نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشکده علوم و مهندسی کشاورزی، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران
2 گروه زیست شناسی، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Plants employ various defensive strategies to cope with heavy metal stress in their growing environment. In this study, proline content, antioxidant enzyme activities, and phenolic compound levels were analyzed in saffron corms exposed to varying concentrations of cadmium stress. Saffron corms were cultivated under cadmium stress at concentrations of 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10, and 20 mM, and samples were collected on days 0, 5, 10, 20, and 30 after cultivation. Antioxidant enzyme activities, proline levels, and phenolic content were measured. Statistical analysis was performed at a significance level of P < 0.05 using SPSS software. The results revealed significant increases in the activities of superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX), catalase (CAT), polyphenol oxidase (PPO), guaiacol peroxidase (GPX), phenylalanine ammonia-lyase (PAL), as well as in proline content and phenolic compound accumulation, in response to cadmium treatments. The activity responses of PPO, CAT, APX, PAL, and GPX enzymes followed a biphasic pattern, while phenolic compound accumulation exhibited a linear regression trend. In contrast, the activities of SOD and proline accumulation conformed to a flattened exponential function. Maximum activities of PPO, CAT, APX, and PAL enzymes were observed at a cadmium concentration of 10 mM in corms harvested after 30 days of stress exposure. Similarly, the highest SOD activity and proline accumulation were recorded in 30-day-old corms, with phenolic compound accumulation significantly increasing with higher cadmium concentrations, albeit with varying rates depending on the duration of exposure. The observed changes in enzyme activities during growth suggest activating regulatory mechanisms in saffron to mitigate cadmium stress. The antioxidant roles of enzymes, proline, and phenolic compounds are critical in Safran’s response to cadmium-induced stress. Given that high cadmium levels induce the production of reactive oxygen species (ROS), the saffron plant enhances the synthesis of antioxidant enzymes to neutralize destructive radicals effectively.
Introduction
Plants frequently encounter various environmental stresses throughout their lifecycle, with heavy metal stress being among the most significant. Environmental contamination by heavy metals adversely affects plant growth, leading to reduced crop quality and posing serious risks to human health and the well-being of other organisms. To counteract heavy metal stress, plants employ diverse defensive mechanisms. In this context, the proline content, antioxidant enzyme activities, and phenolic compound levels were examined in saffron corms exposed to different concentrations of cadmium stress.
Material and Methods
In this research, saffron corms were dropped in a 2% benomyl solution after removing the top shell and the decayed corms to prevent fungal activity. Cultivation of saffron corms was carried out in the liquid culture medium with 4 saffron corms in each pot. The corms were classified into 7 groups. The growth of corms was done at room temperature of 20 to 25 ℃ and conditions of 16 hours of light and 8 hours of darkness. Growing corms were extracted at time intervals of 0, 5, 10, 20, and 30 days after growth. Saffron corms were treated at different concentrations of 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10, and 20 mM cadmium, so extraction of corms was done on days 0, 5, 10, 20, and 30 days after cultivation, and the activity of antioxidant enzymes, proline content, and phenolic content was measured. Data analysis was done at the level of P < 0.05 with the help of SPSS software.
Results and Discussion
The sensitivity of GPX to cadmium concentration is higher than PPO, So, the lowest activity was observed in the absence of cadmium. Contrary to GPX and PPO, the response of SOD in the presence of cadmium followed a flat exponential function. By increasing the placement of corms in the presence of cadmium, the increase of activity has also been obtained in different slopes. The maximum activity of PPO, CAT, APX, and PAL was obtained in 30-day-old corms under 10 mM cadmium stress. The maximum SOD activity and proline accumulation based on the flat exponential function was observed in the 30-day corms exposed to stress, and the accumulation of phenolic compounds also increased with significant and different slopes at different times. PPO oxidizes phenolic compounds to quinones and as a result, reduces them in various parts of plants under stress. With increasing of cadmium, the activity of SOD increased. So, SOD destroys the destructive effects of cadmium by breaking radicals into H2O2. Regulating the level of ROS by SOD is an important protection path against oxidative stress because O2- is a precursor for more toxic or destructive derivatives such as nitrite peroxide or HO-. The activity of catalase increased under cadmium stress, which is due to the protective role of the enzyme in controlling H2O2, O2- and a complementarity role with SOD. Increasing PAL activity is a cellular solution to moderate the resulting stresses in the plant, by trapping oxygen radicals through phenolic compounds.
ConclusionThe results indicate that changes in enzyme activity during growth reflect the activation of regulatory mechanisms in saffron to cope with cadmium stress. In response, the plant increases the production of antioxidant enzymes to neutralize harmful radicals and mitigate their effects. Consequently, the antioxidant defense provided by enzymes and the production of proline and phenolic compounds, play a crucial role in saffron's ability to withstand cadmium-induced stress.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
