تأثیر محلول‌پاشی سلنیوم و کلسیم بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و برخی صفات بیوشیمیایی گیاه گلرنگ در شرایط تنش خشکی

مقدمه.

خشکی یکی از مهم‌ترین تنش‌های غیرزیستی است که رشد گیاهان را در مناطق خشک و نیمه‌خشک محدود ساخته است (Liz et al., 2013). تحقیقات مختلف تأثیر کمبود آب بر رشد گیاه (مورفولوژی)، فیزیولوژی و تغییرات ژنتیکی و بیوشیمیایی را نشان داده است (Zamani et al., 2020). از جمله اثرات دیگر خشکی می‌توان به افزایش تشکیل گونه‌های اکسیژن واکنش‌پذیر (ROS) اشاره کرد که ممکن است باعث پراکسیداسیون لیپیدها و آسیب غشا شود. ROS‌ها مانند رادیکال سوپراکسید، رادیکال هیدروکسیل و پراکسید هیدروژن برای سیستم‌های زیستی مضر هستند، زیرا آنها ماکرومولکول‌هایی مانند لیپیدها و پروتئین‌ها را اکسید می‌کنند و رنگدانه‌های فتوسنتزی و همچنین فتوسنتز را کاهش می‌دهند (Kavas et al., 2013). برای محافظت از سلول‌ها در برابر حملات اکسیداتیو، ارگانیسم‌ها مکانیسم‌های دفاعی را تشکیل داده‌اند که از اجزای آنزیمی و غیرآنزیمی تشکیل شده است. دفاع آنتی‌اکسیدانی از طریق آنزیمی شامل آنزیم‌هایی است که قادر به حذف، خنثی‌سازی یا مهار رادیکال‌های آزاد هستند. این آنزیم‌ها عبارتند از سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، پراکسیداز (POX)، پلی فنل اکسیداز (PPO)، گلوتاتیون ردوکتاز (GR) و آسکوربات پراکسیداز (APX). اجزای غیرآنزیمی شامل گلوتاتیون، آسکوربات، توکوفرول، فنل، فلاونوئیدها و غیره است (Apel and Hirt, 2004; Gapper and Dolan, 2006; Kwak et al., 2006).

گلرنگ با نام علمی (Carthamus tinctorius L.) گیاهی یکساله از تیره کاسنی (Asteraceae) که به‌عنوان یک گیاه روغنی، دارویی و صنعتی شناخته می‌شود. این گیاه تا حدودی قابلیت تحمل تنش‌هایی مانند خشکی و شوری را داراست، اما در برابر تنش‌های جدی عملکرد این گیاه محدود می‌شود ( Lovelli et al., 2007). واکنش گلرنگ نسبت به طول روز، خنثی و روز بلند است، بنابراین می‌تواند در فصول مختلف (بهار، تابستان، پاییز) در سراسر جهان رشد کند. در سال‌های اخیر، گلرنگ به‌علت کیفیت روغن مناسب و ترکیب اسیدهای چرب، به‌عنوان یک محصول اصلی دانه‌های روغنی در مناطق خشک و نیمه‌خشک در نظر گرفته شده است (Mostafavi et al., 2019).

تنظیم‌کننده‌ها و محرک‌های رشد آلی به‌طور فعال در بسیاری از فرآیندهای متابولیک نقش دارند و در شرایط تنش و عدم تنش نقش اساسی در رشد و نمو گیاه ایفا می‌کنند. آنها همچنین به‌عنوان پیام‌رسان‌های شیمیایی برای تعدیل فرآیندهای مختلف یا ژن‌های دخیل در رشد و نمو عمل می‌کنند و در سازگاری گیاهان با محیط‌های تنش‌زا از جمله تنش خشکی نقش مهمی دارند (Ashraf et al., 2011). بنابر تحقیقات، غلظت‌های پایین سلنیوم اثرات سودمندی بر متابولیسم سلول‌های گیاهی دارد و باتوجه‌به شواهد، کاربرد خاکی یا محلول‌پاشی سلنیوم می‌تواند رشد، عملکرد و کیفیت محصولات را افزایش دهد (Xu et al., 2003). در هنگام پیری گیاه افزودن سلنیوم باعث جلوگیری از کاهش غلظت توکوفرول و همچنین، به‌علت افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، ظرفیت آنتی‌اکسیدانی گیاه را تقویت می‌کند (Xue et al., 2001). در بررسی اثر محلول‌پاشی سلنیوم بر صفات کیفی و فعالیت‌های آنزیمی گلرنگ، سلنیوم باعث افزایش آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی شد و در بین تیمارهای محلول‌پاشی سلنیوم بیشترین فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار 200 میلی‌گرم در لیتر حاصل شد (Khademi et al., 2015).

افزایش طول سلول که عامل اصلی تعیین‌کننده رشد گیاه است، با تعادل بین فشار اسمزی و قابلیت ارتجاع‌پذیری سلول کنترل می‌شود (Cosgrove, 2016). بنابراین، شکل و اندازه نهایی گیاه از دریافت و ادغام پیام‌های شیمیایی وتغییرات فیزیکی حاصل می‌شود (Stoeckle et al., 2018). کلسیم یکی از پویاترین مولکول‌های پیام‌رسان شناخته شده است (Trewavas and Knight, 1994). نقش اساسی کلسیم در بسیاری از مکانیسم‌های دفاعی در شرایط خشکی و پیام‌رسانی آن برای تحمل یا مقاومت به خشکی مورد نیاز است (Cousson et al., 2009). علاوه‌براین، وظیفه دیگر کلسیم ثبات و پایداری دیواره سلولی است (Marschner, 1995). در آزمایشی، محققان به‌منظور کاربرد کلسیم بر کیفیت روغن و تحمل به خشکی گیاه کلزا بیان داشتند، کاربرد کلسیم علاوه بر بهبود شاخص‌های رشدی گیاه در شرایط تنش خشکی باعث تعدیل اثرات مضر تنش با القای سیستم آنتی‌اکسیدانی و افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان شد. همچنین کاربرد کلسیم در شرایط تنش باعث افزایش پروتئین و قندهای محلول در گیاه شد (Rezayian et al., 2018).

