نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زیست شناسی گیاهی، دانشکده علوم، دانشگاه جیرفت، جیرفت، کرمان
2 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه پیام نور، تهران
3 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره)، قزوین
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
The destruction of the ozone layer leads to the penetration of some harmful solar radiation, such as ultraviolet rays into the atmosphere. These radiations have negative effects on plants’ growth and development. The current study investigated the effect of three UV radiation bands on plant growth, oxidative stress induction, and defense mechanisms in Melissa officinalis seedlings. The experiment was conducted in a hydroponics system under a completely randomized plan with three replicates. The seedlings, after a seven-leaf stage, were exposed to UV-A and UV-B for 20 min, and UV-C for three min daily for one week. The effect of different UV bonds was reported on oxidants, such as oxygen free radicals (ROS), hydrogen peroxide (H2O2), malondialdehyde (MDA), antioxidants (total antioxidants, phenolic compounds, anthocyanin and superoxide dismutase (SOD) enzyme activity), and seedling growth. The results revealed that UV-A radiation did not induce a significant effect on ROS, H2O2 and MDA contents compared with those of the control. However, under UV-B and UV-C ROS, H2O2 and MDA contents showed 59-89, 67-104, and 103-166 % increase compared with the control. All of the studied anti-oxidant content increased under three different UV radiations. The highest increase was reported for phenolic compounds with 148-178% compared with the control. The oxidant content increased under UV-B, and UV-C indicating that the plants’ anti-oxidant system was unable to sweep ROS and reduce the stress. Consequently, the radiation treatments reduced root and shoot fresh weight. Overall, the results indicated that the lemon balm plant was sensitive to UV radiation.
Introduction
Plants need light for photosynthesis and respond to light through different photoreceptors. Apart from active photosynthetic rays (PAR), plants are also exposed to other rays including ultraviolet (UV) light. Ultraviolet rays are classified based on their wavelengths into UV-C (200-280 nm), UV-B (280-320 nm), and UV-A (320-390 nm). UV-C is the most dangerous range of ultraviolet light that is completely absorbed by the ozone layer. UV-B is very important because of its severe destructive effects on the growth and development of plants. UV-A radiation has less toxic effects than other wavelengths of ultraviolet radiation. Plants control growth and development changes in response to UV by creating a complex network of transcriptomes. Severe UV-B or UV-C stress leads to cell cycle arrest, chloroplast and mitochondrial dysfunction, DNA fragmentation, and finally programmed cell death (PCD). The amount of damage in plants varies depending on environmental factors, plant species, intensity of radiation, and type of radiation. Current knowledge about the eco-physiological impact of UV radiation on plants is limited. In this study, the effects of UV-A, UV-B, and UV-C on growth, induction of oxidative stress and resistance mechanisms of Melissa officinalis seedlings were studied.
Materials and Methods
The seeds of Melissa officinalis were grown in containers with perlite. After germination, plants were transferred to pots containing washed perlite and irrigated with Hoagland's nutrient solution with one-fifth dilution. The lemon balm plants were exposed to ultraviolet rays (UV-A and UV-B for 20 minutes, and UV-C for 3 minutes) for one week after the 7-leaf stage. The control plants were exposed to visible light in the growth chamber. At the end of the treatments, growth parameters (fresh weight of shoots, roots, and leaves), oxidants (ROS, H2O2, and MDA), and antioxidants (total antioxidants, phenolic compounds, anthocyanins, and SOD enzyme activity) were measured. The experiment was conducted in a completely randomized design (CRD) with three replications (n=3). The analysis of variance (ANOVA) and SPSS 22 software were used for the statistical analysis of the data. Mean data were compared by Duncan's multiple range test (p ≤ 0.05).
Results and Discussion
The results of the study revealed that there is a positive correlation of 0.9 (R2) between oxidant indices, such as ROS, H2O2, and MDA in the treated plants. The amount of oxidants in seedlings treated with UV-A did not show any significant difference in comparison with the control plants. UV-B and UV-C rays increased oxidant contents. UV-B and UV-C rays lead to the transfer of electrons to O2 and the formation of active oxygen species due to the photo-oxidation of the chloroplast membrane and mitochondria. The produced ROS are highly reactive and lead to oxidative damage to DNA, proteins, and lipid peroxidation. The antioxidant system in cells was able to remove ROS molecules.
The results of the analysis of variance obtained from the data showed that all the antioxidant indices measured in this study increased in all of the seedlings treated with UV. The increase of these organic compounds in plants was probably due to the induction effect of UV rays on the genes encoding the enzymes of relevant pathways. However, UV-B and UV-C rays led to an increase in the amount of ROS, increased lipid peroxidation, and ultimately cell damage, despite the increase in non-enzymatic and enzymatic antioxidant system components. This system was not able to control 100% of the effects caused by these rays in plants. Therefore, it led to the reduction of biomass in UV treatments, which was a general response in many plant species under severe stress conditions.