مقدمه گیاهان همواره با انواع مختلفی از تنشهاى محیطى در طول زندگی خود روبرو هستند که در این میان تنش فلزات سنگین از برجستهترین آنها محسوب میشود. فلزات سنگین به عنوان مضرترین آلودهکنندههای محیطی، در رسوبات خاکی سطح زمین به وفور دیده میشوند ( Bafeel et al., 2010). آلودگی محیط رشد گیاهان تحت تاثیر فلزات سنگین متنوع محیطی با کـاهش کیفیت محصول همراه بوده و سلامتی افراد جامعه و موجودات زنده را نیز با خطر مواجه میسازد (Hou et al., 2007; María et al., 2005). با وجود نیکل، مس و روی به عنوان عناصر حیاتی در ساختار رنگیزهها و آنزیمها، غلظتهای فراتر از نیاز فیزیولوژیکی این عناصر برای گیاهان سمی محسوب میشود. کادمیوم و سرب به عنوان عناصر غیرضروری در غلظتهای پائین قابلیت تخریب گیاهان به لحاظ فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی را دارند. بر همین اساس فلزات سنگین جز عوامل اصلی تنشزای گیاهان به شمار میآیند (Damien et al., 2006). فلزات سنگین با کاهش عملکرد اجزای مختلفی از جمله غشای تیلاکوئید در کلروپلاست، لیپیدها و پروتئینها، رشد گیاه را محدود میکنند. در میان تمام فلزات سنگین، اهمیت کادمیوم به علّت نقش آن در آلودگی زنجیره غذایی و نیز جذب راحت آن توسط سلولهای گونههای مختلف گیاهی است، به طوری که پس از حلشدن در آب با انتقال فعال وارد غشای نیمه تراوا سلولهای ریشه میشوند (Mahmoudi et al., 2023). کادمیوم به کار گرفته شده در صنایع تولید لاستیکسازی، ساخت رنگ، تولید باطری و نیز در کودهای کشاورزی میتواند با مواد خوراکی و تنفس وارد بدن شده و با دخالت در متابولیسم، شخص را با عوارض کم خونی، استخوانی، کبدی و کلیوی درگیر نماید (Salvato et al, 2003; Vassilev et al., 1998; John et al., 2008).کادمیوم دارای تمایل بالا با گروههای عملکردی مهم و مختلف از جمله سولفیدریل، هیدروکسیل و لیگاندهای نیتروژندار، آنـزیمهای مهم متابولیسم را تغییر و غیرفعال نموده و منجر به ایجاد اختلال در فتوسنتز، تنفس و مسیرهای متابولیسمی در گیاه میشود (Torres et al., 2000). تنش فلزات سنگین با تأثیر منفی بر ساختار پروتئینها و فعالیت آنزیمها بر واکنشهای جایگزینی یونهای فلزی ضروری با مولکولهای زیستی تاثیرگذار است که نتیجه آن اختلال در یکپارچگی غشاءها و نیز تغییر در واکنشهای متابولیکی اساسی، از جمله هموستاز، تنفس و فتوسنتز است (Karimi et al., 2024). مقادیر بالای کادمیوم به علّت ایجاد اختلالات متابولیسمی، تولید انواع اکسیژن فعال را در سلول افزایش داده و منجر به وقوع تنش اکسیداتیو در گیاه میشود (Goncalvez et al., 2007; Iannelli et al., 2002). اکسیژن فعال با حمله به ترکیبات حیاتی یاخته مانند اسیدهای چرب غیراشباع، پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک منجر به تغییر ویژگیهای حیاتی از جمله سیالیت غشاء، انتقال یونی، فعالیت آنزیمی و سنتز پروتئینها شده و با تخریب هستهای، میتوکندریایی، در نهایت مرگ یاخته یعنی آپوپتوز را ایجاد خواهد کرد (Zhang et al., 2003). رادیکالها با تغییر ماهیت پیوندهای دوگانه اسیدهای چرب غیراشباع، سبب تحریک واکنشهای زنجیره پراکسیداسیون شده که منجر به تخریب اسیدهای چرب و به عبارتی پراکسیداسیون لیپیدها و تخریب اکسیداتیو پروتئینها در جایگاه ویژهای از آمینواسیدها در پروتئین میشوند (Gomez et al., 2004; Shah et al., 2001). برای مقابلـه بـا تنش اکسیداتیو، سیستم حفاظتی ضداکسیدانی بـا راندمان بالا در گیاهان وجود دارد که در برگیرنده آنزیمهای ضداکسیدانی مانند کاتالاز (CAT)، سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، آسکوربات پراکسیداز (APX)، فنل پراُکسیداز (POX) و گایاکل پراکسیداز (GPX) و نیـز سیستم ضداکسیدان غیرآنزیمی شامل آسکوربات، آلفاتوکوفرول، کاروتنوئیدها، ترکیبات فنلی، پرولین و گلوتاتیون است که قادرند رادیکالهای آزاد را از بین برده و یا بی اثر کنند (Shahid et al., 2014, Grill et al, 1985). ترکیبات فنلی با ویژگی ضداکسیدانی با جمعآوری و احیای گونههای فعال اکسیژن از اکسیداسیون مولکولهای زیستی یاخته ممانعت نموده و از بروز تنش اکسیداتیو در یاختههای گیاه جلوگیری میکند (Myung Min et al., 2009; Iannelli et al., 2002). آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز (PAL)، به عنوان آغازگر مسیر فنیل پروپانوئید، فنیلآلانین را با دآمیناسیون به ترانسسینامیک اسید تبدیل کرده که این آنزیم نقش کلیدی در ایجاد ترکیبات فنلی و به کارگیری سازوکار دفاعی غیرآنزیمی به عنوان یک نشانگر بیوشیمیایی دفاعی گیاه در مقابل تنشهای محیطی بر عهده دارد. در این پژوهش جهت بررسی عملکرد سامانه حفاظتی ضداکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی گیاه زعفران در مواجه با سمیت کادمیوم، محتوای پرولین، میـزان فعالیت آنزیمهای CAT،SOD ، PPO، GPX، APX و PALو نیز ترکیبات فنلی در گیاهچههای زعفران مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
پژوهش حاضر در آزمایشگاه تحقیقاتی دانشگاه پیام نور استان کردستان (مرکز سقز) انجام شد. در این پژوهش ، بنههای زعفران از سایت دهکده گشتا خریداری شده و پس از برداشتن پوشش فیبری، بنههای 3 تا 6 گرمی جمعآوری و برای کشت مورد استفاده قرار گرفتند. بـه این منظور بنههای زعفران در خرداد ماه تهیه شده و پس از جدا کردن پوسته رویی و بنههای تحلیل رفته، در محلول بنومیل 2 درصد برای جلوگیری از فعالیت قارچی ضدعفونی شدند. کشت بنهها در محیط کشت مایع به تعداد 4 بنه زعفران در هر گلدان انجام شد، طوری که با افزودن 50 میلی لیتر آب مقطر، تنها بخش پایه بنه در زیر سطح آب قرار گرفت. بنهها در 7 گروه طبقهبندی شدند. گروه اول به عنوان شاهد تنها در حضور آب مقطر رشد کردند. گروه دوم در معرض کلرید کادمیوم 25/0 میلیمولار، گروه سوم، چهارم، پنجم، ششم و هفتم به ترتیب در حضور کلرید کادمیوم 5/0، 1، 2، 5 و 10 میلیمولار رشد کردند. رشد بنهها در دمای اتاق 20 تا 25 درجه سانتیگراد و شرایط 16 ساعت نور و 8 ساعت تـاریکی انجام شد. عصارهگیری از بنههای در حال رشد در فواصل زمانی 0، 5، 10، 20 و 30 روز پس از رشد صورت گرفت. برای تهیه عصاره از بنههای در حال رشد، بنهها را در روزهای مختلف و مشخص از رشد یعنی روزهای 0، 5، 10، 20 و 30 روز به طور جداگانه پس از خارج کردن از محیط رشد با آب مقطر شسته و در حضور بافر فسفات 1/0 مولار با 7= pH و محلول 02/0 فنیل متان سولفونیل فلوراید به عنوان مهارکننده پروتئازی هموژنیزه شد. مخلوط هموژنیزه به مدت 10 دقیقه با دور g3000 سانتریفیوژ شد. رسوب بالایی به مدت نیم ساعت در g15000 سانتریفیوژ شد و محلول شفاف بالایی به عنوان عصاره خام و انجام سنجشهای بعدی یعنی اندازهگیری فعالیت آنزیمهای CAT، SOD، APX، GPX، PAL و PPO مورد استفاده قرار گرفت. جهت اندازهگیری کمی پـروتئین نمونهها از روش Bradford (1976) استفاده شد. اساس روش برادفورد بر اتصال کوماسی برلیانت بلو G250 به پروتئین در محیط اسیدی و خواندن جذب نمونهها در طـول مـوج 595 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مـدلJenway سـاخت کشور انگلستان) انجام شد. غلظت پـروتئین بـا منحنی استاندارد آلبومین گاوی محاسبه و بر حسب میلیگرم بـرگرم محاسبه شد. میزان جذب نوری در 595 نانومتر با غلظت پروتئین نسبت مستقیم دارد.
سنجش فعالیت آنزیم ها
آنزیم پراکسیداز: فعالیت آنزیم با روش Polle و همکاران (1997) اندازهگیری شد. مخلوط واکنش حاوی2400 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم 100 میلیمولار، 100 میکرولیتر گایاکول 18 میلیمولار، 100 میکرولیتر از H2O2 و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی در لوله آزمایش بود. جذب نمونه بر اساس اکسیداسیون گایاکول بـا استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر بـه مدت 2 دقیقـه در طول موج 436 نـانومتر خوانده شد. از محلول واکنش بدون عصاره جهت صفر کردن دستگاه استفاده شد.
آنزیم پلیفنل اکسیداز: برای سنجش فعالیت آنزیم پلیفنل اکسیداز (PPO) از روش Cho & Ahn (1993) استفاده شد. برای اندازهگیری آنزیم پلیفنل اکسیداز مخلوط واکنش شامل 100 میکرولیتر از عصاره آنزیمی، 500 میکرولیتر آب اکسیژنه 5 میلیمولار و 500 میکرولیتر متیل کاتکول 02/0 میلیمولار در 1900 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم60 میلیمولار با 7/6= pH است. افزایش فعالیت آنزیم بر اساس شدت رنگ نارنجی متیل کاتکول تولید شده، در طول موج 410 نانومتر و توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. فعالیت آنزیمی به ازای تغییرات جذب به میکرو‌گرم پروتئین در دقیقه در میلیگرم بیان شد.