با‌توجه‌به مطالب فوق و نقش مفید عناصر سلنیوم و کلسیم در محافظت آنتی‌اکسیدانی گیاه در شرایط تنش خشکی، آزمایش حاضر به‌منظور بررسی تأثیر محلول‌پاشی سلنیوم و کلسیم بر میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و برخی صفات بیوشیمیایی گیاه گلرنگ در شرایط تنش خشکی انجام شد.

مواد و روش‌ها

آزمایش حاضر در مزرعه تحقیقاتی چاه‌نیمه واقع در شهرستان زهک در سال زراعی 1396-1397، به صورت کرت‌های خرد شده بر پایه طرح بلوک‌های کاملاً تصادفی با سه تکرار اجرا گردید. این منطقه بر اساس طبقه‌بندی کوپن در اقلیم خشک بسیار گرم، با تابستان‌های گرم و خشک و بر اساس طبقه‌بندی آمبرژه نیز جزو مناطق گرم و خشک قرار می‌گیرد. میانگین دراز مدت (30 ساله) بارندگی در منطقه 63 میلی‌متر، میزان تبخیر سالیانه به‌طور متوسط 4500-5000 میلی‌متر، میانگین دراز مدت دمای منطقه 23 درجه سانتی‌گراد و کمینه حرارت مطلق 7- درجه است. پیش از کاشت نمونه خاک‌های مزرعه برای انجام آزمایش تجزیه خاک به آزمایشگاه منتقل شد و نتایج آن در جدول (1) ارائه شده است.

 جدول 1. خواص فیزیکی و شیمیایی خاک محل آزمایش در عمق 30-0 سانتی‌متر

Table 1. Physical and chemical properties of test soil at a depth of 0-30 cm

تیمارهای آزمایش شامل سطوح قطع آبیاری بر اساس مراحل فنولوژیک گیاه (Tanaka et al., 2002) در سه سطح شاهد (آبیاری کامل تا پایان فصل رشد)، =R₁ آبیاری تا مرحله تشکیل طبق ساقه اصلی به قطر 25/0 اینچ و =R₂ آبیاری تا مرحله تکمیل گل‌دهی و عامل فرعی شامل چهار سطح تیمار محلول‌پاشی شامل F₁= شاهد (آب خالص)، F₂= تنظیم‌کننده رشد هامون گرین 1 لیتر در 10 لیتر آب + کربنات کلسیم، F₃= تنظیم‌کننده رشد هامون گرین 1 لیتر در 20 لیتر آب + کربنات کلسیم و F₄= تنظیم‌کننده رشد هامون گرین 1 لیتر در 30 لیتر آب + کربنات کلسیم بود. بذر استفاده‌شده رقم گلدشت بود که از مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی سیستان تهیه شد. تنظیم‌کننده رشد آلی (هامون گرین^®) شامل ترکیبات نانوسلنیوم، آنتوسیانین، الکل استیک و کلسیم آلی است. تنظیم‌کننده رشد هامون گرین (شرکت سروش سپهر هامون، مشهد) یک محلول رشد آلی است که به‌صورت محلول‌پاشی در دو مرحله رشد رویشی و رشد زایشی کاربرد دارد. ازآنجایی‌که عنصر اصلی این محلول سلنیوم است، دارای اثر محافظتی در برابر تنش خشکی است. کلسیم استفاده‌شده در این آزمایش از کلسیم موجود در پودر پوسته تخم‌مرغ که در اسید سولفوریک 96% هضم شده و سپس به‌وسیله آب مقطر به اسیدیته خنثی رسانیده شد، به دست آمده است. نمونه حاوی پودر پوسته تخم‌مرغ به‌منظور تجزیه به آزمایشگاه منتقل شد که در نتیجه هضم با اسید سولفوریک شامل (756/70 درصد وزنی کلسیم، 141/0 درصد وزنی پتاسیم، 513/0 درصد وزنی منیزیم، 002/0 درصد وزنی روی و 217/0 درصد وزنی فسفر) بوده است. سپس بر طبق نتایج به دست آمده از تجزیه و تعیین مقادیر مول بر لیتر کلسیم خالص با استفاده از جرم اتمی استاندارد کلسیم برای هر سطح تیمار محلول‌پاشی و تبدیل واحد مولاریته به گرم مقدار کلسیم در تیمار 1 لیتر در 10 لیتر (برای هر کرت در حدود 78 گرم بر لیتر کلسیم)، تیمار 1 لیتر در 20 لیتر (برای هر کرت در حدود 39 گرم بر لیتر کلسیم) و تیمار1 لیتر در 30 لیتر (برای هر کرت در حدود 8/25 گرم بر لیتر کلسیم) مشخص گردید.

پیش از محلول‌پاشی، ابتدا محلول به دست آمده از پودر پوسته تخم‌مرغ به‌نسبت برابر با هر سه سطح محلول هامون گرین مخلوط و سپس محلول‌پاشی انجام شد. به‌منظورجلوگیری از هدر رفت و عدم سرایت محلول مورد نظر به کرت‌های مجاور، محلول‌پاشی در غروب و در هوای کاملاً صاف و بدون وزش باد انجام گرفت. مویان (Surfactant) استفاده شده برای محلول‌پاشی با نام تجاری (Hydrosil) بوده که ترکیبات آن شامل حلال (15 درصد)، (Trisiloxan-85%)، مقدار مصرف آن 3/0 تا 5/0 میلی‌لیتر در لیتر است. محلول‌پاشی بر اساس مراحل فنولوژیک رشد (Tanaka et al., 2002) در سه مرحله 1- تشکیل طبق ساقه اصلی به قطر 25/0 اینچ (R1)، 2- تکمیل شاخه‌دهی (R2)، 3- تکمیل گل‌دهی (R3) اعمال شدند.

