تأثیر سالیسیلیک اسید بر فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز و محتوای فنل و فلاونوئید کل گل سازویی (Scrophularia striata L.) در شرایط تنش کم‌آبی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ایلام، ایلام، ایران

2 کارشناس آزمایشگاه بیوتکنولوژی -گروه آموزشی زراعت و اصلاح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه ایلام

3 گروه باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ایلام، ایلام، ایران

چکیده

چکیده

امروزه، کاربرد مواد تنظیم کننده رشد گیاهی، در بهبود مقاومت گیاهان به تنش خشکی افزایش یافته است. از این رو به‌منظور بررسی اثر سالیسیلیک اسید بر فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز و محتوای فنل و فلاونوئید کل گیاه گل سازویی تحت تنش کم-آبی آزمایشی به‌صورت فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار اجرا شد. فاکتورهای مورد بررسی شامل تنش کم‌آبی در چهار سطح (100، 75، 50 و 25 درصد ظرفیت زراعی) و محلول‌پاشی با سالیسیلیک اسید در دو سطح (0 و 5/1 میلی‌مولار اسید) بود. نتایج نشان داد در 75 و 25 درصد ظرفیت زراعی محلول‌پاشی با سالیسیلیک اسید، میزان مالون دی آلدئید را به‌ترتیب 81/17 و 04/34 درصد در مقایسه با تیمار عدم محلول‌پاشی کاهش داد. همچنین کاربرد محلول‌پاشی میزان نشت یونی را تحت شرایط تنش شدید خشکی کاهش داد. محلول‌پاشی با سالیسیلیک اسید تحت شرایط 100، 75، 50 و 25 درصد ظرفیت زراعی، مقدار فنل کل را به‌ترتیب به‌میزان 92/20، 00/33، 84/10 و 19/10 درصد افزایش داد. تحت شرایط تنش شدید خشکی، محلول‌پاشی با اسید سالیسیلیک میزان فلاونول و فلاونوئید را در مقایسه با شاهد افزایش داد. با اعمال تنش خشکی، فعالیت آنزیم کاتالاز در مقایسه با عدم تنش خشکی به‌ترتیب 09/36 و 65/67 درصد افزایش یافت. همچنین بیشترین مقدار فعالیت آنزیم پراکسیداز (07/1 واحد در میلی‌گرم پروتئین در دقیقه) در شرایط 25 درصد ظرفیت زراعی با محلول‌پاشی با سالیسیلیک اسید و کمترین میزان آن در شرایط 100 درصد ظرفیت زراعی به‌دست آمد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

The effect of salicylic acid on the activity of catalase and peroxidase enzymes and the content of phenol and flavonoid of (Scrophularia striata L.) under water deficit stress

نویسندگان [English]

  • Roholah Bazi Zlan 1
  • Arash Fazeli 1
  • Batool Zarei 2
  • Javad Erfani Moghadam 3
1 Agriculture and Plant Breeding Department, Faculty of Agriculture, Ilam University, Ilam, Iran
2 Expert of Biotechnology Laboratory - Educational Center for Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, University of Ilam
3 Horticulture Department, Faculty of Agriculture, Ilam University, Ilam, Iran
چکیده [English]

Nowadays, the use of plant growth regulators has increased in improving the resistance of plants to drought stress. Therefore, in order to investigate the effect of salicylic acid on antioxidant enzymes activity and secondary metabolites of Scrophularia striata under water deficit stress, an experiment was conducted as the arrangement in a randomized complete block design with three replications in 2018 at the research greenhouse of Ilam University. Treatments included water deficit stress at four levels (100, 75, 50 and 25% of field capacity) and foliar application with salicylic acid at two levels (0 and 1.5 mM). The results showed that in 75 and 25% of field capacity with salicylic acid, malondialdehyde decreased by 17.81% and 34.04% compared with non-foliar application treatment, respectively. Also, the application of foliar spray reduced the amount of ion leakage under severe drought-stress conditions. Foliar application of salicylic acid increased total phenol content by 20.92, 33.00, 10.84 and 10.19% under 100, 75, 50 and 25%, field capacity, respectively. Under severe drought stress conditions, foliar spray with salicylic acid increased the amount of flavonol and flavonoid compared to the control. With the application of drought stress, catalase enzyme activity increased by 36.09 and 67.65%, respectively, compared to the absence of drought stress. The highest amount of peroxidase activity (1.07 units per mg protein per minute) under 25% of field capacity by application of salicylic acid was observed with the lowest amount of peroxidase activity under 100 per cent of field capacity, respectively. According to the mentioned content, it can be concluded that salicylic acid improved the growth and production of secondary metabolites (Phenol, flavonol and flavonoid) in Scrophularia striata under drought stress and non-stress conditions.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Antioxidant enzymes
  • drought stress
  • Peroxidase
  • Scrophularia striata
  • Salicylic acid

مقدمه.

گیاه گل سازویی یا تشنه‌داری با نام علمی (Scropularia striata) متعلق به تیره گل میمون (Scrophulariaca) است (Amiri et al., 2011). در مناطق غرب ایران به‌صورت محلی و سنتی از جوشانده و دم‌کرده این گیاه برای عفونت‌های سطحی، عمقی و داخلی استفاده می‌شود (Aidi and Aidi, 2007). اهمیت گیاهان دارویی سبب شده است که هر ساله تعداد بیشتری از کشاورزان با تغییر نوع کشت از زراعت‌های معمول به کشت گیاهان دارویی، به سمت تولید این دسته از گیاهان روی آورند (Sharma, 2004). خواص گیاهان دارویی به‌دلیل حضور متابولیت‌های ثانویه است که منابع احتمالی برای تولید داروهای جدید با منشأ طبیعی و دارای عملکردهای اکولوژیک

 

