های محیطی است که می‌تواند از طریق تجمع مواد محلول در سلول‌ها به حفظ تورژسانس سلول‌ها و فرایندهای وابسته به آن در پتانسیل‌های کم‌آب منجر شود. در زمان تنش خشکی، مولکول‌های آلی دارای وزن مولکولی کمتر مانند قندهای محلول و اسیدهای آمینه آزاد در ریشه‌ها و اندام‌های هوایی گیاهان به‌منزله تنظیم‌کننده‌های اسمزی عمل می‌کنند (Rahimi et al., 2019).
مطالعات پیشین نشان داد که تلقیح گیاهان جو با قارچ P. indica باعث افزایش مقاومت به تنش‌های خشکی و شوری می‌شود. نتایج برخی پژوهش‌ها ثابت کرده است که تلقیح گیاهان با قارچ باعث افزایش محتوای مواد محلول مانند پرولین، گابا، قندها و همچنین، حفظ تعادل یون‌ها در شرایط تنش خشکی و شوری می‌شود (Ghaffari et al., 2016; Abdelaziz et al., 2019). نتایج اغلب پژوهش‌ها بر تأثیر مثبت قارچ P. indica بر رشد و شاخص‌های مورفوفیزیولوژیک و بیوشیمیایی گیاهان میزبان در مرحله گیاهچه‌ای (رشد رویشی) تأکید دارند و پژوهش‌های محدودی درباره تأثیر این قارچ بر عملکرد گیاهان میزبان منتشر شده است، بنابراین، هدف این پژوهش مطالعه آثار مثبت قارچ بر رشد و برخی عوامل مورفوفیزیولوژیک در زمان گل‌دهی و اوایل دوره ظهور سنبله‌ها و همچنین، عوامل عملکردی گیاه جو (Hordeum vulgare L.) است.
مواد و روش‌ها
تهیه و تکثیر مایه تلقیح قارچ P. indica
جدایه قارچ با تهیه تعداد کافی پتری‌دیش محتوی محیط‌کشت Hill و Kaefer (حاوی عناصر میکرو، ماکرو، نمک‌ها، پپتون و عصاره مخمر)، کشت و در دمای 24 درجه سانتیگراد به‌مدت 4 هفته نگهداری شد. پس از سپری شدن مدت زمان لازم برای تولید اسپور، مقدار 20-30 میلی‌لیتر محلول آب-توئین 20 درصد به هر پتری‌دیش افزوده شد و پس از جمع‌آوری اسپورهای قارچ، تعداد آنها با استفاده از لام نئوبار شمارش شد (Ghabooli et al., 2013).
کشت گیاه و اعمال تیمارها
در این پژوهش، از خاک طبیعی و گلدان‌های 5 کیلوگرمی استفاده شد. برای جلوگیری از آثار ناخواسته سایر میکروارگانیسم‌های موجود در خاک و برهمکنش آنها با قارچ P. indica، خاک در کیسه‌های 10 کیلوگرمی به‌مدت 30 دقیقه در دمای 121 درجه سانتیگراد در اتوکلاو استریل شد. این پژوهش به‌صورت آزمایش گلخانه‌ای در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام گردید. عوامل آزمایش شامل 3 سطح خشکی (ظرفیت زراعی (F.C.)، 50% ظرفیت زراعی و 25% ظرفیت زراعی) و 2 سطح تیمار قارچ (تلقیح و عدم‌تلقیح) بودند. بذر جو واریته Golden promise از مؤسسه تحقیقات ژنتیک گیاهی و گیاهان زراعی (IPK) آلمان تهیه شد. سپس بذرهای جوانهدارشده با مایه تلقیح قارچ حاوی 105×5 اسپور در میلی‌لیتر تلقیح و برای اتصال اسپورهای قارچ به سطح ریشه‌چه، به‌مدت 20 دقیقه روی شیکر با دور آرام قرار داده شدند، سپس تعداد 5 گیاهچه تلقیح‌شده با قارچ در داخل هر گلدان کاشته شد. لازم‌به‌ذکر است که در مورد تیمار شاهد، بذرهای جوانهدارشده جو با محلول آب-توئین فاقد اسپور تیمار و در گلدان کشت شدند. گلدان‌ها پس از کشت تا زمان اتمام دوره رشد گیاه، به گلخانه با طول دوره روشنایی 16 ساعت و با بیشینه دمای روزانه 22 تا 24 درجه سانتیگراد، دمای شبانه 18 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 60 درصد منتقل شدند. 10 روز پس از کاشت گیاهان، نمونه‌برداری از ریشه گیاهان تلقیح‌شده برای تعیین میزان آلودگی ریشه با قارچ با برداشت 2 گیاه در هر گلدان و سپس رنگ‌آمیزی و مشاهده آنها در زیر میکروسکوپ صورت پذیرفت (درصد کلونیزاسیون ریشه: نسبت ریشه‌هایی که در آنها اندام‌های قارچ مشاهده شده نسبت به کل ریشه‌های مورد مطالعه. این نسبت در گیاهان شاهد برابر با صفر بود). گلدان‌ها تا سه هفته در حد ظرفیت زراعی نگه داشته شدند و اعمال تنش خشکی 21 روز پس از کاشت گیاهان انجام شد. برای اعمال تنش خشکی، ظرفیت زراعی خاک موردنظر در آزمایشگاه تعیین شد و تنش با قطع آبیاری و با توزین روزانه گلدان‌ها و تنظیم آنها در میزان رطوبت مورد نظر اعمال شد.