Conclusion
Considering the result of the present study, Melissa officinalis seedlings showed physiological changes when exposed to ultraviolet rays. Increasing the amount of antioxidants in UV treatments allowed plants to survive under oxidative stress conditions, but it still caused damage (e.g. oxidants increase and weight decrease) to the plant. Therefore, Melissa officinalis was sensitive to stress caused by ultraviolet rays.
کلیدواژه‌ها [English]
گیاهان برای فتوسنتز به نور نیاز دارند و از طریق گیرنده‌های نوری مختلف به نور پاسخ می‌دهند. نور مراحل مختلف رشد و فرایندهای فیزیولوژیکی حیاتی در طول چرخۀ زندگی گیاهان را تنظیم می‌کند. گیاهان به‌جز اشعه‌های فعال فتوسنتزی (PAR، 400 تا 700 نانومتر)، در معرض نور ماورابنفش (UV) نیز قرار می‌گیرند که از نظر واکنش‌های شیمیایی بسیار فعال است. اشعۀ ماورابنفش به‌طور گسترده بر اساس طول موج به UV-C (200 تا 280 نانومتر)، UV-B (280 تا 320 نانومتر) و UV-A (320 تا 390 نانومتر) طبقه‌بندی میشود (Kakani et al., 2003; .Nawkar et al., 2013; Loconsole & Santamaria, 2021). UV-C (خطرناک‌ترین محدودۀ نور ماورابنفش) آثار ناچیزی بر گیاهان دارد؛ زیرا لایۀ ازون این طول موج‌ها را به‌طور کامل جذب می‌کند. UV-B از طریق لایۀ ازون استراتوسفر فیلتر میشود و تنها مقدار کمی از آن به سطح زمین می‌رسد. مقدار UV-B روی سطح زمین به عواملی مانند غلظت ازون، زاویۀ تابش پرتوهای خورشید، مقدار رطوبت موجود در هوا و ارتفاع از سطح دریا بستگی دارد. لایۀ ازون، UV-A را جذب نمی‌کند و به‌طور کامل به سطح زمین می‌رسد؛ برخی مواد زیستی این اشعه را جذب می‌کنند و درنتیجه فرایندهای فیزیولوژیکی تحت‌تأثیر قرار می‌گیرند (Kakani et al., 2003). در بین سه نوع اشعۀ ماورابنفش، اگرچه مقادیر کمتری از UV-B (5/1 درصد از کل تابش) به سطح زمین می‌رسد، این اشعه آثار مخرب شدیدی بر رشدونمو گیاهان دارد و ازاین‌رو، دارای اهمیت زیادی است. تشعشعات UV-A با حدود 3/6 درصد از کل تابش نسبت به سایر طول موج‌های تابش ماورابنفش، آثار سمی کمتری دارد (Nawkar et al., 2013; Yadav et al., 2020)؛ لایۀ اپیدرم گیاهان مقادیر بسیار زیادی از این اشعه را جذب می‌کند و مانع رسیدن آن به سایر بخش‌های گیاه میشود (Kakani et al., 2003; Loconsole & Santamaria, 2021).
گیاهان با داشتن گیرنده‌های نوری مختلف می‌توانند کیفیت (طول موج)، شدت، مدت (ازجمله طول روز) و جهت نور را حس کنند. گیاهان با ایجاد شبکۀ پیچیده‌ای از ترانسکریپتوم، تغییرات رشدی (جوانه‌زنی بذر، اتیلاسیون، حرکت روزنه و رشد تولیدمثلی در زمان گل‌دهی) را در پاسخ به نور کنترل می‌کنند. بخش‌های مهم تحت‌تأثیر پرتو ماورابنفش در سلولهای گیاهی عبارتند از: DNA، لیپیدها و پروتئین‌ها و همچنین فرایندهای حیاتی مانند فتوسنتز (Nawkar et al., 2013). پژوهش‌های مختلف نشان داده‌اند تابش UV-B پاسخ‌های فنوتیپی متنوعی ازجمله مهار رشد هیپوکوتیل، گسترش لپه‌ها و تحریک بیوسنتز رنگدانه‌های محافظ UV-B را در گیاهان سبب میشود. تغییرات فیزیولوژیکی ناشی از UV-C و UV-B از طریق پروتئین UVR8 (مقاومت در برابر اشعۀ ماورابنفش) به‌عنوان گیرندۀ نوری UV-B در سلول تنظیم میشود (Yadav et al., 2020; Heijde & Ulm, 2012). تنش خفیف پرتو UV-B سبب تحریک پاسخ‌های فتومورفوژنز در گیاهان میشود؛ درحالی‌که تنش شدید UV-B یا UV-C به توقف چرخۀ سلولی، اختلال در عملکرد کلروپلاست و میتوکندری، فعال‌شدن پروتئازهای شبه‌کاسپاز، تکه‌تکه‌شدن DNA الیگونوکلئوزومی و درنهایت، مرگ برنامه‌ریزی‌شدۀ سلولی (PCD) منجر میشود (Nawkar et al., 2013)؛ باوجوداین، گیاهان، سلول‌ها و ساختمان‌های درون‌سلولی از طریق آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان مثل سوپراکسیددیسموتاز، آسکوربات‌پراکسیداز، گلوتاتیون‌رودکتاز و کاتالاز حفاظت می‌شوند؛ علاوه‌بر آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، بسیاری از متابولیت‌ها مانند گلوتاتیون، آسکوربیک‌اسید، کاروتنوئیدها، فلاونوئیدها، آنتوسیانین‌ها و ترکیبات فنلی با جاروکردن رادیکال‌های آزاد سبب حفاظت گیاه در برابر تنش‌های اکسیداتیو می‌شوند (Kakani et al., 2003; Loconsole & Santamaria,. 2021).