مهم در گیاهان هستند و در حفاظت گیاهان در مقابل گیاهخواران و عوامل بیماری‌زای میکروبی، جذب‌ گرده‌افشان‌ها و جانوران منتشرکننده بذر، رقابت گیاه با گیاه و همزیستی گیاه با میکروب نقش دارند (Wink, 2010). گروهی از ترکیبات شناخته شده درگونه‌های مختلف گیاهان و همچنین، گیاه گل سازویی، فلاونوئیدها هستند. این مواد با خواص آنتی‌اکسیدانی بالا، بزرگترین گروه ترکیبات فنلی طبیعی به شمار می‌روند. بیش از 200 ترکیب از این گروه متابولیت‌های ثانویه شناخته شده‌اند، که حدود 50 ترکیب از آن‌ها به‌صورت آزاد وجود دارند. اکثر مواد این گروه به‌ویژه اگر به شکل گلیکوزیدی باشند، در آب محلول‌اند (Jafary et al., 2012). بر‌اساس مطالعات انجام شده روی ترکیبات شیمیایی و مواد مؤثره گیاه گل سازویی در سال‌های اخیر، ترکیبات فنولی، فلاونوئید و فلاونولی در عصاره اتانولی این گیاه شناسایی شده است (Sharafati-chaleshtori et al., 2010). عصاره گل سازویی دارای ترکیبات آنتی‌اکسیدانی متعددی است و ترکیبات شاخص شامل سینامیک اسید (Cinnamic acid)، سه ترکیب فلاونوئیدی شامل نپیترین (Nepitrin)، روتینوزید (Rutinoside) و فنیل پروپانوئید گلیکوزید (Phenyl propanoid glycoside)، کوئرستین (Quercetine) و ایزورامنتین (Isorhamnetin) در عصاره اندام‌های هوایی این گیاه شناسایی شده است (Monsef–Esfahani et al., 2010).

گیاهان دارای سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی هستند که تولید اضافی گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) را تحت شرایط تنش کنترل می‌کنند و بنابراین، آن‌ها را در مقابل آثار مضر گونه‌های فعال اکسیژن محافظت می‌کنند. ازسوی دیگر، سطح مناسبی از گونه‌های فعال اکسیژن را برای رشد و مسیر انتقال پیام حفظ می‌کنند (Mittler, 2002). سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، دهیدروآسکوربات ردوکتاز و گلوتاتیون ردوکتاز ازجمله مهم‌ترین آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی (Esfandiari et al., 2011) و آسکوربات، گلوتاتیون، آلفاتوکوفرول (ویتامین E)، کاروتنوئید‎ها، فلاونوئیدها و آنتوسیانین‌ها مهم‌ترین آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی در سلول‌های گیاهی به‌شمار می‌آیند (Ahmad et al., 2010).

برای مقابله با انواع تنش، تنظیم‌کننده‌های رشد گیاه به‌طور مستقیم یا غیرمستقیم در طیف گسترده‌ای از پاسخ و تحمل به تنش‌های زیستی و غیرزیستی در گیاهان دخیل هستند و نقش مهمی در تنظیم فرایندهای رشد گیاهان و شبکه‌های سیگنال‌دهنده ایفا می‌کنند (Asgher et al., 2015). دراین میان، سالیسیلیک اسید نقش محوری در تنظیم فرایندهای فیزیولوژیک مختلف مانند رشد و نمو گیاه، جذب یون‌ها، فتوسنتز، جوانه‌زنی، رسیدگی و پاسخ‌های دفاعی ایفا می‌کند (Miura and Tada, 2014). الیسیتورهایی مانند سالیسیلیک اسید در افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه دارای ارزش دارویی، نقش کلیدی دارند و با سرعت دادن به تشکیل متابولیت‌های ثانویه زمان دست‌یابی به مقادیر زیاد متابولیت‌ها را کاهش می‌دهند(Singh and Dwivedi, 2018) . همچنین، سالیسیلیک اسید از طریق افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، گیاه را از صدمات به‌دست آمده از واکنش‌های اکسیداتیو محفاظت می‌کند (Nemeth et al., 2002).

مطالعات مربوط به محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید توسط Salarpour و Farahbakhsh (2015) نشان داد کاربرد سالیسیلیک اسید با افزایش فعالیت آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز و گایوکول پراکسیداز در گیاه رازیانه تحت شرایط تنش کم‌آبی باعث کاهش خسارت تنش اکسیداتیو خواهد شد. در پژوهشی دیگر در گندم، کاربرد سالیسیلیک اسید با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی همچون آسکوربات پراکسیداز، سوپراکسیداز دیسموتاز و کاتالاز سبب کاهش مقدار مالون‌دی‌آلدهید و پراکسید هیدروژن تحت تنش خشکی شد (Abbadi et al., 2015). در پژوهشی Ali و همکاران (2007) تأثیر سالیسیلیک اسید با غلظت 200 میکرومولار در گیاه جینسینگ (Panax ginseng) را بررسی و بیان کردند که مقدار فلاونوئیدها به میزان88 درصد در مقایسه با شاهد افزایش یافت. همچنین، سالیسلیک اسید در گیاه سیاهدانه فعایت آنزیم فنیل‌آلانین‌آمولیاز و ترکیبات فنلی و فلانوئیدی (Kabiri et al., 2014) و در گل همیشه بهار مقدار فلاونوئیدها را افزایش داد (Pacheco et al., 2013). در پژوهشی Rostami و Fazeli (2021) تأثیر سه الیسسیتور سالیسیلیک اسید، جاسمونیک اسید و جیبرلیک اسید را بر بیان ژنهای سینامات 4-هیدروکسیلاز و چالکون سنتتاز در ریشه گیاه گل سازویی بررسی و نشان دادند که غلظت 100 پی‌پی‌ام از سالیسیلیک اسید و جیبرلیک اسید بیشترین تأثیر را در بیان این ژنها داشته و به تجمع ترکیبات فنیل پروپانوئیدی منجر شده است. همچنین، Rostami و همکاران (2022) ژنهای سینامات 4-هیدروکسیلاز و چالکون سنتتاز را از گیاه دارویی گل سازویی جداسازی نمودند. بیان این ژنها در دو مرحله رویشی و زایشی تحت سه الیسیتور نشان داد که بیان این ژنها در مرحله زایشی بیشتر از رویشی بود و علاوه‌بر اینها تیمار 300 پی‌پی‌ام سالیسیلیک اسید بیشترین تأثیر را در افزایش ترکیبات فنیل پروپانوئیدی در مرحله زایشی داشته است اگرچه تاکنون پژوهش‌های فراوانی در رابطه با تأثیر تنش خشکی روی گیاهان زراعی انجام شده است، اما تاکنون مطالعه‌ای در خصوص تأثیر سالیسیلیک اسید بر ویژگی‌های فیزیولوژیک و متابولیت‌های ثانویه گیاه دارویی گل سازویی در شرایط تنش خشکی انجام نشده است. بنابراین، پژوهش حاضر، تأثیر سالیسیلیک اسید بر فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز و محتوای فنل و فلاونوئید کل گیاه گل سازویی تحت تنش کم‌آبی را بررسی می‌کند.