نمونه‌برداری و اندازه‌گیری عوامل مورفوفیزیولوژیک در اوایل گل‌دهی و ظهور سنبله‌ها
14 هفته پس از اعمال تنش و در دوره گل‌دهی و ظهور سنبله‌ها، نمونه‌برداری از اندام‌های هوایی گیاهان انجام شد. برای این منظور یک گیاه از هر گلدان برداشت شد. پس از تعیین وزن تر نمونه‌های گیاهی برداشت‌شده، نمونه‌های یادشده به‌مدت 48 ساعت در آون با دمای 65 درجه سانتیگراد قرار داده شدند و وزن خشک آنها نیز محاسبه گردید. همچنین از هر گیاه، نمونه‌هایی به‌منظور اندازه‌گیری شاخص‌های مورد نظر برداشت و بلافاصله در ازت مایع قرار داده شدند.
استخراج و اندازه‌گیری پرولین، گابا و نشاسته
اندازه‌گیری اسیدهای آمینه پرولین و گابا با استفاده از روش رولتشک و همکاران (Rolletschek et al., 2002) با اندکی تغییرات انجام شد. برای این کار 3 میلی‌گرم از پودر AQC (6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl carbamate) در 1 میلی‌لیتر استونیتریل خالص حل و سپس در 55 درجه سانتیگراد برای بیشینه 10 دقیقه انکوبه شد. محلول 2/0 مولار اسید بوریک با اسیدیته 8/8 تهیه شد (بافر بورات). برای هر نمونه، 160 میکرولیتر بافر، 20 میکرولیتر از استاندارد یا نمونه و 20 میکرولیتر از معرف AQC درون هر تیوپ ریخته و سپس نمونه‌ها به‌مدت 10 دقیقه در 55 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. نمونه‌ها به‌مدت 1 دقیقه در rpm8000 سانتریفیوژ (MPW-260R) و پس از انتقال به پلیت با استفاده از دستگاه HPLC (waters 2795 separation module) در 400 نانومتر قرائت انجام شد. عصاره‌گیری از نمونه‌ها برای اندازه‌گیری نشاسته بر اساس روش ول و همکاران (Voll et al., 2003) با اندکی تغییرات و با استفاده از دستگاه Microtitre plate reader انجام گرفت. 50 میلی‌گرم از بافت پودرشده به همراه 750 میکرولیتر اتانول 80% به تیوپ 5/1 میلی‌لیتری اضافه گردید. نمونه‌ها به مدت 75 دقیقه در دمای 80 درجه سانتیگراد و سپس به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند و سپس به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد و در rpm14000 سانتریفیوژ شدند. به‌منظور استخراج و اندازه‌گیری نشاسته، رسوب حاصله استفاده شد. اندازه‌گیری شاخص‌های موردنظر در نمونه‌ها در 3 تکرار زیستی و 2 تکرار تکنیکی انجام شد.
اندازه‌گیری کربن، نیتروژن، سدیم و پتاسیم
اندازه‌گیری کربن و نیتروژن با استفاده از روش رولتشک و همکاران (Rolletschek et al., 2002) با اندکی تغییرات انجام شد. ابتدا مقداری از بافت پودرشده گیاهی با استفاده از دستگاه IMAGO 500 (شرکت Dieter-Piatkowski) و تحت خلأ خشک شد. سپس مقدار 4/1 تا 6/1 میلی‌گرم از بافت خشک‌شده درون فویل‌های آلومینیومی کوچک (ابعاد 9×5 میلی‌متری) قرار داده شده و با استفاده از دستگاه Euro EA Elemental Analyser (شرکت EUROVECTORE) میزان کربن و نیتروژن موجود در نمونه‌ها قرائت شد. اندازه‌گیری عناصر سدیم و پتاسیم مطابق با روش گروبر و همکاران (Gruber et al., 2013) با اندکی تغییرات انجام شد. برای این کار مقدار 100 میلی‌گرم از بافت پودرشده گیاهی تحت خلأ و دمای پایین خشک شدند.10 میلی‌گرم از بافت خشک‌شده درون تیوب‌ها ریخته شد و به هر تیوب 2 میلی‌لیتر HNO3 اضافه شد تا هضم نمونه‌ها انجام شود. سپس تمام مواد جامد نمونه تبدیل به مایع شد و در نهایت با استفاده از دستگاه ICP-OES (Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA) میزان عناصر هر نمونه اندازه‌گیری شد.
اندازه‌گیری شاخص‌های عملکرد
پس از تکمیل دوره رشد و برداشت گیاهان، شاخص‌های عملکردی مانند تعداد سنبله در گیاه، تعداد بذر در هر گیاه، عملکرد بذر در گیاه، وزن هزار دانه، طول بذر و سطح بذر با استفاده از دستگاه Marvin instrument اندازه‌گیری شد (Kalladan et al, 2013).
تجزیه‌و‌تحلیل آماری داده‌ها
برای تجزیه آماری نتایج از نرم افزار JMP نسخه 13.2.0 و برای رسم نمودارها از نرم‌افزار اکسل استفاده شد. مقایسه میانگین تیمارها با استفاده از روش آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح 5 درصد انجام شد.