گزارش شده است UVR8 سبب القای ترکیبات جذب‌کنندۀ UV، حذف گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و پاسخ‌های دفاعی در برابر اشعۀ UV میشود (Heijde & Ulm, 2012; Nawkar et al., 2013; Yadav et al., 2020). میزان خسارت در گیاهان زراعی و دارویی ممکن است بسته به عوامل محیطی، نوع گیاه، شدت تابش و نوع تابش متفاوت باشد. دانش کنونی در زمینۀ تأثیر اکوفیزیولوژیکی اشعۀ ماورابنفش بر گیاهان محدود است؛ بنابراین، بررسی آثار اشعه‌های ماورابنفش بر مراحل مختلف رشد گیاهان و شدت‌های مختلف تنش اهمیت دارد. در پژوهش حاضر، آثار UV-A، UV-B و UV-C بر رشد، القای تنش اکسیداتیو و سازوکارهای مقاومت گیاهچۀ بادرنجبویه مطالعه شد.
مواد و روش‌ها
بذر گیاه بادرنجبویه (Melissa officinalis) از شرکت پاکان‌بذر اصفهان تهیه شد. بذرها در ظرف‌های حاوی پرلیت درشت، متوسط و ریز (1:1:2) شسته و در خزانه کشت شدند. باتوجهبه وجود اندوخته در لپه‌ها، ظروف کشت تا ظهور گیاهچه‌ها (بهمدت 10 روز) روزانه با آب و سپس تا ظهور برگ سوم اصلی، هفته‌ای یک بار با محلول غذایی هوگلند با رقت یک‌پنجم آبیاری شدند (Hothem et al., 2003). پس از کامل‌شدن برگ دوم، گیاهان به گلدان‌هایی به حجم 700 میلی‌لیتر حاوی پرلیت شسته‌شده در گلخانه منتقل شدند. برای هر تیمار، سه گلدان حاوی چهار گیاه در نظر گرفته شد و دو روز برای سازگاری گیاه با شرایط جدید در محلول غذایی هوگلند فرصت داده شد. پس از بهینه‌سازی اولیۀ زمان تیماردهی، تیمارهای UV-A، UV-B و UV-C اعمال شدند. تیمار UV در محفظه‌ای از جنس پلکسی‌گلاس مستطیلی‌شکل (90×40×50 سانتی‌متر) حاوی لامپ‌های UV-C (با طول موج 254 نانومتر)، UV-B (با طول موج 312 نانومتر) و UV-A (با طول موج 365 نانومتر) با توان 8 وات و از هر لامپ دو عدد اعمال شد. لامپ‌های استفاده‌شده ساخت شرکت Philips لهستان (مدلActinic BL) بودند. پس از بهینه‌سازی اولیه و رسیدن به مرحلۀ هفت‌برگی، گیاهان بادرنجبویه یک هفته به‌طور روزانه در معرض پرتوهای ماورابنفش (UV-A و UV-B بهمدت 20 دقیقه و UV-C بهمدت 3 دقیقه در فاصلۀ 30 سانتی‌متری از لامپ‌های UV) قرار گرفتند. گیاهان شاهد در معرض تابش نور مرئی در اتاقک رشد قرار داده شدند. کشت گیاهان در اتاقک رشد با دورۀ نوری 16 ساعت نور و دمای 2±25 درجۀ سانتی‌گراد و 8 ساعت تاریکی و دمای 2±17 درجۀ سانتی‌گراد با رطوبت 50 درصد انجام شد. پس از پایان تیمارها، شاخص‌های رشدی (وزن تر اندام هوایی، ریشه و برگ) چهار گیاه هر گلدان اندازه‌گیری و میانگین آن برای هر گلدان در نظر گرفته شد؛ سپس اکسیدان‌ها (ROS، H2O2 و MDA) و آنتی‌اکسیدان‌ها (آنتی‌اکسیدان کل، ترکیبات فنلی، آنتوسیانین‌ها و فعالیت آنزیم SOD) اندازه‌گیری شدند.