 

مواد و روش‌ها

این آزمایش در گلخانه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه ایلام در سال 1397 به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. عامل‌های مورد بررسی شامل محلول‌پاشی با سالیسیلیک اسید در دو سطح (0 و 5/1 میلی‌مولار اسید سالیسیلیک) و تنش کم‌آبی در چهار سطح (25، 50، 75 و 100 درصد ظرفیت زراعی) بود (Elyasi et al., 2016). کپسول‌های حاوی بذر گل سازویی مورد استفاده در این آزمایش از ارتفاعات استان ایلام جمع‌آوری شدند. برای انجام این آزمایش، خاکی با بافت متوسط (خاک، شن و کود دامی با نسبت 2:1:1) تهیه و از گلدان‌هایی با قطر دهانه 20 سانتی‌متر، ارتفاع 21 سانتی‌متر به ظرفیت 4/4 کیلوگرم خاک استفاده شد. ابتدا 20 عدد بذر در گلدان‌های آماده شده کشت و پس از رشد گیاهچه‌ها، تعداد بوته‌ها به دو بوته در هر گلدان تنک شد. رشد گیاهچه‌های گل سازویی در گلخانه با طول دوره روشنایی 10-12 ساعت و دمای 15-28 درجه سانتیگراد بود. عملیات کشت گلخانه‌ای در مهرماه 1397 انجام و پس از دوره رشد هشت ماهه در اواخر اردیبهشت 1398 برداشت شدند.

تنش کم‌آبی پس از مرحله سبز شدن گیاهچه‌ها و با‌روش ظرفیت زراعی اعمال شد. برای تعیین ظرفیت آب گلدانی، خاک مورد نظر در داخل گلدان پلاستیکی زهکش‌دار ریخته و آبیاری گلدان به‌صورت کامل و در حد اشباع انجام شد. پس از خارج‌شدن کامل آب ثقلی، نمونه خاکی از گلدان برداشت و بلافاصله وزن شد (وزن مرطوب خاک) و سپس در آون الکتریکی با دمای 70 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت منتقل شد و وزن خاک خشک نیز به‌دست آمد. درصد رطوبت خاک در حد ظرفیت زراعی با استفاده از رابطه (1) محاسبه شد:

رابطه 1:

          FC (%) = ×100

 

دراین رابطه، FC: ظرفیت زراعی، FW: وزن خاک مرطوب و DW وزن خاک خشک است.

میزان ظرفیت زراعی خاک معادل 28 درصد بود که با‌توجه‌به وزن خاک گلدان‌ها (4/4 کیلوگرم) میزان آب مورد نیاز برای 100، 75، 50 و 25 درصد ظرفیت زراعی به‌ترتیب 1232، 924، 616 و 308 میلی‌لیتر به‌دست آمد. با‌توجه‌به وزن اولیه گلدان‌ها و شن استفاده شده به‌عنوان زهکش (6/0 کیلوگرم) میزان وزن گلدان‌ها برای اعمال سطوح تنش خشکی به‌ترتیب 6232، 5924، 5616 و 5308 گرم محاسبه شد. برای اعمال تنش چهار گلدان به‌عنوان مرجع در نظر گرفته شد که کاملاً مشابه گلدان‌های اصلی بودند. تیمارهای آبیاری با توزین روزانه گلدان‌ها و

 

 اضافه نمودن آب مصرفی در هر تیمار (میزان کاهش وزن گلدان‌ها) اعمال شد.

در این آزمایش از سالیسیلیک اسید با فرمول C7H6O3 و جرم مولکولی 12/138 گرم بر مول ساخت شرکت مرک آلمان استفاده شد. تیمار سالیسیلیک اسید از طریق محلول‌پاشی براساس غلظت مورد نظر (5/1 میلی‌مولار) روی برگ طی دو مرحله پس از سبز شدن گیاهچه‌ها و قبل از اعمال تنش خشکی و با فواصل زمانی 7 روز، تکرار شد. محلول‌پاشی گیاهان با سالیسیلیک اسید به‌صورتی بود که تمام سطوح فوقانی و زیرین اندام های هوایی کاملاً خیس شدند. همچنین، گیاهان شاهد با آب مقطر محلول‌پاشی شدند.

برای سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز از روش Luck (1974) استفاده شد. تجزیه آب اکسیژنه با کاهش جذب در طول موج 240 نانومتر همراه است که از طریق همین کاهش جذب، فعالیت آنزیمی اندازه‌گیری شد. برای این‌منظور نـیم گـرم از بافـت برگ در25 میلی‌مولار از بافر سدیم فسفات با اسیدیته 7 ساییده شد و به مدت 10 دقیقـه در دمـای 4 درجـه ســانتیگــراد و بــا ســرعت 10000 دور در دقیقــه سـانتریفوژ(مدل Spectrod، شرکتJena AG  آلمان) شد. سپس به 5 میلی‌لیتر آب مقطر، 5/2 میلی‌لیتر از بافر فسفات سدیم 25 میلی‌مولار با اسیدیته 7 ،1/0 میلی‌لیتر از سوپرناتانت و 1/0 میلی‌لیتر از پراکسـید هیـدروژن 25 میلـی‌مـولار اضافه و فعالیت این آنزیم توسط دستگاه اسپکتروفتومتر(UV-Visible مدل Cary-50 ساخت شرکت Varian آمریکا) در طول موج 240 نـانومتر، در مـدت 5 دقیقـه، هـر 5 ثانیه یکبار، طیف سنجی شد.