فعالیت کاتالاز: فعالیت سینتیکی آنزیم کاتالاز به کمک روش Cakmakو همکاران (1993) اندازهگیری شد. مقدار 20 میکرولیتر از عصاره آنزیمی بـه همراه 400 میکرولیتر از محلول بـافر فسفات سدیم 25 میلیمولار و 300 میکرولیتر H2O2 مخلوط و در طول موج 240 نانومتر سرعت حذف H2O2 به مدت 2 دقیقه انـدازهگیری شد. میزان جذب H2O2 در بافر فسفات 4/0 تنظیم شد که نقطه شروع برای اندازهگیری سینتیک سرعت بود. در این آزمایش 2 میلیلیتر از بافر حاوی H2O2 فاقد عصاره آنزیمی بهعنوان نمونه شاهد برای صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده شد.
آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز: فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز (EC: 1.15.1.1) بر اساس روش پیشنهادی Giannopolitis و همکاران (1997) با اندازهگیری توانایی آن در جلوگیری از احیای نـوری نیترو بلو تترازولیوم کلراید (NBT) اندازهگیری شد. اساس اندازهگیری فعالیت سوپر اکسید دیسموتاز، اثر بازدارندگی این آنزیم بـا احیای نوری NBT است. مخلوط واکنش شامل، 2 میلیلیتر بافرHEPES-KOH 50 میلیمولار با اسیدیته برابر 8/7 حاوی EDTA 1/0 میلیمولار، کربنات سدیم 50 میلیمولار با اسیدیته برابر 2/10،L-methionine 12 میلیمولار، نیتروبلو تترازولیوم 75 میکرومولار، ریبوفلاوین 1 میکرومولار و 200 میکرولیتر عصاره آنزیمی است. نمونهها به مدت 15 دقیقه در شدت نور تقریباً 8000 لوکس (در زیر نور خورشید) قرار گرفت. سپس در طول موج 560 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر مدل Jenway جذب نمونهها خوانده شد.
آنزیم آسکوربات پراکسیداز: فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز به روش Nakano & Asada (1987) اندازهگیری شد. یک میلیلیتر مخلوط واکنش شامل بافر فسفات پتاسیم یک مولار، آسکوربات 10 میلیمولار، پراکسیدهیدرژن 10 میلیمولار و 10 میکرولیتر عصارة خام بود. فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز بر اساس میزان اکسیدشدن آسکوربات در طول موج 290 نانومتر و با ضریب خاموشی cm-1mM-18/2 تعیین شد.
ترکیبات فنلی کل: محتوای ترکیبات فنلی کل با روش Velioglu و همکاران (1998) اندازهگیری شد. 1/0گرم از نمونهها با پنج میلی لیتر متانول 80 درصد حاوی اسیدکلریدریک یک درصد سائیده و به مدت 2 ساعت در دمای اتاق روی همزن عصارهگیری کامل شد. سپس مخلوط حاضر در 3000 سانتریفوژ و از محلول رویی جهت تعیین ترکیبات فنلی کل استفاده شد. به 100 میکرولیتر از محلول رویی 750 میکرولیتر معرف فولین اضافه و مخلوط حاصل به مدت پنج دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد. سپس 750 میکرولیتر کربنات سدیم 6 درصد به آن اضافه و پس از 90 دقیقه جذب هر نمونه در طول موج 725 نانومتر خوانده شد .برای محاسبه غلظت ترکیبات فنلی کل با اسیدگالیک منحنی استاندارد رسم و غلظت ترکیبات فنلی بر حسب میلیگرم بر گرم گزارش شد.
آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز: سنجش فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز از غلظت محصول حاصله یعنی اسیدسینامیک انجام شد (Wang et al., 2007). ابتدا 300 میلیگرم از عصاره ریشه کنگر بـا 5/6 میلیلیتر بافر تریس 50 میلی مولار حاوی بتامرکاپتواتانول 15 میلیمولار در هاون سرد شده سائیده شد. سپس عصارة حاصله بـا دورg 50000 به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجـه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. محلول بالایی برای سنجش فعالیت آنزیمی استفاده شد. برای انجام آن، به100 میکرولیتر از عصاره پروتئین استخراج شده، 600 میکرولیتر بافر پتاسیم فسفات 1/0 مولار با اسیدیته 8 و 300 میکرولیتر محلول فنیلآلانین20 میلیمولار اضافه شد. مخلوط به دست آمده به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت. در ادامه واکنش با اضافه کردن50 میکرولیتر HCl (M5/0) متوقف و محصول حاصل با 15 میلیلیتر اتیل استات استخراج و سپس اتیل‌استات بخار شد. ماده جامد باقیمانده در سه میلیلیتر هیدروکسیدسدیم 5/0 مولار حل شد و غلظت سینامیک اسید با اندازهگیری میزان جذب در طول موج290 نانومتر و با ضریب خاموشی معادل 9500 تعیین شد.
پرولین: برای تعیین مقدار پرولین از روش Bates و همکاران (1973) استفاده شد .ابتدا پنجگرم از نمونههای عصاره ریشه کنگر در10 میلیلیتر اسید سولفوسالسیلیک سه درصد توسط هاونهموژن شده و عصارة بدست آمده صاف شد. بـه 2 میلیلیتر ازعصارة صاف شده حاصله 2 میلیلیتر اسید استیک و 2 میلیلیتر اسیدناینهیدرین (5/0 گرم نـاینهیدرین، 1/2 میلیلیتر اسیداستیک و 8/0 میلیلیتر اسیداُرتوفسفریک 6 مولار) اضافهشد. محلول به دست آمده به مدت یک ساعت در حمام آب و در دمای 100 درجه سانتیگراد قرار گرفت، در ادامه برای پایان یافتنواکنش، لولههای آزمایش در داخل یک بستر یخی قرار گرفتند وچهار میلیلیتر تولوئن به هر لوله اضافه شد.غلظت پرولیننمونهها در تولوئن با اسکپتروفتومتر در طول موج 520 نانومتر و در نهایت با توجه به منحنی استاندارد حاصل ازغلظتهای مختلف پرولین، میزان پرولین نمونهها برحسبمیکرومول بر گرم محاسبه شد.
در این پژوهش برای تعیین حداکثر فعالیت بهینه آنزیمی در ترکیب تیماری کادمیوم با توجه به کمی بودن تیمارها از تجزیه رگرسیون غیرخطی بهره گرفته شد. بدین منظور توابع رگرسیون عیرخطی مورد استفاده در پژوهش حاضر عبارت بودند از:
روش تجزیه و تحلیل: در این پژوهش برای تعیین بهترین سطح پاسخ آنزیم آسکوربات پراکسیداز به سطوح مختلف تیمارهای مورد بررسی با توجه به کمی بودن تیمارها از تجزیه رگرسیون خطی و غیرخطی بهره گرفته شد. توابع رگرسیون مورد استفاده در این پژوهش عبارت بودند از:
مدل رگرسیون ساده خطی، که در آن intercept عبارت است از مقدار Y وقتی x=صفر باشد. Slope نیز شیب تغییرات متغیر Y در برابر متغیر X است. تابع این مدل عبارت است از
رابطه 1 : intercept+ slope
مدل دو تکه ای: که در آن a، عرض از مبداء، b1 و b2 شیب مدل دو دو طرف نقطه چرخش Break point)) و x0، نقطه چرخش مدل یا حداکثر مقدار عددیy است. مقادیر a و b1 همیشه مثبت و مقدار b2 نیز همیشه منفی است. تابع این مدل عبارت است از:
رابطه (2):
if x< x0
y= a+b1x0
if x > x0 then y= a+b1x0 + b2 (x-x0)
مدل نمائی مسطح: این مدل در شرایطی استفاده میشود که مقدار متغیر تابع (فعالیت آنزیم) با گذشت زمان یا در اثر افزایش مقدار یک نهاده یا ماده تحریک کننده کاهش مییابد. تغییر در مقدار Y معمولاً در ابتدا سریع رخ میدهد ولی همچنانکه Y به یک مقدار حداقلی نزدیک میشود، شیب کاهش در مقدار Yنیز به تدریج کاهش مییابد. فرم این مدل عبارت است از رابطه (3):
Y = Ym + (Ym – Y0) × exp (-k × X)
که در آن، Y0 حداقل مقدار Y است که با افزایش در مقدار X، Y به آن نزدیک میشود، Ym حداکثر مقدار Yو k، شیب کاهش مدل است. برای برازش مدلهای رگرسیون غیرخطی و از رویه Proc nlin در محیط نرم افزار SAS (SAS, 2009) از روش مطلوب‌سازی تکراری و نرم افزار GraphPadPrism (1999 ،Motulsky) بهره گرفته شد. در این روش با هر بار وارد کردن مقادیر اولیه فاکتورها، مقادیر نهائی آنها با روش کمترین توانهای دوم تخمین زده میشود و تغییر مقادیر اولیه تا زمانی انجام میشود که بهترین برآورد از فاکتورها به دست آید.