آماده‌سازی زمین شامل شخم و دیسک و تسطیح بود. تعداد 36 کرت به طول و عرض 2 متر فواصل بین ردیف 40 سانتی‌متر و فاصله روی ردیف 10 سانتی‌متر، فاصله بین کرت‌های اصلی 5/1 متر و فاصله بین کرت‌های فرعی 50 سانتی‌متر در نظر گرفته شد. باتوجه‌به نتایج تجزیه خاک (جدول 1) و توصیه کودی، کودهای شیمیایی مورد نیاز به خاک اضافه شد. کاشت در آبان‌ماه 1396 به‌صورت دستی انجام شد و نخستین آبیاری بلافاصله پس از کاشت صورت پذیرفت. وجین علف‌های هرز به روش دستی انجام شد و همچنین آفت مهمی در طول دوره آزمایش مشاهده نشد. در مرحله رسیدگی فیزیولوژیک، تعداد 6 بوته از هر کرت به‌طور تصادفی انتخاب و نمونه‌برداری از برگ گیاهان انجام و نمونه‌ها در فریزر در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد.

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی

عصاره آنزیمی: برای عصاره‌گیری نمونه‌ها به‌منظور اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و میزان پروتئین، ابتدا 1/0 گرم نمونه برگ در ازت مایع کاملاً ساییده شد. سپس دو میلی‌لیتر بافر استخراج (حاوی 607/0 گرم تریس با اسیدیته 7، 05/0 گرم پلی وینیل پیرولیدین و 10 میلی‌لیتر اسید کلریدریک شش نرمال در 50 میلی‌لیتر آب مقطر) به آن اضافه شد و در داخل هاون چینی کاملاً هموژنیزه گردید. مخلوط حاصل به‌مدت 15 دقیقه در سانتریفیوژ (شرکت پارس طب، ایران) با دور rpm 13000 قرار گرفت و پس از آن، فاز بالایی برای قرائت صفات، استفاده شد. برای اندازه‌گیری غلظت پروتئین از روش برادفورد (Bradford, 1976) استفاده شد.

سنجش آنزیم کاتالاز: برای اندازه‌گیری آنزیم کاتالاز، 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی، 600 میکرولیتر بافر فسفات سدیم (اسیدیته 7)، 15/0 میکرولیتر EDTA، 85/549 میکرولیتر آب مقطر را در تیوب ریخته و 300 میکرولیتر آب اکسیژنه به آن اضافه شد و بلافاصله در دستگاه اسپکتوفتومتری با طول موج 240 نانومتر میزان جذب آن ثبت گردید و پس از سپری شدن زمان یک دقیقه، دوباره میزان جذب یادداشت شد. تغییرات جذب پس از تقسیم بر میزان پروتئین بر اساس واحد میلی‌گرم پروتئین در دقیقه بیان شد (Beers and Sizer, 1952).

سنجش آنزیم پراکسیداز: دو میلی‌لیتر محلول واکنش (4/1 میلی‌لیتر بافر سیترات - فسفات 25 میلی‌مول (اسیدیته 4/5)، 20 میکرولیتر گایاکول و 40 میکرولیتر عصاره آنزیمی) در یک لوله آزمایش مخلوط شدند و سپس 10 میکرولیتر پراکسید هیدروژن (H₂O₂) 30 درصد به مخلوط اضافه شد و تغییرات جذب نور با فواصل 10 ثانیه و به مدت یک دقیقه در طول موج 475 نانومتر قرائت گردید (Moaveni and Kheiri, 2011).

سنجش آنزیم پلی فنل اکسیداز: برای اندازه‌گیری آنزیم پلی فنل اکسیداز 5/2 سی‌سی بافر فسفات پتاسیم (مخلوط KH₂PO₄ و K₂HPO₄)، 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی و 200 میکرولیتر پیروگالول 20 میلی‌مولار اضافه گردید. تغییرات جذب نور در طول موج 420 نانومتر اندازه‌گیری شد (Janovitz-Klapp et al., 1990).

سنجش آنزیم آسکوربات پراکسیداز: برای اندازه‌گیری آنزیم آسکوربات پراکسیداز 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی، 5/37 میکرولیتر آسکوربات، 85/1118 میکرولیتر آب در تیوب ریخته شد و 5/1 میکرولیتر آب اکسیژنه به آن اضافه شد و بلافاصله در طول موج 290 نانومتر در دستگاه اسپکتوفتومتری میزان جذب آن یادداشت و پس از سپری شدن مدت زمان یک دقیقه، دوباره میزان جذب یادداشت گردید (Nakano and Asada, 1981).