برای سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز مطابق روش In و همکاران (2007) از دو بافر آب اکسیژنه (H2O2) 225 میلی‌مولار و بافر حاوی گایاکول 45 میلیمولار استفاده شد. ابتدا 450 میکرولیتر محلول H2O2 و 450 میکرولیتر محلول گایاکول در دمای پایین (ظرف حاوی یخ) با هم مخلوط و به آن 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی اضافه شد و سپس تغییرات جذب در طول موج 470 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر دنبال شد. در محلول شاهد به جای عصاره آنزیمی، 100 میکرولیتر از بافر فسفات 50 میلی‌مولار استفاده شد. فعالیت آنزیمی با استفاده از قانون بیر- لامبرت و ضریب خاموشی محصول کاتالیز گایاکول پراکسیداز محاسبه و بر حسب واحد میلی‌گرم پروتئین در دقیقه بیان شد.

میزان ترکیبات فنلی کل براساس روش رنگ‌سنجی فولین- سیوکالتیو (Singleton et al., 1965) و بر حسب منحنی استاندارد گالیک اسید در طول موج 765 نانومتر اندازه‌گیری شد. ابتدا 3/0 گرم از اندام‌های هوایی تازه در 3 میلی‌لیتر متانول 80 درصد هموژن و به مدت 3 ساعت در بن‌ماری با دمای 70 درجه سانتیگراد قرار داده شد. سپس به مدت 15 دقیقه با سرعت 9000 دور در دقیقه سانتریفیوژ و پس از جدا کردن عصاره متانولی از رسوب، این عصاره برای سنجش فنل کل، فلاونوئیدها و فلاونول‌ها استفاده شد. به‌این‌منظور به 50 میکرولیتر عصاره متانولی، 500 میکرولیتر محلول فولین- سیو کالتیو اضافه و به مخلوط حاصل پس از 5 دقیقه، 500 میکرولیتر محلول سدیم کربنات 7 درصد اضافه و جذب پس از 10 دقیقه در طول موج 765 نانومتر خوانده شد. درنهایت، برای محاسبه غلظت نهایی از منحنی استاندارد گالیک اسید استفاده و مقدار فنل کل بر حسب میلی‌گرم گالیک اسید بر گرم وزن خشک محاسبه شد. برای اندازه‌گیری فلاونوئید کل به یک میلی‌لیتر از عصاره متانولی 250 میکرولیتر از محلول کلرید آلومینیوم 10 درصد و 250 میکرولیتر پتاسیم استات یک مولار اضافه شد. به‌منظور سنجش فلاونوئید کل از نمودار استاندارد روتین (Rutin) استفاده و در نهایت جذب نمونه‌ها در طول موج 415 نانومتر خوانده شد (Akkol et al., 2008). سنجش فلاونول کل نیز براساس منحنی استاندارد روتین سنجیده شد. برای‌این‌منظور به یک میلی‌لیتر از عصاره متانولی یک میلی‌لیتر از محلول کلریدآلومینیوم 2 درصد و 3 میلی‌لیتر از محلول سدیم استات 5 درصد اضافه و میزان فلاونول کل در طول موج 445 نانومتر اندازه‌گیری شد (Akkol et al., 2008).

غلظت مالون‌دی‌آلدهید که حاصل پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع است، با روش Heath و Parker (1968) اندازه‌گیری شد. 2/0 گرم از بافت تازه برگ در هاون چینی حاوی 5 میلی‌لیتر تری کلرواستیک اسید (یک درصد) سائیده و عصاره حاصل با استفاده از دستگاه سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه در 10000 دور در دقیقه، سانتریفیوژ شد. به یک میلی‌لیتر از محلول رویی حاصل از سانتریفیوژ، 5 میلی‌لیتر محلول تری کلرواستیک اسید (20 درصد) که حاوی 5/0 درصد تیوباربیوتیک بود، اضافه و محلول حاصل به مدت 30 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد قرار داده شد. برای توقف واکنش در نمونه‌های گرمادیده، نمونه‌ها بلافاصله به سطح یخ و دمای پایین برای سرد شدن، منتقل شدند. سپس نمونه‌ها به مدت 5 دقیقه با 10000 دور در دقیقه و دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ و جذب محلول روئی که طیف رنگی زرد تا قرمز را شامل می‌شود، در طول موج 532 و 600 نانومتر خوانده شد. در نهایت از حاصل تفریق این دو، عدد نهایی برای تعیین غلظت مالون‌دی‌آلدهید به‌دست می‌آید که ضریب خاموشی آن معادل 155 بر میلی‌مولار بر سانتی‌متر است.

برای سنجش میزان نشت یونی مقدار 2/0 گرم از بافت سالم و تازه اندام هوایی گیاه پس از شستشو با آب مقطر درون لوله‌ی آزمایش قرار داده و 10 میلی‌لیتر آب مقطر به آن اضافه شد. لوله آزمایش به‌مدت 2 ساعت در دمای 32 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت و میزان هدایت الکتریکی نمونه‌ها (EC1) ، با EC متر اندازه‌گیری شد؛ سپس لوله‌های آزمایش در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه در بن‌ماری قرار داده شدند و پس از خنک‌شدن لوله‌های آزمایش تا دمای 25 درجه سانتیگر‌اد، میزان هدایت الکتریکی نمونه‌ها (EC2) دوباره اندازه‌گیری و درصد نشت یونی با رابطه (2) محاسبه شد (Ben Hamed et al., 2007).