مقدار رادیکال‌های آزاد فعال اکسیژن
محتوای گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) به روش زایلنول نارنجی تعیین شد (Bindschedler et al., 2001). به این منظور، ابتدا بافت برگ درون هاون چینی حاوی بافر فسفات‌سدیم 50 میلی‌مولار با اسیدیتۀ 8/6 ساییده شد. محلول همگن حاصل بهمدت 15 دقیقه با سرعت 12000 دوردردقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ (مدل universal 320 R، شرکت Hettich، آمریکا) شد. جذب نوری محلول حاصل حاوی عصاره و زایلنول نارنجی اسیدی در طول موج 560 نانومتر خوانده شد. غلظت‌های مختلف H2O2 برای رسم منحنی استاندارد استفاده و نتایج برحسب میکرومولبرگرم وزن تر محاسبه و ارائه شدند.
مقدار H2O2
به‌منظور تعیین مقدار هیدروژن‌پراکسید، ابتدا 1/0 گرم از بافت برگ با 1 میلی‌لیتر تری‌کلرواستیک‌اسید 1/0 درصد (W/V) درون هاون چینی و در حمام یخ کاملاً ساییده و همگن شد؛ سپس محلول بهمدت 15 دقیقه با سرعت 12000 دوردردقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد. سپس مقدار 500 میکرولیتر بافر فسفات (100 میلی‌مولار، اسیدیتۀ 7) و 1 میلی‌لیتر یدیدپتاسیم 1 مولار به 500 میکرولیتر عصاره افزوده و پس از همگن‌شدن، جذب نمونه‌ها در طول موج 360 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل UV-1601، شرکت Rayleigh، چین) تعیین شد. غلظت‌های مختلف 30 درصد H2O2 برای رسم منحنی استاندارد استفاده شدند و مقدار هیدروژن‌پراکسید برحسب میکرومولبرگرم وزن تر محاسبه و ارائه شد (Zlatev et al., 2006) .
مقدار پراکسیداسیون چربی‌ها
مقدار پراکسیداسیون چربی‌ها به‌وسیلۀ غلظت مالون‌دی‌آلدئید (MDA) توسط TCA-TBA اندازه‌گیری شد (Costa et al., 2002). جذب در طول موج 532 نانومتر با اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. کدورت لیپیدهای غیراختصاصی با کم‌کردن جذب در طول موج 600 نانومتر اصلاح شد. ضریب خاموشی (ɛ) 155 بر میلی‌مول بر سانتی‌متر در نظر گرفته شد. محتوای MDA برحسب میکرومولبرگرم وزن تر گزارش شد.
آنتی‌اکسیدان کل بر اساس قدرت آنتی‌اکسیدان. احیاکنندگی یون فریک FRAP))
به‌منظور تعیین آنتی‌اکسیدان کل، مقدار 100 میلی‌گرم از بافت برگ با 1 میلی‌لیتر بافر فسفات‌سدیم (50 میلی‌مولار، اسیدیتۀ 7) درون هاون چینی روی یخ ساییده شد. محلول همگن به‌دست‌آمده به اپندورف منتقل و بهمدت 20 دقیقه با سرعت 12000 دوردردقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد با سانتریفیوژ یخچال‌دار سانتریفیوژ شد. سپس 50 میکرولیتر از عصارۀ رویی به 950 میکرولیتر از معرف TPTZ (2, 4 ,6-tri (2-pyridyle) - 1, 3, 5 triazine) در تاریکی افزوده شد و نمونه‌ها بهمدت 30 دقیقه در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد و تاریکی نگهداری شدند. جذب نوری نمونه‌ها (رنگ آبی) در طول موج 593 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. از FeSO4 برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد و بلانک شامل 50 میکرولیتر بافر فسفات‌سدیم (50 میلی‌مولار، اسیدیتۀ 7) و950 میکرولیتر معرف TPTZ بود. مقدار آنتی‌اکسیدان کل FRAP)) هر نمونه برحسب میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر محاسبه و گزارش شد (Wojdyło et al., 2007).
ترکیبات فنلی
مقدار ترکیبات فنلی طبق روش Soland & Laima (1999) اندازه‌گیری شد؛ بر اساس این روش، گالیک‌اسید برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد و نتایج برحسب میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر محاسبه و گزارش شدند.
آنتوسیانین‌ها
به‌منظور اندازه‌گیری مقدار آنتوسیانین‌های برگ از روش واگنر استفاده شد. جذب عصاره‌های متانول اسیدی در طول موج ۵۵0 نانومتر خوانده شد. بلانک، متانول اسیدی بود و برای محاسبۀ غلظت آنتوسیانین‌ها، ضریب خاموشی (ɛ) 33000 بر میلی‌مول بر سانتی‌متر بود (Wagner, 1979). نتایج برحسب میکرومولبرگرم وزن تر محاسبه و ارائه شدند.
فعالیت آنزیم (SOD)
فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز (EC 1.15.1.1) (SOD) با استفاده از سنجش مهار احیای نوری نیتروبلوتترازولیوم‌کلراید (NBT) در طول موج 560 نانومتر سنجش شد. فعالیت آنزیم SOD برحسب واحد آنزیم در مقدار پروتئین کل (میلی‌گرم) محاسبه شد (Giannopolitis & Ries, 1977).
