نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکدۀ کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل، ایران
2 گروه فارماسیوتیکس و بیوتکنولوژی دارویی، دانشکدۀ داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی اردبیل، اردبیل، ایران
3 گروه فارماکوگنوزی، دانشکدۀ داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی اردبیل، اردبیل، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
The Moringa (Moringa oleifera L.) is a medicinal plant with medicinal properties and many valuable metabolites including flavonoids. Due to the medicinal and therapeutic importance of this plant, this research was conducted with the aim of studying the effect of elicitors such as methyl jasmonate, salicylic acid, and phenylalanine on biochemical properties and the production of valuable secondary metabolites from its callus tissue in vitro. According to the results obtained, it was found that higher concentrations of salicylic acid and methyl jasmonate led to a significant increase in peroxidase enzyme activity in the treated calluses. The callus samples treated with methyl jasmonate and phenylalanine showed significantly higher catalase enzyme activity compared to the control treatment at most concentrations and treatment durations. The highest level of flavonoids (0.628 mg g-1) was related to the culture medium containing 200 mg L-1 methyl jasmonate for 96 h. Regarding the duration of treatment with plant growth stimulants, for most treatments, the amount of anthocyanin production increased with the growing duration of elicitors treatment. Based on the results, increasing the salicylic acid concentration from 50 to 100 and 200 mg L-1, particularly over a 48-h period, resulted in a rise in rutin production in the Moringa callus. On the other hand, the highest amount of quercetin (5.38 mg g-1) in the culture medium with 200 mg L-1 methyl jasmonate for 96 hours and the highest amount of kaempferol (3.45 mg g-1) in the culture medium containing 100 mg L-1 salicylic acid was observed for 96 h.
Introduction
Moringa, Moringa oleifera L, is a member of the Moringaceae family (Mashamaite et al., 2022). Due to the high medicinal and food value of this plant, it is known as the tree of the century. All constituent parts of Moringa, encompassing its roots, stems, leaves, and seeds, bear both medicinal and dietary utility, serving as a pivotal reservoir of vitamins and minerals (Mohlala et al., 2023). The leaves, in particular, exhibit pivotal medicinal attributes, owing to the presence of notable bioactive compounds such as saponins, tannins, steroids, flavonoids, coumarins, quinones, phenolic compounds, and alkaloids, which are proficiently employed in cancer prevention and treatment endeavors (Kurtulbaş et al., 2022). Prominently, a comprehensive range of quercetins, rutin, kaempferol, gallic acid, moringin, and the extensive Niazimicin assemblage represents the principal assortment of compounds derived from the diverse organs of this botanical specimen (Syeda & Riazunnisa, 2020). By virtue of its potent antioxidant property, quercetin, abundantly discovered within the leaf and seed samples of M. oleifera, orchestrates metal chelation and free radical inhibition (Bhaskar et al., 2022). There are various methods to increase the production of secondary metabolites as valuable compounds in medicinal plants, which include the use of agents in cell and plant tissue culture in vitro. The induction of callus cells in M. oleifera plant is largely influenced by temperature, nutrients, pH, and the addition of ascorbic acid and plant growth regulators in the culture medium. Stress induction increases the production of plant secondary metabolites. Stimulants are divided into biological and non-biological categories (Arya et al., 2021). Among the widely used stimulating factors used in most tissue culture programs are fungal carbohydrates, yeast extract, methyl jasmonate, salicylic acid, and amino acids such as phenylalanine and Polyamines such as chitosan (Raj & Saudagar, 2019). Common plant hormones such as salicylic acid and jasmonic acid are key markers for the expression of genes involved in plant defense systems (Patel et al., 2020; Shafighi et al., 2022). Considering the unique properties of the M. oleifera plant and its importance in the pharmaceutical and food industries, as well as the importance of new methods of plant tissue culture to produce and increase the amount of plant secondary metabolites, the present research aimed at increasing the production of biochemical compounds and valuable secondary metabolites such as rutin, quercetin and kaempferol from the callus tissue obtained from the leaf explants of this plant, using methyl jasmonate, salicylic acid, and phenylalanine as stimulating agents in different concentrations and time durations.
Materials and Methods
Callus tissue samples of M. oleifera plant were obtained from leaf explants grown in an MS base medium containing 2 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BAP (Riyathong et al., 2010). Plant growth stimulants (methyl-jasmonate, salicylic acid, and phenylalanine) in concentrations of zero (control), 50, 100, and 200 mg/l during time periods in an MS base culture medium containing 2 ml 2,4-D and 0.5 mg/liter of BAP were utilized. Biochemical compounds such as peroxidase (MacAdam et al., 1992), catalase (Chanes & Mahely, 1996), proline (Bates, 1973), flavonoid (Chang et al., 2002) and anthocyanin (Wagner, 1979) along with metabolites secondary substances such as rutin, quercetin, and kaempferol (Hurst et al., 1983) were measured in callus tissue samples collected after 24, 48, and 96 hours after applying the stimuli. The experiment was conducted in a completely randomized design with three replications. Data variance analysis and average data comparison using SPSS ver. 26 were done.
Results and Discussion
The results of variance analysis of the data demonstrated that the activity level of peroxidase and catalase enzymes, the amount of amino acid accumulation of proline, total flavonoid, anthocyanin, the amount of rutin, quercetin, and kaempferol in the callus samples of M. oleifera plant in vitro was significantly (p < 0.01) affected by the type of stimulus used, the duration of use, and the interaction between the type of stimulus and the duration of its use. The highest amount of peroxidase enzyme activity was related to the culture medium containing 100 or 200 mg/l of methyl jasmonate and 200 mg/l of phenylalanine for a period of 96 hours. According to the obtained results, by raising the concentration of plant growth stimulants (methyl jasmonate and salicylic acid) from 50 to 100 and 200 mg/liter in different periods of time, the peroxidase enzyme activity did not change significantly. On the other hand, the highest amount of peroxidase enzyme activity (455.886 protein-µmol H2O2 min-1 mg-1) was related to the culture medium containing 200 mg/liter of phenylalanine for a period of 96 hours. The obtained results are consistent with the results reported by Shabani et al., (2009). The highest amount of proline amino acid accumulation (2.19 μg/mg) was observed in the treatment of callus samples with 200 mg/L of methyl-jasmonate for a period of 96 hours. In regards to the temporal extent of utilizing stimulants in any and all culture mediums that encompass methyl jasmonate, phenylalanine, or salicylic acid, the quantity of proline accumulation detected in callus obtained subsequent to a treatment period of 96 hours is notably greater. This phenomenon becomes apparent within the time frames of 24 and 48 hours. The highest amount of flavonoid (0.628 mg/g of callus) was observed in the treatment of 200 mg/l of methyl jasmonate for 96 hours. Zhang et al. (2009) stated that the flavonoid content of blackberry callus tissue increases remarkably in the treatment with methyl jasmonate and salicylic acid, which is consistent with the results obtained in this study. Also, the highest amount of anthocyanin (12.42 μmol/g of callus weight) was related to the treatment of 200 mg/l phenylalanine for 96 hours. According to the results obtained in this research, utilizing methyl jasmonate, phenylalanine, and salicylic acid as stimulants (especially in higher concentrations and time durations) significantly increased the amount of rutin production in callus tissue samples, which is consistent with the results obtained by Ishikawa et al. (2007). The highest amounts of rutin, quercetin, and kaempferol were respectively (12.86, 5.38 and 3.45 mg per gram of callus fresh weight) related to the culture medium containing 50 mg/liter salicylic acid for 48 hours, the culture medium containing 200 mg/liter methyl-jasmonate for 96 hours, and the culture medium containing 100 mg/liter salicylic acid for 96 hours.