نتایج و بحث
در بررسی فعالیت آنزیمهای ضداکسیدان در حضور کادمیوم، آنزیمهای مورد بررسی، رفتارهای مختلفی را در طول زمان رشد از مرحله بنه تا مرحله گلدهی نشان دادند. دسته اول در برگیرنده آنزیمهای PPO و CAT، دسته دوم شامل آنزیم PAL و دسته سوم شامل آنزیمهای APX و SOD و دسته چهارم شامل آنزیم GPX است. بررسی کمی تأثیر سطوح مختلف کادمیوم بر میزان فعالیت پلیفنل اکسیداز در زمانهای متفاوت عصارهگیری از بنه زعفران نشان دادند پاسخ فعالیت این آنزیم به سطوح مختلف کادمیوم در همه زمانهای عصارهگیری از یک تابع دو تکهای تبعیت میکند (شکل 1). فعالیت آنزیم در تمامی زمانهای نمونهبرداری تا غلظت 10 میلیمولار کادمیوم با شیبهای متفاوت افزایش و سپس در غلظت 10 میلیمولار کادمیوم پس از رسیدن به بیشینه مقدار خود، روند نزولی به خود گرفت. بدین ترتیب که بیشترین شیب کاهش فعالیت آنزیم در زمانی ایجاد شد که بنه 30 روز در معرض کادمیوم قرار گرفت و میزان کاهش 123/0 واحد بر میلیگرم پروتئین بازای هر واحد افزایش در غلظت کادمیوم بود (جدول 1). فعالیت آنزیم در غلظت 5 میلیمولار کادمیوم نسبت به شاهد کمتر بود و در مقابل در سایر غلظتها، افزایش فعالیت PPO مشاهده شد. برخی مطالعات نمایانگر آن است که عملکرد این آنزیم با واکنشهای مرتبط با فتوسنتز، تنفس و سنتز ترکیبات فنلی در ارتباط است. تصور میشود که PPO در مقابله گیاه با تنش کادمیوم نقش دارد. PPO سبب اکسایش ترکیبات فنلی به کوئینونها و در نتیجه کاهش میزان این ترکیبات در بخشهای مختلف گیاهان تحت تنش میشود. این عمل با تغییر سینتیک پراکسایش، منجر به کاهش سیالیت غشاء و ممانعت از انتشار رادیکالهای آزاد شده و در نتیجه مقاومت گیاه نسبت به تنش کادمیوم افزایش مییابد ((Unsal et al., 2020.
تأثیر کادمیوم بر فعالیت GPX نیز به مانند PPO از یک تابع دوتکهای پیروی میکند (شکل 2)، با این تفاوت که بیشینه فعالیت GPX در غلظت 5 میلیمولار کادمیوم به دست آمد و این بدان معنی است که حساسیت فعالیت GPX به سطوح غلظتی کادمیوم بیشتر از PPO است. با افزایش غلظت کادمیوم تا غلظت 5 میلیمولار فعالیت آنزیم در روزهای مختلف نمونهبرداری به ترتیب با شیبهای 0011/0، 0016/0 0014/0 و 0018/0 واحد بر میلیگرم پروتئین بازای هر واحد افزایش در غلظت کادمیوم، برای روزهای 5، 10، 20 و 30 افزایش پیدا کرد و پس از رسیدن به غلظت 5 میلیمولار، واکنش فعالیت آنزیم به افزایش غلظت کادمیوم نزولی شد و بیشینه شیب کاهش همچنان در تیمار مربوط به عصارهگیری پس از 30 روز مشاهده شد (جدول 2). در کل کمترین فعالیت آنزیمی در بنه هائی مشاهده شدند که در معرض تیمار با کادمیوم قرار نداشتند.
شکل 1- تأثیر کادمیوم بر میزان فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز گیاهچههای زعفران.
Figure 1- The effect of cadmium on the activity of polyphenol oxidase enzyme in saffron seedlings.
جدول 1- ضرایب برازش مدل دو تکه ای به تغییرات پلی فنل اکسیداز در سطوح مختلف کادمیوم در روزهای محتلف پس از تیماردهی
Table 1- Fitted Segmented model coefficients of PPO activity vs. different level of Cd on various days level after treatment.
|
R2 |
X0 |
b2 |
|
b1 |
intercept |
Day |
|
91 |
10 |
0.037 |
|
0.053 |
0.489 |
Control |
|
85 |
10 |
0.030 |
|
0.039 |
0.342 |
5 |
|
86 |
10 |
0.070 |
|
0.079 |
0.675 |
10 |
|
87 |
10 |
0.085 |
|
0.093 |
0.849 |
20 |
|
89 |
10 |
0.123 |
|
0.127 |
1.02 |
30 |
جدول 2- ضرایب برازش مدل دو تکهای به تغییرات گایاکل پراکسیداز در سطوح مختلف کادمیوم در روزهای محتلف پس از تیماردهی
Table 2- Fitted Segmented model coefficients of GPX activity vs. different level of Cd on various days level after treatment.
|
R2 |
X0 |
b2 |
|
b1 |
intercept |
Day |
|
|
90 |
5.0 |
0.147 |
|
0.282 |
2.90 |
Control |
|
|
96 |
5.0 |
0.227 |
|
0.380 |
3.76 |
5 |
|
|
98 |
5.0 |
0.241 |
|
0.419 |
4.06 |
10 |
|
|
97 |
5.0 |
0.262 |
|
0.455 |
4.60 |
20 |
|
|
98 |
5.0 |
0.289 |
|
0.522 |
5.10 |
30 |
|
شکل 2- اثر کادمیوم بر میزان فعالیت آنزیم گایاکل پراکسیداز گیاهچه های زعفران.
Figure 2- The effect of cadmium on the activity of guaiacol peroxidase enzyme in saffron seedlings.