برای سنجش کربوهیدرات‌های محلول کل از روش اشلیگل (Sheligl, 1986) استفاده شد. در هر کدام از نمونه‌ها، هیدرات کربن با استفاده از آب مقطر و بر اساس روش اسید سولفوریک استخراج شد. در این روش 1/0 گرم از بافت تر برگ به همراه 10 سی‌سی آب مقطر، یک ساعت در بن‌ماری در دمای 80 درجه سانتیگراد حرارت داده شد. به یک سی‌سی از این نمونه، یک سی‌سی فنل 5/0 درصد و 4 سی‌سی اسید سولفوریک 98 درصد اضافه شد. میزان نور جذبی در 483 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. ﻣﻘﺪار ﻓﻨﻞ ﺑﺎ ﻣﻌﺮف ﻓﻮﻟین- سیوکالتیو ﺗﻌﯿـﯿﻦ ﺷﺪ. ﺑﺮای ﺳﻨﺠﺶ ﻣﻘﺪار ﻓﻨـﻞ، ﺣـﺪود 1/0 گرم از ﺑﺮگ‌ﻫﺎی ﺗﺎزه را در 10 ﻣﯿﻠﯽ‌ﻟﯿﺘﺮ ﻣﺘـﺎﻧﻮل ﺑـﻪ‌ﻣـﺪت 2 دﻗﯿﻘﻪ ﺳﺎﯾﯿﺪه و ﻣﺤﻠﻮل ﺑﻪ دﺳﺖ آﻣﺪه ﺑﺎ ﮐﺎﻏـﺬ ﺻـﺎﻓﯽ، ﺻــﺎف ﺷــﺪ. ﺑــﻪ 2/0 میلی‌لیتر از ﻋﺼــﺎره رﻗﯿﻖ ﺷﺪه (1:3) با محلول متانول، 1 میلی‌لیتر فولین و ﺳـﭙﺲ 8/0 میلی‌لیتر کربنات سدیم ﺑﻪ آن اﺿﺎﻓﻪ ﺷﺪه و ﻧﻤﻮﻧﻪ‌ﻫﺎ ﺑﻪ‌ﻣﺪت 15 دﻗﯿﻘﻪ در دﻣﺎی آزﻣﺎﯾﺸﮕﺎه ﺑﺎﻗﯽ ﻣﺎﻧﺪ و ﺟﺬب آن در 765 نانومتر ﺑﺎ دﺳﺘﮕﺎه اسپکتوفتومتر (مدل Gold 54، شرکت Angstrom Advanced، آمریکا) قرائت ﺷﺪ (McDonald et al., 2001). محتوای تام فلاونوئید با استفاده از معرف آلومینیوم کلرید اندازه‌گیری شد. به 5/0میلی‌لیتر از هر عصاره (10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر)، 5/1 میلی‌لیتر متانول، 1/0میلی‌لیتر از محلول آلومینیوم کلرید 10 درصد در اتانول، 1/0 میلی‌لیتر از استات پتاسیم 1 مولار و 8/2 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه شد. جذب مخلوط 30 دقیقه پس از نگهداری در دمای اتاق، در طول موج 415 نانومتر در مقابل بلانک خوانده شد. از کوئرستین به عنوان استاندارد برای رسم منحنی کالیبراسیون استفاده شد (Chang et al., 2002).

برای تجزیه و تحلیل داده‌ها از نرم افزار SAS نسخه (1/9) و برای انجام مقایسه میانگین‌ها از آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد استفاده شد.

نتایج و بحث

فعالیت آنزیم کاتالاز

جدول تجزیه واریانس نشان داد اثر تنش خشکی و محلول‌پاشی در سطح احتمال یک درصد و اثر متقابل آنها در سطح احتمال پنج درصد بر فعالیت آنزیم کاتالاز معنی‌دار بود (جدول 2). بیشترین میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (61/35 واحد میلی‌گرم پروتئین در دقیقه) در تیمار آبیاری تا مرحله تشکیل طبق ساقه اصلی به قطر 25/0 اینچ توأم با محلول‌پاشی تنظیم‌کننده رشد آلی به مقدار 1 لیتر در 10 لیتر آب + کلسیم و کمترین میزان آن (59/13 واحد میلی‌گرم پروتئین در دقیقه) در تیمار آبیاری کامل توأم با محلول‌پاشی آب خالص مشاهده شد که 83/61 درصد طی تنش خشکی افزایش یافته است (شکل 1).

جدول 2. تجزیه واریانس اثرات تنش خشکی و محلول‌پاشی بر صفات: کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، پلی فنل اکسیداز، پراکسیداز، فنل، فلاونوئید، کربوهیدرات و پروتئین.

Table 2. ANOVA of the effects of drought stress and foliar application on traits: catalase, ascorbate peroxidase, polyphenol oxidase, peroxidase, phenol, flavonoid, carbohydrate, and protein.

**، *و ns: به‌ترتیب معنی‌دار در سطح احتمال یک و پنج درصد و غیر معنی‌دار

**, * and ns: significant at 5% and 1% probability levels and non-significant, respectively.

شکل 1-اثر برهم‌کنش تنش خشکی و محلول‌پاشی بر فعالیت آنزیم کاتالاز. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

Fig 1- Interaction effect of drought stress and foliar application on catalase activity. Same letters indicate no significant differences with Duncan test.

یکی از پاسخ‌های سازگاریافته گیاهان در برابر تنش اکسیداتیو سنتز آنزیم‌هایی مانند کاتالاز است (Mittler, 2002). تحت تنش خشکی فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز افزایش یافته و در از بین بردن پراکسید هیدروژن تولید شده در سلول‌های تحت تنش نقش اساسی داشته که باعث محدود شدن آسیب سلولی و همچنین، افزایش ظرفیت اکسیداتیو گیاهان برای مقابله با تنش خشکی می‌شود (Nojavan and Khorshidi, 2006). افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز تحت تنش خشکی در آزمایش‌های مختلفی روی گلرنگ (Mahdavi et al., 2013; Fathi Amirkhiz et al., 2011) و کلزا (Dawood and Sadak, 2014) گزارش شده است. تحقیقات اخیر نشان داده است که سلنیوم نه‌تنها قادر به تحریک رشد و نمو گیاهان است، بلکه مقاومت و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی گیاهانی را که تحت تنش‌های مختلف قرار دارند، نیز افزایش می‌دهد (Djanaguiraman et al., 2005). اثر مفید سلنیوم در گیاهان تحت شرایط تنش در بیشتر موارد به افزایش فعالیت آنتی‌اکسیدانی نسبت داده شده است. کارهای تحقیقاتی انجام شده توسط Djanaguiraman و همکاران (2005) اثر سلنیوم به‌صورت سلنات بر پیری کاهو و سویا را نشان داد و تأیید کرد که کاهش فعالیت آنزیم آنتی‌اکسیدان در گیاهان تحت تیمار با این عنصر ملایم‌تر است که با افزایش رشد در گیاهان تیمار شده با سلنیوم خسارت اکسیداتیو را جبران می‌کند. نتایج آزمایش Khademi و همکاران (2015) بر گیاه گلرنگ که بیان کردند محلول‌پاشی سلنیوم باعث افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان شد، هم‌راستا با نتایج این آزمایش است. اثر آنتی‌اکسیدانی سلنیوم در سبزیجات غنی‌شده با سلنیوم به‌علت افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، لیپوکسی‌ژناز (Rios et al., 2008)، سوپراکسید دیسموتاز (Rios et al., 2009)، کاتالاز (Ramos et al., 2010)، آسکوربات پراکسیداز و گلوتاتیون پراکسیداز (Rios et al., 2009) مشخص شده است. Xu و همکاران (2013) در آزمایش کاربرد کلرید کلسیم در گیاه چمن ژاپنی گزارش کردند، در اثر پیش تیمار 10 میلی‌مول کلرید کلسیم در گیاه فعالیت آنزیم کاتالاز هم در شرایط تنش خشکی و هم در شرایط نرمال افزایش معنی‌دار یافت.