Conclusion
Recent advances in various fields of biotechnology have made it possible to revive new methods of plant tissue culture and produce valuable compounds at a commercial level. The employment of plant biotechnological techniques, particularly the generation of plant compounds in a controlled environment, presents the potential to manufacture items possessing therapeutic properties, irrespective of the variability in climate and seasons, thereby ensuring year-round availability. Today, many studies have been conducted and are being conducted on the medicinal and nutritional value of the Moringa plant (M. oleifera). Due to the high value of this plant in terms of medicine and treatment of diseases such as cancer in the traditional medicine of different nations, suitable and alternative methods for producing its effective compounds are very important. The use of plant tissue culture and esters is an effective method to produce valuable compounds of this plant in vitro. According to the results obtained in this study, treating callus with higher concentrations (100 and 200 mg/L) of methyl jasmonate, salicylic acid, and phenylalanine increases the possibility of increasing the production of plant secondary metabolites (rutin, quercetin, and kaempferol) in this plant.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.. .
گیاه مورینگا با نام علمی Moringa oleifera L. عضوی از خانوادۀ Moringaceae است که خاستگاه اصلی آن جنوب تبت و شمال هندوستان است (Mashamaite et al., 2022). ارزش دارویی و غذایی زیاد گیاه مورینگا سبب شده است از آن با عنوان درخت قرن یاد شود. تمام اندام‌های این درخت ازجمله ریشه، ساقه، برگ و دانۀ آن مصرف دارویی و غذایی دارند (Mohlala et al., 2023). در بسیاری از کشورهای اروپایی، آسیایی و آفریقایی، برگ‌های این گیاه به‌عنوان چاشنی غذا یا دم‌نوش و پودر ساقه و ریشۀ آن به‌عنوان چاشنی استفاده می‌شود (Al-Ghanayem et al., 2022). این گیاه منبع مهمی از ویتامینها و مواد معدنی است و برگ‌ها و غلاف‌های جوان آن حاوی مقادیر درخور توجهی از مواد معدنی و ویتامینها مانند ویتامین‌های A، B و C هستند. برگ‌های این گیاه، ویتامین A بیشتر از هویج، کلسیم بیشتر از شیر، آهن بیشتر از اسفناج، ویتامین C بیشتر از پرتقال و پتاسیم بیشتر از موز دارند و کیفیت پروتئین آن بیشتر از شیر و تخم‌مرغ است (Ramzan et al., 2022)؛ همچنین برگ‌های این گیاه ترکیبات دارویی مهمی ازجمله ساپونین‌ها، تانن‌ها، استروئیدها، فلاونوئیدها، کومارین‌ها، کوئینون‌ها، ترکیبات فنلی و آلکالوئیدها را دارند که برای پیشگیری و درمان سرطان استفاده می‌شوند و فعالیت ضدمیکروبی و ضدقارچی دارند (Kurtulbaş et al., 2022). انواع کوئرستین‌ها، روتین، کامپفرول، گالیک‌اسید، مورینگین و خانوادۀ بزرگ نیازیمیسین (Niazimicin) از مهم‌ترین ترکیبات استخراج‌شده از اندام‌های مختلف این گیاه به شمار می‌آیند (Syeda & Riazunnisa, 2020). ایزوفلاونوئیدهایی مانند ژنیستئین، روتین و کوئرستین از رشد سلول‌های سرطانی جلوگیری می‌کنند (Cayetano‐Salazar et al., 2021). کوئرستین موجود در نمونههای برگ و بذر گیاه M. oleifera به دلیل ویژگی آنتی‌اکسیدانی سبب کلاته‌شدن فلزات و مهار رادیکال‌های آزاد می‌شود. آثار متعدد کوئرستین بر عملکرد سلول‌های سرطانی پستان ازجمله القای پروتئین p21 (مهارکنندۀ CDK) و توقف چرخۀ سلولی در مراحل G1 یا G2/M گزارش شده است (Tang et al., 2020).
روش‌های مختلفی برای افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه به‌عنوان ترکیبات باارزش در گیاهان دارویی وجود دارند که ازجملۀ آنها می‌توان به کاربرد عوامل در کشت سلول و بافت گیاهی در شرایط درونشیشه اشاره کرد (Bhaskar et al., 2022). عوامل محرک به دو دستۀ زیستی و غیرزیستی تقسیم می‌شوند (Arya et al., 2021) و با تأثیر بر ترکیبات و همچنین دیوارۀ سلولی سبب فعال‌شدن سیستم دفاعی گیاه می‌شوند که درنتیجه، تولید متابولیت‌های ثانویه در سلول‌های گیاهی افزایش می‌یابد (Lertphadungkit et al., 2020)؛ کربوهیدرات‌های قارچی، عصارۀ مخمر، متیل‌جاسمونات، سالیسیلیک‌اسید، آمینواسیدهایی مانند فنیل‌آلانین و پلی‌آمین‌هایی مانند کیتوزان ازجمله عوامل محرک پرکاربردی هستند که در بیشتر برنامه‌های کشت بافت استفاده می‌شوند (Raj & Saudagar, 2019). جاسمونیک‌اسید (JA) و مشتقات آن مانند متیل‌جاسمونات تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی هستند که در پاسخ‌های دفاعی گیاه ازجمله تحریک تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دخالت دارند (Ho et al., 2020). سالیسیلیک‌اسید (SA) نوعی اسید فنولی و یکی از هورمون‌های رشد گیاهی است که نقش بسیار مهمی در بسیاری از فرایندهای حیاتی سلول‌های گیاهی ازجمله رشدونمو، فتوسنتز و تنظیم و فعال‌سازی پاسخ سلول در برابر عوامل زیستی و غیرزیستی دارد (Ali, 2021). هورمون‌های متداول گیاهی مانند سالیسیلیک‌اسید و جاسمونیک‌اسید علامت‌رسان‌های کلیدی برای بیان ژن‌های درگیر در سیستم‌های دفاعی گیاهان به شمار می‌روند. عوامل محرک با تأثیر بر تنظیم بیان ژن و فرایند پیام‌رسانی ثانویه درسلول‌های گیاهی سبب افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه در کشت سلول و بافت گیاهی می‌شوند (Patel et al., 2020; Shafighi et al., 2022).
گیاه M. oleifera پراکنش بسیار محدودی در ایران و بیشتر در استان‌های جنوبی کشور دارد؛ ازاین‌رو، مطالعه‌های انجام‌شده در زمینۀ این گیاه به‌ویژه بررسی‌های به‌نژادی، ویژگی‌های درمانی، تنوع ژنتیکی و سایر ویژگی‌های مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی آن در ایران بسیار اندک است و بیشتر گزارش‌هایی در زمینۀ گیاه‌شناسی آن وجود دارد. استفاده از روش کشت بافت گیاهی و استفاده از عوامل محرک در این گونۀ گیاهی بسیار کم بوده و هیچ‌گونه گزارشی از کاربرد این روش‌ها در ایران ارائه نشده است. القای سلول‌های کالوس در گیاه M. oleifera تا حد زیادی تحت‌تأثیر دما، مواد مغذی، اسیدیته و افزودن آسکوربیک‌اسید و تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی در محیط‌کشت قرار دارد (Bennet et al., 2003). محیط‌کشت MS همراه با 5/0 میلیگرمدرلیتر BAP و 2 میلیگرمدرلیتر 2,4-D سبب تولید 100 درصدی کالوس از ریزنمونه‌های برگی M. oleifera می‌شود (Riyathong et al., 2010).
باتوجه‌به ویژگی‌های منحصربه‌فرد گیاه M. oleifera و اهمیت آن در صنایع دارویی و غذایی و اهمیت روش‌های نوین کشت بافت گیاهی برای تولید و افزایش میزان متابولیت‌های ثانویۀ گیاهی، پژوهش حاضر در راستای افزایش تولید ترکیبات بیوشیمیایی و متابولیت‌های ثانویۀ باارزش همانند روتین، کوئرستین و کمپفرول از بافت کالوس حاصل از ریزنمونه‌های برگ این گیاه با استفاده از متیل‌جاسمونات، سالیسیلیک‌اسید و فنیل‌آلانین به‌عنوان عوامل محرک در غلظت‌ها و مدت زمان‌های مختلف انجام شد.
مواد و روش‌ها.