برعکس واکنش دو آنزیم GPX و PPO به سطوح مختلف کادمیوم در زمانهای متفاوت در معرض تیماردهی، پاسخ آنزیم SOD به حضور کادمیوم در محیط در تمامی زمانهای نمونهبرداری از یک تابع نمائی مسطح پیروی کرد (شکل 3). بر همین اساس کمینه فعالیت آنزیم در تیمار شاهد و بیشینه فعالیت آنزیم در زمان 30 روز پس از تیماردهی مشاهده شد (جدول 3). ضریب K در مدل، بیانگر شیب افزایش فعالیت آنزیم در مقابل افزایش غلظت کادمیوم در محیط است. بیشترین شیب افزایش فعالی SOD در غلظت 10 میلیمولار و کمترین فعالیت آنزیم مربوط به تیمار شاهد بود. مقادیر بالای ضریب تبیین نیز موید برازش(Curve fitting) مطلوب مدل به دادهای فعالیت آنزیم در سطوح مختلف کادمیوم هستند. همچنین نتایج نشان داد با افزایش قرارگیری بنهها در محیط حاوی کادمیوم، افزایش فعالیت آنزیم نیز به تناسب زمانهای مختلف در شیبهای مختلف به دست آمده است.
گیاهان همواره در طول رشد خود، اکسیژنهای فعال واکنشگر (ROS) را طی انجام فرایندهای متابولیکی در داخل یاختهها، به وجود آورده که برای مقابله با آنها بایستی از مسیرها و سازوکارهای ضداکسیدانی پیچیدهای جهت حذف آنها بهره بگیرند. زیرا درصد تولید اکسیژنهای واکنشگر فراتر از میزان نرمال بوده که مقابله با آن توسط گیاه سخت خواهد بود. عدم حذف اکسیژنهای واکنشگر میتواند به انواع آسیبهای اکسیداتیو از جمله اکسیدشدن رنگدانههای فتوسنتزکننده و نیز خسارت به لیپیدها و پروتئینهای غشایی و تخریب اسیدهای نوکلئیک منجر شود (Laspina et al, 2005). بر این اساس آنزیمهای ضداکسیدان وظیفه مهمی در سازگار نمودن و حفظ گیاهان در طول تنش بر عهده دارند که میزان فعالیت این آنزیمها بسته بـه زمان ایجاد تنش و نـوع تنش، گونه، تیره گیـاه و اینکه در کدام بخش گیاه ایجاد شده، متفاوت است (Dinakar et al, 2009).
شکل 3- اثر کادمیوم بر میزان فعالیت آنزیم سوپر اُکسید دیسموتاز گیاهچه های زعفران
Figure 3- The effect of cadmium on the activity of superoxide dismutase enzyme in saffron seedlings.
جدول 3- ضرایب برازش مدل نمائی مسطح به تغییرات سوپر اکسید دسموتاز در سطوح مختلف کادمیوم در روزهای محتلف پس از تیماردهی
Table 3- Fitted Segmented model coefficients of SOD activity vs. different level of Cd on various days level after treatment.
|
R2 |
K |
|
Y0 |
Ym |
Day |
|
97 |
0.480 |
|
2.23 |
3.18 |
Control |
|
96 |
1.105 |
|
3.30 |
5.41 |
5 |
|
98 |
0.744 |
|
3.57 |
6.86 |
10 |
|
98 |
0.621 |
|
3.82 |
7.26 |
20 |
|
99 |
0.586 |
|
4.32 |
7.47 |
30 |
آنچه مشخص است این است که در حضور غلظتهای کادمیوم بالاتر از 5/0 میلیمولار، تولید ترکیبات سمی ROS افزایش یافته و گیاه زعفران به منظور حذف رادیکالهای تخریبگر و مقابله با آن، رویکرد افزایش تولید و القاء هر چه بیشتر آنزیمهای ضد اکسیدانی را در پیش گرفته است (Tian et al., 2007). نتایج آزمایشات Zhang و همکاران (2003) بر گیاهان ماش علوفه‌ای و ماش سبز نشان دادند غلظت 100 میکرومولار کادمیوم تولید آنیون پراکسید، پراکسید هیدروژن و همچنین فعالیت NADH اکسیداز پیوند یافته با غشای پلاسمایی و فعالیت‌های SOD و APX آپوپلاستی و سیم پلاستی را در برگ‌های هر دو گیاه فوق افزایش داد Zhang et al., 2003)). SOD اولین و مهمترین آنزیم در فرآیند سمیتزدایی ترکیبات ROS اسـت کـه بـا تبدیل رادیکال سوپراکسید ( (O2-به H2O2 در سیتوزول، کلروپلاست و میتوکندری، نقش مهمی در سازوکارهای دفاعی یاخته در مقابل خطر ایجاد رادیکال هیدروکسیل (OH) بر عهده دارد. آنزیم SOD حمایتکننده گیاهان در شرایط تنش فلزات سنگین، برای مقابله با گونههای فعال اکسیژن تولیدی در شرایط تنش میباشد Barandeh & Kavousi, 2016)). با توجه به شکل 1 با افزایش میزان کادمیوم، فعالیت سوپراکسید دیسموتاز افزایش یافته که نشاندهنده تولید گونههای فعال اکسیژن در گیاه است، بنابراین SOD با تجزیه رادیکالهای فعال اکسیژن به H2O2 تأثیر سمیت و تخریب‌کنندگی آنها را از بین میبرد. تنظیم سطح گونههای فعال اکسیژن توسط SOD، مسیر حفاظتی با اهمیتی در برابر تـنش اکسیدی در یاخته است، زیـرا O2- به عنوان پیشساز برای مشتقات سمیتر یا مخربتری مانند پر اکسید نیتریت یا HO-است (Khatun et al., 2008). افزایش غلظت فلز سنگین کادمیوم در محیطهای رشد گیاهانی مانند Achnatherum inebrians (Zhang et al., 2010)، توت سفید (Tewari et al., 2008) و نیز لوبیا (Ahmadvand et al., 2013) با افزایش فعالیت و القاء فعالیت سوپر اکسید دیسموتاز همراه است (Barandeh & Kavousi, 2016) در مجموع، SOD، از منابع تولید پراکسیدهیدروژن در یاختههای گیاهی است که از مسیر دیسموتاسیون سوپر اکسید منجر به تولید H2O2میشود. نتایج حاصله از پژوهش Jafarhaddadian و همکاران (2021) نقش آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز در کنترل میزان ROS و افزایش تحمل گیاه به تنش کادمیوم را نشان دادند که پژوهش انجام شده تائیدکننده این مهم است .نتایج تأثیر سطوح مختلف کادمیوم بر میزان فعالیت کاتالاز در زمانهای متفاوت عصارهگیری از بنه زعفران نیز نشان دادند پاسخ فعالیت این آنزیم به سطوح مختلف کادمیوم در همه زمانهای عصاره گیری از یک تابع دوتکهای تبعیت میکند (شکل 4). فعالیت آنزیم در تمامی زمانهای نمونه برداری تا غلظت 10 میلیمولار کادمیوم با شیبهای متفاوت افزایش و سپس در غلظت 10 میلیمولار کادمیوم پس از رسیدن به بیشینه مقدار خود، روند نزولی بخود گرفت. بدین ترتیب که بیشترین شیب کاهش فعالیت آنزیم در زمانی ایجاد شد که بنه 30 روز در معرض کادمیوم قرار گرفت و میزان کاهش 0023/0 واحد بر میلیگرم پروتئین بازای هر واحد افزایش در غلظت کادمیوم بود (جدول 1). فعالیت آنزیم کاتالاز به طور مشابه با پلیفنل اکسیداز در غلظت 5 میلیمولار کادمیوم نسبت به شاهد کمتر بود و در مقابل در سایر غلظتها، افزایش فعالیت کاتالاز مشاهده شد. پراکسید هیدرژن حاصله در مرحله بعدی توسط آنزیمهایی نظیر کاتالار حذف میشود ((María et al, 2005. در ادامه فعالیت