نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 کارشناسارشد، بیوتکنولوژی و ژنتیک مولکولی محصولات باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج
2 دانشیار، گروه علوم و مهندسی باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج
3 استادیار، گروه علوم و مهندسی باغبانی، مرکز پژوهشی اصلاح و توسعهی گیاهان دارویی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Satureja avromanica Maroofi. is an endemic and endangered medicinal plant. In order to in vitro propagation of this plant, an experiment was performed in two phase. The first phase was performed as a factorial based on completely randomized design. The first factor included four concentrations of simvastatin (0, 5, 10 and 20 µmol) and second factor included four concentrations of salicylic acid (0, 0.1, 0.3 and 0.5 mmol). Shoot tips were used as micro explants and MS culture media was used as stock culture media for all treatments. After 45 days from culture of micro explants, viability of micro explants, percentage of dry weight, number and length of stem, leaf area, content of chlorophyll a, b and total chlorophyll, carotenoid, proline, total phenol and total soluble protein were evaluated. In the second phase, the effects of three levels of IBA (0, 0.5 and 1 μmol) on percentage of rooted sample, root length and number of roots were investigated. Results indicated that micro explants that were subjected under interaction of high concentrations of simvastatin and salicylic acid were burned. The most of studied traits were affected significantly by simvastatin and salicylic acid. Maximum mean of dry weight percentage, proline and total phenol were observed in explants treated with 0.3 mmol SA+ 5µmol SS. The highest of stem length was related to 10 µmol SS treatment and the maximum of chlorophyll, carotenoid and total soluble protein were observed in explants treated with 20 µmol SS. Among the applied treatments for stimulation of rooting, 0.5 μmol IBA was the most effective treatment.
کلیدواژهها [English]
مرزه (Satureja sp.) یکی از مهم ترین گیاهان دارویی خانوادۀ نعناع (Lamiaceae) است که بهطور خام یا فرآوریشده به عنوان تسکیندهندۀ درد دندان، آرامبخش، ضدعفونیکننده، ضدنفخ، خلطآور، اشتهاآور، ضداسهال، مقوی قوای جنسی و ضداسهال در صنایع مختلف استفاده میشود (Omidbaigi, 2005). حدود 16 گونه از این جنس در ایران گزارش شده که 10 گونۀ آن ازجمله مرزۀ اورامانی (S. avromanica Maroofi) اندمیک ایران است (Jamzad, 2012). تنها در محدودۀ کوچکی از اورامانات استان کردستان حدود 150 بوته مرزۀ اورامانی رویش دارد و بهشدت در معرض خطر انقراض است (Khorshidi et al., 2017). محتوای اسانس این گونه 4/1 درصد و ترکیب غالب اسانس آن، تیمول است (Hooshidary et al., 2017). بذرهای مرزۀ اورامانی قدرت جوانهزنی بسیار کم و قلمههای علفی این گیاه توان ریشهزایی بسیار اندکی دارند (Khorshidi et al., 2017)؛ ازاینرو، ضروری به نظر میرسد برای حفظ این گونۀ گیاهی و جلوگیری از انقراض آن یا به عبارتی، در راستای حفاظت برونجای (Ex-situ conservation) این گونۀ اندمیک، مطالعههای بیشتری دربارۀ روش بهینۀ تکثیر آن انجام شوند. مطالعههای اندکی در زمینۀ روشهای تکثیر این گیاه ازجمله کشت درونشیشهای (in vitro) آن انجام شده است. Mozafari و همکاران (2015) در پژوهشی به مطالعۀ تأثیر محیطکشتهای موراشیگ و اسکوگ (MS) و محیطکشت گیاهان چوبی (WPM) حاوی نسبتهای مختلف تنظیمکنندههای رشد بر باززایی مرزۀ اورامانی پرداختند و مشاهده کردند بیشترین تعداد شاخۀ باززاییشده روی محیط MS حاوی 2 میلیگرمدرلیتر بنزیلآدنین (BA) به وجود میآید؛ درحالیکه بیشترین طول شاخساره در محیط MS حاوی 2 میلیگرمدرلیتر تیدیازورون (TDZ) ایجاد میشود. بر اساس گزارش Karimi و همکاران (2014)، محیطکشت MS حاوی 5/0 میلیگرمدرلیتر 2 و 4- دیکلروفنوکسیاستیکاسید (2,4-D)، 5/0 میلیگرمدرلیتر بنزیلآمینوپورین (BAP) و 5/0 میلیگرمدرلیتر نفتالیناستیکاسید (NAA) مناسبترین محیطکشت برای باززایی مرزۀ اورامانی است. در دهههای اخیر، تولید و تکثیر گیاهان در شرایط درونشیشهای بهویژه گونههایی که تکثیر آنها با سایر روشها امکانپذیر نیست یا درصد موفقیت آن کم است، رواج زیادی یافته است. تکثیر در شرایط درونشیشهای راهکار مطلوبی برای تولید سریع و انبوه گونههای گیاهی و بهدستآوردن گیاهان یکنواخت به شمار میآید که امروزه با عنوان فرایندی ضروری در زیستفناوری و اصلاح از آن یاد میشود (Sadeghian et al., 2014).