تولید بافت کالوس.
نمونههای بافت کالوس گیاه M. oleifera از ریزنمونه‌های برگ کشت‌شده در محیط‌کشت پایۀ MS حاوی 2 میلیگرمدرلیتر 2,4-D و 5/0 میلیگرمدرلیتر BAP به دست آمدند (Riyathong et al., 2010). به‌منظور بررسی تأثیر انواع عوامل محرک بر تولید و افزایش ترکیبات بیوشیمیایی و متابولیت‌های ثانویۀ گیاهی از ترکیب محیط‌کشت یادشده استفاده شد؛ همچنین برای دستیابی به یکنواختی بیشتر در نمونههای کالوس، بافت‌های کالوس حاصل سه مرتبه و هر بار به‌مدت 15 تا 20 روز در محیط‌کشت یادشده واکشت شدند.
آماده‌‌سازی عوامل محرک.
در پژوهش حاضر از محرک‌های رشد گیاهی مانند متیل‌جاسمونات، سالیسیلیک‌اسید و فنیل‌آلانین استفاده شد. به‌منظور تهیۀ محلول متیل‌جاسمونات از N- هگزان به‌طور حجمی-حجمی استفاده شد. به‌منظور تهیۀ محلول سالیسیلیک‌اسید و فنیل‌آلانین به‌طور جرمی-حجمی (به دلیل حلالیت زیاد این دو ترکیب در آب)، مقدار معینی از این ترکیبات (1 گرم) در آب (50 میلی‌لیتر) حل شد. باتوجه‌به حساسیت زیاد هر سه ترکیب یادشده به دمای زیاد اتوکلاو، محلول‌های یادشده با عبور از فیلتر 2/0 میکرون ضدعفونی و زیر هود لامینار به محیط‌کشت استریل با دمای 35 تا 45 درجۀ سانتی‌گراد افزوده شدند.
اعمال محرک‌ها.
محرک‌های رشد گیاهی (متیل‌جاسمونات، سالیسیلیک‌اسید و فنیل‌آلانین) در غلظت‌های صفر (شاهد)، 50، 100 و 200 میلیگرمدرلیتر در مدت زمان‌های 24، 48 و 96 ساعت درون محیط‌کشت پایۀ MS حاوی 2 میلیگرمدرلیتر 2,4-D و 5/0 میلیگرمدرلیتر BAP استفاده و سپس تمام کشت‌ها به اتاقک رشد با دمای 25 درجۀ سانتی‌گراد منتقل شدند. نمونههای کالوس مدنظر برای ارزیابی ویژگی‌های بیوشیمیایی و تولید و تجمع متابولیت‌های ثانویه در مدت زمان‌های یادشده جمع‌آوری و پس از انجماد در ازت مایع، در دمای منفی 80 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شدند.
اندازه‌گیری ویژگی‌های بیوشیمیایی.
ابتدا 1/0 گرم از هر نمونه کالوس درون هاون چینی حاوی ازت مایع ساییده و سپس 5/1 میلی‌لیتر بافر فسفات‌سدیم (7=pH) حاوی 1 درصد پلی‌وینیل‌پیرولیدون (PVP) و 1 میلی‌مولار EDTA به آن اضافه شد. نمونه‌ها به‌مدت 10 دقیقه با سرعت 13000 دوردردقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند؛ سپس فاز رویی به‌عنوان عصارۀ پروتئینی برای اندازه‌گیری میزان پروتئین و فعالیت‌های آنزیمی جمع‌آوری شد. روش Bradford (1976) برای اندازه‌گیری مقدار پروتئین کل نمونه‌ها استفاده شد؛ به این منظور، 50 میکرولیتر عصارۀ پروتئینی، 50 میکرولیتر معرف برادفورد و 900 میکرولیتر بافر فسفات به‌عنوان محلول واکنش استفاده شد. میزان جذب نوری عصارۀ پروتئینی در طول موج 595 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (BIORAD, SmartspecTM plus، آمریکا) تعیین شد. کمی‌سازی غلظت پروتئین با آلبومین سرم گاوی (BSA) در غلظت‌های مختلف انجام شد.
اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و کاتالاز.
اندازه‌گیری فعالیت آنزیم پراکسیداز طبق روش Mac-Adam et al. (1992) با کمی تغییر انجام شد. مخلوط واکنش شامل 81/0 میلی‌لیتر بافر فسفات‌پتاسیم 100 میلی‌مولار (7pH=)، 20 میکرولیتر عصارۀ پروتئینی، 90 میکرولیتر گلایکول (10 میلی‌مولار)، 90 میکرولیتر آب‌اکسیژنه (5 میلی‌مولار) بود. تغییرات جذب مخلوط واکنش به‌مدت 60 ثانیه در طول موج 425 نانومتر و دمای 25 درجۀ سانتی‌گراد با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. فعالیت آنزیم پراکسیداز برحسب تغییرات جذب در دقیقه به‌ازای هر میلی‌گرم پروتئین بیان شد و میزان فعالیت آن از رابطۀ (×(V/Vt)/(0.1×T)/Cp425A∆) محاسبه شد. در این رابطه، 425A∆: تغییرات جذب نوری، V: حجم کل، Vt: حجم عصارۀ استفاده‌شده در واکنش، T: زمان واکنش (دقیقه) و Cp: غلظت پروتئین است.
به‌منظور اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز از روش Chanes & Mahely (1996) با کمی تغییر استفاده شد. بافر فسفات‌سدیم 20 میلی‌مولار با 7pH= و 20 میکرولیتر پراکسیدهیدروژن (H2O2) 5 میلی‌مولار به‌عنوان پذیرندۀ الکترون استفاده و سپس 60 میکرولیتر عصارۀ پروتئینی در حمام یخ به آن اضافه و تغییرات جذب نوری در طول موج 240 نانومتر خوانده شد. برای نمونۀ بلانک از بافر فسفات (0/7pH=) به‌جای عصارۀ پروتئینی استفاده شد. فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس میزان تغییرات جذب در میکروگرم پروتئین در دقیقه از فرمول ×(V/Vt)/(0/1×T)(×(V/Vt)/(0.1×T)/Cp240A∆) محاسبه شد. در این رابطه، 240A∆: تغییرات جذب نوری، V: حجم کل، Vt: حجم عصارۀ استفاده‌شده در واکنش، T: زمان واکنش (برحسب دقیقه) و Cp: غلظت پروتئین است.
پرولین آزاد نمونههای مدنظر طبق روش (1973) Bates اندازه‌گیری شد؛ به این منظور، 1/0 گرم نمونه کالوس به‌مدت 3 دقیقه در سولفوسالیسیلیک‌اسید 3/3 درصد درون هاون چینی کوچک ساییده شد. همگنای حاصل به‌مدت 10 دقیقه با سرعت 4000 دوردردقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ و محلول رویی به میکروتیوب جداگانه منتقل شد؛ سپس 1 میلی‌لیتر معرف نین‌هیدرین و 1 میلی‌لیتر استیک‌اسید خالص به آن اضافه شد. مخلوط حاصل به حمام آب با دمای 90 درجۀ سانتی‌گراد منتقل و به مدت یک ساعت در شرایط یادشده نگهداری شد. پس‌از سرد‌شدن نمونه، 2 میلی‌لیتر تولوئن به آن اضافه و به‌مدت 2 دقیقه هم زده شد. جذب نوری محلول رویی در طول موج 520 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. پرولین آزاد نمونه با استفاده از منحنی استاندارد پرولین خالص تعیین شد.
به‌منظور استخراج متابولیت‌های ثانویۀ نمونههای کالوس از روش Chang et al. (2002) استفاده شد؛ به این منظور، ابتدا 1/0 گرم نمونه کالوس تازه با 5 میلی‌لیتر متانول اسیدی )متانول خالص و کلریدریک‌اسید به نسبت حجمی 99:1) درون هاون چینی کاملاً ساییده شد. مخلوط حاصل به‌مدت 72 ساعت در دمای 25 درجۀ سانتی‌گراد و تاریکی نگهداری شد؛ سپس نمونه‌ها به‌مدت 10 دقیقه در 4000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند و محلول رویی برای اندازه‌گیری مقدار فلاونوئید و آنتوسیانین استفاده شد.