آنزیم CAT بعنوان آنزیم تاثیرگذار در تجزیه پراکسیدهیدرژن، تحت تنش کادمیوم در بنه زعفران افزایش پیدا کرد. در نتیجه با افزایش فعالیت CAT، پِراکسیدهیدروژن با شکستن آن به آب و اکسیژن، حذف میشود. هر چند که پراکسیدهیدروژن در غلظتهای بالا از خود سمیت نشان میدهد و بـه واسطه CAT و APX و سیکل ضداکسیدانی آسکوربات گلوتاتیون از بین میرود، ولی در غلظتهای کم، سیگنالی جهت فعالکردن ژنهای وابسته به مقاومت در گیاه را بر عهده دارد (Unyayar et al., 2005). آنالیز آماری دادههای حاصل از اندازهگیری فعالیت آنزیم کاتالاز با روش ANOVA یکطرفه نشان داد که فعالیت آنزیم در گیاهچههای زعفران تیمار شده بـا کادمیوم در مقایسه بـا کنترل معنیدار (05/0P≤) است. تیمار با غلظتهای مختلف کادمیوم موجب افزایش فعالیت CAT نسبت بـه کنتـرل شد. در بررسی تأثیر کادمیوم بر فعالیت CAT (شکل 2) در روزهای مختلف صفر، 5، 10، 20 و 30 روز پس از کشت، پروفایل یکسانی را نشان میدهد. طوری که در بنه زعفران در روز صفر و در عدم حضور کادمیوم، فعالیت U/mg Protein 02/0 را نشان میدهد و فعالیت CAT در روز 5 ام از کشت به U/mg Prot. 011/0 کاهش داشت. به تدریج با گذشت زمان رشد بنه و ایجاد ساقه در روز دهم، فعالیت CAT دوباره افزایش داشت و به U/mg Prot. 021/0 رسید. فعالیت CAT در روز 30 ام رشد یعنی زمان گلدهی به بیشترین میزان یعنی U/mg Protein 032/0 رسید. با افزایش غلظت کادمیوم از 25/0 تا 10 میلیمولار در روزهای مختلف، فعالیت CAT افزایش یافت، طوری که بیشترین میزان فعالیت آنزیم در روز سیام و در حضور غلظت 10 میلیمولار کادمیوم و تا اندازه U/mg Protein 052/0 پروتئین به دست آمد، در حالیکه افزایش بیشتر کادمیوم از 10 تا 20 میلیمولار با کاهش شدید فعالیت CAT در روزهای مختلف همراه بود و در روز 30 ام ، فعالیت آنزیم به U/mg Protein 03/0 کاهش داشت. با توجه به نتایج، کاتالاز با غلبه بر تنش اکسیداتیو به واسطه سمزدایی H2O2، از تولید رادیکال هیدروکسیل ممانعت و از پروتئینها، اسیدهای نوکلئیک و چربیها در برابر ROS محافظت میکند (Rastgoo & Alemzadeh, 2011). در این پژوهش فعالیت کاتالاز در معرض تنش کادمیوم افزایش داشت که علّت آن نقش حفاظتی آنزیم در کنترل و تنظیم H2O2، O2-و مکمل بودن نقش کاتالاز در کنار نقش سوپر اکسیددیسموتاز در متابولیسم یاخته است .افزایش در فعالیت کاتالاز و سوپر اکسیددیسموتاز به واسطه سمیت کادمیوم در یونجه یکساله توسط Mohammadi و همکاران (2011) نیز گزارش شده است.
شکل 4- تأثیر کادمیوم بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز گیاهچههای زعفران.
Figure 4- The effect of cadmium on the activity of catalase enzyme in saffron seedlings.
جدول 4- ضرایب برازش مدل دو تکه ای به تغییرات کاتالاز در سطوح مختلف کادمیوم در روزهای مختلف پس از تیماردهی
Table 4- Fitted Segmented model coefficients of CAT activity vs. different level of Cd on various days level after treatment.
|
R2 |
X0 |
b2 |
|
b1 |
intercept |
Day |
|
|
91 |
10 |
0.0019 |
|
0.0014 |
0.017 |
Control |
|
|
85 |
10 |
0.0006 |
|
0.0011 |
0.010 |
5 |
|
|
92 |
10 |
0.0013 |
|
0.0016 |
0.017 |
10 |
|
|
87 |
10 |
0.0016 |
|
0.0014 |
0.027 |
20 |
|
|
88 |
10 |
0.0023 |
|
0.0018 |
0.035 |
30 |
|
در این پژوهش، تأثیر کادمیوم بر فعالیت آسکوربات پراکسیداز نیز به مانند پلیفنل اکسیداز، گایاکل پراکسیداز و کاتالاز از یک تابع دوتکهای پیروی کرد (شکل 5). با افزایش غلظت کادمیوم تا غلظت 10 میلیمولار فعالیت آنزیم در روزهای مختلف نمونهبرداری به ترتیب با شیب های: 269/0، 280/0 314/0 و 265/0 واحد بر میلیگرم پروتئین بازای هر واحد افزایش در غلظت کادمیوم، برای روزهای 5، 10، 20 و 30 افزایش پیدا کرد و پس از رسیدن به غلظت 10 میلیمولار، واکنش فعالیت آنزیم به افزایش غلظت کادمیوم نزولی بود و بیشینه شیب کاهش مربوط به عصارهگیری پس از 30 روز حاصل آمد (جدول 5). در کل کمترین فعالیت آنزیمی در بنههایی مشاهده شد که در معرض تیمار با کادمیوم قرار نداشتند.
فعالیت آنزیم ضداکسیدان آسکوربات پراکسیداز (APX) در اثر تنش کادمیوم به طور معنیداری افـزایش پیدا کرد. بهطور معمول فعالیت آنزیم APX به موازات سایر آنزیمهای ضداکسیدان در پاسخ به عوامل تنشزای محیطی افـزایش مییابد. آنزیم CAT و APX هر دو در حذف سمیت پراکسید هیدروژن نقش دارند با این تفاوت که CAT در پراکسیزوم یاختهها واقع شده و قادر به حذف H2O2 از محیط است. بنابراین H2O2 تولید شده در اندامکهای دیگر یاخته و سیتوزول به وسـیله APX از محیط حذف میشوند. نتایج حاصل از این پژوهش نشان دادند بـه موازات افزایش فعالیت آنزیم SOD، فعالیت آنزیم APX نیز افزایش مییابد (Mittler et al., 2002). APX از آسکوربات به عنوان پیش ماده احیاکننده استفاده نموده و H2O2را از روش سیکل آسکوربات-گلوتاتیون تجزیـه میکند. در این سیکل با فعالیت آنزیمAPX ، آسکوربات بـه مونو دهیدروآسکوربات اکسید شده و برای ادامه چرخه، سنتز مجدد آسکوربات ضروری اسـت. بنابراین طی این فرایند، آنزیمهای مونو دهیدروآسکوربات ردوکتاز، دهیدروآسکوربات ردوکتاز و گلوتاتیون ردوکتاز فعالیت نموده و با از NAD(P)Hو گلوتاتیون، مجدداً در یاخته آسکوربات را سنتز میکنند (Mittler et al., 2002). افزایش در فعالیت CAT و APX درگیاهچههای زعفران قابل انتظار بود، به این علّت که افزایش در فعالیت SOD سبب تولید H2O2 شده که در ادامه باید به کمک این آنزیمها برای سمیت زدایی از محیط حذف شوند، تـا وضعیت پتانسیل و احیای یاخته حفظ شود. بنابراین در شرایط ایجاد تنش در حضور کادمیوم افزایش فعالیت SOD بـه تنهایی قادر به حفاظت از گیاه در برابر خطر رادیکالهای اکسیژن نخواهد بود و افزایش فعالیت دیگر آنزیمها مانند CAT و APX جهت حذف سمیت H2O2 ضروری است. در پژوهشهای انجام شده دیگر بر روی گیاه گلرنگ، نتایج نشاندهنده افزایش فعالیت کاتالاز، پراکسیداز و سوپر اکسیددیسموتاز تحت تنش نیتراتکادمیوم است (Badpa et al., 2015).