استفاده از محرکهای زیستی (Elicitors) در فرایند تولید و تکثیر گیاهان و بهبود عملکرد کمّی و کیفی آنها رواج بسیاری یافته است. این ترکیبات از طریق فعالسازی و تحریک بیان ژنها موجب افزایش تولید برخی آنزیمها و نهایتاً ترکیبات مختلفی میشوند که درمجموع، رشد و نمو گیاه را بهبود میبخشند و به افزایش سنتز متابولیتهای اولیه و ثانویه منجر میشوند (Howlett, 2006)؛ همچنین این ترکیبات بهشکل مولکولهای پیامرسان در گیاه عمل میکنند و موجب فعالشدن سیستم دفاعی گیاه میشوند (Zhao et al., 2005)؛ سالیسیلیکاسید و استاتینها ازجملۀ این ترکیبات به شمار میآیند. سالیسیلیکاسید، ترکیبی فنولی است که با تأثیر بر فتوسنتز، تنفس، هدایت روزنهای، تعرق و جذب و انتقال یونها بر رشد و نمو گیاهان تأثیر میگذارد (Popova et al., 2003). تأثیر مثبت سالیسیلیکاسید بر رشد و نمو گیاهان در مطالعههای متعددی گزارش شده است (Gharib, 2006; Eraslan et al., 2007; .Hussein et al., 2007; Idrees et al., 2011; .Zahra et al., 2011; Hashmi et al., 2012; .Hesami et al., 2012; Rahimi et al., 2013; .Divya et al., 2014; Ghaderi et al., 2015; Mozafari et al., 2018).
استاتینها با مهار آنزیم HMG-CoAردوکتاز موجب کاهش تولید ترکیبات مسیر موالونات و برعکس، افزایش تولید ترکیبات مسیر مستقل از موالونات میشوند و از این طریق بر رشد و نمو گیاهان تأثیر میگذارند (Zieden and Olsson, 2005). مطالعههای بسیار اندکی دربارۀ تأثیر استاتینها بر رشد و نمو گیاهان انجام شدهاند. در پژوهشی که Laule و همکاران (2003) روی گیاه آرابیدوپسیس انجام دادند، گزارش کردند کاربرد لواستاتین (Lovastatin) که بازدارندۀ مسیر موالونات است، موجب افزایش تولید کاروتنوئیدها و کلروفیل میشود؛ همچنین در گزارش دیگری آمده است لواستاتین موجب کاهش سنتز کاروتنوئید در گیاه گوجهفرنگی میشود (Rodriguez-concepcion and Gruissem, 1999).
ازآنجاکه مرزۀ اورامانی گیاهی دگرگشن است و هر بوتۀ آن مانند رقمی مستقل واکنشهای متفاوتی به محیطکشتها و محرکهای زیستی مختلف نشان میدهد، نمیتوان به نتایج یک پژوهش اکتفا کرد و به مطالعههای بیشتری در این زمینه نیاز است؛ بنابراین، پژوهش حاضر با هدف بررسی تأثیر غلظتهای مختلف محرکهای زیستی سیمواستاتین، سالیسیلیکاسید و نوع محیطکشت بر باززایی و پرآوری گیاه یادشده و دستیابی به مناسبترین غلظت این ترکیبات برای تکثیر بهینۀ این گیاه در شرایط درونشیشهای انجام شد.
مواد و روشها.
بهمنظور انجام پژوهش حاضر، نمونههای گیاهی زنده از عرصۀ طبیعی استان کردستان (روستای بلبر شهرستان مریوان) جمعآوری و بهشکل گلدانی در گلخانۀ گروه علوم و مهندسی باغبانی دانشگاه کردستان کشت و نگهداری شدند. پژوهش حاضر بهشکل فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد. عوامل شامل دو نوع محرک زیستی سالیسیلیکاسید و سیمواستاتین (هرکدام در چهار غلظت) و اثر متقابل آنها بودند (جدول 1).
در پژوهش حاضر، محیطکشت پایۀ موراشیگ و اسکوگ (MS) حاوی 1/0 میلیگرمدرلیتر ایندولبوتیریکاسید (IBA) و 2 میلیگرمدرلیتر بنزیلآمینوپورین (BAP)، محیط ثابت تمام آزمایشها در نظر گرفته شد. در تهیۀ محلول پایۀ سالیسیلیکاسید از هیدروکسیدسدیم نرمال و در تهیۀ محلول پایۀ سیمواستاتین از اتانول 96 درصد برای حلال استفاده شد؛ محلولهای یادشده همزمان با آمادهسازی محیطکشت به آن اضافه شدند. شیشههای حاوی محیطکشت برای ضدعفونیشدن بهمدت 15 دقیقه در اتوکلاوی با دمای 121 درجۀ سانتیگراد و فشار 2/1 اتمسفر قرار گرفتند. اشعۀ فرابنفش و اتانول 96 درصد برای استریلکردن محیط کار و سایر تجهیزات استفاده شد. سرشاخههای گیاه به طول 2 سانتیمتر، ریزنمونههای استفادهشده در پژوهش حاضر بودند که برای ضدعفونی سطحی، ابتدا بهمدت 10 ثانیه در اتانول 76 درصد و سپس بهمدت 10 دقیقه در هیپوکلریتسدیم 2/1 درصد قرار گرفتند؛ در نهایت، ریزنمونهها سه بار با آب دوبارتقطیرشده شستشو و روی محیطهای کشت آمادهشده قرار داده شدند. در هر ظرف کشت، چهار گیاه کشت و هر 13 ظرف کشت، یک تکرار در نظر گرفته شد. هر تیمار شامل سه تکرار بود. ظروف شیشهای استفادهشده 250 میلیلیتری و حاوی 40 میلیلیتر محیطکشت بودند. نمونههای گیاهی برای رشد و باززایی به اتاقک رشدی با دورۀ نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، شدت نور40 میکرومول بر متر در ثانیه، دمای 25 درجۀ سانتیگراد و رطوبت نسبی 65 درصد منتقل شدند. پساز گذشت 45 روز از کشت ریزنمونهها، شاخصهای درصد وزن خشک گیاه، تعداد شاخه، طول شاخه، سطح برگ، میزان کلروفیل a، b و کل، میزان کاروتنوئید، پرولین، فنول کل و پروتئین محلول نمونهها اندازهگیری و ثبت شدند. درصد وزن خشک با ترازوی دیجیتالی با دقت 0001/0 گرم، سطح برگ با دستگاه پلانیمتر، کلروفیل a، b و کل و نیز کاروتنوئید مطابق روش Lichtenthaler و Buschmann (2001)، پرولین بر اساس روش Bates و همکاران (1973)، فنول کل مطابق روش Singleton و همکاران (1999) و پروتئین محلول کل بر اساس روش Bradford (1976) به دست آمد؛ همچنین تعداد شاخه بهشکل مشاهدهای شمارش و طول شاخهها با خطکش اندازهگیری شد.