تجزیه‌وتحلیل آماری
تمام آزمایش‌ها در قالب طرح کاملاً تصادفی (CRD) و در سه تکرار (n=3) انجام شدند. پیش از تجزیه‌وتحلیل داده‌ها، توزیع نرمالیتۀ داده‌ها بررسی شد؛ بر این اساس، تبدیل داده برای صفت‌های ROS، MDA، ترکیبات فنلی و آنتوسیانین به روش لگاریتمی، برای H2O2 به روش جذری و برای وزن تر اندام هوایی، ریشه و برگ به روش انعکاس انجام شد تا توزیع نرمال برقرار شود. تجزیه واریانس داده‌ها و مقایسۀ میانگین با آزمون یک‌طرفۀ چنددامنه‌ای دانکن در سطح احتمال خطای p≤0.05 از نرم‌افزار SPSS 22 انجام شد.
نتایج و بحث
نتایج تجزیه‌وتحلیل واریانس داده‌ها نشان داد آثار تیمارهای UV بر تمام شاخص‌های ارزیابی‌شده در سطح 5 درصد معنادار است (جدول 1).
جدول 1- تجزیه واریانس (میانگین مربعات) آثار باندهای مختلف UV بر اکسیدان‌ها مانند رادیکال‌های آزاد اکسیژن (ROS)، آب‌اکسیژنه (H2O2) و مالون‌دآلدئید (MDA) و آنتی‌اکسیدان‌ها نظیر آنتی‌اکسیدان کل، ترکیبات فنلی (Phenolic)، آنتوسیانین‌ها (Antho) و فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز (SOD) و وزن تر (اندام هوایی، ریشه و برگ) گیاهچه‌های بادرنجبویه
Table 1- Analysis of variance (mean square) of the effects of different UV bands on oxidants such as oxygen free radicals (ROS), hydrogen peroxide (H2O2) and malonaldehyde (MDA), antioxidants such as total antioxidant, phenolic compounds (Phenolic), anthocyanin (Antho) and superoxide dismutase (SOD) enzyme activity and fresh weight (shoot, root and leaf) of Melissa officinalis seedlings
|
Leaf FW |
Root FW |
Shoot FW |
SOD |
Antho |
Phenolic |
Total antioxidant |
MDA |
H2O2 |
ROS |
df |
Source of variation |
|
0.002** |
0.028** |
0.13** |
5266.5* |
578.5** |
13.20** |
23.9** |
68.0** |
0.085** |
65.8** |
3 |
Treatment |
|
0.000 |
0.002 |
0.003 |
277.21 |
97.89 |
0.60 |
8.09 |
4.65 |
0.007 |
7.70 |
8 |
Error |
|
3.4 |
7.9 |
1.6 |
11.19 |
5.7 |
10.2 |
14.1 |
11.5 |
14.5 |
12.2 |
- |
CV (%) |
* و** به‌ترتیب معنادار در سطح احتمال خطای ٥ و ١ درصد
* and ** respectively significant at 5 and 1 percent probability
محتوای اکسیدان.
در مطالعۀ حاضر، محتوای اکسیدان‌ها با تولید ROS، H2O2 و MDA (پراکسیداسیون لیپیدها) اندازه‌گیری شد (شکل 1). نتایج نشان دادند بین شاخص‌های اکسیدان مانند ROS، H2O2 و MDA در گیاهان تیمارشده 9/0 (R2) همبستگی مثبت وجود دارد (جدول 2). مقدار ROS، H2O2 و MDA گیاهچه‌های تیمارشده با UV-A در مقایسه با گیاهان شاهد تفاوت معناداری نشان ندادند. پرتوهای UV-B و UV-C مقادیر ROS، H2O2 و MDA را به‌طور معناداری افزایش دادند؛ این افزایش در گیاهان تیمارشده با UV-B به‌ترتیب 59، 67 و 103 درصد و در تیمار با UV-C به‌ترتیب 89، 104 و 166 درصد بود؛ بنابراین، آثار پرتوهای UV-B و UV-C بر MDA شدیدتر از ROS و H2O2 است.