رابطه 2:

 =درصد نشت یونی (EC1/EC2)×100

قبل از تجزیه واریانس داده‌ها، ابتدا نرمال بودن داده‌ها بررسی و تجزیه آماری داده‌های آزمایش با نرم‌افزار SAS 9.1 و مقایسه میانگین‌ها با آزمون حداقل اختلاف معنی‌دار (LSD) در سطح احتمال پنج درصد انجام شد. برای رسم نمودارها از نرم افزار Excel استفاده شد.

نتایج و بحث

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که تأثیر تیمارکم‌آبی بر فعالیت آنزیم کاتالاز در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار بود اما تأثیر تیمار سالیسیلیک اسید و بر همکنش تیمارها تأثیر معنی‌داری بر فعالیت آنزیم کاتالاز نداشت. با اعمال تنش کم‌آبی (ظرفیت زراعی 50 و 25 درصد) فعالیت آنزیم کاتالاز در مقایسه با شاهد (100 درصد ظرفیت زراعی) به‌ترتیب 09/36 و 65/67 درصد افزایش یافت (شکل 1-الف). Liu و همکاران (Liu et al., 2011) بیان کردند که فعالیت کاتالاز تحت تنش ملایم بالاتر از تنش خشکی شدید و شرایط آبیاری کامل است. در مقابل Ghobadi و همکاران (2013)، بیان نمودند که فعالیت آنزیم کاتالاز در شرایط تنش شدید، بیشتر از تنش ملایم و همچنین، فعالیت کاتالاز در شرایط تنش ملایم بیشتر از شرایط آبیاری کامل است.

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که کم‌آبی و سالیسیلیک اسید توانستند فعالیت آنزیم پراکسیداز در سطح احتمال یک درصد را تحت تأثیر قرار دهند و همچنین، برهمکنش این تیمارها در سطح احتمال پنج درصد بر فعالیت آنزیم پراکسیداز معنی‌دار بود. بیشترین مقدار فعالیت آنزیم پراکسیداز (07/1 واحد در میلی‌گرم پروتئین در دقیقه) تحت شرایط 25 درصد ظرفیت زراعی با محلول‌پاشی با سالیسیلیک اسید مشاهده شد و کمترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز تحت شرایط 100 درصد ظرفیت زراعی به‌دست آمد که در این شرایط محلول‌پاشی با سالیسیلیک اسید تأثیر معنی‌داری بر فعالیت آنزیم پراکسیداز نداشت (شکل 1-ب). در بسیاری از پژوهش‌ها بیان شده است که تنش خشکی می‌تواند در برگ‌ها باعث افزایش شدید فعالیت گایاکول پراکسیداز ‌شود که می‌تواند به‌عنوان پاسخی به آسیب اکسیداتیو ایجاد شده توسط تنش خشکی باشد و حذف پراکسید هیدروژن توسط این آنزیم انجام می‌شود. نتایج آزمایش Keshavarz and Modarres Sanavy  (2014) نشان داد که با کاربرد اسید سالیسیلیک به میزان400

 

400 میلی‌مولار میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز افزایش یافت، که با نتایج آزمایش حاضر مطابقت دارد.

اعمال کم‌آبی و سالیسیلیک اسید و برهمکنش آن‌ها تأثیر معنی‌داری (P ≤0.01) بر میزان نشت یونی داشت. با اعمال تنش کم‌آبی میزان نشت یونی افزایش یافت و کاربرد محلول‌پاشی میزان نشت یونی در گل سازویی را تحت شرایط تنش شدید خشکی کاهش داد. نتایج مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد میزان نشت یونی در شرایط عدم تنش و تنش متوسط (75 و 100 درصد ظرفیت زراعی) تحت تأثیر محلول‌پاشی با سالیسیلیک اسید قرار نگرفت.

 

 

 

(الف)

 

(ب)

 

 

شکل 1- مقایسه میانگین تأثیر کم‌آبی و سالیسیلیک اسید بر فعالیت آنزیم‌های کاتالاز (الف) و پراکسیداز (ب) گل سازویی. میانگین‌های دارای حداقل یک حرف مشترک، براساس آزمون LSD در سطح احتمال پنج درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند.

Figure 1 - Comparison of the mean effect of water deficit stress and salicylic acid on the activity of catalase (A) and peroxidase (B) enzymes Scrophularia striata. The means with at least one common letter are not significantly different from each other based on the LSD test at the level of 5% probability.

 

 

 

محلول‌پاشی با سالیسیلیک اسید میزان نشت یونی را تحت شرایط 50 و 25 درصد ظرفیت زراعی در مقایسه با عدم محلول‌پاشی در این شرایط به‌ترتیب 56/20 و 43/15 درصد کاهش داد (شکل 2- الف). نتایج به‌دست آمده در این آزمایش که نشان‌دهنده افزایش نشت یونی توسط تنش خشکی است، مطابق با بسیاری از بررسی‌های دیگر درمورد گیاهان دارویی است (Jalalvand et al., 2019; Shahrivar et al., 2019). در این پژوهش اگرچه با افزایش شدت تنش نشت الکترولیتی غشا زیاد شد، اما محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید در این شرایط سبب بهبود غشا و در نتیجه کاهش نشت الکترولیت شد. طبق بررسی‎های انجام شده تیمار با سالیسیلیک اسید سبب کاهش نشت یونی تا 32 درصد در گیاهان برنج تحت تنش کم‌آبی می‌شود (Sawada et al., 2006).