جدول 1- تیمارهای مختلف اعمالشده برای باززایی درونشیشهای گیاه مرزۀ اورامانی (S. avromanica Maroofi.)
|
سطوح تیماری |
نوع محرک زیستی |
|
چهار غلظت صفر، 5، 10 و 20 میکرومولار |
سیمواستاتین (SS) |
|
چهار غلظت صفر، 1/0، 3/0 و 5/0 میلیمولار |
سالیسیلیکاسید (SA) |
|
5 میکرومولار SS + 1/0 میلیمولار SA 5 میکرومولار SS + 3/0 میلیمولار SA 5 میکرومولار SS + 5/0 میلیمولار SA 10 میکرومولار SS + 1/0 میلیمولار SA 10 میکرومولار SS + 3/0 میلیمولار SA 10 میکرومولار SS + 5/0 میلیمولار SA 20 میکرومولار SS + 1/0 میلیمولار SA 20 میکرومولار SS + 3/0 میلیمولار SA 20 میکرومولار SS + 5/0 میلیمولار SA |
سالیسیلیکاسید+سیمواستاتین |
ریشهدارکردن نمونهها: گیاهچههای حاصل از مرحلۀ پرآوری به قطعههای کوچکتری شامل ریزشاخهای به طول 2 سانتیمتر تقسیم شدند و روی محیطکشت ½MS در معرض سه تیمار مختلف صفر، 5/0 و 1 میکرومولار ایندولبوتیریکاسید (IBA) قرار گرفتند. پساز گذشت چهار هفته، صفتهایی ازجمله درصد نمونۀ ریشهدارشده، تعداد ریشۀ تشکیلشده در هر ریزنمونه و طول ریشه اندازهگیری شدند. بهمنظور سازگاری و ادامۀ رشد ریزنمونهها، گیاهچههای ریشهدارشده به گلدانهای کوچک پلاستیکی حاوی مخلوطی از محیطکشتهای خاک باغچه، کوکوپیت، پرلیت و ورمیکولایت به نسبت حجمی منتقل و در اتاقک رشدی با شرایط نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، شدت نور 40 میکرومول بر متر در ثانیه، متوسط دمای شبانهروز 20 درجۀ سانتیگراد و رطوبت نسبی 65 درصد قرار داده شدند. پساز گذشت دو هفته، پوشش پلاستیکی روی گلدانها بهتدریج برداشته شد. پساز سازگارشدن گیاهچهها با شرایط طبیعی بیرون از محیط درونشیشهای کشت بافت، نهایتاً نمونهها به گلدانهای پلاستیکی بزرگ حاوی خاک زراعی منتقل و در گلخانه قرار داده شدند.
تجزیهوتحلیل دادهها با نرمافزار SAS (نسخۀ 1/9)، مقایسۀ میانگینها بر اساس آزمون حداقل اختلاف معناداری (LSD) و رسم نمودارها با نرمافزار Sigma Plot (نسخۀ 3/12) انجام شد.
نتایج
مشاهدههای 45 روز پساز کشت ریزنمونهها نشان دادند برخی تیمارها نهتنها موجب باززایی و پرآوری مطلوب گیاه نمیشوند، ریزنمونهها حالت سوخته مییابند و درنتیجه، این تیمارها از روند ارزیابیها حذف شدند (جدول 2).
جدول 2- نتایج ارزیابی کلی ریزنمونهها 45 روز پساز کشت ریزنمونههای گیاه مرزۀ اورامانی (S. avromanica Maroofi.) در تیمارهای مختلف سالیسیلیکاسید و سیمواستاتین
|
تیمارهایی که دچار سوختگی شدند و از روند ارزیابیها حذف شدند. |
تیمارهای با رشد مطلوب که ازنظر مورفوفیزیولوژیک ارزیابی شدند. |
|
5 میکرومولار SS + 5/0 میلیمولار SA 10 میکرومولار SS + 1/0 میلیمولار SA 10 میکرومولار SS + 3/0 میلیمولار SA 10 میکرومولار SS + 5/0 میلیمولار SA 20 میکرومولار SS + 1/0 میلیمولار SA 20 میکرومولار SS + 3/0 میلیمولار SA 20 میکرومولار SS + 5/0 میلیمولار SA |
چهار غلظت 0، 1/0، 3/0 و 5/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید (SA) چهار غلظت 0، 5، 10 و 20 میکرومولار سیمواستاتین (SS) 5 میکرومولار SS + 1/0 میلیمولار SA 5 میکرومولار SS + 3/0 میلیمولار SA |
درصد وزن خشک: مادۀ خشک بهدستآمده از شاخههای باززاییشده تحتتأثیر تیمارهای سیمواستاتین بهطور معناداری بیشتر از تیمار شاهد بود و بهطور متوسط، سیمواستاتین در مقایسه با سالیسیلیکاسید مادۀ خشک بیشتری تولید کرد. میزان زیستتودۀ گیاه با افزایش غلظت سیمواستاتین از 5 به 20 میکرومولار، روند افزایشی نشان داد؛ در حالیکه با افزایش غلظت سالیسیلیکاسید، تغییر معناداری در میزان زیستتودۀ گیاه مشاهده نشد. بیشترین میزان مادۀ خشک گیاه از نمونههایی به دست آمد که از هر دو محرک زیستی سیمواستاتین و سالیسیلیکاسید در آنها استفاده شده بود؛ هرچند تیمارهای یادشده با تیمارهای 10 و 20 میکرومولار سیمواستاتین تفاوت معناداری نداشتند. میزان مادۀ خشک تیمارهای سالیسیلیکاسید ازنظر آماری تفاوت معناداری با تیمار شاهد نداشت (شکل 1).