شکل 5- تأثیر کادمیوم بر میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز گیاهچههای زعفران
Figure 5- The effect of cadmium on the activity of ascorbat peroxidase enzyme in saffron seedlings.
جدول 5- ضرایب برازش مدل دو تکه ای به تغییرات آسکوربات پراکسیداز در سطوح مختلف کادمیوم در روزهای محتلف پس از تیماردهی
Table 5- Fitted Segmented model coefficients of APX activity vs. different level of Cd on various days level after treatment.
|
R2 |
X0 |
b2 |
|
b1 |
intercept |
Day |
|
|
90 |
10 |
0.340 |
|
0.269 |
2.64 |
Control |
|
|
95 |
10 |
0.402 |
|
0.280 |
3.42 |
5 |
|
|
95 |
10 |
0.545 |
|
0.314 |
4.41 |
10 |
|
|
92 |
10 |
0.502 |
|
0.265 |
4.89 |
20 |
|
|
86 |
10 |
0.549 |
|
0.289 |
5.74 |
30 |
|
نتایج حاصل از تأثیر کادمیوم بر میزان فعالیت آنزیم PAL موید پاسخ دوتکه ای این آنزیم به سطوح مختلف کادمیوم در محیط بود (شکل 6). فعالیت PAL در بنههای قرار گرفته در غلظت 10 میلیمولار کادمیوم اگرچه به بیشینه فعالیت خود رسید، امّا میزان این فعالیت در زمانهای مختلف عصارهگیری متفاوت بود و بیشینه آن در بنهها، پس از 30 روز قرارگیری در معرض کادمیوم مشاهد شد. شیب افزایش فعالیت این آنزیم نیز در همین زمان نمونهبرداری بیشتر از سایر بنههایی بود که کمتر در معرض تنش فلز سنگین کادمیوم قرار گرفته بودند (جدول 6). شیب کاهش فعالیت آنزیم پس از نقطه چرخش مدل در غلظت 10 میلیمولار، در بنههای قرارگرفته به مدت 30 روز درمعرض کادمیوم نیز بیشتر از دیگر زمانهای نمونهبرداری بود و این نشانگر حساسیت بیشتر فعالیت PAL به حضور کادمیوم در محیط پس از عبور از غلظت10 میلیمولار در محیط است. پژوهشهای انجام شده بر روی گیاه بابونه تحت تنش کادمیوم و مس نشان دادند با افزایش فعالیت PAL همراه بوده است (Kovacik & Backor, 2007). در واقع آنزیم PALبعنوان آغـازگر مسـیر فنیل پروپانوئیـد، فنیلآلانین را با دآمینهکردن به ترانسسینامیک اسید تبدیل میکند (Solecka, 1997). بنابراین میتوان گفت افزایش فعالیت آنزیم PAL راهکاری سلولی در جهت واکنش و مقابله با تنشهای حاصله در گیاه است، زیرا ویژگی به داماندازی رادیکالهای اکسیژن را از ترکیبات فنلی تولید شده از خود بروز میدهد (Tian & Lee, 2007).
شکل 6- تأثیر کادمیوم بر میزان فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز گیاهچههای زعفران.
Figure 6- The effect of cadmium on the activity of Phenylalanine ammonia-lyase enzyme in saffron seedlings.
جدول 6- ضرایب برازش مدل دو تکهای به تغییرات فنیل آلانین آمونیالاز در سطوح مختلف کادمیوم در روزهای محتلف پس از تیماردهی
Table 6- Fitted Segmented model coefficients of PAL activity vs. different level of Cd on various days level after treatment.
|
R2 |
X0 |
b2 |
|
b1 |
intercept |
Day |
|
|
98 |
10 |
0.015 |
|
0.0129 |
0.143 |
Control |
|
|
94 |
10 |
0.014 |
|
0.0125 |
0.115 |
5 |
|
|
92 |
10 |
0.013 |
|
0.0101 |
0.106 |
10 |
|
|
99 |
10 |
0.015 |
|
0.0127 |
0.172 |
20 |
|
|
95 |
10 |
0.017 |
|
0.0111 |
0.239 |
30 |
|
آنالیز آماری دادههای حاصل از اندازهگیری میزان ترکیبات فنلی نیز نشان دادند پاسخ میزان تجمع این ترکیبات به سطوح مختلف کادمیوم از یک تابع رگرسیون خطی ساده پیروی میکند (شکل 7). بدین معنی که با افزایش غلظت کادمیوم در محیط بر میزان محتوای فنلی بنه افزوده میشود و بیشترین شیب افزایش در تیمار 30 روزه تحت تنش کادمیوم بود. این افزایش برابر 16/2 میلیگرم در گرم بازای هر واحد افزایش در غلظت کادمیوم حاصل آمد. این افزایش، وابسته بـه غلظت و وابسته به زمان رشد گیاهچههای زعفران بـود، طوریکه مقدار ترکیبات فنلی در 20 میلیمولار به بالاترین مقدار خود رسید. کمترین افزایش تجمع ترکیبات فنلی نیز در تیمار شاهد مشاهده شد (جدول 7). محتوای ترکیبات فنلی در زمان گلدهی افزایش بیشتر و قابل توجهی نسبت به سایر روزها از خود بروز میدهد. ترکیبات فنلی به عنوان یکی از ترکیبات ضداکسیدان دارای سازوکارهای مختلفی از جمله ربایش رادیکالهای آزاد، خاموشکردن اکسیژنهای فعال، شلات نمودن یونهای فلزی هستند (Barandeh & Kavousi, 2016). این ترکیبات فنلی به عنوان پیشماده آنزیمهای پراکسیداز، با نقش ضد اکسیدانی خود با انتقال سریع هیدرژن به رادیکالهای لیپیدی، از ادامه زنجیره پراکسیداسیون لیپیدها جلوگیری میکنند (Chu et al., 2000). سنتز ترکیبات فنلی در شرایط طبیعی در یاخته صورت میگیرد، هرچند که تنشهای محیطی مقدار آنها را در یاخته تغییر میدهد. نتایج این پژوهش نشان داد میزان محتوای ترکیبات فنلی در زمان گلدهی افزایش بیشتر و قابل توجهی را نسبت به سایر روزها از خود بروز میدهد. همچنین افزایش ترکیبات فنلی از غلظت صفر کادمیوم تا غلظت 10 میلیمولار کادمیوم با شیب یکسانی در حال افزایش است، در حالی که در غلظت 20 میلیمولار میزان ترکیبات فنلی افزایش شدیدتری را نشان میدهند. افزایش میزان ترکیبات پلیفنلی در گیاه Albizia procera و گیاه چمن شور (Aeluropus littoralis) قرارگرفته در معرض تنش کادمیوم گـزارش شده است (Pandey & Tripathi, 2011; Rastgoo & Alemzadeh, 2011). براساس نتایج این پژوهش یعنی از یک طرف افزایش تولید ترکیبات فنلی و رشد فعالیت PALدر گیاهچههای زعفران در معرض تنش کادمیوم و از سوی دیگر افزایش ترکیبات مختلف فنلی حاصل از فعالیت PAL به واسطه مسیر فنیل پروپانوئید، میتوانند به عنوان عوامل ضد اکسیدان غیرآنزیمی، نقش مهمی در جهت مقابله گیاه زعفران در برابر تنش کادمیوم بر عهده داشته باشند. در واقع وقتی غلظت کادمیوم کم باشد، تولید اکسیژن واکنشگر در زعفران از طریق افزایش فعالیت پراکسیدازها خنثی شده که احتمالاً یک راهکار دفاعی عمومی برای جلوگیری از سمیت حاصل از متابولیتهای حدواسط خواهد بود. زمانی که غلظت کادمیوم از غلظت10 تا 20 میلیمولار باشد، گیاه در این شرایط با کاهش فعالیت ضد اکسیدانی مواجه خواهد بود. زیرا کادمیوم در غلظت بالا، به علّت تولید ترکیباتROS ، کارکرد سیستم دفاع ضد اکسیدانی آنزیمی را کاسته و سبب تداخل در ظرفیت متابولیکی گیاه میشود (Javad Hassan et al., 2020 )
تغییرات در میزان پرولین تحت تنش کادمیوم مشابه با ترکیبات فنلی و نیز پاسخ آنزیم SOD به حضور کادمیوم در محیط در تمامی زمانهای نمونهبرداری و متفاوت با سایر آنزیمها از یک تابع نمائی مسطح پیروی میکند (شکل 7). بر همین اساس کمینه فعالیت آنزیم در تیمار شاهد و بیشینه فعالیت آنزیم در زمان 30 روز پس از تیماردهی مشاهد شد (جدول 7). مقدار ضریب K در مدل بیانگر شیب افزایش فعالیت آنزیم در مقابل افزایش غلظت کادمیوم در محیط است. مقدار آن برعکس آنزیم SOD در تیمار شاهد بیشترین بود. این نشان میدهد که میزان تجمع پرولین در زمانهای اولیه قرارگیری در معرض کادمیوم بیشتر از زمانهایی بوده است که بنه به مدت بیشتری در معرض تنش کادمیوم قرار گرفته است. به عبارت دیگر سطح تجمع پرولین به محض قرارگیری بنه در معرض تنش کادمیوم، افزایش سریع یافته و تداوم قرارگیری آن در معرض کادمیوم با شیب کمتری سبب افزایش پرولین خواهد شد.