به‌منظور اندازه‌گیری فلاونوئید کل از روش Chang et al. (2002) با کمی تغییر استفاده شد. ابتدا 250 میکرولیتر محلول کلریدآلومینیوم 10 درصد (جرمی-حجمی) و 250 میکرولیتر پتاسیم‌استات 1 مولار به 1 میلی‌لیتر عصارۀ حاصل اضافه و مقادیر جذب نمونه‌ها در طول موج 498 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر تعیین شد. منحنی استاندارد کوئرستین با استفاده از غلظت‌های مختلف کوئرستین (صفر، 25، 50 و 100 میلیگرمدرلیتر متانول) تهیه و برای کمی‌سازی میزان فلاونوئید کل در نمونه‌ها استفاده شد. مقدار فلاونوئید از رابطۀ T=(C×V)/M برحسب میلیگرمدرگرم بافت کالوس محاسبه شد. در این رابطه، T: میزان فلاونوئید برحسب میلیگرمدرگرم بافت کالوس، C: غلظت فلاونوئید برحسب میلی‌گرم کوئرستین در میلی‌لیتر، V: حجم نهایی عصاره و M: وزن نمونه (بافت کالوس برحسب گرم) است.
به‌منظور اندازه‌گیری مقدار آنتوسیانین نمونههای کالوس از روش Wagner (1979) استفاده شد؛ به این منظور، جذب نوری عصارۀ حاصل در طول موج 550 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. میزان آنتوسیانین از رابطۀ A=εbc و ضریب خاموشی M-1cm-1 33000 محاسبه شد. در این رابطه، A: مقدار عدد جذبی، b:عرض کووت (Cuvette)، ε: ضریب خاموشی و c: غلظت آنتوسیانین است.
اندازه‌گیری مقدار متابولیت‌های ثانویه به روش HPLC
به‌منظور اندازه‌گیری مقدار متابولیت‌های ثانویه (روتین، کوئرستین و کمپفرول) با دستگاه HPLC، از روشHurst et al. (1983) استفاده شد؛ به این منظور، ابتدا 1 گرم نمونه کالوس به همراه 5/1 میلی‌لیتر اتانول 90 درصد درون هاون چینی کاملاً ساییده و به‌مدت 10 تا 15 دقیقه ورتکس شد؛ سپس دو بار و هر بار به‌مدت 15 دقیقه در حمام اولتراسونیک (Bandelin electronic®, Germany) و دمای 35 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری و پس از 3 ساعت، دوباره تیمار ورتکس و اولتراسوند تکرار شد. نمونه‌ها به‌مدت 10 دقیقه در 10000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند. ﻋﺼﺎرۀ رویی ﺑﻪدﺳﺖآﻣﺪه برای اندازه‌گیری ترکیبات بیوشیمیایی یادشده با استفاده از دستگاه HPLC (Germany AZURA, KENUVER) ستون فاز معکوس C18 استفاده شد. فاز متحرک شامل متانول گرید HPLC و آب مقطر بود. تشخیص و کمی‌سازی مقدار روتین، کوئرستین و کمپفرول به‌ترتیب در طول موج‌های 257، 368 و 368 نانومتر انجام شد. به‌منظور رسم منحنی استاندارد از غلظت‌های 10، 20، 50، 100 و 500 میلیگرمدرلیتر نمونۀ خالص روتین (NAWAH-HIKA2001-Egypt)، کوئرستین (Sigma-Aldrich) و کمپفرول (Sigma-Aldrich) استفاده شد.
آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام شد. نرمال‌بودن توزیع داده‌ها با آزمون کولموگروف- اسمیرنوف بررسی شد. تجزیه واریانس داده‌ها و مقایسۀ میانگین داده‌ها با نرم‌افزار SPSS ver. 26 انجام شد. نرم‌افزار Excel برای رسم نمودارها استفاده شد.
نتایج
ترکیبات بیوشیمیایی
نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان دادند میزان فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و کاتالاز، میزان تجمع آمینواسید پرولین، فلاونوئید کل و آنتوسیانین نمونه کالوس‌های گیاه M. oleifera در شرایط درونشیشه به‌طور معناداری (p<0.01) تحت‌تأثیر نوع محرک استفاده‌شده، مدت زمان استفاده و اثر متقابل نوع محرک و مدت زمان استفاده از آن قرار می‌گیرد. مدت زمان استفاده از محرک تأثیر معناداری بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز نداشت، اما بر فعالیت آنزیم پراکسیداز مؤثر بود (جدول 1).
جدول 1- میانگین مربعات تأثیر نوع، غلظت و مدت زمان استفاده از محرک‌های رشد گیاهی بر ویژگی‌های بیوشیمیایی و متابولیت‌های ثانویۀ کالوس‌های M. oleifera در شرایط درونشیشه
Table 1- Mean squares of type, concentration and duration of plant growth stimulants effects on biochemical characteristics and secondary metabolites of M. oleifera in vitro calli.
|
Source of variation |
df |
MS |
|
||||
|
Peroxidase |
Catalase |
Proline |
flavonoid |
Anthocyanin |
|||
|
Elicitor (A) |
9 |
424.22 ** |
2418.72 ns |
1.27 ** |
0.09 ** |
43.76 ** |
|
|
Time (B) |
2 |
813.05 ** |
51536.74 ** |
0.63 ** |
0.19 ** |
24.97 ** |
|
|
A× B |
18 |
202.11 ** |
6633.65 ** |
0.11 ** |
0.01 ** |
5.54 ** |
|
|
Erorr |
60 |
73.90 |
3028.31 |
0.01 |
0.005 |
0.55 |
|
|
CV (%) |
- |
9.51 |
22.00 |
14.08 |
22.11 |
15.94 |
|
ns and **: Non-significant and significant at 1% level of probability, respectively.
از نظر میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز نمونه کالوس‌های گیاه M. oleifera تیمارشده با محرک‌های مختلف در مدت زمان‌های مختلف، بیشتر تیمارها نسبت به شاهد اختلاف معنادار نشان دادند (شکل a1). بیشترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز به محیط‌کشت حاوی 100 و 200 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات و 200 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین برای مدت زمان 96 ساعت تعلق داشت. با افزایش غلظت محرک‌های رشد گیاهی (متیل‌جاسمونات و سالیسیلیک‌اسید) از 50 به 100 و 200 میلیگرمدرلیتر در مدت زمان‌های مختلف، میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز تغییر معناداری نشان نداد. میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز بین نمونه کالوس‌های تیمارشده با فنیل‌آلانین 100 و 200 میلیگرمدرلیتر برای مدت زمان 24 و 96 ساعت اختلاف معناداری نداشت، اما هر دو تیمار یادشده به‌طور معناداری فعالیت آنزیم پراکسیدازی بیشتری نسبت به غلظت 50 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین در مدت زمان برابر (24 یا 96 ساعت) داشتند (شکل a1). در مدت زمان 48 ساعت استفاده از محرک‌ها، بین غلظت‌های 50 و 100 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین از نظر فعالیت آنزیم پراکسیداز اختلاف معناداری مشاهده نشد، اما افزایش غلظت فنیل‌آلانین در محیط‌کشت به 200 میلیگرمدرلیتر سبب افزایش معنادار میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز نمونههای کالوس تیمارشده شد. از نظر تأثیر مدت زمان استفاده از محرک‌ها بر فعالیت آنزیم پراکسیداز در تیمار شاهد نیز بین نمونههای کالوس تیمارشده در مدت زمان‌های 24، 48 و 96 ساعت اختلاف معناداری مشاهده نشد. بر اساس نتایج، میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز نمونه کالوس‌های گیاه M. oleifera تیمارشده با 50 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات یا 100 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین یا 200 میلی‌گرم‌در لیتر‌اسیدسالیسیلیک برای مدت زمان 24 ساعت به‌طور معناداری بیشتر از مدت زمان 48 و 96 ساعت با همان نوع و غلظت محرک‌ها بود.