نتایج و بحث
بررسی میزان کلونیزاسیون ریشه
نتایج بررسی میکروسکوپی همانند پژوهش‌های پیشین نشان داد که قارچ P.indica توان بالایی در کلونیزاسیون ریشه گیاه جو دارد، به‌طوری‌که بیش از 80% ریشه‌ها توسط قارچ آلوده شده بودند. توانایی کلونیزاسیون ریشه جو توسط قارچ در پژوهش‌های پیشین اثبات شده است (Ghabooli et al., 2013; Ghaffari et al., 2016).
وزن تر و خشک اندام هوایی
نتایج تجزیه واریانس وزن خشک و تر اندام هوایی در جدول (1) آورده شده است. نتایج نشان داد تنش خشکی سبب کاهش وزن خشک و تر اندام هوایی گیاهان تلقیح‌شده و تلقیح‌نشده می‌شود. بیشترین کاهش در تیمار خشکی شدید مشاهده شد، به‌طوری‌که تنش شدید به‌ترتیب باعث کاهش 46 و 47 درصدی وزن تر و خشک اندام هوایی در گیاهان تلقیح‌نشده گردید، بااین‌حال میزان این کاهش در گیاهان تلقیح‌شده با قارچ P. indica به ترتیب 27 و 29 درصد بود. نتایج اندازه‌گیری وزن خشک (شکل 1) نشان داد در سه تیمار خشکی بین گیاهان تلقیح‌نشده و تلقیح‌شده اختلاف معنی‌داری وجود دارد و این اختلاف با افزایش تنش مشهودتر است. قارچ در شرایط بدون تنش باعث افزایش 7% (08/1 گرم در بوته) وزن خشک گیاهان تلقیح‌شده گردید، درحالیکه در شرایط تنش خشکی شدید این مقدار به 43% (50/3 گرم در بوته) افزایش پیدا کرده است. همچنین، قارچ توانسته است آثار منفی تنش خشکی بر افت وزن خشک گیاه را کاهش دهد، به‌طوری‌که در گیاهان تلقیح‌نشده 47% (27/7 گرم در بوته) کاهش در وزن خشک مشاهده می‌شود، درحالیکه در گیاهان تلقیح‌شده این مقدار 29% (85/4 گرم در بوته) است. استفاده از وزن خشک گیاه به‌عنوان شاخص تحمل به تنش‌هایی نظیر خشکی و شوری مورد استفاده قرار گرفته است (Shannon et al., 1998; Ghaffari et al., 2016). در این پژوهش از وزن خشک به‌عنوان معیاری برای بررسی میزان تحمل گیاهان موردمطالعه به تنش خشکی و مقایسه آنها استفاده شد و نتایج نشان داد قارچ دارای اثر تحریک‌کنندگی بر وزن خشک است. به نظر می‌رسد میسیلیوم‌های قارچ با افزایش سطح جذب گیاهان تلقیح‌شده و کمک به نگهداری آب در اطراف گیاه سبب رشد بهتر اندام‌های هوایی و تأمین سطح فتوسنتزی کارآمد و در نتیجه تولید ماده خشک بیشتر می‌گردند. این امر به‌ویژه در شرایط تنش برای گیاهان دارای اهمیّت زیادی است (Ghabooli et al., 2013). باتوجهبه اینکه از وزن خشک گیاه به‌عنوان شاخص تحمل به تنش استفاده می‌شود، میتوان نتیجه گرفت که قارچ در افزایش مقاومت به تنش خشکی مؤثر بوده است. تأثیر مثبت قارچ بر میزان وزن خشک ریشه و اندام هوایی گیاهان جو تلقیح‌شده با قارچ در چندین پژوهش مستقل گزارش شده است (Alikhani et al., 2013; Waller et al., 2005).
شکل 1- نمودار پاسخ وزن خشک اندام هوایی گیاه جو به سطوح مختلف خشکی در شرایط تلقیح و بدون تلقیح با قارچ P. indica. مقادیر میانگین سه تکرار±SE است. حروف غیرمشترک بیانگر تفاوت معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح 5% است.
Fig 1- Comparing total shoot dry weight in P. indica inoculated and non-inoculated barley plants under different levels of drought stress. Values are given as means ± SE from three replicates. Different letters indicate significant differences at p ≤0.05 by Duncan’s multiple range test.
جدول 1- میانگین مربعات اثر تیمارهای بررسی‌شده بر وزن تر و خشک اندام هوایی
Table 1- Mean square of studied treatments on total shoot fresh and dry weight
|
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
||
|
وزن تر اندام هوایی |
وزن خشک اندام هوایی |
|
||
|
خشکی |
2 |
**15/1782 |
**02/55 |
|
|
قارچ |
1 |
**61/534 |
**15/24 |
|
|
خشکی × قارچ |
2 |
ns 28/92 |
ns 20/2 |
|
|
خطا |
12 |
28/25 |
069/1 |
|
ns، * و **: به‌ترتیب غیرمعنی‌دار و معنی‌دار در سطح احتمال 5 و 1 درصد
ns, *, **: Non significant and significant at 5% and 1% probability levels, respectively
اندازه گیری نشاسته، پرولین و گابا
نتایج آنالیز تجزیه واریانس نشاسته، پرولین و گابا در جدول (2) و نتایج بررسی آنها در شکل (2) نشان داده شده است. خشکی باعث کاهش معنی‌دار در میزان نشاسته برگ گیاهان مورد بررسی نگردید. همچنین، اگرچه میزان نشاسته در گیاهان تلقیح‌شده نسبت به گیاهان تلقیح‌نشده در تمام سطوح خشکی بالاتر است، اما این تفاوت تنها در شرایط بهینه معنی‌دار بود و به نظر می‌رسد قارچ تأثیر زیادی بر سطوح نشاسته در گیاهان مورد بررسی در شرایط تنش ندارد. نشاسته در اکثر گیاهان به‌عنوان منبع اصلی ذخیره کربوهیدرات است و متابولیسم آن به تغییرات محیطی بسیار حساس است. علاوه‌بر نوسانات روزانه در سطوح نشاسته، تنش‌های شوری و خشکی عموماً به کاهش محتوای نشاسته منجر می‌شوند (Kempa et al., 2008; Basu et al., 2007). به نظر می‌رسد که تنش خشکی در این مرحله بر محتوای نشاسته و همچنین، فعالیت آنزیم بتا-آمیلاز تأثیر کاهشی معنی‌داری نداشته است.