شکل 1- میانگین درصد مادۀ خشک شاخههای باززاییشدۀ مرزۀ اورامانی (S. avromanica Maroofi.) تحتتأثیر تیمارهای مختلف سیمواستاتین (SS) و سالیسیلیکاسید (SA) در شرایط درونشیشهای. میانگینهای هر ستون که حرفهای مشابهی دارند، اختلاف معناداری در سطح 1 درصد ندارند.
طول شاخه: هر دو محرک زیستی سیمواستاتین و سالیسیلیکاسید طول شاخه را بهطور درخور توجهی در مقایسه با شاهد افزایش دادند؛ هرچند افزایش طول شاخه با افزایش غلظت محرکهای زیستی روند منطقی نداشت. در تیمارهای سیمواستاتین، طول شاخه با افزایش غلظت این محرک بهطور معناداری افزایش و سپس کاهش یافت که البته کاهش آن معنادار نبود. تیمارهای مختلف سالیسیلیکاسید ازنظر طول شاخه اختلاف معناداری باهم نداشتند. طول شاخههای باززاییشده در تیمار ترکیبی 3/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید+5 میکرومولار سیمواستاتین بهطور معناداری بیشتر از طول شاخههای باززاییشدۀ تیمارهای سالیسیلیکاسید بود؛ هرچند تفاوت معناداری با تیمارهای 5، 10 و 20 میکرومولار سیمواستاتین نداشت (شکلهای 2 و 3).
|
|
شکل 2- میانگین طول شاخسارههای باززاییشده از ریزنمونههای مرزۀ اورامانی (S. avromanica Maroofi.) در معرض تیمارهای مختلف سیمواستاتین (SS) و سالیسیلیکاسید (SA) در شرایط درونشیشهای. میانگینهای هر ستون که حرفهای مشابهی دارند، اختلاف معناداری در سطح 1 درصد ندارند.
|
A |
|
B |
|
C |
|
D |
|
E |
|
F |
|
G |
|
H |
|
I |
شکل 3- مقایسۀ طول شاخسارههای پرآوریشدۀ مرزۀ اورامانی (S. avromanica Maroofi.) در شرایط درونشیشه (45 روز پساز کشت ریزنمونهها) در تیمارهای مختلف شاهد (A)، 5 میکرومولار سیمواستاتین (B)، 10 میکرومولار سیمواستاتین (C)، 20 میکرومولار سیمواستاتین (D)، 1/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید (E)، 3/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید (F)، 5/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید (G)، 5 میکرومولار سیمواستاتین+1/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید (H) و 5 میکرومولار سیمواستاتین+3/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید (I)
تعداد شاخه:بیشترین تعداد شاخۀ باززاییشده از هر ریزنمونه به تیمار شاهد مربوط بود و کمترین تعداد شاخه در تیمارهای 20 میکرومولار سیمواستاتین و اثر متقابل تیمارهای ترکیبی سیمواستاتین و سالیسیلیکاسید مشاهده شد. افزایش غلظت سیمواستاتین و سالیسیلیکاسید با افزایش تعداد شاخۀ باززاییشده روند منطقی نداشت. تیمارهای ترکیبی دو محرک ازنظر تعداد شاخۀ باززاییشده اختلاف معناداری باهم نداشتند. تعداد شاخههای باززاییشده در تیمارهای سالیسیلیکاسید بهطور متوسط بیشتر از تیمارهای سیمواستاتین و اثر متقابل آنها بود (شکل 4).
|
LSD 0.01= 3.86 |
شکل 4- میانگین تعداد شاخۀ باززاییشده از هر ریزنمونۀ مرزۀ اورامانی (S. avromanica Maroofi.) در تیمارهای مختلف سیمواستاتین (SS) و سالیسیلیکاسید (SA) در شرایط درونشیشهای. میانگینهای هر ستون که حرفهای مشابهی دارند، اختلاف معناداری در سطح 1 درصد ندارند.
سطح برگ: سطح برگ شاخههای باززاییشده در معرض تیمارهای سیمواستاتین بهطور معناداری بیشتر از سایر تیمارها بود و با افزایش غلظت این محرک رشد، سطح برگ نیز افزایش یافت؛ درحالیکه در تیمارهای سالیسیلیکاسید، ابتدا روند افزایشی و سپس کاهشی مشاهده شد. سطح برگ ریزنمونههایی که با هر دو محرک زیستی تیمار شده بودند کمتر از ریزنمونههایی بود که تنها با یکی از محرکهای زیستی تیمار شده بودند. بیشترین سطح برگ به تیمار 20 میکرومولار سیمواستاتین مربوط بود و کمترین سطح برگ در تیمار 1/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید+5 میکرومولار سیمواستاتین مشاهده شد (شکل 5).
شکل 5- سطح برگ شاخسارههای باززاییشده از هر ریزنمونۀ مرزه اورامانی (S. avromanica Maroofi.) در تیمارهای مختلف سیمواستاتین (SS) و سالیسیلیکاسید (SA) در شرایط درونشیشهای. میانگینهای هر ستون که حرفهای مشابهی دارند، اختلاف معناداری در سطح 1 درصد ندارند.