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز

نتایج نشان داد اثر تنش خشکی و محلول‌پاشی بر فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز معنی‌دار بود (جدول 2). بیشترین میزان فعالیت این آنزیم (67/66 واحد میلی‌گرم پروتئین در دقیقه) در تیمار آبیاری تا مرحله تشکیل طبق ساقه اصلی به قطر 25/0 اینچ توأم با محلول‌پاشی تنظیم‌کننده رشد آلی به مقدار 1 لیتر در 10 لیتر آب + کلسیم و کمترین میزان آن (33/29 واحد میلی‌گرم پروتئین در دقیقه) در تیمار آبیاری کامل توأم با محلول‌پاشی آب خالص به‌ دست آمد که نشان داد، فعالیت این آنزیم در تنش خشکی 58 درصد افزایش یافته است (شکل 2). از دیدگاه محققان آنزیم آسکوربات پراکسیداز به‌عنوان مهم‌ترین آنتی‌اکسیدان در گیاه، احیاکننده بسیاری از رادیکال‌های آزاد به‌ویژه پراکسید هیدروژن عمل می‌کند، به‌همین‌علت می‌تواند خسارت‌های حاصل از تنش اکسیداتیو را به حداقل رساند (Kafi et al., 2012). در میان پراکسیدازها، آسکوربات پراکسیداز و گلوتاتیون پراکسیداز به‌ترتیب از آسکوربات و گلوتاتیون به‌عنوان دهنده الکترون استفاده می‌کنند و به‌علت نقش آنها در سم‌زدایی پراکسید هیدروژن در گیاهان شناخته شده است. این مسیر در کلروپلاست و همچنین، در سیتوزول عمل می‌کند (Hediye Sekmen et al., 2007). بسته به گونه گیاهی ایزوآنزیم‌های مختلف آسکوربات پراکسیداز، یا در استروما (sAPX) قرار دارند و یا به غشای تیلاکوئید (tAPX) متصل می‌شوند (Shigeoka et al., 2002). کلروپلاست حاوی مخزن اصلی آسکوربات سلولی در محدوده میکرومولار است و آسکوربات پراکسیداز، پراکسید هیدروژن تولید شده را توسط چرخه آب-آب (water-water cycle) تنظیم می‌کند. این مکانیسم چرخه به‌صورت کارآمد طول عمر رادیکال آنیون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن تولیدی توسط نور را کوتاه می‌کند تا از تولید رادیکال‌های هیدروکسیل و ترکیب آنها با مولکول‌های هدف جلوگیری و در نهایت به مهار نوری منجر می‌شود (Kohli et al., 2019; Asada, 2006). در آزمایشی که در گیاه گلرنگ انجام شد، محققان گزارش کردند تنش خشکی باعث افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان شده است که هم‌سو با نتایج پژوهش حاضر است (Khosrowshahi et al., 2020). محققان افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز را در شرایط قطع آبیاری در مرحله تکمیل شاخه‌دهی در گیاه گلرنگ گزارش کردند (Hamidi moghaddam et al., 2021). در آزمایش حاضر محلول‌پاشی تنظیم‌کننده رشد آلی سبب افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز گردید، در این راستا محققان گزارش کردند کاربرد سلنیوم در گیاه منداب باعث افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان به‌ویژه آنزیم آسکوربات پراکسیداز شد (Khattab et al., 2004). در آزمایشی محققان بیان کردند کاربرد کلسیم با تقویت سیستم آنتی‌اکسیدانی آنزیمی به‌ویژه آنزیم‌های آسکوربات پراکسیداز و سوپراکسیددیسموتاز و همچنین، کاهش تجمع گونه‌های فعال اکسیژنی، سطح مقاومت به شوری را تا حدی در گیاه گوجه‌فرنگی در شرایط تنش افزایش داده است (Hosseini Tafreshi et al., 2019).  

شکل 2- اثر برهم‌کنش تنش خشکی و محلول‌پاشی بر فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

Fig 2- Interaction effect of drought stress and foliar application on ascorbate peroxidase activity. Same letters indicate no significant differences with Duncan test.

فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز

تنش خشکی، محلول‌پاشی و اثر متقابل آنها بر فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز معنی‌دار بود (جدول 2). بیشینه میزان فعالیت این آنزیم (08/14 واحد میلی‌گرم پروتئین در دقیقه) در تیمار آبیاری تا مرحله تشکیل طبق ساقه اصلی به‌قطر 25/0 اینچ توأم با محلول‌پاشی تنظیم کننده رشد آلی به مقدار 1 لیتر در 10 لیتر آب + کلسیم و حداقل میزان فعالیت آن (52/3 واحد میلی‌گرم پروتئین در دقیقه) در تیمار آبیاری کامل توأم با محلول‌پاشی آب خالص مشاهده شد، فعالیت این آنزیم 75 درصد در طی تنش خشکی افزایش نشان داد (شکل 3). فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز در شرایط تنش خشکی از تولید بیش از اندازه اجزای خطی انتقال الکترون در واکنش مهلر جلوگیری می‌کند (Thipyapong et al., 2004) و به همین علت موجب کاهش اکسیژن مولکولی و تنظیم سطح اکسیژن پلاستیدی می‌شود (Trebst and Depka, 1995).Dawood  وSadak (2014) در آزمایشی تحت تنش خشکی بر گیاه کلزا، گزارش کردند تنش خشکی باعث افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و به‌ویژه آنزیم پلی فنل اکسیداز گردید و از این طریق سیستم آنتی‌اکسیدانی گیاه باعث کاهش اثرات سوء تنش خشکی در این گیاه شد. Zafari و همکاران (2020) گزارش کردند، فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز در گلرنگ تحت تأثیر تنش خشکی قرار گرفت و فعالیت این آنزیم در تمام واریته‌های مورد آزمایش افزایش یافت که هم‌راستا با نتایج آزمایش حاضر است. در آزمایشی بر گیاه گندم، کمبود آب میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان را افزایش داد، از طرفی محلول‌پاشی سلنیوم در شرایط تنش میزان آنزیم‌های آنتی اکسیدان را افزایش داد و در غلظت 20 گرم در هکتار به حداکثر رسید (Dadnia, 2018).

شکل 3- اثر برهم‌کنش تنش خشکی و محلول‌پاشی بر فعالیت آنزیم پلی‌فنل اکسیداز. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

Fig 3- Interaction effect of drought stress and foliar application on polyphenol oxidase activity. Same letters indicate no significant differences with Duncan test.

فعالیت آنزیم پراکسیداز

فعالیت آنزیم پراکسیداز تحت تأثیر تنش خشکی، محلول‌پاشی و اثر متقابل آنها در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار شد (جدول 2). بیشترین میزان فعالیت این آنزیم (33/14 واحد میلی‌گرم پروتئین در دقیقه) در تیمار آبیاری تا مرحله تشکیل طبق ساقه اصلی به قطر 25/0 اینچ توأم با محلول‌پاشی تنظیم‌کننده رشد آلی به‌مقدار 1 لیتر در 10 لیتر آب + کلسیم و کمترین میزان فعالیت این آنزیم (42/2 واحد میلی‌گرم پروتئین در دقیقه) در تیمار آبیاری کامل توأم با محلول‌پاشی آب خالص به دست آمد که نشان داد فعالیت این آنزیم به مقدار 83 درصد در طی تنش خشکی افزایش یافته است (شکل 4). آنزیم پراکسیداز عمدتاً رادیکال‌های آزاد هیدروکسیل (OH) را به آب اکسید می‌کند (Jovanović et al., 2018). در آزمایش حاضر سطوح مختلف تنش خشکی باعث افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز شد، نتایج مشابهی توسط Mosavi و همکاران (2020)، Thippeswamy و همکاران (2021) بر گیاه گلرنگ در شرایط تنش خشکی گزارش شده است که تأییدکننده نتایج پژوهش حاضر است. Bybordi (2016) در آزمایشی بر گیاه کلزا بیان کرد، محلول‌پاشی سلنیوم باعث افزایش فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و سوپر اکسید دیسموتاز شد که هم‌سو با نتایج آزمایش حاضر است. پژوهشگران در آزمایشی بر گیاه چمن ژاپنی بیان کردند کاربرد تیمار کلرید کلسیم در شرایط تنش خشکی باعث افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان کاتالاز، پراکسیداز و سوپر اکسید دیسموتاز شد. نتایج آنها نشان داد که توسط کاربرد غلظت مناسب کلسیم می‌توان آسیب‌های اکسیداسیون ناشی از تنش خشکی را با سم‌زدایی گونه‌های فعال اکسیژن کاهش داد (Chengbin et al., 2013).

شکل 4- اثر برهم‌کنش تنش خشکی و محلول‌پاشی بر فعالیت آنزیم پراکسیداز. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

Fig 4- Interaction effect of drought stress and foliar application on peroxidase activity. Same letters indicate no significant differences with Duncan test.