نتایج تجزیه واریانس غلظت مالون‌دی‌آلدهید معنی‌دار بودن تأثیر تیمارهای مطالعه شده و برهمکنش آن‌ها را نشان می‌دهد. تحت شرایط عدم تنش (100 درصد ظرفیت زراعی) و تنش شدید خشکی (25 درصد ظرفیت زراعی) محلول‌پاشی با سالیسیلیک اسید بر میزان مالون‌دی‌آلدهید تأثیر معنی‌داری نداشت. اما در 75 و 25 درصد ظرفیت زراعی محلول‌پاشی با اسید سالیسیلیک میزان مالون‌دی‌آلدهید را به‌ترتیب 81/17 و 04/34 درصد در مقایسه با تیمار عدم محلول‌پاشی کاهش داد (شکل 2- ب). اگرچه روند تغییرات مالون‌دی‌آلدهید در واکنش به تنش خشکی به‌صورت افزایشی بود، اما با محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید کاهش یافت. پژوهشگران در نتایج پژوهشی گزارش کردند،

در شرایط تنش، میزان مالون‌دی‌آلدهید به‌شدت افزایش می‌یابد (Liu et al., 2014). کاهش میزان مالون‌دی‌آلدهید با کاربرد سالیسیلیک اسید در گیاه در شرایط تنش خشکی ممکن است به‌دلیل نقش تنظیم‌کنندگی آن در برابر تنش‌ها باشد. به‌طوری‌که این هورمون به‌عنوان یک مولکول علامتی سیگنال طبیعی برای فعال‌سازی سازوکارهای دفاعی در گیاهان شناخته شده است (Wang and Li, 2006). در یک آزمایش Salarpour و Farahbakhsh (2015) نشان دادند که کاربرد سالیسیلیک اسید

در گیاه رازیانه به کاهش معنی‌دار مقدار مالون‌دی‌آلدهید تحت تنش خشکی منجر شده است که با نتایج این بررسی هم‌خوانی دارد.

 

 

 

 

(الف)

(ب)

 

 

 

شکل2- مقایسه میانگین تأثیر کم‌آبی و سالیسیلیک اسید بر میزان نشت یونی (الف) و غلظت مالون‌دی‌آدهید (ب) گل سازویی. میانگین‌های دارای حداقل یک حرف مشترک، براساس آزمون LSD در سطح احتمال پنج درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند.

Figure 2 - Comparison of the mean effect of water deficit stress and salicylic acid on ion leakage (A) and malondiadehyde concentration (B) of Scrophularia striata. The means with at least one common letter are not significantly different from each other based on the LSD test at the level of 5% probability.

 

 

 

 

       

 

نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان‌دهنده معنی‌داری تأثیرات تنش خشکی و سالیسیلیک اسید (در سطح احتمال یک درصد) و برهمکنش آن‌ها (در سطح احتمال پنج درصد) بر مقدار فنل کل بود. محلول‌پاشی با سالیسیلیک اسید تحت شرایط 100، 75، 50 و 25 درصد ظرفیت زراعی، مقدار فنل کل را در گل سازویی به‌ترتیب به‌میزان 92/20، 00/33، 84/10 و 19/10 درصد افزایش داد (شکل 3- الف). افزایش میزان فنل‌ در این آزمایش تحت شرایط تنش خشکی مشاهده شد که نتایج مشابهی توسط سایر محققان در این مورد گزارش شده است (Moradi and Pourghasemian, 2018). Asadi Kavan و همکاران (2010) گزارش دادند که براساس سنجش‌هایی که در اندام هوایی گیاه انیسون انجام شد، همگام با افزایش تنش خشکی، میزان ترکیب‌های فنلی کل افزایش معنی‌داری پیدا کرد. محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید در شرایط تنش شدید (25 درصد ظرفیت زراعی) باعث افزایش فنل کل شد که اختلاف معنی‌داری با عدم محلول‌پاشی داشت (شکل 3- الف). در مطالعات پیشین سالیسیلیک اسید به‌عنوان عامل محرک سیستم دفاعی در افزایش میزان ترکیبات فنلی گیاه مریم‌گلی (Dong et al., 2010) و رازیانه (Salarpour and Frahbakhsh, 2015) شناخته شده است.

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اعمال تنش کم‌آبی (در سطح احتمال یک درصد) و سالیسیلیک اسید (در سطح احتمال پنج درصد) بر میزان فلاونول کل در گل سازویی معنی‌دار بودند. همچنین، برهمکنش این تیمارها (در سطح احتمال یک درصد) بر میزان فلاونول کل معنی‌دار بود. مقایسه میانگین‌ها نشان داد محلول‌پاشی با سالیسیلیک اسید در مقایسه با عدم محلول‌پاشی، میزان فلاونول را به‌ مقدار 10/30 درصد تحت شرایط تنش شدید خشکی افزایش داد (شکل 3- ب). فلاونول‌ها مهم‌ترین نوع از انواع فلاونوئیدها هستند (Winkel-Shirley, 2002) و همچنین، فلاونوئیدها متابولیت‌های ثانویه گیاهی هستند که به‌طورکلی، به‌عنوان مواد آنتی اکسیدان شناخته شده‌اند (Ververidis et al., 2007). به‌نظر‌ می‌رسد که در این آزمایش افزایش این متابولیت ثانویه رنگدانه توسط سالیسیلیک اسید از طریق پاک‌سازی گونه‌های فعال اکسیژن از تنش‌های اکسیداتیو جلوگیری کرده و باعث افزایش مقاومت در گیاه می‌شود (Khan et al., 2003).

نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که کم‌آبی و سالیسیلیک اسید تأثیر معنی‌داری (در سطح احتمال یک درصد) بر میزان فلاونوئید گل سازویی داشتند اما برهمکنش آنها معنی‌دار نبود. با اعمال تنش خشکی (ظرفیت زراعی 50 و 25 درصد) میزان فلاونوئیدها در مقایسه با شاهد (100 درصد ظرفیت زراعی) به‌ترتیب 02/32 و 22/73 درصد افزایش یافت (شکل 4- الف). همچنین، محلول‌پاشی با سالیسیلیک اسید میزان فلاونوئیدها در گل سازویی را در مقایسه با عدم محلول‌پاشی به‌میزان 57/15 درصد افزایش داد (شکل 4- ب). به‌نظ‌رمی‌رسد سالیسیلیک اسید از طریق افزایش محتوای فلاونوئید باعث پاک‌سازی گونه‌های فعال اکسیژن شده و از تنش‌های اکسیداتیو جلوگیری می‌کند که در نهایت افزایش مقاومت در گیاه را به‌دنبال دارد (Khan et al., 2003). افزایش محتوای فنل کل و فلاونوئید با تیمار سالیسیلیک اسید در پژوهش حاضر، با نتایج بررسی‌های پیشین در شیرین‌بیان (Shabani and Ehsanpour, 2010) و سیاهدانه (Samadi et al., 2014) مطابقت دارد. Zarinkamar و همکاران (2016) گزارش کردند که محلول‌پاشی باعث افزایش میزان فلانوئیدهای کل در بابونه آلمانی شده است. در گیاه همیشه‌بهار کاربرد غلظت‌های 25/0، 5/0 و 1 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید موجب افزایش فلاونوئیدهای کل شد (Pacheco et al., 2013).