محتوای کلروفیل و کاروتنوئید: تغییرات میزان کلروفیل a، b و کل و کاروتنوئید گیاهچههای باززاییشده روند نسبتاً مشابهی داشتند. میزان رنگیزههای یادشده با افزایش غلظت سیمواستاتین، روند افزایشی معناداری نشان داد؛ ولی با افزایش غلظت سالیسیلیکاسید، تفاوت معناداری در میزان این رنگیزهها مشاهده نشد. بیشترین میزان کلروفیل a در تیمار 20 میکرومولار سیمواستاتین مشاهده شد که البته با تیمارهای 10 میکرومولار سیمواستاتین و تیمار ترکیبی 3/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید و 5 میکرومولار سیمواستاتین تفاوت معناداری نداشت. بیشترین میزان کلروفیل b به نمونههای تیمار 20 میکرومولار سیمواستاتین تعلق داشت که اختلاف معناداری با تیمارهای 10 میکرومولار سیمواستاتین، تیمارهای مختلف سالیسیلیکاسید و نیز تیمارهای ترکیبی سیمواستاتین و سالیسیلیکاسید نداشت. بیشترین محتوای کلروفیل کل و نیز کاروتنوئید در نمونههای تیمار 20 میکرومولار سیمواستاتین مشاهده شد که با تیمارهای 10 میکرومولار سیمواستاتین و تیمار ترکیبی 3/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید و 5 میکرومولار سیمواستاتین تفاوت معناداری نداشت. میزان کلروفیل a، b و کل و نیز کاروتنوئید در تیمار سیمواستاتین بهطور متوسط بیشتر از سایر تیمارها بود و کمترین میزان این رنگیزهها در تیمار شاهد مشاهده شد (شکلهای 6 و 7).
|
LSD 0.01 Chl a = 0.06 LSD 0.01 Chl b = 0.06 LSD 0.01 Chl total = 0.08
|
شکل 6- میانگین محتوای کلروفیل a، b و کل شاخههای باززاییشدۀ مرزه اورامانی (S. avromanica Maroofi.) در تیمارهای مختلف سیمواستاتین (SS) و سالیسیلیکاسید (SA) در شرایط درونشیشهای. میانگینهای هر ستون که حرفهای مشابهی دارند، اختلاف معناداری در سطح 1 درصد ندارند.
شکل 7- میانگین محتوای کاروتنوئید شاخههای باززاییشدۀ مرزه اورامانی (S. avromanica Maroofi.) در تیمارهای مختلف سیمواستاتین (SS) و سالیسیلیکاسید (SA) در شرایط درونشیشهای. میانگینهای هر ستون که حرفهای مشابهی دارند، اختلاف معناداری در سطح 1 درصد ندارند.
محتوای پرولین: بهطورکلی، میزان پرولین نمونههای تیمارشده با ترکیبی از دو محرک زیستی سیمواستاتین و سالیسیلیکاسید بیشتر از سایر نمونهها بود؛ هرچند اختلاف معناداری با میزان پرولین تیمارهای 5 و 10 میکرومولار سیمواستاتین نداشت. افزایش غلظت سیمواستاتین و سالیسیلیکاسید تغییر معناداری در محتوای پرولین نمونهها ایجاد نکرد. درمجموع، محتوای پرولین نمونههای تیمارشده با سیمواستاتین بیشتر از نمونههای تیمارشده با سالیسیلیکاسید بود. کمترین میزان پرولین به نمونههای شاهد مربوط بود (شکل 8).
شکل 8- میانگین محتوای پرولین شاخههای باززاییشدۀ مرزۀ اورامانی (S. avromanica Maroofi.) در تیمارهای مختلف سیمواستاتین (SS) و سالیسیلیکاسید (SA) در شرایط درونشیشهای. میانگینهای هر ستون که حرفهای مشابهی دارند، اختلاف معناداری در سطح 1 درصد ندارند.
میزان فنول کل: افزایش غلظت سیمواستاتین بهطور معناداری موجب افزایش محتوای فنول کل شد، ولی افزایش غلظت سالیسیلیکاسید تغییر معناداری در میزان فنول کل ایجاد نکرد. میانگین میزان فنول نمونههای تیمارشده با سیمواستاتین بیشتر از میانگین فنول نمونههای تیمارشده با سالیسیلیکاسید بود. بیشترین محتوای فنول به نمونههای تیمار ترکیبی 3/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید+5 میکرومولار سیمواستاتین مربوط بود؛ هرچند تفاوت معناداری با تیمار 20 میکرومولار سیمواستاتین نداشت. کمترین میزان فنول به نمونههای شاهد تعلق داشت که تفاوت معناداری با تیمار 5 میکرومولار سیمواستاتین و تیمارهای 1/0 و 3/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید نداشت (شکل 9).
پروتئین محلول کل: مشابه با فنول کل، محتوای پروتئین محلول نمونهها بهطور معناداری تحتتأثیر غلظت سیمواستاتین قرار گرفت؛ بهطوریکه با افزایش غلظت این محرک زیستی، میزان پروتئین محلول افزایش معناداری داشت. افزایش غلظت سالیسیلیکاسید تأثیر معناداری بر میزان پروتئین محلول نداشت. بیشترین محتوای پروتئین محلول در نمونههایی مشاهده شد که با 20 میکرومولار سیمواستاتین تیمار شده بودند که البته با تیمار 10 میکرومولار سیمواستاتین و تیمار ترکیبی 3/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید+5 میکرومولار سیمواستاتین تفاوت معناداری نداشت. کمترین محتوای پروتئین محلول کل به نمونههای تیمار شاهد تعلق داشت و اختلاف معناداری با تیمار 3/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید نداشت (شکل 10).
شکل 9- میانگین میزان فنول شاخههای باززاییشدۀ مرزۀ اورامانی (S. avromanica Maroofi.) در تیمارهای مختلف سیمواستاتین (SS) و سالیسیلیکاسید (SA) در شرایط درونشیشهای. میانگینهای هر ستون که حرفهای مشابهی دارند، اختلاف معناداری در سطح 1 درصد ندارند.
شکل 10- میانگین میزان پروتئین محلول شاخههای باززاییشدۀ مرزۀ اورامانی (S. avromanica Maroofi.) در تیمارهای مختلف سیمواستاتین (SS) و سالیسیلیکاسید (SA) در شرایط درونشیشهای. میانگینهای هر ستون که حرفهای مشابهی دارند، اختلاف معناداری در سطح 1 درصد ندارند.