محتوای فنل و فلاونوئید

محتوای فنل تحت تأثیر تنش خشکی، محلول‌پاشی و اثر متقابل آنها در سطح احتمال یک درصد و محتوای فلاونوئید در اثر متقابل تنش خشکی و محلول‌پاشی در سطح احتمال پنج درصد معنی‌دار شد (جدول 2). بیشترین میزان فنل (46/28 میلی‌گرم بر گرم وزن تر) و فلاونوئید (01/17 میلی‌گرم بر گرم وزن تر) از تیمار آبیاری تا مرحله تشکیل طبق ساقه اصلی به قطر 25/0 اینچ توأم با محلول‌پاشی تنظیم‌کننده رشد آلی به مقدار 1 لیتر در 10 لیتر آب + کلسیم و کمترین میزان فنل (67/4 میلی‌گرم بر گرم وزن تر) و فلاونوئید (42/3 میلی‌گرم بر گرم وزن تر) از تیمار آبیاری کامل توأم با محلول‌پاشی آب خالص به دست آمد، محتوای فنل و فلاونوئید به‌ترتیب 83 و 79 درصد در طی تنش خشکی افزایش یافته است (شکل 5). محتوای فنلی کل در دانه‌های روغنی برای پایداری اکسیداتیو اسیدهای چرب اشباع‌نشده چندگانه روغن‌ها و همچنین، نشان‌دهنده فعالیت آنتی‌اکسیدانی بسیار مهم است (Ali et al., 2013). محققان بیان کردند ترکیبات فنلی با دادن الکترون به آنزیم‌های نوع پراکسیداز و سم‌زدایی آب‌اکسیژنه تولیدشده در سلول‌ها به‌عنوان نوعی آنتی‌اکسیدان عمل می‌کنند (Sakihama et al., 2002) ، این ترکیبات در گیاهان دارای ساختار شیمیایی خاصی هستند که سلول‌ها را در برابر تنش‌های اکسیداتیو از طریق کلات کردن فلزات و اتصال با رادیکال‌های آزاد به همراه پراکسیداسیون کمتر چربی‌ها محافظت می‌کنند (Michalak, 2006). فلاونوئیدها از انواع آنتی‌اکسیدان‌هایی هستند که قابلیت انتقال یک پروتون موجود درحلقه خود را دارند و از این رو باعث پاک‌سازی رادیکال‌های آزاد می‌شوند (Cao et al., 1997)، همچنین از پراکسیداسیون لیپید جلوگیری کرده و باعث افزایش پایداری غشا و سیالیت غشا می‌شوند و از آزاد شدن رادیکال‌های آزاد اکسیژن جلوگیری می‌کنند و باعث مهار واکنش‌های پراکسیداسیون می‌شوند (Kadioglu et al., 2011). در آزمایشی که Farooq و همکاران (2020)، روی 4 واریته گلرنگ تحت تنش خشکی انجام دادند، بیان کردند فعالیت سیستم آنتی‌اکسیدانی و محتوای فنلی کل تمامی واریته‌های مورد آزمایش تحت تنش خشکی افزایش یافت، این یافته‌ها تأییدکننده نتایج حاضر در این آزمایش است. در آزمایشات مختلفی کاربرد سلنیوم باعث افزایش محتوای ترکیبات فنلی کل در برگ‌های گیاه ریحان (Skrypnik et al., 2019)، ذرت (Gul et al., 2017) و بادرنجبویه (Habibi et al., 2016) شد. بااین‌حال، لازم به ذکر است که مکانیسم تأثیر سلنیوم بر متابولیسم ثانویه گیاهان هنوز درک نشده است. Zhu و همکاران (2018) همچنین نشان دادند که افزایش سطح فلاونوئیدها در گوجه‌فرنگی توسط تیمار سلنیوم با افزایش بیان تعدادی از ژن‌های موجود در بیوسنتز این متابولیت‌های ثانویه همراه است. نقش کلسیم نیز با تأثیر بر آنزیم‌های مؤثر در سنتز و اکسیداسیون فنل‌ها مانند فنیل آلانین آمونیالیاز، پراکسیداز، پلی فنل اکسیداز مشخص شده است. از این طریق عنصر کلسیم در چرخه متابولیسم اسیدهای فنولیک نقش مؤثری دارد (Castaneda et al., 1996).

کربوهیدرات‌های محلول کل

تنش خشکی، محلول‌پاشی و اثر متقابل آنها بر محتوای کربوهیدرات‌های محلول معنی‌دار بود (جدول 2). بیشترین مقدار کربوهیدرات (95/0 میکرومول گلوکز بر گرم وزن تر) در تیمار آبیاری تا مرحله تشکیل طبق ساقه اصلی به قطر 25/0 اینچ توأم با محلول‌پاشی تنظیم‌کننده رشد آلی به مقدار 1 لیتر در 10 لیتر آب + کلسیم و کمترین میزان آن (19/0 میکرومول گلوکز بر گرم وزن تر) در تیمار آبیاری کامل توأم با محلول‌پاشی آب خالص به دست آمد، افزایش کربوهیدرات به میزان 80 درصد در طی تنش خشکی مشاهده شد (شکل 6). در هنگام تنش خشکی گیاهانی که از مکانیسم تحمل به تنش استفاده می‌کنند، با افزایش مواد تنظیم‌کننده اسمزی (مانند پرولین و کربوهیدرات) در سلول با تنش کم‌آبی مقابله می‌کنند، زیرا افزایش قندهای محلول می‌تواند به‌عنوان ترکیبات اسمزی و همچنین، به‌عنوان حفاظت‌کننده‌های اسمزی عمل کنند که در نهایت سبب ثبات پروتئین‌ها و غشاء می‌شوند (Kafi et al., 2010).

شکل 5- اثر برهم‌کنش تنش خشکی و محلول‌پاشی بر محتوای فلاونوئید (الف) و فنل (ب). حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

Fig 5- Interaction effect of drought stress and foliar application on flavonoid (A) and Phenol (B) content. Same letters indicate no significant differences with Duncan test.

در آزمایش حاضر تجمع کربوهیدرات به‌عنوان یکی از راهکارهای تحمل گیاه در شرایط تنش خشکی نشان داده شد، این نتایج با یافته‌های محققان پیشین که افزایش محتوای کربوهیدرات را در طی تنش خشکی بر گیاه گلرنگ (Chavoushi et al., 2019; Rahmani et al., 2019) گزارش کرده‌اند، مطابقت دارد. Simojoki (2003) با کاربرد سلنیوم در کاهو نتیجه گرفت که افزایش رشد گیاه احتمالاً به‌علت تأثیرات مثبت سلنیوم بر اندام‌های هوایی از جمله افزایش تولید و تجمع کربوهیدرات است. در آزمایش دیگری تحت تنش شوری Kong و همکاران (2005)، گزارش کردند که در غلظت‌های کم (5-1 میکرومولار)، سلنیوم تمایل به تحریک رشد، فعالیت آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز و همچنین، تجمع قندهای محلول در آب در برگ‌های گیاه ترشک دارد. Karimi (2020) در آزمایشی به‌منظور تأثیر تغذیه ابتدای فصل کلسیم و روی بر عملکرد، محتوای قند و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی انگور بیان داشتند، محتوای قندهای محلول کل در تاک‌های تیمار شده توسط سولفات کلسیم و سولفات روی روند افزایشی نشان داد، به‌طوری‌که در تاک‌های تیمار شده با سولفات کلسیم یک درصد به ‌مقدار بیشینه رسید.