شکل 7- تأثیر کادمیوم بر میزان محتوای ترکیبات فنلی گیاهچههای زعفران.
Figure 7- The effect of cadmium on the content of phenolic compounds in saffron seedlings.
جدول 7- ضرایب برازش مدل رگرسیون خطی ساده به تغییرات کل محتویات فنلی در سطوح مختلف کادمیوم در روزهای محتلف پس از تیماردهی
Table 7- Fitted Linear regression model coefficients of total phenol activity vs. different level of Cd on various days level after treatment.
|
Pvalue |
R2 |
|
slope |
intercept |
Day |
|
0.001 |
94 |
|
1.40 |
35.86 |
Control |
|
0.001 |
96 |
|
1.63 |
38.88 |
5 |
|
0.001 |
95 |
|
1.77 |
43.30 |
10 |
|
0.001 |
93 |
|
1.84 |
46.88 |
20 |
|
0.001 |
96 |
|
2.16 |
51.06 |
30 |
شکل 8- تأثیر کادمیوم بر میزان محتوای پرولین گیاهچههای زعفران.
Figure 8-The effect of cadmium on the proline content of saffron seedlings.
جدول 8- ضرایب برازش مدل نمائی مسطح به تغییرات پرولین در سطوح مختلف کادمیوم در روزهای محتلف پس از تیماردهی
Table 8- Fitted Segmented model coefficients of Proline activity vs. different level of Cd on various days level after treatment.
|
R2 |
K |
|
Y0 |
Ym |
Day |
|
99 |
0.524 |
|
11.01 |
62.93 |
Control |
|
99 |
0.44 |
|
16.37 |
69.06 |
5 |
|
99 |
0.39 |
|
28.47 |
72.48 |
10 |
|
99 |
0.37 |
|
33.13 |
75.49 |
20 |
|
98 |
0.30 |
|
53.96 |
79.01 |
30 |
تجمع پرولین بـهعنوان یک اسمولیت، جاروبکننده رادیکالها، تثبیتکننده ماکرومولکولها در گیاهانی که در معرض تنش هستند با کاهش دادن صدمات غشایی در یاخته و کاستن پتانسیل اسمزی سیتوپلاسمی مرتبط است (Smirnoff & Cumbes, 1989; Barandeh & Kavousi, 2016; Wallace, 1987; Levitt, 1980; Jain et al., 2001).
پرولین در زمان تنش در گیاهان توسط فلزات سنگین، افزایش یافته تا نقش حفاظت از فرم طبیعی پروتئینها را انجام دهد و از تغییر ماهیت ساختاری ترکیبات آنزیمی ممانعت کند. همچنین پرولین به عنوان یک شلاتهکننده (chelating agents)، فلزات از پراکسیداسیون لیپیدها جلوگیری و غشاء را محافظت میکند (Matysik et al., 2002; Siripornadulsil et al., 2002; Hayat et al., 2012 ). نتایج مشابه پژوهش حال حاضر توسط آزمایشات Zhangو همکاران (2003) بر گیاهان ماش علوفه‌ای و ماش سبز تأئید شد که نتایج این پژوهشگران نیز افزایش فعالیت GPX آپوپلاستی در برگ‌های هر دو گونه بهطور معنیداری نشان میدهد، به نحوی که در ماش سبز (غلظت 100 میکرومولار کادمیوم)، فعالیت آنزیمهای پاداکساینده مثل APX، GPX و گلوتاتیون ردوکتاز افزایش نشان دادند (Pietrini et al., 2003). نتایج Manzoor و همکاران (2022) نشان دادند در حضو کادمیوم، میزان فتوسنتز در پاسخی به کاهش کلروفیل در گیاهان مورد تیمار کادمیوم کاهش مییابد، زیرا کادمیوم در فعالیت آنزیمهای مسیرها و چرخههای مختلف آنابولیمی و کاتابولیسمی و تثبیت سولفات اختلال ایجاد نموده و سبب تولید انواع اکسیژن فعال میشود. این رادیکالهای آزاد اکسیژن تولید شده احتمالاً با حمله به آنزیمهای ضداکسیدان و آسیبهای اکسیداتیو موجب مهار فعالیت GPX میشوند Manzoor et al., 2022)).
نتیجه‌گیری
در پژوهش حال حاضر تنش به وجود آمده در زعفران توسط فلز سنگین کـادمیوم با افـزایش فعالیت تمامی آنزیمها به طور متفاوت تا غلظتهای خاصی همراه بود کـه این افزایش حاکی از ایجاد رادیکالهای واکنشگر در گیاهچههای زعفران است که خود حاصل متابولیسم هوازی یاخته‌ای هستند. پاسخ فعالیت آنزیمهای پلیفنل اکسیداز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، فنیل آلانین آمونیالاز و گالایکل پراکسیداز به سطوح مختلف کادمیوم از یک تابع دو تکهای، پاسخ تجمع ترکیبات فنلی از تابع رگرسیون خطی و پاسخ سوپراکسید دسموتاز و تجمع پرولین به صورت تابع نمائی مسطح بود. براساس نتایج این پژوهش یعنی افزایش تولید ترکیبات فنلی و رشد فعالیت PALدر گیاهچههای زعفران در معرض تنش کادمیوم و همچنین افزایش ترکیبات مختلف فنلی حاصل فعالیتPAL به واسطه مسیر فنیل پروپانوئید، میتواند به عنوان یک بخش ضد اکسیدان غیرآنزیمی، نقش مهمی در جهت مقابله گیاه زعفران در برابر تنش کادمیوم بر عهده داشته باشد. در واقع وقتی غلظت کادمیوم کم باشد، تولید اکسیژن واکنشگر در زعفران با افزایش فعالیت پراکسیدازها خنثی شده که احتمالاَ یک راهکار دفاعی عمومی برای جلوگیری از سمیت حاصل از متابولیتهای حدواسط خواهد بود.
)