ریشهزایی شاخسارهها: ارزیابی ریزنمونهها پساز گذشت چهار هفته از کشت در محیط ریشهزایی نشان داد ریشهزایی در هیچکدام از ریزنمونههای تیمار شاهد اتفاق نیفتاده است؛ هرچند با گذشت زمان استقرار در محیطکشت، درصد شاخسارههای ریشهدارشده در ریزنمونههای تیمارشده با IBA افزایش یافت. درنهایت، بیشترین میانگین ریزنمونههای ریشهدارشده (6/96 درصد) و تعداد ریشۀ بهوجودآمده از هر ریزنمونه (66/5) در تیمار 5/0 میکرومولار IBA مشاهده شد که تفاوت معناداری با تیمار 1 میکرومولار IBA نداشت. بیشترین میانگین طول ریشه (73/5 سانتیمتر) به نمونههای تیمار 5/0 میکرومولار IBA متعلق داشت (شکل 11 و جدول 3).
|
A |
|
B |
|
C |
شکل 11- ریشهزایی شاخسارههای باززاییشدۀ مرزۀ اورامانی (S. avromanica Maroofi.) در شرایط درونشیشهای در تیمارهای صفر (A)، 5/0 میکرومولار (B) و 1 میکرومولار (C) ایندولبوتیریکاسید
جدول 3- مقایسه میانگین درصد، تعداد و طول ریشههای بهوجودآمده از شاخسارههای مرزۀ اورامانی (S. avromanica Maroofi.) در تیمارهای مختلف ایندولبوتیریکاسید (IBA) در شرایط درونشیشهای
|
طول ریشه (سانتیمتر) |
تعداد ریشۀ بهوجودچآمده از هر ریزنمونه |
ریزنمونههای ریشهدارشده (درصد) |
غلظت ایندولبوتیریکاسید (IBA) |
|
c 0/0 ± 0/0 |
b 0/0 ± 0/0 |
b 0/0 ± 0/0 |
صفر (شاهد) |
|
a 92/0 ± 73/5 |
a 57/0 ± 66/5 |
a 05/3 ± 6/96 |
5/0 میکرومولار |
|
b 87/0 ± 23/3 |
a 1 ± 4 |
a 51/3 ± 6/91 |
1 میکرومولار |
میانگینهای هر ستون که حرفهای مشابهی دارند، اختلاف معناداری در سطح 1 درصد ندارند.
.سازگارکردن گیاهچهها با محیط برونشیشهای (in vivo):تعدادی از گیاهچههای باززاییشده در محیط درونشیشهای پساز انتقال به اتاقک رشد از بین رفتند. میزان زندهمانی گیاهچهها پساز گذشت دو هفته از انتقال به محیط برونشیشهای برابر 76 درصد بود؛ اما پساز گذر از مرحلۀ اتاقک رشد و انتقال به محیط گلخانه، گیاهان رشد بسیار مطلوبی داشتند (شکل 12).
شکل 12- گیاهچههای مرزۀ اورامانی (S. avromanica Maroofi.) قرارگرفته در اتاقک رشد (سمت راست) و گیاه سازگار شدۀ مرزۀ اورامانی در گلخانه (سمت چپ)
بحث
محرکهای زیستی ترکیباتیاند که از طریق ایجاد تغییرات ریختشناختی و فیزیولوژیکی در گیاه و نهایتاً ایجاد تغییر در متابولیسم گیاه سبب افزایش یا کاهش رشد و عملکرد آن میشوند. افزایش یا کاهش رشد و عملکرد گیاه بسته به نوع محرک زیستی، غلظت آن، مرحلۀ رشدی گیاه، نوع گیاه و مدت زمان تیمار متفاوت است (Namdeo, 2007). همانطور که نتایج نشان دادند در برخی تیمارها که اغلب اثر متقابل غلظتهای زیاد سیمواستاتین و سالیسیلیکاسید بودند، ریزنمونهها رشد نداشتند، حالت سوخته پیدا کردند و نهایتاً از بین رفتند که احتمالاً بهعلت تنش شدید ناشی از غلظت زیاد محرکهای زیستی بهکاررفته است. تجمع بیش از حد متابولیتهای ثانویه، آسیب به سلول و سرانجام مرگ سلول و بافت در اثر کاربرد غلظت زیاد محرکهای زیستی گزارش شده است (Kai et al., 2012)؛ همچنین غلظت زیاد محرکهای زیستی موجب آسیب به غشای سلول و کاهش و نهایتاً توقف متابولیسم سلول و مرگ بافت گیاه میشود (Ghanati et al., 2010). گزارش شده است غلظت کم سالیسیلیکاسید (کمتر از 01/0 میلیمولار) در گیاه شابیزک محرک رشد است، ولی غلظت زیاد آن (بیشتر از 1/0 میلیمولار) موجب اختلال در رشد میشود (Ahmadian Chashmi et al., 2010). ایجاد خسارت به گیاه در غلظت زیاد سالیسیلیکاسید بسته به گونۀ گیاهی متفاوت است؛ به این مطلب در گزارش Horvath و همکاران (2007) اشاره است. بیشترین سطح برگ، طول شاخساره و وزن خشک به تیمارهای سیمواستاتین مربوط بود و با افزایش غلظت این محرک زیستی، میزان سه صفت یادشده افزایش یافت. کلروفیل و کاروتنوئیدها رنگیزههای جاذب نور و مؤثر در فتوسنتز هستند و افزایش تولید آنها تحتتأثیر تیمار سیمواستاتین موجب افزایش فتوسنتز و طبیعتاً افزایش سطح برگ، طول شاخساره و وزن خشک گیاه میشود. دو صفت سطح برگ و وزن خشک تحتتأثیر سالیسیلیکاسید بهطور جزئی افزایش یافتند؛ هرچند اختلاف معناداری با شاهد نداشتند که شاید بهعلت حساسیت زیاد این گیاه به غلظتهای زیاد سالیسیلیکاسید است. محرک یادشده در غلظتهای