شکل 6- اثر برهم‌کنش تنش خشکی و محلول‌پاشی بر کربوهیدرات­های محلول کل. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

Fig 6- Interaction effect of drought stress and foliar application on total soluble carbohydrates. Same letters indicate no significant differences with Duncan test.

پروتئین محلول

محتوای پروتئین تحت تأثیر تنش خشکی، محلول‌پاشی و اثر متقابل آنها در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار بود (جدول 2). بیشترین مقدار پروتئین (021/0 میلی‌گرم بر گرم وزن تر) در تیمار آبیاری تا مرحله تشکیل طبق ساقه اصلی به قطر 25/0 اینچ توأم با محلول‌پاشی تنظیم‌کننده رشد آلی به مقدار 1 لیتر در 10 لیتر آب + کلسیم و کمترین میزان آن (01/0 میلی‌گرم بر گرم وزن تر) در تیمار آبیاری کامل توأم با محلول‌پاشی آب خالص به دست آمد، بر اساس نتایج مقدار پروتئین 52 درصد در اثر متقابل تنش و محلول‌پاشی افزایش یافت (شکل 7). املاح آلی مانند پروتئین‌های محلول می‌توانند گیاهان را در شرایط تنش از طریق تنظیم اسمزی، کاهش گونه‌های فعال اکسیژن واکنش‌پذیر (ROS)، تثبیت ساختار غشا محافظت کنند و به ویژگی‌های ساختاری پروتئین‌ها و آنزیم‌ها کمک کند (Farooq et al., 2009). نتایج آزمایشی که Wei و همکاران (2020) به منظور مطالعه بر متابولیسم، مسیرها و ژن‌های مرتبط با تحمل به تنش خشکی در گلرنگ انجام دادند، بیانگر این مطلب بود که مقدار پروتئین محلول هر دو واریته گلرنگ مورد آزمایش در شرایط تنش خشکی افزایش یافت که تأییدکننده نتایج حاضر است، همچنین، Amini و همکاران (2014) در آزمایشی بر واریته‌های گلرنگ تحت تنش خشکی گزارش کردند، محتوای پروتئین واریته‌های مورد آزمایش تحت تنش خشکی افزایش یافت. تاکنون سازوکار تأثیر سلنیوم بر سنتز پروتئین‌ها به‌طور کامل مشخص نشده است، اما محققان پیشنهاد کردند که ممکن است یکی از علل آن افزایش فعالیت آنزیم نیترات ردوکتاز باشد. در آزمایشی که Hajiboland و همکاران (2015) به‌منظور بررسی تأثیر تیمار سلنیم بر تحمل تنش خشکی در گیاه کلزا انجام دادند، مقدار پروتئین برگ تحت تأثیر تیمار سلنیوم به صورت معنی‌داری افزایش یافت. آنها اظهار داشتند که افزایش مقدار پروتئین‌های گیاهان در شرایط تنش خشکی می‌تواند از تحریک رشد مشاهده شده توسط سلنیوم حمایت نموده و نشان‌دهنده تحریک متابولیسم ازت در کنار تحریک متابولیسم کربن در گیاهان تحت تیمار سلنیوم باشد. Khademi و همکاران (2015) در آزمایشی بر گیاه گلرنگ بیان کردند، محلول‌پاشی سلنیوم باعث افزایش درصد پروتئین در این گیاه شد و بیشترین میزان پروتئین از تیمار 200 میلی‌گرم در لیتر سلنیوم حاصل شد که با نتایج حاصل از این آزمایش هم‌خوانی دارد. نتایج محققان دیگر در گیاه باقلا نشان‌دهنده افزایش میزان پروتئین برگ با کاربرد تیمار سلنیوم بود و بیشترین میزان پروتئین از تیمار 50 میلی‌گرم در لیتر سلنیوم حاصل شد (Moussa and Ahmed, 2010). در مطالعه Madanipour و همکاران (2017) بر دو رقم سویا در شرایط کم‌ آبیاری گزارش کردند، تنش خشکی بر میزان پروتئین دانه اثر گذاشته و به کاهش این صفت منجر شده است. از طرفی محلول‌پاشی سیلیکات کلسیم بر رقم L17 باعث افزایش عملکرد پروتئین شد.

شکل 7- اثر برهم‌کنش تنش خشکی و محلول‌پاشی بر پروتئین محلول. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

Fig 7- Interaction effect of drought stress and foliar application on soluble protein. Same letters indicate no significant differences with Duncan test.

تیجه گیری کلی

تنش خشکی باعث افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، فنل و فلاونوئید شد. همچنین، محتوای کربوهیدرات و پروتئین در طی تنش خشکی افزایش یافتند. در بین تیمارهای تنش، آبیاری تا مرحله تشکیل طبق ساقه اصلی به قطر 25/0 اینچ باعث بیشترین افزایش فعالیت سیستم آنتی‌اکسیدانی گیاه شد که نشان‌دهنده حساسیت گیاه به این شدت از تنش است. سلنیوم و کلسیم موجود در محلول به کار برده شده در این آزمایش باعث افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و اجزای غیر آنزیمی در هر سطح تنش شد که نشان‌دهنده سازوکار بهبوددهندگی این دو عنصر در شرایط تنش خشکی است. در هر سطح تنش بیشترین مقدار صفات مطالعه‌شده در تیمار 1 لیتر در 10 لیتر آب + کلسیم به دست آمد. به‌طورکلی می‌توان گفت کاربرد سلنیوم و کلسیم در شرایط تنش خشکی با فعال کردن سیستم آنتی‌اکسیدانی و غیر آنزیمی اثرات مضر تنش را در گیاه کاهش داده و باعث تحمل گیاه در شرایط تنش می‌شود.

سپاسگزاری

بخشی از هزینه اجرای این آزمایش از محل اعتبار پژوهانه IR-UOZ-GR-2904 دانشگاه زابل تأمین شده است.