نتایج این پژوهش نشان داد که تنش خشکی باعث افزایش پرولین (1/3 برابر در گیاهان تلقیح‌شده و 9/1 برابر در گیاهان تلقیح‌نشده؛ به ترتیب 29/722 و 68/247 نانومول برگرم وزن تازه افزایش یافت) در هر دو گروه از گیاهان مورد بررسی گردیده است. میزان افزایش پرولین در خشکی متوسط کم بود، درحالیکه با افزایش تنش میزان پرولین نیز افزایش پیدا کرد. قارچ در شرایط بدون تنش باعث افزایش 23% میزان پرولین گردید، درحالیکه در شرایط تنش خشکی شدید این مقدار به 03/2 برابر افزایش پیدا کرده است. به‌طور سنتی، پرولین به‌عنوان مهمترین اسید آمینه مرتبط با تنش در نظر گرفته می‌شود. جدا از نقش پرولین به‌عنوان حفاظت‌کننده اسمزی، این اسید آمینه در تنظیم تعادل سلولی نقش مهمی ایفا می‌کند (Podlešáková et al., 2019).
در این پژوهش نیز افزایش بیان پرولین تحت تنش خشکی مشاهده شد، اما آنچه مهم است بالاتر بودن میزان این افزایش در گیاهان تلقیح‌شده نسبت به گیاهان تلقیح‌نشده است. میزان پرولین در گیاهان تلقیح‌شده در شرایط تنش متوسط و شدید به‌طور معنی‌داری بیشتر از گیاهان تلقیح‌نشده بود که به نظر می‌رسد در مقاومت بالاتر این گیاهان به تنش مؤثر بوده است. تنش خشکی سبب افزایش معنی‌دار اسید آمینه گابا نیز گردیده است که روند این افزایش را میتوان در شکل (2) مشاهده کرد (به‌ترتیب 55% و 48% افزایش در گیاهان تلقیح‌شده و تلقیح‌نشده). همچنین، میزان اسید آمینه گابا در تمامی سطوح تنش در گیاهان تلقیح‌شده بالاتر از گیاهان تلقیح‌نشده بود و این تفاوت در تنش شدید معنی‌دار بود (قارچ در شرایط بدون تنش باعث افزایش 15% و در شرایط تنش شدید باعث افزایش 20% در میزان گابا گردید). گاما بوتریک اسید (گابا) یک اسید آمینه غیر پروتئینی است که تحت شرایط نامطلوب محیطی سریعاً تجمع پیدا می‌کند (Renault et al., 2010). متابولیسم گابا با توازن کربن-نیتروژن و زدودن ROSها مرتبط است (Liu et al., 2011). تصور می‌شود که گابا برای حفظ روابط متقابل قارچ-گیاه نیز مورد نیاز باشد. بنابراین، گابا احتمالا می‌تواند به‌عنوان یک نشانگرزیستی متابولیک برای تعامل متقابل در روابط همزیستی یا برای تنش‌های زیستی در نظر گرفته شود (Scott et al., 2007). مطالعاتی در زمینه ارتباط پرولین با گابا در تنظیم مقاومت به تنش‌ها انجام شده است (Podlešáková et al., 2019). مطالعات بیشتر در زمینه ارتباطات بین گابا با پرولین می‌تواند در درک نقش این اسیدهای آمینه در رشد گیاه و پاسخ به تنش‌ها کلیدی باشد. نتایج پژوهش حاضر با نتایج پژوهش سایر محققان هم‌خوانی دارد، به‌طوری‌که نتایج آنها نشان می‌دهد که تنش خشکی و تیمار با قارچ P. indica سبب افزایش تجمع پرولین و گابا می‌شود (Rai, 2002; Ghaffari et al., 2016; Song et al., 2010).
شکل 2- مقایسه محتوای نشاسته، پرولین و گابا تحت تأثیر سطوح محتلف خشکی در شرایط تلقیح و بدون‌تلقیح با قارچ P. indica. مقادیر میانگین سه تکرار±SE است. حروف غیرمشترک بیانگرتفاوت معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح 5% است.
Fig 2- Comparing starch, proline and GABA contents in P. indica inoculated and non-inoculated plants under different levels of drought stress. Values are given as means ± SE from three replicates. Different letters indicate significant differences at p ≤0.05 by Duncan’s multiple range test.