از نظر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز، اختلاف معناداری بین بیشتر تیمارها و شاهد مشاهده نشد (شکل b1). بیشترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز (proteinµmol H2O2 min-1 mg-1 886/455) به محیط‌کشت حاوی 200 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین برای مدت زمان 96 ساعت تعلق داشت. طبق نتایج مقایسۀ میانگین داده‌ها (شکل b1)، اختلاف معناداری از نظر فعالیت آنزیم کاتالاز بین محیط‌کشت حاوی 50 و 100 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات یا 50 و 100 میلیگرمدرلیتر سالیسیلیک‌اسید برای مدت زمان 24 ساعت درون محیط‌کشت پایه و شاهد (24 ساعت) مشاهده نشد؛ همچنین اختلاف معناداری از نظر فعالیت آنزیم کاتالاز بین محیط‌کشت حاوی 50 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات یا 50 میلیگرمدرلیتر سالیسیلیک‌اسید برای مدت زمان 48 و 96 ساعت درون محیط‌کشت پایه و شاهد (48 و 96 ساعت) مشاهده نشد. همان‌طور که در شکل b1 مشاهده می‌شود، بین غلظت‌های مختلف متیل‌جاسمونات (50، 100 و 200 میلیگرمدرلیتر) از نظر فعالیت آنزیم کاتالاز در مدت زمان 24 ساعت اختلاف معناداری دیده نمی‌شود. از نظر فعالیت آنزیم کاتالاز، غلظت‌های مختلف متیل‌جاسمونات (50، 100 و 200 میلیگرمدرلیتر) در تیمار محرک برای مدت زمان 48 ساعت اختلاف معنادار نشان دادند؛ به‌طوری‌که در استفاده از 200 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات برای مدت زمان 48 ساعت، فعالیت آنزیم کاتالاز به‌طور معناداری بیشتر از زمانی بود که از 50 یا 100 میلیگرمدرلیتر استفاده شد. بر اساس نتایج، استفاده از 200 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین برای مدت زمان 96 ساعت در مقایسه با مدت زمان مشابه برای غلظت‌های 50 یا 100 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین، میزان فعالیت آنزیم کاتالاز را به طور معناداری افزایش می‌دهد (شکل b1)؛ علاوه‌براین، میزان فعالیت آنزیم کاتالاز کالوس‌های تیمارشده با 100 یا 200 میلیگرمدرلیتر سالیسیلیک‌اسید در مدت زمان‌های 48 و 96 ساعت نسبت به مدت زمان مشابه برای 50 میلیگرمدرلیتر سالیسیلیک‌اسید به‌طور معناداری افزایش یافت.
بیشترین مقدار تجمع آمینواسید پرولین (19/2 میکروگرم‌در‌میلی‌گرم) در تیمار نمونه کالوس‌ها با 200 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات برای مدت زمان 96 ساعت مشاهده شد. از نظر مدت زمان استفاده از محرک‌ها در تمام محیط‌کشت‌های حاوی متیل‌جاسمونات، فنیل‌آلانین یا سالیسیلیک‌اسید، میزان تجمع پرولین در کالوس‌های جمع‌آوری‌شده در تیمار زمانی 96 ساعت به‌طور معناداری بیشتر از مدت زمان‌های 24 و 48 ساعت بود، ولی در بیشتر تیمارها اختلاف معناداری بین مدت زمان 24 و 48 ساعت مشاهده نشد و تنها در محیط‌کشت‌های حاوی 100 و 200 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات یا 100 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین، مدت زمان 48 ساعت در مقایسه با 24 ساعت میزان تجمع آمینواسید پرولین را به‌طور معناداری افزایش داد (شکل C1).
از نظر میزان فلاونوئید استخراج‌شده از بافت‌های کالوس، اختلاف معناداری (01/0>p) بین محیط‌کشت‌های حاوی محرک‌ها و شاهد مشاهده شد (شکل a2). بیشترین مقدار فلاونوئید (628/0 میلی‌گرم‌بر‌گرم کالوس) در تیمار 200 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات برای مدت زمان 96 ساعت مشاهده شد. نتایج پژوهش حاضر نشان دادند میزان فلاونوئید کل کالوس‌های تیمارشده با 50 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات تحت‌تأثیر مدت زمان‌های مختلف قرار نمی‌گیرد؛ به‌طوری‌که استفاده از 50 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات در مدت زمان‌های 24، 48 و 96 ساعت تفاوت معناداری از نظر آماری ایجاد نکرد، ولی تیمار کالوس‌های مدنظر برای مدت زمان‌های مختلف با متیل‌جاسمونات در غلظت‌های 100 و 200 میلیگرمدرلیتر اختلاف معناداری را نشان داد؛ به‌طوری‌که استفاده از 100 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات برای مدت زمان 48 ساعت، مقدار بیشتر و معناداری نسبت به مدت زمان‌های 24 و 96 ساعت داشت. در غلظت 200 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات، تیمار کالوس‌ها برای مدت زمان 96 ساعت به‌طور معناداری بیشتر از 24 ساعت بود، اما اختلاف معناداری با تیمار زمانی 48 ساعت نداشت. استفاده از 50 و 200 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین برای مدت زمان‌های 48 و 96 ساعت نسبت به 24 ساعت سبب افزایش معنادار میزان تولید فلاونوئید کالوس‌های مدنظر شد، اما میزان فلاونوئید کالوس‌های تیمارشده برای مدت زمان‌های 48 و 96 ساعت در غلظت‌های یادشده تفاوت معناداری نداشت. اختلاف معناداری بین مدت زمان‌های استفاده‌شده برای غلظت 100 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین مشاهده شد؛ به‌طوری‌که افزایش مدت زمان تیمار کالوس‌ها با 100 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین از 24 به 48 و 96 ساعت سبب افزایش معنادار میزان فلاونوئید کل شد (شکل b2). میزان تولید فلاونوئید در محیط‌کشت حاوی 50، 100 و 200 میلیگرمدرلیتر سالیسیلیک‌اسید تحت‌تأثیر مدت زمان استفاده از آن قرار نگرفت.
اختلاف معناداری از نظر میزان تولید آنتوسیانین بین بیشتر تیمارها و شاهد مشاهده نشد (شکل b2). بیشترین مقدار آنتوسیانین (42/12 میکرومول‌بر‌گرم وزن کالوس) به تیمار 200 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین برای مدت زمان 96 ساعت تعلق داشت. میزان تولید آنتوسیانین در بیشتر تیمارها با افزایش مدت زمان استفاده از محرک‌ها افزایش یافت؛ این تفاوت در تیمار شاهد، تیمار 50 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین و 200 میلیگرمدرلیتر سالیسیلیک‌اسید معنادار نبود. بر اساس نتایج، افزایش غلظت متیل‌جاسمونات در محیط‌کشت از50 به 100 و 200 میلیگرمدرلیتر در هریک از مدت زمان‌های 24، 48 و 96 ساعت، تأثیر معناداری بر میزان تولید آنتوسیانین کالوس‌های تیمارشده نداشت؛ باوجوداین، افزایش مدت زمان استفاده از 24 به 48 و 96 ساعت سبب افزایش معنادار تولید آنتوسیانین در کالوس‌های تیمارشده شد. در تیمار فنیل‌آلانین با غلظت‌های 100 و 200 میلیگرمدرلیتر و سالیسیلیک‌اسید با غلظت 50 میلیگرمدرلیتر، افزایش زمان تیمار سبب افزایش معنادار میزان تولید آنتوسیانین شد (شکل b2).