گزارش شده است پرتوهای UV سبب افزایش اکسیدان‌ها در گیاه ماش (Rezayi Far et al., 2018) و بادرنجبویه در کشت خاکی (Pourakbar & Abedzadeh, 2014) می‌شوند. پرتوهای UV-B و UV-C به دلیل فتواکسیداسیون بخش‌های تیلاکوئید کلروپلاست و غشای میتوکندری منجر به انتقال الکترون‌ها به O2 و تشکیل گونه‌های فعال اکسیژن مانند -O2، H2O2 و رادیکال-OH می‌شوند. یکی از اشکال ROS، پراکسیدهیدروژن (H2O2) است که می‌تواند در تنظیم سوخت‌وساز سلول و بیان ژن‌ها نقش داشته باشد؛ بنابراین، H2O2 به‌عنوان مولکول پیام‌رسان برای بقای سلول‌ها اهمیت دارد، اما مقادیر زیاد آن می‌تواند به سلول‌ها آسیب برساند. H2O2 پایداری بیشتری نسبت به سایر گونه‌های فعال اکسیژن دارد و به‌راحتی از غشا عبور می‌کند. تابش‌های ماورابنفش سبب تحریک واکنش‌های فتوشیمیایی، تولید گونه‌های فعال اکسیژن و در نهایت، آسیب به DNA، پروتئین‌ها و چربی‌ها می‌شوند؛ بنابراین پایداری غشا به‌علت جذب مستقیم اشعه یا آثار غیرمستقیم گونه‌های فعال اکسیژن به خطر می‌افتد. گونه‌های فعال اکسیژن تولیدشده در سلولهای گیاهی طی شرایط تنش، بسیار واکنش‌پذیر و سمی هستند و سبب آسیب اکسیداتیو DNA، پروتئین‌ها و پراکسیداسیون چربی‌ها می‌شوند(Hideg et al., 2013; Nawkar et al., 2013). واکنش‌های پراکسیداسیون باتوجهبه تعداد و موقعیت باندهای دوگانه متفاوت هستند. در مرحلۀ ابتدایی، رادیکال‌های هیدروکسیل آزادشده با یک اتم هیدروژن اسیدچرب واکنش می‌دهند و گروه وینیل برداشته میشود، سپس باقیماندۀ مرحلۀ پیش با اکسیژن سه‌تایی واکنش می‌دهد و یک رادیکال پراکسی و آلکوکسی ایجاد می‌کند که این رادیکال با برداشتن دومین اتم هیدروژن اسیدچرب، یک لیپید هیدروپراکسی تولید می‌کند. در مراحل بعدی، انواع آلدئیدها و هیدروکربن‌ها از باقیماندۀ اسیدهای چرب ایجاد می‌شوند. یکی از محصولات پراکسیداسیون لیپیدها، مالون‌دِآلدئید (MDA) است. غالباً پراکسیداسیون لیپیدها از رادیکال‌های آزاد مربوط به اسیدهای چرب غیراشباع مانند لینولئیک‌اسید و لینولنیک‌اسید ناشی میشود. آثار این آسیب ناشی از تنش نوری سبب غیرقطبی‌شدن غشا، افزایش نفوذپذیری غشا، خروج پتاسیم، ورود یون کلر، تخریب غشای اندامک‌های درون‌سلولی و افزایش کلروز و نکروز است (Costa et al., 2002; Kakani et al., 2003; Nawkar et al., 2013).
|
|
|
|
|
|
شکل 1- تأثیر باندهای مختلف اشعۀ ماورابنفش بر مقدار تولید (A) ROS، (B) H2O2 و (C) MDA در برگ گیاهچه‌های بادرنجبویه. مقادیر، میانگین 3 تکرار±SD است. حروف یکسان، وجودنداشتن اختلاف معنادار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.
Figure 1- The effect of different bands of ultraviolet rays on (A) ROS and (B) H2O2 and (C) MDA content of Melissa officinalis seedlings. The data are mean of 3 replicates ±SD. The same letters indicate no significant difference using Duncan's test.
جدول 2- ضرایب همبستگی بین شاخص‌های اندازه‌گیری‌شدۀ گیاهچه‌های بادرنجبویه در پاسخ به باندهای مختلف اشعۀ ماورابنفش
Table 2- Correlation matrices showing relationships between measured parameters of Melissa officinalis seedlings in response to different bands of ultraviolet rays.
|
ROS |
H2O2 |
MDA |
FRAP |
Phenolic |
Anthocyanin |
SOD |
Shoot FW |
|
|
H2O2 |
.901** |
1 |
||||||
|
MDA |
.898** |
.891** |
1 |
|||||
|
FRAP |
0.549 |
0.538 |
0.54 |
1 |
||||
|
Phenolic |
.587* |
.670* |
.678* |
.655* |
1 |
|||
|
Anthocyanin |
.655* |
.723** |
.608* |
.865** |
.696* |
1 |
||
|
SOD |
.659* |
.736** |
.609* |
.580* |
.881** |
.622* |
1 |
|
|
Shoot FW |
-.917** |
-.912** |
-.932** |
-0.425 |
-.662* |
-0.518 |
-.601* |
1 |
|
Root FW |
-.858** |
-.919** |
-.952** |
-.627* |
-.756** |
-.749** |
-.700* |
.875** |
**و * همبستگی در سطوح 01/0 و 05/0 معنادار است.
**and * Correlation is significant at the 0.01 and 0.05 levels.
محتوای آنتی‌اکسیدان
نتایج سنجش محتوای آنتی‌اکسیدان (آنتی‌اکسیدان کل بر اساس روش FRAP، ترکیبات فنلی، آنتوسیانین‌ها و فعالیت آنزیم SOD) در شکل 2 آورده شده است. سیستم آنتی‌اکسیدانی در سلول‌ها قادر به حذف مولکول‌های ROS است. روش‌های متعددی برای اندازه‌گیری فعالیت آنتی‌اکسیدانی نمونه‌های گیاهی وجود دارند. اندازه‌گیری آنتی‌اکسیدان کل به روش FRAP بر اساس قدرت احیاکنندگی یون فریک و تبدیل یون فریک (Fe+3) به یون فرو (Fe+2) در اسیدیتۀ کم و تغییر کمپلکس فریک- TPTZ (قهوه‌ای خیلی کم‌رنگ) به کمپلکس فرو- TPTZ (آبی‌رنگ) است (Wojdyło et al., 2007). اندازه‌گیری آنتی‌اکسیدان کل، ترکیبات فنلی، آنتوسیانین‌ها و فعالیت آنزیم SOD نشانگر خوبی برای تعیین ظرفیت آنتی‌اکسیدانی بالقوه است و به‌طور گسترده برای سنجش قدرت آنتی‌اکسیدانی گیاهان در معرض تنش استفاده میشود (Wagner, 1979; Wojdyło et al., 2007).