اندازه‌گیری کربن، نیتروژن، سدیم و پتاسیم
نتایج آنالیز تجزیه واریانس عناصر نیتروژن و کربن در جدول (3) آورده شده است. نتایج نشان داد که اثرات ساده و متقابل بر میزان نیتروژن معنی‌دار نیست؛ البته قارچ باعث افزایش جزیی این عنصر به‌ویژه در شرایط تنش خشکی گردید. بر اساس نتایج جدول تجزیه واریانس، آثار ساده خشکی و قارچ بر میزان کربن بسیار معنی‌دار است، اما اثرات متقابل معنی‌دار نیست. خشکی سبب کاهش معنی‌دار کربن در هر دو گروه از گیاهان تلقیح‌شده و تلقیح‌نشده می‌شود، اما میزان این کاهش در گیاهان تلقیح‌شده کمتر است. همچنین، در تمام سطوح تنش خشکی میزان کربن در گیاهان تلقیح‌شده بالاتر بود (3% در شرایط نرمال و 4% در شرایط تنش) (شکل 3).
جدول 2- میانگین مربعات اثر تیمارهای بررسی‌شده بر شاخص‌های پرولین، گابا و نشاسته
Table 2- Mean square of studied treatments on proline, GABA and starch
|
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
|
|||
|
پرولین |
گابا |
نشاسته |
|
|||
|
خشکی |
2 |
**6/747103 |
**96/55170 |
ns 529/0 |
|
|
|
قارچ |
1 |
**9/680710 |
*40/14385 |
*48/2 |
|
|
|
خشکی × قارچ |
2 |
**2/176101 |
ns 44/3180 |
ns 281/0 |
|
|
|
خطا |
30 |
16744 |
0/3020 |
329/0 |
|
|
ns، * و **: به ترتیب غیرمعنی‌دار و معنی‌دار در سطح احتمال 5 و 1 درصد
ns, *, **: Non significant and significant at 5% and 1% probability levels, respectively
شکل 3- مقایسه نسبت کربن به نیتروژن و نمودار پاسخ کربن و نیتروژن به سطوح مختلف خشکی در شرایط تلقیح و بدون‌تلقیح با قارچ P. indica. مقادیر میانگین سه تکرار±SE است. حروف غیرمشترک بیانگرتفاوت معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح 5% است.
Fig 3- Comparing carbon, nitrogen and C/N ratio in P. indica inoculated and non-inoculated plants under different levels of drought stress. Values are given as means ± SE from three replicates. Different letters indicate significant differences at p≤0.05 by Duncan’s multiple range test.
کربن و نیتروژن از عوامل ضروری بوده و برای کارکردهای گوناگون سلولی حیاتی هستند و بنابراین، تأمین این دو عنصر برای رشد و نمو، پاسخ به تنش‌ها و در نهایت تکمیل چرخه زندگی ضروری است (Waraich et al., 2011). نتایج برخی مطالعات نشان می‌دهد که قارچ P. indica جذب و متابولیسم نیتروژن را تحریک (Oelmüller et al., 2009) و اسیمیلاسیون کربن را افزایش می‌دهد (Das et al., 2012).
نسبت کربن به نیتروژن شاخص مهمی در بررسی رشد یک گیاه در شرایط مختلف از جمله تنش است. بررسی این نسبت نشان می‌دهد که خشکی باعث کاهش آن می‌شود؛ در گیاهان تلقیح‌شده این نسبت در شرایط تنش خشکی بالاتر از گیاهان تلقیح‌نشده است. عموماً تنش با اثرگذاری منفی بر فرایند فتوسنتز باعث کاهش فراهمی کربن در گیاهان می‌شود و بنابراین، نسبت کربن به نیتروژن را کاهش می‌دهد. در این پژوهش نیز این کاهش نسبت مشاهده شد. اما تلقیح گیاهان با قارچ باعث افزایش این نسبت در هر سه سطح تنش خشکی شد و این امر نشان می‌دهد که در گیاهان تلقیح‌شده، آثار منفی تنش بر فتوسنتز و فراهمی کربن کاهش یافته است و این امر باعث افزایش رشد اندام‌های رویشی و در نیتجه افزایش وزن گیاهان شده است (Ghaffari et al., 2016).
در جدول (3) نتایج تجزیه واریانس سدیم و پتاسیم آورده شده است. بر اساس این نتایج، در مورد عنصر سدیم تنها اثر ساده خشکی معنی‌دار است، اما در مورد عنصر پتاسیم، اثرات ساده و متقابل معنی‌دار هستند. خشکی باعث افزایش عنصر سدیم شد (به‌ترتیب 46% و 60% در گیاهان تلقیح‌شده و تلقیح‌نشده). همچنین، بررسی‌ها نشان می‌دهد میزان این عنصر در گیاهان تلقیح‌شده بالاتر از گیاهان تلقیح‌نشده است، اما این افزایش معنی‌دار نیست. بررسی نتایج همچنین نشان می‌دهد که پتاسیم نیز در شرایط تنش خشکی افزایش می‌یابد و میزان این افزایش در گیاهان تلقیح‌شده بیشتر است (به‌ترتیب 34% و 59% در گیاهان تلقیح‌شده و تلقیح‌نشده) (شکل 4). همچنین، تلقیح گیاهان جو با قارچ P. indica محتوای پتاسیم را افزایش داده است، به‌طوری‌که در شرایط نرمال تلقیح با قارچ باعث افزایش حدود 1% پتاسیم شده، درحالیکه در شرایط تنش خشکی شدید این مقدار به 20% افزایش پیدا کرده است.