 

 

 

 

 

 

(الف)

(ب)

 

 

شکل 3- مقایسه میانگین تأثیر سالیسیلیک اسید بر مقدار فنل کل (الف) و فلاونول کل (ب) در گل سازویی تحت سطوح مختلف کم‌آبی. میانگین‌های دارای حداقل یک حرف مشترک، براساس آزمون LSD در سطح احتمال پنج درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند.

Figure 3. Comparison the mean of salicylic acid on the amount of total phenol (A) and flavonol (B) in Scrophularia striata under different levels of water deficit stress. The means with at least one common letter are not significantly different from each other based on the LSD test at the level of 5% probability.

 

 

 

 

 

 

(الف)

(ب)

 

 

شکل4- مقایسه میانگین تأثیر کم‌آبی (الف) و سالیسیلیک اسید (ب) بر فلاونوئید در گل سازویی. میانگین‌های دارای حداقل یک حرف مشترک، براساس آزمون LSD در سطح احتمال پنج درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند.

Figure 4 - Comparison of the mean effect of water deficit stress (A) and salicylic acid (B) on flavonoid Scrophularia striata. The means with at least one common letter are not significantly different from each other based on the LSD test at the level of 5% probability.

 

 

نتیجه‌گیری

به‌طورکلی، نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که مقدار مالون‌دی‌آلدهید و نشت یونی با افزایش شدت تنش خشکی افزایش یافتند. همچنین، مقدار ترکیبات فنلی و آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز طی تنش خشکی در گیاه گل سازویی افزایش یافتند. محلول‌پاشی با سالیسیلک اسید از طریق افزایش میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز و کاهش نشت یونی و مقدار مالون‌دی‌آلدهید باعث افزایش مقاومت گیاه گل سازویی در برابر تنش خشکی شد. همچنین، محلول‌پاشی با سالیسیلیک اسید توانست تولید و تجمع فنل کل، فلاونول و فلاونوئیدها به‌عنوان یکی از مهمترین ترکیبات گیاه دارویی گل سازویی را افزایش دهد. بنابراین، استفاده از ترکیباتی که قادر به کاهش تأثیر تنش‌های محیطی و افزایش متابولیت‎های ثانویه در گیاهان هستند، می‎توانند اهمیت فراوانی برای کشاورزی و زراعت داشته باشند.

 

تشکر و قدردانی

نگارندگان از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه ایلام که حمایت‎های لازم در قالب هسته پژوهشی به شماره 32/1764 داشته‌اند صمیمانه تشکر و قدردانی می‌نمایند.

 

 
Abbadi, A., Shekari, F. and Mustafavi, S. H. (2015) Effect of paclobutrazol and salicylic acid on antioxidants enzyme activity in drought stress in wheat. Idesia 33(4): 5-13
Ahmad, P. C. A., Jeleel, C. A., Azooz, M. M. and Nabi, G. (2010) Generation of ROS and non-enzymatic antioxidants during abiotic stress in plants. Botany Research International 2(1): 11-20.
Aidi, A. and Aidi, M. (2007) Iranian Medicinal Plants. First Edition. Islamic Azad University, Science and Research Branch of Tehran. (In Persian).
Akkol, E. K., Goger, F., Kosar, M and Baser, K. H. (2008) Phenolic composition and biological activities of Salvia halophila and Salvia virgata from Turkey. Food Chemistry 108(3): 942-949.
Ali, M. B., Hahn, E. J. and Paek, K. Y. (2007) Methyl jasmonat and salicylic acid induced oxidative stress and accumulation of phenolic in Panax ginseng bioreactor root suspension culture. Journal of Molecular 12(3): 607-621.
Amiri, A., Parsa, S. R., Nezami M. and Ganjeali, A. (2011) The effects of drought stress at different phenological stages on growth indices of chickpea (Cicer arietinum L.) in greenhouse conditions. Iranian Journal of Pulses Research 1(2): 69-84.
Asadi Kavan, Z. h., Ghorbanli, M and Sateei, A. (2010) The effect of drought stress and exogenous ascorbate on photosynthetic pigments, flavonoids, phenol compounds and lipid peroxidation in Pimpinella anisum L. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants 25(4): 456-469.
Asgher M., Khan, M. I. R., Anjum, N. A and Khan, N. A. (2015) Minimizing toxicity of cadmium in plants role of plant growth regulators. Protoplasma 252(2): 399-413.
Ben Hamed, K., Castagna, A., Salem, E. A., Ranieri, A and Abdelly, C. (2007) Sea fennel (Crithmum maritimum L.) under salinity conditions: a comparison of leaf and root antioxidant responses. Plant Growth Regulation 53: 185-194.
Dong, J., Wan, G and Liang, Z. (2010). Accumulation of salicylic acid-induced phenolic compounds and raised activities of secondary metabolic and antioxidative enzyme in Salvia miltiorrhiza cell culture. Journal of Biotechnology 148(2-3): 99-104.
Elyasi, R., Majdi, M., Bahramnejad, B and Mirzaghaderi, G. (2016) Spatial modulation and abiotic elicitors responses of the biosynthesis related genes of mono/triterpenes in black cumin (Nigella sativa). Industrial Crops and Products 79: 240-247
Esfandiari, E., Enayati, V and Abbasi, A. (2011) Biochemical and physiological changes in response to salinity in two durum wheat (Triticum turgidum L.) genotypes. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca 39(1): 165-170.
Ghobadi, M., Taherabadia, S., Ghobadi, M. E., Mohammadi, G. H. R. and Jalali-Honarmand, S. (2013) Antioxidant capacity, photosynthetic characteristics and water relations of sunflower (Helianthus annuus L.) cultivars in response to drought stress. Industrial Crops and Products 50: 29-38.
Jafary, A. A., Latifi, A. M., Shohrati, M., Haji Hosseini, R. and Salesi, M. (2012) The effect of Scrophularia striata extracts on wound healing of Mice. Armaghane-danesh, Yasuj University of Medical Sciences Journal 18(3): 194-209. (In Persian).
Jalalvand, A., Andalibi, B., Tavakoli, A and Moradi, P. (2019). Investigating the effects of salicylic acid and cycocel on gas exchange process in moldavian balm (Dracocephalum moldavica L.) under drought stress conditions. Environmental Stresses in Crop Sciences 12(2): 481-494.
Kabiri, R., Nasibi, F and Farahbakhsh, H. (2014) Effect of exogenous salicylic acid on some physiological parameters and alleviation of drought stress in Nigella sativa Plant under hydroponic culture. Plant Protection Science 50(1): 43-51.
Keshavarz, H and Modarres Sanavy, S. A. M. (2014) Effect of salicylic acid on chlorophyll, some growth characteristics and yield of two canola varieties. Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources 7(4): 167-178. (In Persian).
Khan, W., Balakrishnan, P and Smith, D. L. (2003) Photosynthetic responses of corn and soybean to foliar application of salicylates. Journal of Plant Physiology 160: 485-492.
Liu, C., Liu, Y., Guo, K., Fan, D., Li, G., Zheng, Y., Yu, L and Yang, R. (2011) Effect of drought on pigments, osmotic adjustment and antioxidant enzymes in six woody plant species in karst habitats of southwestern China. Environmental and Experimental Botany 71: 174-183.
 