نتایج تجزیه‌وتحلیل واریانس داده‌ها نشان دادند تمام شاخص‌های آنتی‌اکسیدان اندازه‌گیری‌شده در پژوهش حاضر برای تمام گیاهچه‌های تیمارشده با UV افزایش نشان می‌دهند؛ هرچند در برخی موارد، الگوی تغییر شاخص‌ها متفاوت است. افزایش مشاهده‌شده در روش FRAP برای تیمارهای UV-A، UV-B و UV-C به‌ترتیب 23، 40 و 24 درصد بود (شکل A2). مقدار ترکیبات فنلی تحت‌تأثیر UV-A، UV-B و UV-C به‌ترتیب 187، 148 و 173 درصد افزایش یافت (شکل B2)؛ به‌طوری‌که بین مقادیر FRAP با ترکیبات فنلی، آنتوسیانین‌ها و فعالیت آنزیم SOD در گیاهان تیمارشده به‌ترتیب 65/0، 86/0 و 58/0 (R2) همبستگی مثبت وجود داشت (جدول 2). در شرایط تنش UV، ترکیبات متفاوتی از فنولیک‌های با وزن مولکولی کم (فلاونوئیدها) تا فنولیک‌های با وزن مولکولی زیاد (تانن‌ها) تولید می‌شوند. نقش اساسی این ترکیبات، محافظت از گیاهان در برابر تنش اکسیداتیو طی رویارویی با تابش ماورابنفش است (Loconsole & Santamaria, 2021; Wojdyło et al., 2007). مقدار آنتوسیانین‌ها به‌ترتیب افزایش 32، 67 و 43 درصدی را در گیاهچه‌های در معرض تیمار UV-A، UV-B و UV-C نشان داد (شکل C2). نتایج یادشده با نتایج سایر پژوهشگران در زمینۀ گیاه گوجه‌فرنگی (Bijami et al., 2011)، سه رقم گندم (Rezayi Far et al., 2018) و کاهو(Ranjbar & Mousavi, 2018) مطابقت دارند. بسیاری از ترکیبات فنیل‌پروپانوئید مانند مشتقات هیدروکسی‌سینامیک‌اسید، گلوتاتیون، آسکوربیک‌اسید، کاروتنوئیدها، ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و آنتوسیانین از غشا و ساختارهای درون‌سلولی در برابر تنش اکسیداتیو ناشی از UV محافظت می کنند(Yadav et al., 2020; Loconsole & Santamaria, 2021; Singh et al., 2023). گزارش شده است در معرض UV-B و UV-C، ترکیبات یادشده در واکوئل سلولهای اپیدرم رویی و زیری برگ‌های بالغ بیشتر گیاهان تجمع می‌کنند. آنتوسیانین‌ها از نظر ساختمانی مشابه فلاونوئیدها هستند و گروهی از ترکیبات فنلی در گیاهان به شمار می‌آیند که با تغییر کیفیت و کمیت نور جذب‌شده و جاروکردن رادیکال‌های آزاد می‌توانند پرتوهای UV را فیلتر کنند و آثار این پرتوها در گیاهان را کاهش دهند. ترکیبات فنلی و آنتوسیانین‌ها از مسیر فنیل‌پروپانوئیدی سنتز می‌شوند و تعداد زیادی از آنزیم‌های کلیدی این مسیر تحت‌تأثیر UV فعال می‌شوند (Hideg et al., 2013; Loconsole and Santamaria, 2021; Singh et al., 2023)؛ بنابراین، افزایش این مواد آلی در گیاهان از اثر القایی پرتوهای UV بر ژن‌های کدکنندۀ آنزیم‌های مسیر یادشده ناشی میشود. فعالیت آنزیم SOD در گیاهچه‌های تیمارشده با اشکال مختلف UV در مقایسه با گیاهان شاهد حدود 18 تا 28 درصد افزایش نشان داد (شکل D2). افزایش مقدار فعالیت آنزیم SOD در گیاهان آفتابگردان و ماش در تیمار با UV-B گزارش شده است. افزایش فعالیت آنزیم SOD، سطح گونه‌های فعال اکسیژن در گیاهان در معرض تنش را کاهش می‌دهد (Costa et al., 2002; Rezayi Far et al., 2018). به‌طور کلی، پرتوهای UV-B و UV-C با وجود افزایش اجزای سیستم آنتی‌اکسیدان غیرآنزیمی و آنزیمی (نظیر SOD) سبب افزایش مقدار ROS، افزایش پراکسیداسیون لیپیدها، تغییر متابولیسم یون فریک، تغییر مقدار تنظیم‌کننده‌های رشد و درنهایت، آسیب به سلول می‌شوند و این سیستم قادر به مهار صددرصدی آثار ناشی از پرتوها در گیاهان نیست (Costa et al., 2002; Loconsole & Santamaria, 2021).