جدول 3- میانگین مربعات اثر تیمارهای بررسی‌شده بر عناصر نیتروژن، کربن، سدیم و پتاسیم
Table 3- Mean square of studied treatments on nitrogen, carbon, sodium and potassium elements.
|
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
|||
|
نیتروژن |
کربن |
سدیم |
پتاسیم |
||
|
خشکی |
2 |
ns 1549/0 |
**957/16 |
6/1341345** |
**405983725 |
|
قارچ |
1 |
ns 00007/0 |
**556/19 |
ns 64940 |
**58828900 |
|
خشکی × قارچ |
2 |
ns 1323/0 |
ns 1797/0 |
ns 2/23320 |
**5/32033508 |
|
خطا |
30 |
055981/0 |
4362/2 |
16080 |
4/1630554 |
ns، * و **: به ترتیب غیرمعنی‌دار و معنی‌دار در سطح احتمال 5 و 1 درصد
ns, *, **: Non significant and significant at 5% and 1% probability levels, respectively
گیاهان در مواجهه با تنش‌های غیرزیستی نظیر خشکی و شوری از طریق سنتز محلول‌های سازگار (اسمولیت‌ها) و یا با افزایش جذب یون‌های غیرآلی (پتاسیم و سدیم) تنظیم اسمزی را انجام دهند. در مقایسه با روش تولید اسمولیت، افزایش جذب یون‌های معدنی از نظر انرژی به صرفه‌تر است (Shabala et al., 2010)؛ البته جذب سدیم و افزایش آن در سلول باعث سمیّت می‌شود، بنابراین افزایش جذب پتاسیم یکی از راه‌های مؤثر و کارا برای مقابله با تنش‌هاست (Waraich et al., 2011).
افزایش میزان پتاسیم شاخص مهمی در مقاومت به تنش خشکی است و به نظر می‌رسد تلقیح با قارچ P. indica میزان پتاسیم را در گیاهان تلقیح‌شده افزایش می‌دهد. نتایج یون و همکاران (2018) نیز نشان داد که گیاهان تلقیح‌شده قادرند بارگیری پتاسیم را در ریشه‌ها تنظیم کرده و مقادیر کافی از پتاسیم را به شاخه‌ها منتقل کنند (Yun et al., 2018).
در بافت‌های گیاهی بالا بودن نسبت پتاسیم به سدیم به‌عنوان یکی از سازوکارهای فیزیولوژیک در ایجاد تحمل به تنش مورد توجه قرار گرفته است. این نسبت یک نشانگر قابل اطمینان از شدت تنش است و برای شناسایی ژنوتیپ‌های گیاهی مقاوم مورد استفاده قرار می‌گیرد. معمولاً نسبت پتاسیم به سدیم با افزایش خشکی کاهش پیدا می‌کند؛ در آزمایش حاضر گیاهان تلقیح‌نشده و تلقیح‌شده جو توانسته‌اند تا حدی این کاهش را در شرایط تنش شدید جبران کنند که به نظر می‌رسد به‌علت توانایی این گیاه در مقاومت به تنش خشکی باشد؛ از طرفی نسبت پتاسیم به سدیم در گیاهان تلقیح‌شده نیز بالاتر است و این تفاوت در شرایط تنش شدید بالاتر است. بالا بودن این نسبت در گیاهان تلقیح‌شده با قارچ در مقایسه با گیاهان تلقیح‌نشده، مقاومت آنها را به تنش خشکی افزایش می‌دهد. نتایج عبدالعزیز و همکاران (2017) نشان داد کلونیزاسیون آرابیدوپسیس با قارچ P. indica تعادل پتاسیم و سدیم را در شرایط تنش تغییر می‌دهد (Abdelaziz et al., 2017).
اندازه‌گیری صفات عملکردی
تعداد سنبله و بذر در گیاه: نتایج نشان داد که سطوح مختلف خشکی تأثیر معنی‌داری بر تعداد سنبله و تعداد بذر دارد (جدول‌های 4 و 5). با افزایش سطح تنش میزان این تأثیر افزایش می‌یابد، اما در گیاهان تلقیح‌شده تنش متوسط و شدید تأثیر یکسانی بر میزان این کاهش دارند. تنش در مراحل پیش و پس از گل‌دهی ممکن است به کاهش عملکرد از طریق کاهش تعداد سنبله و باروری سنبلچه‌ها منجر شود (Thomashow, 1999; Kaur et al., 2000). میزان کاهش در تعداد سنبله و بذر در گیاهان تلقیح‌شده نسبت به گیاهان تلقیح‌نشده کمتر است، به‌طوری‌که تفاوت تعداد سنبله در تمام تیمارها و تفاوت تعداد بذر در تیمار تنش شدید و رطوبت کامل بین گیاهان تلقیح‌شده و تلقیح‌نشده معنی‌دار است و تأثیر قارچ بر هر دو شاخص مثبت است (به‌ترتیب 66% و 86% افزایش در تعداد سنبله و تعداد بذر در گیاهان تلقیح‌شده در مقایسه با گیاهان تلقیح‌نشده در تنش شدید).
شکل 4- مقایسه نسبت پتاسیم به سدیم و نمودار پاسخ سدیم و پتاسیم به سطوح مختلف خشکی در شرایط تلقیح و بدون‌تلقیح با قارچ P. indica. مقادیر میانگین سه تکرار±SE است. حروف غیرمشترک بیانگرتفاوت معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح 5% است.