زیاد بهشکل بازدارندۀ رشد عمل میکند (Karlidag et al., 2009). افزایش سطح برگ تحتتأثیر تیمار سالیسیلیکاسید در مطالعه روی گیاهان مرزۀ تابستانه (غلظت 3 میلیمولار) (Faraji-mehmani et al., 2016)، ریحان (غلظت 1 میلیمولار) (Gharib, 2006) و توتفرنگی (غلظت 1/0 میلیمولار) (Ghaderi et al., 2015) گزارش شده است. سالیسیلیکاسید با اثر روی میزان جذب و انتقال مواد غذایی و فتوسنتز بر میزان مادۀ خشک گیاهی تأثیر میگذارد (Hayat et al., 2010). افزایش وزن خشک گیاهان مرزۀ تابستانه (Faraji-mehmani et al., 2016)، بابونه (Kovacik et al., 2009)، رازیانه (Hashmi et al., 2012)، ذرت و سویا (Khan et al., 2003) و گندم (Shakirova et al., 2003) تحتتأثیر سالیسیلیکاسید گزارش شده است. طویلتربودن شاخسارهها در تیمارهای سیمواستاتین در مقایسه با سایر تیمارها احتمالاً بهعلت افزایش تولید هورمون جیبرلین ناشی از اثر بازدارندگی سیمواستاتین بر مسیر موالونات و تأثیر محرک آن بر مسیر مستقل از موالونات است. جیبرلین، هورمونی است که نقش بسزایی در طویلشدن سلولها و طبیعتاً بافتها و اندامهای گیاهی دارد و ازآنجاکه پیشمادۀ آن، دیترپن است و اغلب تولید دیترپنها در مسیر مستقل از موالونات انجام میشود، طبیعی است میزان تولید آن تحتتأثیر سیمواستاتین افزایش یابد و نهایتاً موجب افزایش طول شاخسارهها شود (Kafi et al., 2003). طول شاخسارهها تحتتأثیر سالیسیلیکاسید در مقایسه با شاهد افزایش یافت که احتمالاً بهعلت تأثیر مثبت این محرک زیستی در پروتئینسازی و تقسیم و تمایز سلولی در مریستم انتهایی گیاه است (Shakirova, 2007). برخلاف سایر صفتهای اندازهگیریشده، بیشترین تعداد شاخسارۀ بهوجودآمده از هر ریزنمونه به تیمار شاهد تعلق داشت. افزایش تعداد شاخساره در نمونههای شاهد احتمالاً از تولید بیشتر هورمون سایتوکینین ناشی میشود. سایتوکینین، هورمونی است که نقش مهمی در شاخهزایی دارد و تولید آن از مسیر موالونیک انجام میشود و ازاینرو، در نمونههای تیمارشده با سیمواستاتین که بازدارندۀ مسیر یادشده است، تولید آن کمتر و شاخهزایی کمتری انجام میشود (Kafi et al., 2003). ازآنجاکه سالیسیلیکاسید موجب تحریک تولید داخلی اکسین میشود، طول شاخساره را بیشتر از تعداد شاخساره تحتتأثیر قرار میدهد (Shakirova, 2007). مشاهدهها نشان دادند نمونههای با شاخسارههای طویلتر، تعداد شاخسارۀ کمتری دارند و به نظر میرسد در نمونههای با تعداد شاخسارۀ کمتر، انرژی گیاه بیشتر صرف طویلشدن شاخساره میشود؛ به عبارتی، تعداد شاخساره با طول شاخساره همبستگی منفی دارد. بیشترین محتوای کلروفیل و کاروتنوئید در نمونههای تیمارشده با سیمواستاتین مشاهده شد و با افزایشیافتن غلظت سیمواستاتین، میزان رنگیزههای یادشده افزایش یافت که احتمالاً بهعلت تأثیر سیمواستاتین بر مسیر بیوسنتزی این رنگیزههاست. پیشمادههای کلروفیل و کاروتنوئیدها اغلب از مسیر مستقل از موالونات سنتز میشوند (Kafi et al., 2003). سیمواستاتین مهارکنندۀ مسیر موالونات است و با منحرفکردن مسیر بیوسنتزی بهسمت مسیر مستقل از موالونات موجب افزایش سنتز محصولات نهایی این مسیر میشود. اگرچه سالیسیلیکاسید میزان کلروفیل و کاروتنوئید را در مقایسه با نمونههای شاهد افزایش داد، همسو با افزایش غلظت این محرک زیستی، میزان این رنگیزهها تغییر معناداری نشان نداد. سالیسیلیکاسید با تأثیر بر میزان بازشدگی روزنهها و درنتیجه، تأثیر بر فتوسنتز و تولید متابولیتهای اولیه و ثانویه بر تولید رنگیزههای یادشده تأثیر میگذارد (Faraji-mehmani et al., 2016). افزایش محتوای پرولین و پروتئین محلول کل تحتتأثیر کاربرد سالیسیلیکاسید ممکن است بهعلت نقش مثبت این محرک در تنظیم متابولیسم نیتروژن و پروتئینسازی باشد (Shakirova, 2007). در شرایط تنش، معمولاً پرولین افزایش چشمگیری در گیاه دارد و نقش بسزایی در تنظیم اسمزی، تثبیت پروتئینها، پایداری غشا و مهار رادیکالهای آزاد ایفا میکند(Iqbal et al., 2014). به نظر میرسد غلظتهای مختلف سالیسیلیکاسید اعمالشده در آزمایش حاضر ازنظر اعمال تنش بر گیاه تفاوت چندانی باهم ندارند و بههمینعلت، میزان پرولین تولیدشده در غلظتهای مختلف سالیسیلیکاسید