متابولیت‌های ثانویه
نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان دادند میزان تولید روتین، کوئرستین و کمپفرول بافت کالوس گیاه M. oleifera به‌طور معنادار و در سطح احتمال 1 درصد تحت‌تأثیر نوع محرک‌ها، مدت زمان استفاده از محرک‌ها و اثر متقابل آنها قرار می‌گیرد (جدول 2).
|
A |
|
B |
|
C |
شکل 1- تأثیر نوع، غلظت و مدت زمان استفاده از محرک‌های مختلف بر میزان A) پراکسیداز، B) کاتالاز و C) پرولین کالوس‌های گیاه M. oleifera در شرایط درونشیشه. C: شاهد، MJ: متیل‌جاسمونات، PHA: فنیل‌آلانین و SA: سالیسیلیک‌اسید. حروف متفاوت نشان‌دهندۀ اختلاف معنادار (در سطح احتمال 5 درصد) بین تیمارهای محرک در هریک از زمان‌های اعمال تیمار است.
Figure 1- The effect of the type, concentration and duration of using different elicitors on the Peroxidase (a) and Catalase (b) activity and Proline content of the callus samples of M. oleifera under in vitro conditions. C: Control, MJ: Methyl Jasmonate, PHA: Phenylalanine and SA: Salicylic Acid. Different letters indicate a significant difference (at the 5% probability level) between various elicitors in each treatment duration.
|
A |
|
B |
شکل 2- تأثیر نوع، غلظت و مدت زمان استفاده از محرک‌های مختلف بر میزان a) فلاونوئید وb) آنتوسیانین کالوس M. oleifera در شرایط درونشیشه. C: شاهد، MJ: متیل‌جاسمونات، PHA: فنیل‌آلانین و SA: سالیسیلیک‌اسید. حروف متفاوت نشان‌دهندۀ اختلاف معنادار (در سطح احتمال 5 درصد) بین تیمارهای محرک در هریک از زمان‌های اعمال تیمار است.
Figure 2- The effect of the type, concentration and duration of using different elicitors on the flavonoid (a) and Anthocyanin (b) contents in the callus of M. oleifera under in vitro conditions. C: Control, MJ: Methyl Jasmonate, PHA: Phenylalanine and SA: Salicylic Acid. Different letters indicate a significant difference (at the 5% probability level) between various elicitors in each treatment duration
جدول 2- میانگین مربعات آثار محرک‌های رشد گیاهی و مدت زمان استفاده از آنها بر تولید متابولیت‌های ثانویه نمونههای کالوس M. oleifera
Table 2- The mean squares of the effects of the elicitor type, and duration on the secondary metabolites production in the callus samples of M. oleifera under in vitro conditions
|
Source of variation |
df |
MS |
||
|
Rutin |
Quercetin |
Kaempferol |
||
|
Elicitor (A) |
9 |
34.70 ** |
3.65 ** |
0.69 ** |
|
Time (B) |
2 |
35.83 ** |
0.81 ** |
0.24 ** |
|
A× B |
18 |
11.89 ** |
0.09 ** |
0.11 ** |
|
Erorr |
60 |
2.38 |
0.02 |
0.01 |
|
Cv(%) |
- |
20.09 |
3.27 |
4.39 |
**: significant at 1% level of probability
از نظر میزان تولید روتین توسط کالوس‌های تیمارشده با محرک‌ها، اختلاف معناداری بین شاهد و بیشتر تیمارها مشاهده شد (شکل a3). بیشترین میزان روتین (86/12 میلیگرمدرگرم وزن تر کالوس) به محیط‌کشت حاوی 50 میلیگرمدرلیتر سالیسیلیک‌اسید برای مدت زمان 48 ساعت تعلق داشت. افزایش سن کالوس در محیط‌کشت شاهد از 24 ساعت به 48 و 96 ساعت سبب افزایش معنادار میزان تولید روتین در بافت‌های کالوس شد؛ همچنین افزایش معنادار تولید روتین با افزایش مدت زمان تیمار در محیط‌کشت‌های حاوی 50 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات و 50، 100 و 200 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین مشاهده شد. استفاده از 200 میلیگرمدرلیتر متیل جاسمونات، 50 و 100 میلیگرمدرلیتر سالیسیلیک‌اسید برای مدت زمان 48 ساعت نسبت به مدت زمان‌های 24 و 96 ساعت، تولید روتین در بافت‌های کالوس گیاه M. oleifera را به‌طور معناداری افزایش داد (شکل a3). نتایج نشان دادند تولید روتین با افزایش غلظت فنیل‌آلانین و سالیسیلیک‌اسید در مدت زمان 24 ساعت افزایش می‌یابد.
از نظر میزان تولید کوئرستین کالوس‌های تیمارشده، اختلاف معناداری بین تمام تیمارهای حاوی محرک‌ها و شاهد در زمان‌های مختلف (24، 48 و 96 ساعت) مشاهده شد. نتایج نشان دادند با افزایش مدت زمان استفاده از متیل‌جاسمونات، فنیل‌آلانین و سالیسیلیک‌اسید به‌عنوان محرک (در غلظت‌های مختلف)، میزان تولید کوئرستین در بافت کالوس گیاه M. oleifera افزایش می‌یابد (شکل b3). از نظر میزان تولید کمپفرول در کالوس گیاه M. oleifera، اختلاف معناداری بین بیشتر تیمارهای دارای محرک و تیمار شاهد در مدت زمان 24 ساعت مشاهده نشد. بیشترین میزان کوئرستین (38/5 میلیگرمدرگرم وزن تر کالوس) به محیط‌کشت حاوی 200 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات و مدت زمان 96 ساعت تعلق داشت که اختلاف معناداری با تیمار 100 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات، 100 میلیگرمدرلیتر سالیسیلیک‌اسید و 200 میلیگرمدرلیتر فنیل‌آلانین در همان مدت زمان تیمار نداشت (شکل b3). استفاده از محرک‌های رشد گیاهی در مدت زمان‌های 48 و 96 ساعت، میزان تولید کمپفرول را به‌طور معناداری نسبت به شاهد افزایش داد (شکل b3). در محیط‌کشت‌های حاوی متیل‌جاسمونات (50 و 100 میلیگرمدرلیتر)، فنیل‌آلانین (50 میلیگرمدرلیتر) و سالیسیلیک‌اسید (100 و 200 میلیگرمدرلیتر)، اختلاف معناداری بین مدت زمان استفاده از محرک‌ها مشاهده شد و استفاده از مدت زمان‌های بیشتر برای این غلظت‌ها سبب افزایش معنادار تولید کمپفرول در بافت‌های کالوس شد. بیشترین میزان کمپفرول (45/3 میلیگرمدرگرم وزن تر کالوس) به محیط‌کشت حاوی 100 میلیگرمدرلیتر سالیسیلیک‌اسید برای مدت زمان 96 ساعت و در رتبۀ بعدی به 200 میلی‌گرم‌در‌لیترآن در همان مدت زمان تیمار تعلق داشت (شکل c3). استفاده از محرک‌ها در غلظت‌ها و مدت زمان های مختلف تغییری در نوع، رنگ و رشد بافت های کالوس نداشت (شکل 4).
|
A |
|
B |
|
C |
شکل 3- تأثیر نوع، غلظت و مدت زمان استفاده از محرک‌های مختلف بر میزان a) روتین، b) کوئرستین و c) کمپفرول کالوس گیاه M. oleifera در شرایط درونشیشه. C: شاهد، MJ: متیل‌جاسمونات، PHA: فنیل‌آلانین و SA: سالیسیلیک‌اسید. حروف متفاوت نشان‌دهندۀ اختلاف معنادار (در سطح احتمال 5 درصد) بین تیمارهای محرک در هریک از زمان‌های اعمال تیمار است.