Fig 4- Comparing sodium, potassium and K/Na ratio in P. indica inoculated and non-inoculated plants under different levels of drought stress. Values are given as means ± SE from three replicates. Different letters indicate significant differences at p≤0.05 by Duncan’s multiple range test.
عملکرد بذر در گیاه و وزن هزار دانه: تنش خشکی شدید سبب کاهش معنی‌دار عملکرد بذر در گیاهان تلقیح‌نشده گردید، اما بر کاهش این شاخص در گیاهان تلقیح‌شده با قارچ تأثیر معنی‌داری نداشت (جدول 4). تلقیح با قارچ بر میزان این شاخص در شرایط بهینه و تنش متوسط تأثیر معنی‌داری نداشت، اما در شرایط تنش شدید سبب افزایش معنی‌دار عملکرد بذر در گیاهان تلقیح‌شده گردید؛ به‌طوری‌که قارچ باعث افزایش 9/1 برابری عملکرد بذر شده که درخور توجه است (جدول 5).
اندازه‌گیری وزن هزار دانه نیز نشان داد که سطوح مختلف تنش خشکی سبب کاهش معنی‌دار این شاخص در هر دو گیاهان مورد بررسی می‌شود. مقایسه گیاهان تلقیح‌نشده و تلقیح‌شده نشان داد که قارچ تأثیر معنی‌داری بر این شاخص در شرایط تنش شدید دارد، به‌طوری‌که باعث افزایش 26 درصدی وزن هزار دانه در گیاهان تلقیح‌شده گردیده است (جدول‌های 4 و 5). نتایج پژوهش‌ها نشان داده است که تنش خشکی به‌طور معنی‌داری باعث کاهش عملکرد دانه و وزن هزار دانه در گیاه جو می‌شود (González et al., 2008). در این پژوهش نیز نتایج مشابهی در مورد این شاخص به‌دست آمد، اما قارچ توانسته بخشی از آثار مضر تنش را جبران نموده و به‌ویژه در شرایط تنش شدید سبب بهبود هر دو شاخص در گیاهان تلقیح‌شده با قارچ P. indica شود.
سطح و طول بذر: دو شاخص دیگری که در این پژوهش مورد بررسی قرار گرفتند، سطح و طول بذر بود. نتایج نشان داد که تنش خشکی و تلقیح با قارچ تأثیر معنی‌داری بر آنها ندارد؛ اگرچه میزان هر دو شاخص مورد بررسی در گیاهان تلقیح‌شده با قارچ نسبت به گیاهان تلقیح‌نشده بالاتر بود (جدول‌های 4 و 5).
در بسیاری از گیاهان زراعی بروز تنش آب در دوره رشد رویشی و به‌ویژه دوره گل‌دهی بحرانی است و وقوع آن در این مرحله، تعداد گل‌هایی را که به دانه تبدیل می‌شوند را به طور درخور توجهی کاهش می‌دهد. علت کاهش عملکرد در تیمارهای تنش را شاید بتوان به رشد رویشی کمتر و در پی آن سطح فتوسنتزکننده محدودتر و در نتیجه تولید ماده خشک کمتر در گیاه در شرایط خشکی نسبت داد. گزارش شده است که تعداد سنبله‌ها در گیاه در تیمارهای مختلف خشکی تغییر معنی‌داری داشته و تنش شدید تعداد را کاهش داده است. نتایج نشان داده است که تنش متوسط و شدید تعداد دانه در هر سنبله و وزن هزار دانه را در گیاه جو کاهش می‌دهد (Samarah et al., 2009). در این پژوهش، نتایج اندازه‌گیری شاخص‌های عملکردی نشان داد که قارچ در اکثر موارد تأثیر معنی‌داری بر میزان آنها دارد، به‌طوری‌که تلقیح گیاهان با قارچ سبب کاهش آثار سوء تنش شده و حتی در موارد عدم وجود تنش نیز میزان بیشتر این شاخص‌ها در گیاهان تلقیح‌شده بالاتر بود. این امر نشان می‌دهد که قارچ با تأثیر بر رشد، تأمین بیشتر آب و عناصر، فتوسنتر بیشتر و کارامدتر، افزایش متابولیت‌ها و آنتی‌اکسیدان‌ها در طول دوره رشد سبب می‌شود که گیاه در مرحله سنبله‌دهی و پرشدن دانه منابع بیشتری در اختیار داشته باشد و از طرفی با کاهش آثار مضر و نامناسب تنش، سبب افزایش عملکرد و شاخص‌های مرتبط با آن می‌گردد. تأثیر تلقیح گیاهان جو با قارچ P. indica در افزایش عملکرد در شرایط تنش شوری بررسی و نتایج نشان داده است که قارچ بر مقاومت به تنش شوری و افزایش عملکرد نقش داشته است (Waller et al., 2005). همچنین در پژوهش دیگری تأثیر قارچ بر بهبود اجزای عملکرد گیاه Curcuma longa مشخص شده است (Bajaj et al., 2014). به‌طور‌کلی، پژوهش‌های زیادی بر تأثیر میکروارگانیسم‌های مفید همزیست بر بهبود رشد و عملکرد گیاهان زراعی و باغی انجام شده است (Bagheri et al., 2019; Esna-Ashari and Bahrami, 2018). هدف این پژوهش، اثبات تأثیر مثبت تلقیح گیاهان جو با قارچ P. indica بر شاخص‌های مورفوفیزیولوژیک، عملکرد و همچنین کاهش آثار سوء تنش خشکی بود و نتایج نشان داد که قارچ از مرحله رویشی تا اتمام دوره رشد تأثیر مثبت و پیوسته‌ای بر بیشتر شاخص‌های اندازه‌گیری‌شده دارد و در نهایت به رشد و عملکرد بهتر گیاهان تلقیح‌شده در شرایط تنش کمک شایانی می‌نماید.