|
|
|
|
|
|
شکل 2- تأثیر باندهای مختلف اشعۀ ماورابنفش بر (A مقدار آنتی اکسیدان کل– FRAP، (B ترکیبات فنلی، (C آنتوسیانین‌ها و (D فعالیت SOD در گیاهچه‌های بادرنجبویه. مقادیر، میانگین 3 تکرار±SD است. حروف یکسان، وجودنداشتن اختلاف معنادار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.
Figure 2- The effect of different bands of ultraviolet rays on (A) amount of total antioxidant-FRAP, (B) phenolic compounds, (C) anthocyanin and (D) SOD activity of Melissa officinalis seedlings. The data are mean of 3 replicates ±SD. The same letters indicate no significant difference using Duncan's test.
وزن تر گیاه
بررسی تأثیر پرتوهای ماورابنفش بر وزن تر اندام هوایی نشان داد پرتوهای UV-B و UV-C وزن تر را به‌ترتیب 33 و 76 درصد نسبت به شاهد کاهش می‌دهند، اما UV-A تأثیر معناداری بر وزن تر اندام هوایی ندارد (شکل A3). تمام گیاهان در معرض پرتوهای مختلف UV در مقایسه با شاهد به‌طور درخور توجهی سبب کاهش وزن تر ریشه شدند. پرتوهای UV-B و UV-C به‌ترتیب سبب کاهش 6/34 و 5/35 درصدی وزن تر ریشه در مقایسه با UV-A شدند (شکل B3). تغییرات وزن تر برگ در معرض تیمارهای مختلف UV، الگویی مشابه تغییرات وزن تر اندام هوایی داشت؛ با این تفاوت که شدت کاهش وزن تر برگ تیمارشده با پرتوهای UV-B و UV-C شدیدتر بود (شکل C3).
نتایج یادشده حساسیت بیشتر گیاهچه‌های بادرنجبویه به UV-C در مقایسه با UV-B را نشان می‌دهند. پرتوهای UV-A تغییر معناداری در مقدار وزن تر برگ ایجاد نکردند. نتایج پژوهش حاضر با یافته‌های بسیاری از پژوهشگران در زمینۀ گیاه بامیه (Kargar Khorrami et al., 2013)، دو رقم کدو (Hagihosseinlo et al., 2016) و بادرنجبویه در کشت خاکی (Pourakbar & Abedzadeh, 2014) مطابقت دارند. کاهش وزن در تیمارهای UV بیان‌کنندۀ کاهش تولید زیست‌توده است که پاسخی عمومی در بسیاری از گونه‌های گیاهی به شمار می‌آید. پرتوهای UV با تشکیل دایمرهای پریمیدین پریمیدین و پریمیدین سیکلوبوتان سبب کاهش همانندسازی DNA و کاهش تقسیم سلولی می‌شوند (Kakani et al., 2003; Yadav et al., 2020)؛ از سوی دیگر، کاهش مقدار اکسین تحت‌تأثیر پرتوهای UV به‌طور مستقیم یا غیرمستقیم رخ می‌دهد و سبب کاهش انعطاف‌پذیری دیوارۀ سلولی و مهار رشد گیاهان میشود(Yadav et al., 2020; Loconsole & Santamaria, 2021).
|
|
|
|
|
|
شکل 3- تأثیر باندهای مختلف اشعۀ ماورابنفش بر مقدار وزن تر (A اندام هوایی، (B ریشه و (C برگ گیاهچه‌های بادرنجبویه. مقادیر، میانگین 3 تکرار±SD است. حروف یکسان، وجودنداشتن اختلاف معنادار با استفاده از آزمون دانکن را نشان می‌دهند.
Figure 3- The effect of different bands of ultraviolet rays on the fresh weight of (A) shoot, (B) root and (C) leaves of Melissa officinalis seedlings. The data are mean of 3 replicates ±SD. The same letters indicate no significant difference using Duncan's test
نتیجه‌گیری
نتایج نشان دادند گیاهچه‌های بادرنجبویه در رویارویی با پرتوهای ماورابنفش متحمل تغییرات فیزیولوژیکی می‌شوند. اگرچه افزایش مقدار آنتی‌اکسیدان در تیمارهای UV به گیاهان اجازه می‌دهد در شرایط تنش اکسیداتیو زنده بمانند، سبب آسیب (افزایش اکسیدان‌ها و کاهش وزن تر) به این گیاه شد و بنابراین، بادرنجبویه گیاهی حساس به تنش ناشی از پرتوهای ماورابنفش است.
)