Figure 3- The effect of the type, concentration and duration of different elicitors on the Rutin (a), Quercetin (b) and Kampferol (c) in the callus of M. oleifera under in vitro conditions. C: Control, MJ: Methyl Jasmonate, PHA: Phenylalanine. Different letters indicate a significant difference (at the 5% probability level) between various elicitors in each treatment duration
|
|
|
|
شکل 4- نمونه کالوس‌های جمع‌آوری‌شده از محیط‌کشت پایۀ MS حاوی 2 میلیگرمدرلیتر 2,4-D و 5/0 میلیگرمدرلیتر BAP به همراه 200 میلیگرمدرلیتر متیل‌جاسمونات به‌مدت 96 ساعت (A)، 100 میلیگرمدرلیتر سالیسیلیک‌اسید به‌مدت 96 ساعت (B) و نمونۀ شاهد بدون محرک (C).
Figure 4- Callus samples collected from MS medium containing 2 mg L-1 2,4-D and 0.5 mg L-1 BAP along with 200 mg L-1 methyl Jasmonate for 96 h (A), 100 mg L-1 of salicylic acid for 96 h (B), and control without elicitor (C)
بحث و نتیجه‌گیری
عوامل مختلفی برای تولید متابولیت‌های ثانویه به کمک عوامل محرک درون محیط‌کشت در شرایط درونشیشه وجود دارند که ازجملۀ آنها می‌توان به غلظت محرک، سن محیط‌کشت، زمان افزودن محرک به محیط‌کشت و مدت زمانی که ریزنمونه در معرض آن قرار می‌گیرد، اشاره کرد (Cardoso et al., 2019). امروزه، کاربرد سالیسیلیک‌اسید به‌عنوان یکی از هورمون‌های گیاهی در افزایش مقاومت گیاهان به تنش‌ها اثبات شده است (Saleem et al., 2022). رادیکال‌های آزاد، مولکول‌های درون‌سلولی هستند که به دلیل داشتن الکترون‌های جفت‌نشده، بسیار فعال و واکنش‌پذیرند (Di-Meo & Venditti, 2021). رادیکال‌های آزاد در غلظت‌های فیزیولوژیک برای عملکرد طبیعی سلول ضروری هستند و افزایش کم تا متوسط آنها نقش تنظیم‌کننده‌ای در مسیرهای پیام‌رسان سلولی دارد (Huang et al., 2019; Wan et al., 2020). گیاهان با استفاده از سازوکارهای آنزیمی و غیرآنزیمی می‌توانند غلظت گونه‌های فعال اکسیژن را کاهش دهند و از آثار مخرب آنها بکاهند. دستگاه دفاع آنتی‌اکسیدانی شامل آنزیم‌هایی نظیر پراکسیداز، کاتالاز، سوپراکسیددیسموتاز و آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی مانند فلاونوئیدها، آنتوسیانین‌ها و سایر ترکیبات فنلی است (Zou et al., 2020). فعالیت بیشتر آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی مانند پراکسیداز و کاتالاز برای ایجاد مقاومت گیاه در برابر تنش‌های محیطی بسیار مهم است و به‌طورکلی تغییر در محتوای آنتی‌اکسیدانی، یکی از پاسخ‌های گیاه به تنش‌ها برای تنظیم شرایط فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی است (Galasso et al., 2021). نتایج پژوهش حاضر نشان دادند استفاده از سالیسیلیک‌اسید و متیل‌جاسمونات (در بیشتر غلظت‌ها و مدت زمان‌ها) در مقایسه با شاهد سبب افزایش معنادار میزان آنزیم پراکسیداز در نمونه کالوس گیاه M. oleifera در شرایط درونشیشه می‌شود (شکل a1)؛ به‌طوری‌که افزایش غلظت و مدت زمان استفاده از متیل‌جاسمونات در محیط‌کشت سبب افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز نمونه کالوس‌های تیمارشده شد. در بررسی تأثیر فنیل‌آلانین بر میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز (شکل a1) در مدت زمان‌های 24، 48 و 96 ساعت، افزایش غلظت فنیل‌آلانین به 100 و 200 میلیگرمدرلیتر درون محیط‌کشت، افزایش معنادار فعالیت آنزیم پراکسیداز در کالوس‌های تیمارشده را در پی داشت. بر اساس نتایج، تغییر غلظت و مدت زمان استفاده از سالیسیلیک‌اسید به‌عنوان محرک در محیط‌کشت، تأثیر معناداری بر میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز نداشت؛ این در حالیست که نمونه کالوس‌های تیمارشده با متیل‌جاسمونات و فنیل‌آلانین (در بیشتر غلظت‌ها و مدت زمان‌ها) در مقایسه با تیمارهای شاهد میزان فعالیت آنزیم کاتالاز بیشتری داشتند، ولی استفاده از سالیسیلیک‌اسید (در غلظت‌های 50 و 100 میلیگرمدرلیتر) تأثیر معناداری بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز نسبت به تیمار شاهد نداشت (شکل b1). مطابق نتایج پژوهش حاضر، Pandolfini et al., (1992) بیان کردند سالیسیلیک‌اسید سبب افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز در کالوس Triticum aestivum می‌شود؛ همچنین گزارش شده است افزایش غلظت سالیسیلیک‌اسید سبب کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز و افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز در گیاه شیرین‌بیان می‌شود (Shabania et al., 2009). سالیسیلیک اسید فعالیت آنزیم کاتالاز در برگ‌ها و کشت‌های سوسپانسیون مریم‌گلی را ممانعت می‌کند (Kang et al., 2004). سالیسیلیک‌اسید و متیل‌جاسمونات از طریق افزایش فعالیت مسیر سنتز آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، گیاه را از آسیب‌های اکسیداتیو محافظت می‌کنند. پرولین یکی از مهم‌ترین آمینواسیدهایی است که بیشتر گیاهان در پاسخ به تنش‌های زیستی و غیرزیستی تولید می‌کنند، تجمع آن در سلول‌ها افزایش می‌یابد و نقش‌های فیزیولوژیکی متعددی را در حفاظت سلول‌ها در برابر تنش و بهبود رشدونمو سلول‌ها ایفا می‌کند؛ ازجمله نقش‌های مهم پرولین می‌توان به نقش آن به‌عنوان مادۀ تنظیم‌کنندۀ اسمزی و عامل حفاظت و پایدارکنندۀ ساختار پروتئین‌ها و آنزیم‌های سیتوپلاسمی و ساختمان غشا اشاره کرد. تجمع اسمولیت‌ها در سیتوزول امکان تعدیل فشار اسمزی در سلول را فراهم می‌کند؛ همچنین این آمینواسید از ساختارهای سلولی پروتئین‌ها در برابر آسیب‌های ناشی از تنش محیطی و زیستی محافظت می‌کند (Alvarez et al., 2022). در پژوهش حاضر مشخص شد استفاده از غلظت‌های بیشتر و مدت زمان‌های بیشتر متیل‌جاسمونات، فنیل‌آلانین و سالیسیلیک‌اسید در مقایسه با شاهد و استفاده از غلظت‌های کمتر سبب افزایش معنادار میزان تجمع آمینواسید پرولین در بافت کالوس گیاه M. oleifera در شرایط درونشیشه می‌شود (شکل c1).