نتیجه‌گیری
کاهش وزن خشک و کارایی فتوسنتز و در نتیجه کاهش عملکرد یکی از مهمترین آثار تنش خشکی در کشت گیاهان زراعی مهمی مانند گندم و جو است. نتایج این پژوهش تأثیر منفی تنش خشکی بر ویژگی‌های مورفوفیزیولوژیک و صفات عملکردی را نشان داد که البته در بسیاری از پژوهش‌ها گزارش شده است. آنچه حائز اهمیت است، تأثیر مثبت قارچ در شرایط بدون تنش و تنش می‌باشد. پژوهش‌های پیشین نشان داده است که قارچ سبب افزایش ویژگی‌های مورفوفیزیولوژیک می‌شود و این تأثیرات را در سطح مولکولی نیز اعمال می‌کند؛ اما بسیاری از این پژوهش‌ها در مرحله گیاهچه‌ای انجام شده است؛ نتایج این پژوهش نشان داد که قارچ بر اغلب این شاخص‌ها از جمله اسیدهای آمینه پرولین و گابا، همچنین محتوای کربن و نیتروژن و نسبت‌های کربن/نیتروژن و پتاسیم/سدیم تأثیرات مثبت و معنی‌داری دارد و به نظر می‌رسد تا پایان دوره رشد، گیاه این تأثیرات را حفظ می‌کند و در نهایت سبب افزایش عوامل مؤثر بر عملکرد می‌گردد. این نتایج امید به استفاده از این قارچ را در سطح مزرعه‌ای برای افزایش عملکرد آشکار می‌نماید و افق تازه‌ای در جهت استفاده از کودهای زیستی به‌منظور افزایش عملکرد در مناطق خشک و نیمه‌خشک ایران با استفاده از منابع محدود آب را ایجاد می‌کند.
جدول 4. میانگین مربعات اثر تیمارهای بررسی‌شده بر صفات عملکردی
Table 4- Mean square of studied treatments on yield parameters.
|
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
|
||||
|
تعداد سنبله |
تعداد بذر |
عملکرد بذر |
وزن هزار دانه |
سطح بذر |
طول بذر |
||
|
خشکی |
2 |
**5/58 |
**05/42494 |
**94/24 |
**93/309 |
ns 0822/0 |
ns 0066/0 |
|
قارچ |
1 |
**72/46 |
**0/14112 |
*64/19 |
**11/69 |
ns 28/1 |
ns 005/0 |
|
خشکی × قارچ |
2 |
*72/2 |
*16/2829 |
ns 45/5 |
ns 54/7 |
ns 0066/0 |
ns 00001/0 |
|
خطا |
12 |
611/0 |
9/697 |
15/109 |
53/4 |
307/0 |
0072/0 |
ns، * و **: به ترتیب غیرمعنی‌دار و معنی‌دار در سطح احتمال 5 و 1 درصد
ns, *, **: Non significant and significant at 5% and 1% probability levels, respectively
جدول 5. مقایسه میانگین برخی صفات مرتبط با عملکرد تحت تأثیر سطوح مختلف تنش خشکی و تلقیح با قارچ
Table 5- Mean comparison of some yield-related parameters in different levels of drought stress and fungus inoculation.
|
خشکی |
قارچ |
تعداد سنبله در گیاه
|
تعداد بذر در گیاه
|
عملکرد بذر در گیاه (گرم) |
وزن هزار دانه (گرم)
|
سطح بذر (میلی‌متر مربع) |
طول بذر (میلی‌متر)
|
|
100% F.C. |
عدم تلقیح |
b 12 |
b 67/300 |
a 29/10 |
ab 89/40 |
a 60/22 |
a 87/3 |
|
تلقیح با قارچ |
a 16 |
a 0/360 |
a 30/11 |
a 73/43 |
a 07/23 |
a 90/3 |
|
|
50% F.C. |
عدم تلقیح |
d 67/8 |
c 67/234 |
a 01/9 |
c 75/36 |
a 67/22 |
a 90/3 |
|
تلقیح با قارچ |
c 33/10 |
c 67/245 |
a 98/9 |
bc 17/39 |
a 20/23 |
a 93/3 |
|
|
25% F.C. |
عدم تلقیح |
e 6 |
d 33/113 |
b 65/4 |
e 02/25 |
a 77/22 |
a 93/3 |
|
تلقیح با قارچ |
cd 10 |
c 0/211 |
a 94/8 |
d 52/31 |
a 37/23 |
a 97/3 |
در هر ستون میانگین‌هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک هستند در سطح 5 درصد دارای تفاوت معنی‌داری نیستند.
In each column, mean values marked with at least one common letter aren’t significantly different (p ≤ 0.05).
سپاسگزاری
نگارندگان بر خود لازم می‌دانند از دکتر محمدرضا حاجی رضایی استاد مؤسسه تحقیقات ژنتیک گیاهی و گیاهان زراعی (IPK) به‌واسطه حمایت ایشان از انجام این پژوهش تشکر و قدردانی نماید.
)