اختلاف معناداری نشان نمیدهند. افزایش محتوای فنول کل همسو با افزایش غلظت سالیسیلیکاسید از نقش مؤثر این محرک زیستی در افزایش فتوسنتز و تولید متابولیتهای اولیه ناشی میشود (Ying et al., 2013). متابولیتهای اولیه پیشمادۀ متابولیتهای ثانویهاند و ازآنجاکه ترکیبات فنولی جزو متابولیتهای ثانویه به شمار میروند، طبیعی است با افزایش تولید متابولیتهای اولیه، تولید ترکیبات فنولی نیز افزایش یابد. مشابه با سالیسیلیکاسید، محتوای پروتئین و فنول کل همسو با افزایش غلظت سیمواستاتین افزایش یافت. پیشمادۀ تمام مسیرهای بیوسنتزی موالونیکاسید (مسیر سنتز ترپنها)، مالونیکاسید (مسیر سنتز ترکیبات فنولی) و تریکربوکسیلیکاسید (مسیر سنتز ترکیبات نیتروژندار ازجمله پروتئینها)، استیلکوآنزیمآ است و ازاینرو، سیمواستاتین با اثر بازدارندگی روی مسیر موالونیک موجب منحرفکردن مسیر بیوسنتزی بهسمت تولید پروتئینها و ترکیبات فنولی میشود (Kafi et al., 2003). بهطورکلی و بر اساس نتایج پژوهش حاضر میتوان گفت هرچند سیمواستاتین و سالیسیلیکاسید تأثیر مثبتی بر اغلب صفتهای رشدی مرزۀ اورامانی دارند، در غلظتهای زیاد بهویژه زمانی که این دو محرک زیستی باهم استفاده شوند، سمیت ایجاد میکنند و موجب ازبینرفتن ریزنمونهها میشوند؛ ازاینرو، غلظت بهینۀ محرکهای زیستی بسته به نوع گیاه و نوع محرک زیستی متفاوت است. همانطور که نتایج نشان دادند ریزنمونهها رشد بهتری در تیمارهای سیمواستاتین در مقایسه با سایر تیمارها دارند و افزایش غلظت این محرک زیستی، رشد ریزنمونهها را بهطور درخور توجهی بهبود میبخشد. ایندولبوتیریکاسید بهطور معناداری موجب تحریک ریشهزایی و افزایش تعداد و طول ریشههای ریزنمونهها شد، ولی افزایش غلظت آن از 5/0 به 1 میکرومولار صفتهای یادشده را کاهش داد. ایندولبوتیریکاسید از تنظیمکنندههای رشد مصنوعی است که نقشی مشابه با اکسین طبیعی دارد و موجب تحریک تقسیم سلول، طویلشدن سلولها و در ادامه، رشد ریشهها میشود (Shahhoseini et al., 2015). در مطالعههای بسیاری که دربارۀ گیاهان مختلف ازجمله پونهسای بیکرک (Narimani et al., 2017)، مرزنجوش (Ccedil et al., 2013)، پروانش (Junaid et al., 2007; Dhandapani et al., 2008) و رزماری (Shahhoseini et al., 2015) انجام شدهاند، نقش مؤثر و مثبت این تنظیمکننده در ریشهزایی اثبات شده است؛ باوجوداین، به نظر میرسد کاربرد غلظتهای بیش از حد این تنظیمکننده که بسته به نوع گیاه متفاوت است، نهتنها اثر مثبتی روی ریشهزایی ندارد، بهشکل بازدارنده عمل میکند (Shahhoseini et al., 2015; Narimani et al., 2017). افزایش بیش از حد ایندولبوتیریکاسید با برهمزدن تعادل هورمونی گیاه موجب کاهش ریشهزایی میشود (Jull et al., 1994)؛ همچنین گزارش شده است اکسین و ترکیبات شبهاکسینی در غلظتهای زیاد موجب تخریب سلول و بافتهای ته قلمه و درنتیجه، کاهش شاخصهای مرتبط با ریشهزایی میشوند (Puri and Verma, 1996). دستیابی به مناسبترین غلظت تنظیمکنندۀ رشد برای تحریک ریشهزایی به عوامل بسیاری ازجمله نوع تنظیمکنندۀ رشد، نوع گیاه، سن گیاه، وضعیت تغذیهای گیاه و میزان هورمونهای درونزای گیاه بستگی دارد و نیازمند پژوهشهای بیشتر در این زمینه است.
جمعبندی
همانطور که نتایج نشان دادند، محرکهای سالیسیلیکاسید و سیمواستاتین تأثیر معناداری بر اغلب صفتهای مطالعهشده در مرزۀ اورامانی دارند. از بین تیمارهای اعمالشده، بیشترین میانگین درصد وزن خشک، پرولین و فنول کل در تیمار ترکیبی 3/0 میلیمولار سالیسیلیکاسید+5 میکرومولار سیمواستاتین و بیشترین طول شاخه در تیمار 10 میکرومولار سیمواستاتین مشاهده شد. بیشترین سطح برگ، میزان کلروفیل، کاروتنوئید و پروتئین محلول در تیمار 20 میکرومولار سیمواستاتین به دست آمد. بهطورکلی، ریزنمونههای تیمارشده با سیمواستاتین در مقایسه با تیمارهای شاهد و سالیسیلیکاسید وضعیت رشدی مطلوبتری داشتند؛ همچنین از بین غلظتهای اعمالشدۀ ایندول بوتیریکاسید برای تحریک ریشهزایی ریزنمونهها، غلظت 5/0 میکرومولار مناسبترین غلظت بود.
سپاسگزاری
از واحد پژوهشی اصلاح و توسعۀ گیاهان دارویی دانشگاه کردستان برای حمایتهای مادی و معنوی از پژوهش حاضر سپاسگزاری میشود.
)