Liu, J. H., Peng, T and Dai, W. S. (2014) Critical cis-acting elements and interacting transcription factors, key players associated with abiotic stress responses in plants. Plant Molecular Biology Research 32: 303-317.
Luck, H. (1974) Methods in Enzymatic Analysis V2 (Ed. Bergmeyer, H, U). Academic Press, New York.
Mittler, R. (2002) Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science 9: 405-410.
Miura, K and Tada, Y. (2014) Regulation of water, salinity and cold stress responses by salicylic acid. Plant Science Journal 5(4): 1-12.
Monsef–Esfahani, H. R., Hajiaghaee, R., Shahverdi, A. R., Khorramizadeh, M. R. and Amini, M. (2010) Flavonoids, cinnamic acid and phenyl propanoid from aerial parts of (Scrophularia striata). Pharmaceutical Biology 48(3): 333-336.
Moradi, R and Pourghasemian, N. (2018) Effect of salicylic acid application on mitigating impacts of drought stress in marigold (Calendula officinalis L). Water and Soil Science 28(2): 15-28.
Nemeth, M., Janda, T., Hovarth, E., Paldi, E and Szalai, G. (2002) Exogenous salicylic acid increases polyamine content but may decrease drought tolerance in maize. Plant Science 162: 569-574.
Pacheco, A. C., Cabral, C. S., Silva Fermino, E. S. and Aleman, C. C. (2013) Salicylic acid-induced changes to growth, flowering and flavonoids production in marigold plants. Journal of Medicinal Plants Research 7(42): 3158-3163.
Rostami, Z., Fazeli, A. (2021). Identification and isolation of cinnamate 4-hydroxylase and chalcon syntase genes in the roots of scrophularia striata and study of their expression and some physiological traits under the influence of various abiotic elicitors. Agricultural Biotechnology Journal 13(1): 1-28.
Rostami, Z., Fazeli, A and Hojati, Z. (2022). The isolation and expression analysis of cinnamate 4-hydroxylase and chalcone synthase genes of Scrophularia striata under different abiotic elicitors. Scientific Report 12(8128): 1-14.
Salarpour, F and Farahbakhsh, H. (2015) Effects of water deficit and salicylic acid on essential oil and antioxidant enzymes of fennel (foeniculum vulgare Mill.). Journal of Crop Improvement (Journal of agriculture) 17(3): 713-727.
Samadi, S., Ghasemnezhad, A and Alizadeh, M. (2014) Investigation on phenylalanine ammonia-lyase activity of artichoke (Cynara scolymus L.) affected by methyl jasmonate and salicylic acid in in vitro conditions. Journal of Plant Production Research 21(4): 135-148
Sawada. H., Shim, I. S. and Usui, K. (2006) Induction of benzoic acid 2-hydroxylase and salicylic acid biosynthesis-modulation by salt stress in rice seedling. Plant Science 171: 263-270.
Shabani, L and Ehsanpour, A. (2010) Induction of antioxidant enzymes, phenolic and flavonoid compounds in in vitro culture of licorice (Glycyrrhiza glabra L.) using methyl jasmonate and salicylic acid. Iranian Journal of Biology 2(2): 691-703.
Shahrivar, Z., Abtahi, F. S. and Hatami M. (2019). Effect of growth regulator salicylate on some physiological and biochemical parameters of peppermint (Mentha piperita L.) under drought stress. Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology) 32(4): 815-830.
Sharafati-chaleshtori, R., Sharafati-chaleshtori, F., Sharafati-chaleshtori, A and Ashrafi, K. (2010) Antimicrobial effects and evaluation of total phenols, flavonoids and flavonols contents of ethanolic extracts of Scrophularia striata. Journal of Shahrekord University of Medical Sciences 11(4): 32-37.
Sharma, R. (2004) Agro-Techniques of medicinal plants. Daya Publishing House, Delhi, 264p