متابولیت‌های ثانویه گروه متنوعی از مولکول‌هایی هستند که بخشی از سیستم دفاعی گیاه را شامل می‌شوند. متابولیت‌های ثانویه همیشه و در همۀ بخش‌های گیاه تولید نمی‌شوند، بلکه در پاسخ به تنش‌های زیستی و غیرزیستی به‌سرعت تولید می‌شوند؛ فلاونوئیدها، آنتوسیانین‌ها و کاروتنوئیدها ازجملۀ این ترکیبات هستند که علاوه‌بر نقش‌های حفاظتی و ساختاری در بافت‌ها، به‌عنوان ترکیبات رنگدانه‌ای گیاه در جذب حشرات گرده‌افشان، ایجاد تنوع رنگی برای گل‌ها و گیاهان زینتی، تولید داروها، حشره‌کش‌ها، چاشنی‌های غذایی، رنگ‌های طبیعی، خوشبوکننده‌ها و همچنین به‌عنوان علامت‌های مولکولی در برهم‌کنش گیاهان با محیط و به‌عنوان نشانگرهای زیستی در مطالعه‌های کموتاکسی (سیستماتیک بر پایۀ عوامل شیمیایی) مطرح هستند (Pang et al., 2021). فلاونوئیدها را می‌توان در بیشتر گونه‌های گیاهی و در اندام‌های مختلف گیاه یافت. فلاونوئیدها در کنار طیف گسترده‌ای از عملکردهای مختلفی که دارند، به‌عنوان مولکول‌های سیگنال در تولیدمثل جنسی نقش دارند و از گیاه در برابر آثار مخرب اشعۀ ماورابنفش محافظت می‌کنند؛ همچنین در تعامل‌های گیاهان و میکروب‌ها و پاسخ‌های دفاعی گیاه شرکت دارند (Dias et al., 2021). پس از کلروفیل‌ها، آنتوسیانین‌ها مهم‌ترین گروه از رنگدانه‌های طبیعی به شمار می‌آیند که غیرسمی و محلول در آب هستند و در سطح وسیعی در مایع سلول‌های گیاهی وجود دارند؛ این رنگدانه‌ها مسئول رنگ‌های قرمز، آبی و بنفش در بسیاری از میوه‌ها، سبزی‌ها و گل‌ها هستند. بر اساس نتایج پژوهش حاضر، اختلاف معناداری از نظر میزان فلاونوئید بین شاهد و بیشتر تیمارها وجود دارد (شکل a2)؛ به‌طوری‌که استفاده از متیل‌جاسمونات، سالیسیلیک‌اسید و فنیل‌آلانین به‌ویژه در غلظت‌ها و مدت زمان‌های بیشتر، میزان تولید فلاونوئید را به‌طور معناداری نسبت به شاهد افزایش داد (شکل a2). نتایج پژوهش حاضر نشان دادند استفاده از متیل‌جاسمونات، فنیل‌آلانین و سالیسیلیک‌اسید به‌عنوان محرک (به‌ویژه در غلظت‌ها و مدت زمان‌های بیشتر) به‌طور معناداری میزان تولید روتین در نمونۀ بافت کالوس را افزایش می‌دهد (شکل a3). در مدت زمان 48 ساعت، استفاده از غلظت‌های بیشتر متیل‌جاسمونات و فنیل‌آلانین سبب افزایش تولید روتین نمونه کالوس‌های تیمارشده درون محیط‌کشت شد؛ این در حالیست که برای سالیسیلیک‌اسید در مدت زمان یادشده، استفاده از غلظت‌های بیشتر سبب کاهش عملکرد روتین در کالوس‌های تیمارشده شد. مطابق نتایج پژوهش حاضر، مشخص شده است افزودن متیل‌جاسمونات، سالیسیلیک‌اسید و عصارۀ مخمر به محیط‌کشت سبب افزایش تولید و تجمع متابولیت‌های ثانویۀ بافت کالوس گیاه Glehnia littoralis می‌شود (Ishikawa et al., 2007)؛ علاوه‌براین با افزایش غلظت آمینواسید فنیل‌آلانین به‌عنوان یکی از پیش‌ماده‌های مسیر بیوسنتزی فلاونوئیدها، میزان تولید روتین در بافت‌های کالوس گیاه مورینگا نسبت به غلظت‌های کم این ماده به‌طور معناداری افزایش یافت؛ باوجوداین، میزان تولید روتین در بیشتر موارد، پاسخی وابسته به غلظت نبود. به نظر می‌رسد استفاده از فنیل‌آلانین به‌ویژه در غلظت‌ها و مدت زمان‌های بیشتر سبب هدایت جریان تولید متابولیت‌های ثانویه در سلول‌ها به‌سمت بیوسنتز روتین و استفادۀ حداکثری از ظرفیت آنزیمی سلول‌ها در مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‌ها می‌شود. در کشت سوسپانسیون سلولی خشخاش ایرانی نیز از نظر میزان متابولیت تبائین، پاسخ وابسته به میزان آمینواسید ال- تیروزین گزارش شده است؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان تبائین (3/42 میلیگرمدرلیتر) در غلظت 1 میلی‌مولار ال- تیروزین به دست آمده که به طور معناداری بیشتر از مقدار آن در تیمار 2 میلی‌مولار ال- تیروزین بوده است. نتایج (شکل a3) نشان دادند با افزایش غلظت سالیسیلیک‌اسید از 50 به 100 و 200 میلیگرمدرلیتر به‌ویژه برای مدت زمان 48 ساعت، میزان تولید روتین در نمونه کالوس‌های گیاه مورینگا افزایش می‌یابد. کوئرستین به‌عنوان فلاونول اصلی در برگ‌های گیاهان مختلف شناسایی شده است و تابش نور خورشید سبب افزایش محتوای کوئرستین و کمپفرول در برگ‌های گیاهان می‌شود؛ این امر نشان می‌دهد این ترکیبات در محافظت از گیاهان در برابر اشعۀ مضر نور خورشید نقش دارند (Hosseini et al., 2021). نتایج پژوهش حاضر نشان دادند افزودن متیل‌جاسمونات، فنیل‌آلانین و سالیسیلیک‌اسید به‌عنوان محرک‌های رشد گیاهی به محیط‌کشت سبب افزایش تولید میزان کوئرستین در نمونه بافت‌های کالوس گیاه M. oleifera نسبت به تیمار شاهد می‌شود (شکل b3). استفاده از غلظت‌ها و مدت زمان‌های بیشتر از محرک‌های رشد گیاهی، میزان تولید کوئرستین در نمونه بافت‌های کالوس گیاه M. oleifera را افزایش داد. Zanella et al. (2019) با بررسی تأثیر سالیسیلیک‌اسید بر تولید متابولیت‌های ثانویۀ گیاه M. oleifera بیان کردند افزودن سالیسیلیک‌اسید به محیط‌کشت بافت، تأثیر معناداری بر تولید روتین، کوئرستین و کمپفرول نمونه کالوس‌های کشت‌شدۀ این گیاه ندارد. Zare et al. (2021) با بررسی تأثیر محرک‌های رشد گیاهی فنیل‌آلانین، مخمر و سالیسیلیک‌اسید بر تولید متابولیت‌های ثانویۀ گیاه قره‌قاط (Vaccinium arctostaphylos L.) در محیط‌کشت بیان کردند افزایش غلظت سالیسیلیک‌اسید و فنیل‌آلانین، تولید روتین در برگ‌های حاصل را افزایش می‌دهد، اما تأثیری بر میزان کوئرستین و کمپفرول آنها ندارد.
پیشرفت‌های اخیر در زمینه‌های مختلف زیست‌فناوری، امکان احیای روش‌های نوین کشت بافت گیاهی و تولید ترکیبات باارزش در سطح تجاری را فراهم کرده است. استفاده از روش‌های زیست‌فناوری گیاهی و به‌ویژه تولید ترکیبات گیاهی در شرایط درونشیشه امکان تولید محصولات دارویی باارزش را مستقل از شرایط فصلی و آب‌وهوایی در طول سال فراهم می‌کند. امروزه پژوهش‌های بسیاری در زمینۀ ارزش دارویی و غذایی گیاه مورینگا (M. oleifera) انجام شده و در حال انجام است. باتوجه‌به ارزش زیاد این گیاه از نظر دارویی و درمان بیماری‌هایی نظیر سرطان در طب سنتی ملل مختلف، روش‌های مناسب و جایگزین برای تولید ترکیبات مؤثرۀ آن اهمیت بسیاری دارد. استفاده از کشت بافت گیاهی و همچنین عوامل محرک، روش مؤثری برای تولید ترکیبات باارزش این گیاه در شرایط درونشیشه محسوب می‌شود. بر اساس نتایج پژوهش حاضر، تیمار کالوس با غلظت‌های بیشتر (100 و 200 میلیگرمدرلیتر) متیل‌جاسمونات، سالیسیلیک‌اسید و فنیل‌آلانین، امکان افزایش تولید متابولیت‌های ثانویۀ گیاهی (روتین، کوئرستین و کمپفرول) در این گیاه را فراهم می‌کند.
)